Laboratuvarda yapılan araştırma Araştırma Vakfı hibe tarafından desteklenmiştir - Flanders (FWO; hibe numaraları G.0545.08 ve G.0298.11), Üniversitelerarası Atraksiyon Polonyalılar Programı (Belçika Bilim Politikası; hibe sayısı P6/28 ve P7/13) ve FWO destekli araştırma topluluğu yerleştirilmiştir. Flanders (FWO) - CDH Araştırma Vakfı bir doktora sonrası adam olduğunu. Yazarlar çok Moleküler ve Hücresel Sinyal (KU Leuven), Dr SP Srinivas (Optometri Indiana Üniversitesi, ABD), Dr Leybaert en laboratuvar (Ghent Üniversitesi) Laboratuvarı tüm mevcut ve eski üyelerine minnettar ve vardır yararlı tartışmalar sağlanan Dr Vinken (VUB), prosedürler optimize veya konneksin hemichannels çalışma için araçlar geliştirilmesi dahil edildi.

1. Kornea Endotel Hücre İzolasyonu Başlamadan önce: göz enucleating sonra yerel bir mezbaha, en kısa zamanda elde edilen taze gözlerle, gelen hücreleri izole edin. Göz maksimum 18 aylık, beş dakika ölüm sonrası ve Earle Dengeli Tuz Çözüm korunmuş bir inek olarak çıkarıldı emin olun - 4% 1 iyot çözeltisi laboratuvara taşınması için ° C. <ol><li> Earle Dengeli Tuz Çözeltisi dışında göz atın - 1% iyot çözeltisi ve bir Petri kabı (100 x 20 mm) yerleştirin. </li><li> % 70 etanol ihtiva eden bir çözelti ile göz sterilize ve% 1 iyot içeren Earle Dengeli Tuz Çözeltisi ile durulayın. </li><li> Bu adım, steril bir kaput çalışır. Dikkatlice gözden kornea incelemek ve yukarı gelecek şekilde epitel hücre tabakası ile Earle Dengeli Tuz Çözeltisi içeren bir Petri kabı (35 x 10 mm), yerleştirin. Dikkatlice kalan iris dokusu sti kaldırmakGerekirse kornea bağlanmış ll. </li><li> Yukarı endotel hücre tabakası ile petri içeren başka bir Earle Dengeli Tuz Çözeltisi için kornea aktarın ve Earle Dengeli Tuz Çözeltisi ile iki kez yıkayın. </li><li> Bir fincan şeklinde yemektir bir kum saati, yukarı bakacak şekilde endotel tabakası ile kornea aktarın ve büyüme ortamı ile örtün. Büyüme ortamı, 25 mM glukoz,% 10 fetal sığır serumu,% 6.6 L-glutamin, 2.5 ug / ml amfoterisin B ve% 1 antibiyotik-antimikotik karışım 10,000 birim ihtiva / ml penisilin, 10,000 ug içeren Dulbecco&#39;nun Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı oluşmaktadır streptomisin / ml ve 25 ug / ml amfoterisin B </li><li> Bir emme pipet ile ortam çıkarın. </li><li> Korneanın endotel tabakası (tripsin içeren tüm adımları aynı konsantrasyon ile yapılan) bir tripsin solüsyonu (0.5 g / L) 300 ul uygulayın. </li><li> Kapalı bir Petri kabındaki kornea içeren kum saati yerleştirin ve inc koydum37, 30 dakika boyunca ubator ° C ve% 5 CO2. </li><li> Yavaşça steril bir başlık bir yangın cilalı kanca şeklindeki cam Pasteur pipeti ile kornea uzak endotel hücreleri kazıyın. </li><li> Endotel hücreleri ihtiva eden çözelti emmek ve kültür ortamı 4 ml&#39;lik kültür şişeleri (25 cm2) ekleyin. </li><li> Kornea büyüme ortamı 300 ul uygulayın ve kazıma tekrar ve kültürü şişesi endotel hücreleri içeren çözeltisi ekleyin. </li><li> Bir kez daha bu son adım (1.11) tekrarlayın. </li><li> Kültür yerleştirin 37 inkübatör büyüme ortamı ° C ve% 5 CO2 &#39;de endotel hücreleri içeren şişeler. </li><li> İki gün sonra, kültür ortamı içinde 6 ml eklenir. </li><li> Iki günde bir büyüme ortamı yenileyin. </li></ol> 2. Hücre Kültürü <ol><li> Kültür ortamı çıkarın ve ulaşıldığında konfluent Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (Abou içinde olan hücreler iki kez yıkayınizolasyon sonra t 10 gün). </li><li> Bunları ayırmak ve inkübatör şişesi yerleştirmek için hücrelere 1.5 ml tripsin çözeltisi ekleyin (37 ° C,% 5 CO2) 3-4 dakika karıştırıldı. </li><li> Büyüme ortamı 12 ml ilave edilir. Hücreleri dağıtmak ve hücreleri saymak için içinde ve dışında orta üç kez pipetle. </li><li> Hücre yoğunluğu ve inkübatör koyun bağlı olarak değişken bir kısmı ile tohum hücreleri. 165.000 hücre hücre sayısı (cm 2 başına hücre yoğunluğu 39.286) ile iki iyi odacıklı slaytlar (4.2 cm 2 bir alana sahip) hazırlayın. Cm2 başına 6250 bir yoğunlukta yeni bir pasaj boyunca 80 cm2 kültürü şişeleri hazırlayın ve 25 ml&#39;lik bir toplam hacme taze kültür ortamı ile toplayın. </li><li> Her iki günde orta yenileyin. </li><li> Hücre tabakası birleşene 3-4 gün sonra ulaşılır. Deneyler için hücreler kullanır. </li><li> Şişeler, hücre tabakasının konfluent ulaşıldığında, 2.6 &#39;dan 2.1 adımları tekrarlayın. 2 pasaj kadar hücre kültürleri kullanılan f edilebilirveya deneyler. </li></ol> 3. Indükleyen Kalsiyum Wave için mekanik Uyarım <ol><li> 10 uM Fluo-4 ile odacıklı slayt hücreleri yük AM 37, 30 dakika boyunca fosfat tamponlu tuz ° C&#39;de hafifçe çalkalandı. </li><li> Fluo-4 AM çözeltisi çıkarın, fosfat tamponlu tuz ile hücreler beş defa yıkanır, fosfat tamponlu tuz ile hücre inkübasyon ve ölçümden önce, oda sıcaklığında en az 5 dakika boyunca hücreler bırakın. </li><li> Argon lazer ve kullanım ışın ayırıcı HFT 488 ile 488 nm de Excite, bir uzun geçiş emisyon filtresi LP 505 ile 530 nm floresan emisyon toplamak en azından iğne deliği ayarlayın. Bir yağ daldırma 40X objektif (Hava, 1.2 NA) kullanın. ARL-67156 ile deneylerde, bir 10X objektif kullanın (Hava, 0.3 NA). </li><li> Hücreleri konfokal mikroskop birleşik olduğu bir alan arayın. </li><li> Pozisyon, 45 odacıklı slayta açıdan ° ve-hücre membranı dokunmadan üstünde olacak şekilde pipet.Tek bir hücreye kısa (≈ 1 sn) mekanik stimülasyon kışkırtmak. Mekanik uyarma kısa olan bir amplifikatör aracılığıyla çalıştırılabilir bir piezoelektrik kristal nanopositioner birleştirilmiş bir cam mikropipet (uç çapı &lt;1 mm) ile, hücre zarının% 1&#39;den daha az dokunarak hücre akut, kısa süreli bir etkiye deformasyon oluşmaktadır bir mikro-manipülatör monte. Cam mikropipet çekici bir mikroelektrot ile yapılır. Nanopositioner mekanik uyarılması sırasında 0,2 ve 1,5 V arasında bir gerilim tarafından işletilen olduğundan emin olun. 1,5 V daha bir gerilim yüksek hücre hasarına neden olabilir. Her hücre tipi ve durumu için, hücre zarar vermeden mekanik uyarılması için en uygun voltaj dikkatli yüksek (1,5 V) gerilimi (0,2 V) düşük başlayarak gerilim bir dizi uygulanarak belirlenmelidir. Bu voltaj, hücre zarı uygulanan mekanik stres ve gerginlik belirlediği için gerilim uyarım kuvveti için bir ölçüdür.Mekanik uyarı kuvveti alanı ile mekanik strese çarpılarak hesaplanabilir. Alanı (&lt;3.14 mikron 2) ve mekanik gerilme hem de çok düşük olduğu için, mekanik uyarma gücü düşüktür. (Bir hücre hasar görmesi durumunda, hücre ve hücre dışına floresan sızıntıları karanlık döner unutmayın.) </li><li> Mekansal değişiklikleri ölçmek [Ca 2 +] konfokal mikroskop ile mekanik stimülasyon takip i. </li><li> Görüntü toplama ve depolama. </li><li> Konfokal mikroskop yazılımı kullanarak duyarlı hücreleri (aktif alan, AA) toplam yüzey alanı tanımlamak için ilgi bir çokgen bölge çizin. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda, bir mikropipet kullanarak lokalize ve kontrollü mekanik stimülasyon sağlayarak birincil sığır kornea endotel hücrelerinin tek katmanlarını içinde hücreler arası Ca 2 +-dalga yayılımı ölçmek için basit bir yöntem tarif. Mekanik olarak uyarılmış hücreleri +, her ikisi de arası Ca 2 + dalga yayılımının 11,67 sürücü gerekli hücre içi sinyal molekülleri, hücre içi IP 3 ve Ca 2 yerel bir artış ile yanıt verir. Ca 2 + hemichannels açılması ve G-proteine ​​bağlı P2 aktivasyonu ile komşu hücrelerde Ca 2 + sinyalleri tetikler ATP 68,69, serbest bırakılması kışkırtır ise IP 3 doğrudan, gap junction kanalları 5 ile komşu hücrelere aktarılır reseptörleri 37-40. Boşluk kavşak kanal ve bu süreçte hemichannels nispi katkısının Cx-mimetik kullanılması ile karakterize edilebilirpeptidler, ATP-bozundurucu enzim (ectonucleotidases) ve ectonucleotisdases inhibitörleri. Sığır endotel hücrelerde mekanik stimülasyonu ile oluşturulan hücreler arası Ca 2 + dalga yayılımının özellikleri iyice laboratuarımızda 25-33 olarak karakterize edilmiştir. Sonuçlarımız arası Ca 2 +-dalga yayılımı esas olarak önemli bir rol oynayan Cx43 ile ATP bir Cx-hemichannel-aracılı serbest, tahrik olduğunu gösterir. Bu nedenle, primer sığır endotel hücrelere uygulanan bu yöntem, doğal hücrelerde endojen düzeyde Cx43 hemichannels düzenlenmesinde tanımlamak veya karakterize etmek için özellikle uygundur. Bu yöntemi kullanarak, Cx43 hemichannels faaliyeti kritik aktomizin endojen bir aşırı fren önleyici olarak hizmet edebilir hücre iskeleti ve bu nedenle, zararlı, Cx43 hemichannel açma 25,31,32 tarafından kontrol edildiğini bulduk. Biz daha bu yönetmelik altında yatan moleküler mekanizmaları aydınlatmak ve bulmakCx43 hemichannels 33 açılması için gerekli olan moleküller arası döngü / kuyruk etkileşim önemli bir rol. Açıktır ki, bu sistem Cx ve Panx tabanlı bir boşluk kavşak kanalları ve hemichannels fonksiyonu incelemek için çok uygundur ve kesinlikle sığır endotel hücreleri ile sınırlı değildir, fakat hemen hemen herhangi bir hücre tipi hem de daha kompleks dokuların uyarlanabilir olarak gösterilmiştir mekanik stimülasyonu büyük arası Ca 2 +-dalgaları tüm yarımkürede kapsayan 70 tetikleyen beyinde. Farklı araçlar CX-mimetik peptidler, ATP-aşağılayıcı enzimler, ectonucleotidases inhibitörleri ve karbenoksolon ve 10 Panx1 (Tablo 2) 49,50 gibi farmakolojik bileşikler dahil olmak üzere gap junction kanalları ve hemichannels, katkısını değerlendirmek için mevcuttur. , Bu süreçte belli bir Cx veya Panx izoformunun katkısını belirlemek dikkatle tasarlanmış siRNA probları için tmRNA ve karıştırılmış bir kontrol iki bağımsız argeting bölge kullanılmalıdır. Demonte ölçüde Batı-blot deneyleri ve floresan mikroskopi kullanılarak tek hücre düzeyinde kullanarak total protein düzeyinde belirlenmelidir. Deney hücre mono tabakaları, siRNA probların transfeksiyon etkinliği fluoresan mikroskobu ile değerlendirilmelidir. Bunun için, tek bir floresan etiket sense ipliği 3 &#39;ucunda dahil edildiği bir çift yönlü siRNA gelişebilir. Bu dikkat etmek önemlidir doğru analizi için, ya da Cx Panx izoform (&gt;% 90 azalma) arasında önemli bir azalma, hem de hücre mono tabakasında siRNA dubleks (&gt;% 90 hücre siRNA ile transfekte edilmiş bir homojen transfeksiyon prob) elde edilmelidir. Hedefe doğru tasarlanmış siRNA prob seçicilik 71 değerlendirilmelidir. Kısacası, bu araçlar, diğer Cx veya Panx izoformlarını veya diğer önemli com ifadesi etkilemez böylece valide edilmelidirarası Ca 2 sürüş batıklardan +-dalgaları, P2X veya P2Y reseptörleri gibi. Cx43 hemichannels katkısını değerlendirmek için, bir seçici, güçlü bir inhibitörü olarak görev Cx43 (TAT-L2) hücre içi döngünün ikinci yarısına karşılık gelen bir hücre geçirgen peptid gelişmekte olan Dr Leybaert en laboratuvar ile işbirliği var Cx43 hemichannels Cx43-gap junction kanal aktivitesini 33 korurken. Bizim çalışmalarda, biz Cx43 hemichannels bir tam inhibisyon elde etmek için 100 uM TAT-L2 kullanılır, ancak daha düşük konsantrasyonlarda 72 yeterli olabilir. TAT-L2H126K/I130N bir negatif kontrol 73 olarak tavsiye edilir. Panx1 kanalların katkısının değerlendirmek için, 10Panx1 peptid uygulanabilir. Bu araçlar (m gibi plazma zarı bozulması (aşağıya bakınız) hariç için değil, aynı zamanda hemichannels tarafından değil, diğer mekanizmalarla bu parakrin ATP sinyal aracılık arası Ca 2 +-dalga yayılımının mekanizmaları göstermek için sadece önemli olanaks-anyon kanal ya da ATP içeren veziküller bırakılması). Sonuç olarak, birincil hücreler kullanan tüm çalışmalarda olduğu gibi, hücre kültürü koşulları ve geçişlerinin sayısının hücrelerinin biyolojik özellikleri gibi, standart olmalı ve bu nedenle, farklı Cx ve Panx izoformlarının ifade profili süre 26 içinde değişebilir. Bununla birlikte, bu yöntem için bir takım mahsurları vardır. Yönteme büyük bir dezavantajı mekanik stimülasyon ekstraselüler Ca 2 girişi artar, plazma zarı bozulma tetikleyebilir + ve iyi niyetli arası Ca 2 +-dalga yayılımı 11 altında yatan her ikisi de ATP gibi sinyal molekülleri serbest bırakılması. Bu kesinlikle arası Ca 2 +-dalga (kantitatif) analizi zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, son derece bir) uygun kontrolleri, Cx veya Panx izoformlarının ifade eksikliği yani hücre hatları ve araçları ben kullanması gerektiğini tavsiye edilir entegregap junction kanalları ve / veya hemichannels ve ii olarak Cx ve Panx fonksiyonu ile rfere) (mekanik uyaran sırasında nanopositioner 0,5 ve 2 V arasında bir gerilim tarafından işletilen olduğundan emin olun) mekanik stimülasyon prosedürü standart. Ayrıca, bu yöntem tek başına durmazsa dikkat etmek önemlidir, ama Cx ve Panx kanalları incelemek için ek deneysel yaklaşımlarla desteklenmelidir. Bu hücre içi IP 3 ya da Ca2 + 11,74 arasında Uncaging gibi, mekanik uyarma-aracılı hücre içi Ca2 +-dalga yayılımının katılma hücre içi haberci moleküllerinin bir yerel bir artış kullanılarak elde edilebilir. Arası Ca2 mekanik uyarı bağımsız +-dalgası, bir tampon +-dışı yerel bir düşüşe neden olur diazo-2 gibi bu tür rekombinant pro-apoptotik Bax 11,75 ve foto-etkin hale Ca2 gibi mikro-enjeksiyon, kullanabilir başlatmak için [Ca2 + </sup&gt;] 76, hemichannel açılması için bilinen bir tetikleyici. Alternatif olarak, bir hücre içi Ca 2 tetikleyen hücre geçirmez sinyal molekülleri yerinde elektroporasyon kullanabileceğiniz +-yayın ve hücreler arası Ca 2 gibi IP 3 67,68 olarak +-dalgalar,. Bahsedilen teknik, aynı zamanda, hücre ölümü 5,77 yayılmasını araştırmak için kullanılır. Bu mekanik olmayan uyaranlara uyaran yoğunluğu-yanıt daha iyi bir değerlendirmesini sağlar. Bu Ca 2 + dalga üretme yöntemleri ek olarak, bu hidrofilik boya alımı belirlenmesi (Lucifer sarının gibi) 78 ve ATP serbest değil, sadece dahil olmak üzere diğer yöntemler kullanılarak ya da Cx Panx kanallarının aktivitesini belirlemek için önemlidir aynı zamanda hücre dışı Ca 2 +-tamponlar (EGTA gibi) ve hücre içi Ca 2 +-serbest moleküller (Ca 2 +-iyonofor A23187 gibi) 11,74 yanıt olarak mekanik uyarılara yanıt. Buna ek olarak, to kanal düzeyinde düzenlenmesi için en iyi kanıtı elektrofizyolojik deneyler, çift voltaj kelepçe sistemleri ya veya ektopik GFP gibi bir işaretleyici ile birlikte Cx izoformlarını ifade Cx veya Panx mRNA veya HeLa hücre enjekte Xenopus oosit tam hücreli yolu kelepçe tarafından sağlanmaktadır 79-84. Sonuç olarak, hücreler arası Ca 2 uyaran için mekanik stimülasyon kullanımı +-dalgaları hücre içi iletişim araştırmak ve Cx ve Panx kanallarının katkı ve özelliklerini incelemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Hücreler arası iletişim ve sinyal doku ve tüm organ düzeyinde 1,2 de hücre dışı agonistler yanıt olarak fizyolojik süreçlerin koordinasyonu için gereklidir. Hücreler arası iletişimin en doğrudan yolu boşluğu kavşak oluşumu tarafından oluşturulur. Gap junction 3,4 komşu hücrelerin iki konneksin (Cx) hemichannels (Şekil 1) başkanı kafaya yerleştirme ile oluşan protein kanalları gap junction kanalları plaklar vardır. Ara bağlantılar neden olan ve modüle Ca2 komşu hücreler 6 (Şekil 2) arasında hücre içi mağazalarından +-serbest bırakma., Ca2 + veya IP 3 5 de dahil olmak üzere, en az 1.5 kDa arasında bir moleküler ağırlığa sahip küçük sinyal moleküllerinin geçişine izin Boşluk birleşme kanalları sıkıca redoks modifikasyon ve benzeri gibi, intra-ve intermoleküler protein etkileşimleri ile ve hücresel sinyal süreçler ile düzenlenirfosforilasyon 7. Gjs böylece kimyasal ve elektriksel syncytium olarak hareket eden, bağlı hücrelerin koordine cevabı sağlar. Örneğin, atriyal ve ventriküler kalp miyositleri arasında hareket potansiyelinin yayılmasını Cx-tabanlı GJ kanal 85 aracılığıyla gerçekleşir. Cxs sadece gap junction kanalları olarak rol değil, aynı zamanda eşleşmemiş hemichannels oluşturmak, böylece düzenli iyon kanalları 8-10 (Şekil 1) benzer zarlarında kanalları olarak çalışmıyor. Hemichannels hücre içi ve dışı çevre arasındaki iyon ve sinyal molekülleri değişimini kontrol ederek komşu hücreler arasında parakrin sinyal katılmak. Bir çok hücre tipinde (epitel hücreleri, osteoblastik hücrelerin, astrositlerin, endotelyal hücreler, vb gibi) ve organların (beyin, karaciğer, retina, koklea ve damarsal gibi), hücreler arası Ca 2 + dalgalar hücreli yanıtların koordinasyonu için temel olan <sus&gt; 11. Belirli bir hücrede hücre içi Ca 2 + düzeylerinde artış bu hücre ile sınırlı, ama böylece bir hücreler arası Ca 2 +-dalga 12,13 kurulması, çevredeki komşu hücrelere yaymak değildir. Bu hücreler arası Ca 2 + dalgaları syncytium ve düzensizliği patofizyolojik işlemleri 11 ile ilişkili olduğu gibi hücre katmanları fizyolojik düzenlenmesi için önemlidir. Kornea endotel ve epitel, kendi 25-33 gibi farklı grupları 14-24, hücreler arası iletişim mekanizmaları ve rolleri okudu. Olmayan uyarılabilir hücrelerde, kornea endotel hücreleri gibi, hücreler arası iletişim iki ayrı modu 28,29, yani boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim ortaya çıkar. Gap kavşak arası iletişim boşluğu kavşak 7 ile sinyal molekülleri doğrudan bir değişimi içerir. Gap junctional arası iletişim, doku dengesini korumak hücre çoğalması kontrol ve hücre dışı stres 10,34,35 bir senkronize cevap kurmak için önemlidir. Patolojiler bir dizi, gap junction bağlantı nedeniyle hatalı CXS düşürüldü, ve burada boşluk kavşak arası iletişim 36 etkiliyor. Bu çok hücreli organizmalarda boşluğu kavşak arası iletişimin önemini ve etkisini vurgular. Bu yayılabilir dışı haberciler (Şekil 2) sürümü içerdiğinden boşluğu kavşak arası iletişim aksine, parakrin hücreler arası iletişim, hücre-hücre apozisyon bağlı değildir. Sinyal moleküllerinin farklı hücre sinyalizasyon hücre dışı boşlukta serbest bırakılır. Molekül daha sonra belirli bir reseptör proteini ile tespit edilir, hedef hücreye taşınır. Daha sonra reseptör sinyal kompleksi olan bir hücresel yanıtı indüklersinyal, ya da etkisiz hale duyarsızlaştırma çıkarılması ile sonlandırılır. Çıkış lipofilik hücre dışı sinyal haberciler membran nüfuz ve hücre içi reseptörleri üzerinde hareket ederler. Buna karşılık, hidrofilik haberciler yanıt hücrenin plazma zarı çapraz değil, ama sonra hücre içi çevreye sinyal röle yüzey ifade reseptör proteinler, bağlanan bir ligand olarak hareket ederler. Iyon-kanalı-bağlantılı, enzim-bağlı ve G-protein-bağlantılı: hücre yüzeyi reseptör proteinlerinin üç önemli aile bu süreçte yer alırlar. Serbest haberci molekül yakın (parakrin) hedef hücreleri üzerinde, aynı hücre (otokrin) reseptörleri üzerinde hareket edebilir, ya da dolaşım sistemi (endokrin) gerektiren uzak hedef hücreler üzerinde. Kornea endotel 28,29 dahil olmak üzere birçok hücre tipi içinde, hücre içi ATP Ca 2 + dalgalar 37-40 yayılma sürücü büyük hidrofilik, parakrin faktörlerden biridir. DurÇeşitli maddeler olarak kaldırılması ile mekanik deformasyon, hipoksi, inflamasyon veya stimülasyon, ATP kayma gerilmesi, çekme ya da ozmotik 44,45 şişme tepki olarak 41-44 sağlıklı hücrelerden serbest bırakılabilir. Farklı ATP-serbest bırakma mekanizmaları veziküler ekzositozu 44 ve bu, ATP-bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcılar, plasmalemmal voltaj bağımlı anyon kanalları 46, P2X7 reseptör kanalı 47,48 yanı sıra, ayrıca nakil mekanizması, bir bolluk da dahil olmak üzere, öne sürülmüştür konneksin hemichannels 49-52 ve pannexin hemichannels 43,49,53. Hücre dışı ATP ADP, AMP hızla hidrolize olması ve hücre dışı ortamda mevcut ectonucleotidases ile 54,55 adenozin olabilir. Ekstraselüler serbest ATP ve metaboliti ADP 56 difüzyon yoluyla yayılacak. Komşu hücrelerde purinerjik reseptörleri ile bu nükleotidlerin işlemler daha sonra p rolü de ortaya konmuşturarası Ca 2 +-dalgaları 28,37,51 bir ropagation. Purinerjik reseptörlerinin iki farklı sınıflar mevcut: Her iki pürin (ATP, ADP) ve pirimidin (UTP, UDP) nükleotidler en P2-purinoceptors 57 hareket ise adenozin, P1-purinoceptors için başlıca doğal ligand olduğunu. Hücreler arası iletişim gibi kazıma yükleme, boya transferi, IP 3 ve Ca 2 +, mekanik uyaran, vb gibi agonistlerin yerel uncaging gibi farklı yöntemlerle incelenebilir. Burada + dalga yayılımı, tek bir hücrenin mekanik uyarılar ile ortaya çıkarılan Ca 2 çalışma açıklar. Mekanik olarak uyarılmasıyla, Ca 2 +-dalga yayılımı eğitim avantajı + dalga zamanla Ca 2 yayılmasını ölçmek için kolay bir araç sağlar ve kantitatif olarak farklı hücre ön işlemleri karşılaştırarak izin vermektedir. Kornea endotel, bu hücreler arası Ca 2 +-dalgaları eş izintek tabaka gelen koordine yanıt, burada göz içi ameliyat sırasında hücre dışı zorlamalara dayanıklı endotel yardımcı olmayan rejeneratif kornea endotel olası bir savunma mekanizması olarak hareket, ya da bağışıklık ret veya üveit 58,59 sırasında inflamatuvar mediatörlerin maruz üzerine.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Column1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14155-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>38060-1EA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>11960-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine (Glutamax)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amphotericin-B</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A2942</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic-antimycotic mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>15240-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>25300-054</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14190-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4 AM</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>F14217</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A265</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VII</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two chambered glass slides</td>
 <td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td>
 <td>155380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope </td>
 <td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td>
 <td>LSM510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>P-280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HVPZT-amplifier</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>E463 HVPZT-amplifier</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td>
 <td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td>
 <td>4878</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microelectrode puller </td>
 <td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td>
 <td>WZ DMZ-Universal Puller</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells

Hücreler arası iletişim, beyin, karaciğer, retina, koklea ve damarsal içeren organlar ve dokular, çeşitli hücreler arasında fizyolojik süreçlerin koordinasyonu için gereklidir. Deneysel ayarlarında, hücreler arası Ca 2 +-dalgaları tek bir hücreye mekanik bir uyaran uygulanarak elde edebilir. Bu hücre içi sinyal IP molekülleri 3 ve Ca 2 serbest bırakılması yol açar + komşu hücrelere mekanik uyarılmış hücreden + dalga eş Ca 2 yayılma başlatmasını. Arası Ca 2 +-dalga yayılımı kontrol ana moleküler yollar IP 3 doğrudan transferi yoluyla ve ATP serbest bırakılması ile hemichannels tarafından gap junction kanalları tarafından sağlanmaktadır. Özellikleri ve farklı konneksin ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels olarak pannexin izoformlarının düzenlenmesi belirlenmesi ve karakterizasyonu quantificatio izin verdiğin arası Ca 2 +-dalga siRNA ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels inhibitörlerinin kullanımının yayılması. Burada, bir sonucu olarak hücreler arası Ca2 hücre akut, kısa süreli bir etkiye deformasyonu ile oluşturulan bir kontrollü ve lokalize mekanik uyarıcıya tepki olarak Fluo4-AM yüklendi primer endotel hücrelerinin mono tabakaları + dalga ölçmek için bir yöntem tarif az 1 mikron bir ipucu çaplı bir micromanipulator kontrollü cam mikropipet ile hücre zarının dokunmadan. Ayrıca birincil sığır kornea endotel hücreleri ve + dalgaları ATP serbest bırakılması ile arası Ca 2 için tahrik güç olarak Cx43-hemichannel aktivite değerlendirmek için model sistem olarak kullanımı izolasyonu açıklar. Son olarak, kullanımı, avantajları, sınırlamalar ve boşluk kavşak kanal ve hemichannel araştırma bağlamında bu yöntemin alternatifleri tartışmak.

Tüm deneyler ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar uygun olarak yürütülür ve ortaya olan protokol KU Leuven hayvan bakımı ve kullanımı komitesi rehberlik ve onay altında yapılır. Sığır kornea endotel hücreleri (BCEC) olarak, fonksiyonel gap junction ifade ve boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim hem de interaktif bir şekilde hücreler arası iletişim önemli katkı, ancak ana yol aracılık parakrin hücreler arası iletişim yolu olduğu gösterilmiştir vardır Cx43 tabanlı hemichannels 28,29 ile ATP serbest. ATP ve ADP ectonucleotidase e-NTPD1 (ectonucleoside trifosfat diphosphohydrolase 1, CD39 ATP diphosphohydrolase) tarafından monofosfat (AMP) adenozin hidrolize edilmiş, ve daha sonra 5&#39;-ectonucleotidase CD73 28,29 adenozin. ATP ve ADP katkıdaP2Y1 ve P2Y2 reseptörleri 28,29 bağlanarak Ca 2 +-dalga yayılımı. Reseptörleri Gq ile PLC için çift ve böylece IP uyandırmak hem 3-kaynaklı Ca 2 +-serbest (Şekil 2). BCEC yılında hızlı bir artış purinerjik P2Y reseptörleri sonuçlarının uyarılması [Ca 2 +] [Ca 2 +] o 60 çıkarılması duyarsız i,. [Ca 2 +] agonist stimülasyon tarafından uyarılmış i zirveleri istikrarlı, agonist bağımlı yükselmesine yol açabilir [Ca 2 +] i düşüş tarafından takip edilmektedir, [Ca 2 +] o bağımlı salınımlı dalgalanmalar veya başlangıca dönüş 60-62. BCEC olarak, Ca 2 +-serbest PLC ve IP 3 29 içeren bir yol ile oluşur kanıt olmuştur. IP 3-duyarlı stoklar boşaltılması bir başlangıç ​​zirve noktası yol açan bir ca ile [Ca2 +] i, ardmdanpacitative Ca 2 +-akını plato fazı 63 başlangıcı yol açar. Mekanik uyarma Ca 2 hızlı bir başlangıç ​​yükselmesine neden olur + stimülasyon noktasından kaynaklanır ve daha sonra mekanik olarak uyarılmış hücre boyunca yayılır. Son olarak, hücre içi Ca 2 +-seviyeleri yavaş yavaş temel seviyesine azaltmak. Hücre sınırları ulaştıktan sonra, bazal seviyesi (Şekil 3) çürükleri bir Ca 2 +-geçici olarak bir dalga gibi bir şekilde çevreleyen komşu hücreleri (NB), için hücreler arası Ca 2 +-dalga yayar. Kontrol koşullarda, Ca2 +-geçici uzak mekanik olarak uyarılmış hücre (Şekil 3) yaklaşık 4-8 hücre tabakaları kadar gözlenmiştir. Çizgi grafiği (Şekil 3 panellerin sağ tarafında) Ca 2 zaman ders gösterir +-geçici (normalize floresan (NF) değerleri olarak temsil) olarakmekanik uyarılmış hücre ve komşu hücre katmanları bir ila beş (NB1, NB2, NB3, NB4 ve NB5). Şekil 3, çok açıktır ki normalize floresan azalır, süre başlangıcı için zaman gecikmesini [Ca 2 +] mekanik uyarılmış hücreden artan mesafe ile i katlı artar. Mekanik uyarılmış hücrede maksimum normalize floresan 0.95 ulaşıldı ± 0.04 sn. Bir maksimum normalize floresan değeri ulaştıktan sonra, normalize floresan bazal değeri 152 dönen ± 6 sn uyaran 25 uygulandıktan sonra, çok kademeli ve yavaş bir düşüş gösterdi. Eksojen apyrase VI (30 dakika boyunca 5 U ​​/ ml) ve apyrase VII (30 dakika boyunca 5 U ​​/ ml) bir kombinasyonu ile parakrin arası iletişim yolunun inhibe Ca2 kapsadığı alan içinde bir 7.5-kat azalmaya neden +-dalgası, sözde aktif bir bölge (AA, p &lt;0.001, n = 7N = 35) (Şekil 4A). Apyrase ATP ve ADP hidrolize bilinmektedir. Apyrase VI yüksek ATPaz / ADPase oranı ve apyrase VII tercihen hidroliz ADP 56 vardır. Kornea endotel içinde parakrin hücreler arası iletişim büyük ölçüde ATP sürüm, 28,29 ile oluşur ve ATP kornea endotel ifade olduğu bilinen ectonucleotidases,, 29,64,65 ile hücre dışı ortamda hidrolize olduğu için biz koşullarında AA üzerindeki etkisi araştırıldı nerede ATP hidroliz ectonucleotidase inhibitörleri ile inhibe edilir. ARL-67156 (ARL, 30 dakika boyunca 100 uM) ile ectonucleotidases inhibisyonu BCEC 25,26,28,29, daha önce gösterilmiş olduğu gibi, + dalga yayılımı Ca2 güçlü geliştirilmesi ile sonuçlanmıştır. (Şekil 4B); ARL için BCEC maruz kalma koşulları (N = 12, n = 60 P &lt;0.001) kontrole göre AA bir 3,5 kat artışa neden olmuştur. ÖncesiLaboratuvarımızda, konneksin mimetik peptidler (Gap26 ve Gap27, Tablo 2) öncekine çalışmaları etkin olmayan bir peptid (mekanik stimülasyonu takiben arası Ca 2 +-dalga yayılımı, için boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim göreceli katkıları ayırt etmek için kullanılmıştır Bir kontrol olarak 28,29 Tablo 2). Gap27 ile boşluk kavşak kanal inhibisyonu anlamlı + dalga BCEC 30 Ca 2 yayılma azalmıştır. AA anlamlı Gap27 (30 dakika boyunca 300 uM) ile ön tedavi üzerine azaltılmıştır (p &lt;0.001, n = 8, n = 40), 25 (Tablo 1). Konneksin-mimetik peptid Gap26 28,30 ile konneksin hemichannels inhibisyonu önemli ölçüde + dalga BCEC 28 Ca 2 yayılma azalır. AA anlamlı Gap26 (30 dakika boyunca 300 uM) ile ön tedavi üzerine indirilmiştir(P &lt;0.001, n = 8, n = 40), 25 (Tablo 1). Ayrıca 43-kDa Cx izoformunun arası Ca 2 +-dalgaları kışkırtır hemichannel-aracılı ATP sürümü altında yatan bir ana bileşeni olduğunu gösterdi. Cx43 hedefleyen iki bağımsız tasarlanmış siRNA molekülleri kullanarak, AA 65 yaklaşık% 33 (Tablo 1) azalmıştır bulundu. Bu da TAT-L2 (100 uM, 30 dk), AA önemli bir azalma (p &lt;0.001 tahrik Cx43 hücre içi döngünün ikinci yarısında (Tablo 2), karşılık gelen bir hücre-geçirgen bir peptid kullanılarak yapılan deneyler ile desteklenmiştir , K = 3, n = 30) (Tablo 1). Önemli olarak, TAT-L2 inkübasyon tarafından AA bu azalma, TAT-L2 seçici Cx43 tabanlı hemichannels ancak boşluk kavşak kanallar 33 inhibe ettiği kavramını destekleyen, parakrin sinyal yokluğunda gözlenmedi. Ayrıca, aktif olmayan bir TAT-L2 mutantı (TAT-L2 H126K/I130N) bir kontrol (Tablo 2) olarak kullanılabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50443/50443fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig1.jpg" /> Şekil 1. Şematik: gap junction kanalları ve hemichannels oluşumu. Dört transmembran alan içeren proteinlerdir altı connexins veya pannexins, radyal merkezi bir gözenek etrafında düzenlenmiş zaman A. konneksin veya pannexin hemichannel oluşur. Hemichannels plazma membranında bulunmaktadır. Bunlar aynı proteini alt tip üzerindeki (homomerik hemichannels) oluşabilir ya da iki ya da daha fazla izoformu, aynı hücre (heteromerik hemichannels) olarak ifade edilmiştir farklı bir protein alt, oluşabilir. Bir homotipik gap junction kanal iki özdeş homomerik veya heteromerik hemichannels ve yerleştirme kaynaklanır. D bir heterotipik gap junction kanal sonuçlarıiki farklı homomerik veya heteromerik kanallar ocking. konneksin ve iki komşu hücreler ve hemichannels bağlantı pannexin boşluk kavşak kanal B. şematik yapısı. (Kısmen 66 değiştirilmiş) Bu rakam aslında BioEssays yayımlandı. Catheleyne D&#39;hondt, Raf Ponsaerts, Smedt, Geert Bultynck, ve Bernard Himpens De Humbert. Pannexins, spesifik hücresel fonksiyonları ile konneksin ailenin uzak akrabaları. BioEssays. 2009, 31, 953-974 (2009). BioEssays. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50443/50443fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50443/50443fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig2.jpg" /> Şekil 2. Olmayan uyarılabilir hücrelerde, intercellular Ca 2 +-dalga yayılımı boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişim hem de içerir. tek bir hücre, + katlı Ca 2 ile mekanik uyarılmış hücre (MS) oluşan bir Ca 2 mekanik uyarılması üzerine +-akını ve / veya Ca 2 +-serbest. Daha sonra, ikinci Ca 2 + artış husule mekanik bir hücreler arası Ca2 +-dalgası gibi komşu hücreler (NB) ile uyarılır. Arası yayılma iki mekanizma, yani boşluk kavşak arası iletişim ve parakrin hücreler arası iletişimi içerir. Boşluk kavşak arası iletişimde, bir arabulucu doğrudan bir değişim (IP 3 ve / veya Ca 2 +) gap junction (GJS) ile komşu hücrelerin sitoplazmalarında arasında oluşur. Parakrin hücreler arası iletişim, bir haberci (örneğin ATP) böylece inci bulunan reseptörleri hareket, hücre dışı uzaya salınırKomşu hücrelerin E yüzeyi. Hemichannels (HCS) veya diğer mekanizmalar (metin) bu ATP sürüm aracılık. ADP ve AMP Ectonucleotidases hidrolize ATP. ATP ve P2Y ve / veya komşu hücreler üzerinde P2X reseptörleri üzerinde ADP hareket. (66 alınmıştır.) Bu rakam aslında BioEssays yayımlandı. Catheleyne D&#39;hondt, Raf Ponsaerts, Smedt, Geert Bultynck, ve Bernard Himpens De Humbert. Spesifik hücresel fonksiyonları ile konneksin ailesinin Pannexins, uzak akrabalar. BioEssays. 2.009. 31 953-974 (2009). BioEssays. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50443/50443fig3.jpg" /> Şekil 3,. BCEC kontrol koşullarda kalsiyum dalga yayılımı. Mekanik stimülasyonu neden kalsiyum geçici temsilcisi sözde renkli floresan görüntüleri BCEC kontrol koşullarda zaman noktalarında farklı gösterilmektedir. FluoreUyarı öncesi scence yoğunlukları ilk görüntü gösterilir. İkinci görüntüde beyaz ok mekanik uyarılmış hücre tanımlar. 62.870 mikron 2: Kalsiyum dalga dalga (AA aktif alan) ulaştığı hücrelerin toplam alana sahip altı komşu hücre tabakaları için yayar. Çizgi grafikler ile doğru paneli mekanik uyarılmış hücrede normalize floresan değeri (NF) (MS) ve komşu hücrelerde NF ortalama değeri (NB) katmanları 1 ila 5 (NB1 için NB5) zamanında ders gösterir. (Kısmen 25 değiştirilmiş.) Bu rakam aslında Soruşturma Göz Hastalıkları ve Görsel Bilim yayınlandı. Catheleyne D&#39;hondt, Raf Ponsaerts, Sangly P Srinivas, Johan Vereecke, ve Bernard Himpens. Trombin hemichannels ve boşluk kavşak modülasyonu ile kornea endotel hücrelerinde arası kalsiyum dalga yayılımı engeller. Yatırım. Ophthalmol. Vis. Bilim. 2.007. <strong&gt; 48 (1), 120-33 (2007). Soruşturma Oftalmoloji ve Görsel Bilim. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50443/50443fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig4.jpg" /> Şekil 4. +-Dalgaları eksojen nucleotidases (solda) ile tedavi sonrası ve BCEC içinde ectonucleotidase inhibitörleri (sağda) ile hücreler arası Ca 2 yayılmasında önemli değişiklikler. ATP ve ADP hidrolize eksojen apyrases (apyrase VI (5 U / ml) ve apyrase VII (5 U / ml), 30 dakika süreyle), burada inhibe parakrin arası iletişim yolu ile (BCEC tedavisi sonrasında AA A. önemli azalma K = 7, n = 35). * P apyrase varlığı vs yokluğunda &lt;0.001 anlamına seçici bir ectonucleotidase inhibitörü ARL-67156 (ARL, 30 dakika için 100 mcM) ile BCEC tedavisi sonrası AA B. belirgin artış., Otlu enhancing parakrin hücreler arası iletişim yolu (N = 12, n = 60). * ARL varlığında genel yokluğunda p &lt;0.001 anlamına gelir. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Normalize AA </td><td> St hata </td><td> N </td><td> n </td><td> Istatistik </td></tr><tr><td> kontrol </td><td> 100 </td><td> 8.31 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td></td></tr><tr><td> siScramble </td><td> 87.97 </td><td> 9.3 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td></td></tr><tr><td> siCx43-1 </td><td> 32.45 </td><td> 8.23 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td> * </td></tr><tr><td> siCx43-2 </td><td> 35.49 </td><td> 7.06 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td> * </td></tr><tr><td> Kontrol peptidi </td><td> 91.68 </td><td> 6.5 </td><td> 8 </td><td> 40 </td><td></td></tr><tr><td> Boşluk 26 </td><td> 46.67 </td><td> 4.24 </td><td> 8 </td><td> 40 </td><td> * </td></tr><tr><td> Gap 27 </td><td> 53 </td><td> 4.76 </td><td> 8 </td><td> 40 </td><td> * </td></tr><tr><td> TAT-L2 </td><td> 6.99 </td><td> 0.71 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td> * </td></tr></tbody></table> Tablo 1. (AA) BCEC normalleştirilen aktif alanda Cx43, konneksin mimetik peptidler ve hücre-geçirgen peptid TAT-L2 siRNA hedef moleküllerin etkisi. Mevcut deneyler gün sayısını temsil eder, n mekanik uyarılarla sayısını temsil eder. * Anlamına P kontrol koşullarına göre &lt;0.001. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> AA dizisi </td></tr><tr><td> Kontrol peptidi </td><td> SRGGEKNVFIV </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Gap26 </td><td> VCYDKSFPISHVR </td></tr><tr><td> Gap27 </td><td> SRPTEKTIFII </td></tr><tr><td> TAT-L2 </td><td> YGRKKRRQRRR-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK </td></tr><tr><td> TAT-L2H126K/I130N </td><td> YGRKKRRQRRR-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK </td></tr><tr><td> 10Panx1 </td><td> WRQAAFVDSY </td></tr></tbody></table> Tablo 2&#39;de. Kullanılan peptidlerin amino asit dizileri.

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells at JoVE.com

Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Hücreler arası Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Dalgaları gap junction kanalları ve hemichannels tarafından tahrik edilmektedir. Burada, hücreler arası Ca ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Dalgaları yerel bir tek hücreli mekanik uyaran ve özellikleri ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels düzenlenmesi araştırmak için uygulama yanıt olarak hücre mono tabakaları içinde.

Hücre Tek katmanlar mekanik uyarılması bağlı Kalsiyum Dalga Yayılım: Sığır Kornea Endotel Hücreleri Örneği

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

mechanical-stimulation-induced-calcium-wave-propagation-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K Görüntüleme.  KU Leuven. Hücreler arası Ca 2 +-Dalgaları gap junction kanalları ve hemichannels tarafından tahrik edilmektedir. Burada, hücreler arası Ca ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır 2 +-Dalgaları yerel bir tek hücreli mekanik uyaran ve özellikleri ve boşluk kavşak kanalları ve hemichannels düzenlenmesi araştırmak için uygulama yanıt olarak hücre mono tabakaları içinde.

Video: Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

İnsan Embriyonik Kök Hücre (ES) yayılması

Biyoloji

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Anjiyogenezin Çalışması

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Ozmotik Su Geçirgenliği Katsayısı (P Ölçme<sub&gt; F</sub&gt;) Küresel Hücreleri: Bir Örnek olarak İzole Bitki protoplastlan

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Murin Vana Endotel Hücreleri İzolasyon

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...