O trabalho de investigação realizado em laboratório foi apoiada por doações da Fundação de Pesquisa - Flandres (FWO; números concessão G.0545.08 e G.0298.11), o Programa Interuniversitário poloneses Atração (Ciência Política belga; número de concessão P6/28 e P7/13) e está inserida em uma comunidade de investigação FWO apoiado. CDH é uma bolsa de pós-doutorado da Fundação de Pesquisa - Flandres (FWO). Os autores são muito gratos a todos os membros atuais e antigos do Laboratory of Molecular and Cellular Signaling (KU Leuven), Dr. SP Srinivas (Indiana Escola de Optometria University, EUA), o laboratório de Dr. Leybaert (Universidade de Ghent) e de Dr. Vinken (VUB), que proporcionou discussões úteis, procedimentos otimizados ou estavam envolvidos no desenvolvimento de ferramentas para o estudo de hemichannels conexina.

1. Isolamento de células endoteliais da córnea Antes de começar: Isole as células dos olhos frescos, obtidos a partir de um matadouro local, logo que possível após a enucleação dos olhos. Certifique-se de que foi submetida à enucleação de uma vaca máximas de 18 meses de idade, cinco minutos após o abate e preservados em solução salina equilibrada de Earle - solução de iodo a 1% a 4 ° C durante o transporte para o laboratório. <ol><li> Pegue o olho de Solução Salina Balanceada do Earle - solução de iodo 1% e colocá-lo em uma placa de Petri (100 x 20 mm). </li><li> Esteriliza-se o olho com uma solução contendo etanol a 70% e lavagem com solução salina equilibrada de Earle contendo 1% de iodo. </li><li> A partir deste passo, trabalhar em uma capa estéril. Dissecar cuidadosamente a córnea do olho e coloca-se numa placa de Petri (35 x 10 mm), contendo solução salina equilibrada de Earle, com a camada de células epiteliais voltada para cima. Remova cuidadosamente qualquer sti tecido da íris remanescentell fixada na córnea, se necessário. </li><li> Transferir a córnea para a Solução Salina Equilibrada de Earle contendo um outro prato de Petri com a camada de células endoteliais para cima e lavar duas vezes com Solução Salina Balanceada de Earle. </li><li> Transferir a córnea, com a camada endotelial voltada para cima para uma ampulheta, o qual é um prato em forma de taça, e cobri-lo com um meio de crescimento. O meio de crescimento constituído por Meio de Eagle Modificado por Dulbecco contendo glucose 25 mM, 10% de soro fetal bovino, 6,6% de L-glutamina, 2,5 ug / ml de anfotericina-B e 1% de mistura de antibiótico-antimicótico contendo 10.000 unidades / ml de penicilina, 10.000 ug / ml de estreptomicina, e 25 ug / ml de anfotericina B. </li><li> Remover o meio com uma pipeta de aspiração. </li><li> Aplicar 300 ul de uma solução de tripsina (0,5 g / L) para a camada endotelial da córnea (todos os passos que incluem a tripsina são feitas usando a mesma concentração). </li><li> Coloque a ampulheta contendo a córnea em uma placa de Petri coberta e colocá-lo no incubator durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Raspe as células endoteliais da córnea de distância com um incêndio polido gancho em forma de pipeta de Pasteur de vidro numa câmara estéril. </li><li> Chupam a solução contendo as células endoteliais e adicioná-lo para frascos de cultura (25 cm 2), contendo 4 ml de meio de cultura. </li><li> Aplicar 300 l de meio de crescimento para a córnea e repetir o desbaste, e adicionar a solução contendo as células endoteliais para o balão de cultura. </li><li> Repetir esta etapa final (1,11) mais uma vez. </li><li> Coloque a frascos de cultura contendo as células endoteliais corneanas no meio de crescimento na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Após dois dias, adicionar 6 mL de meio de cultura. </li><li> Recarregar o meio de crescimento a cada segundo dia. </li></ol> 2. Cultura de Células <ol><li> Remover o meio de cultura e lava-se as células duas vezes com Solução Salina Balanceada de Earle, quando for atingida a confluência (dentro About 10 dias após o isolamento). </li><li> Adicionar 1,5 ml de solução de tripsina às células para separar os e colocar o balão na incubadora (37 ° C, 5% CO2) durante 3-4 min. </li><li> Adicionar 12 ml de meio de crescimento. Pipeta as médias de três vezes dentro e fora para dispersar as células e contagem das células. </li><li> Semente as células com uma fração variável dependendo da densidade celular e colocá-los na incubadora. Prepara duas lâminas bem septadas (com uma área de 4,2 cm2), com uma contagem de células de 165.000 células (densidade de 39.286 células por cm2). Preparar 80 centímetros 2 frascos de cultura de uma nova passagem a uma densidade de 6,250 por cm 2, e adiciona-se meio de cultura fresco a um volume total de 25 ml. </li><li> Atualizar o meio a cada dois dias. </li><li> Confluência da camada de células é alcançada após 3 a 4 dias. Usar células para experimentos. </li><li> Quando a confluência da camada de células nos frascos é atingido, repetir os passos 2.1 a 2.6. Culturas de células até a passagem 2 pode ser usado fou experimentação. </li></ol> 3. Estimulação mecânica para induzir ondas de cálcio <ol><li> Carregar as células na lâmina câmaras com 10 pM de Fluo-4 AM no salino tamponado com fosfato durante 30 min a 37 ° C, agitando suavemente. </li><li> Remover o Fluo-04:00 solução, lavar as células cinco vezes com solução salina tamponada com fosfato, incubar as células com solução salina tamponada com fosfato e deixar as células durante pelo menos 5 min à temperatura ambiente antes da medição. </li><li> Excite a 488 nm com laser de argônio e uso divisor de feixe HFT 488, recolher a emissão de fluorescência em 530 nm usando um filtro de emissão longpass LP 505, definir o pinhole, no mínimo. Use uma imersão objetiva de 40X petróleo (Air, 1,2 NA). Em experimentos com ARL-67156, use uma objetiva de 10X (Air, 0,3 NA). </li><li> Procurar um campo em que as células estão confluentes no microscópio confocal. </li><li> Posição da pipeta de modo que é de 45 ° em relação à corrediça compartimentado e tocando a membrana celular.Provocar uma pequena estimulação mecânica (≈ 1 seg) para uma única célula. A estimulação mecânica consiste numa deformação aguda de curta duração, da célula ao tocar rapidamente inferior a 1% da membrana celular com uma micropipeta de vidro (diâmetro da ponta &lt;1 mm) acoplado a um nanopositioner cristal piezoeléctrico, operado através de um amplificador que está montado um micro-manipulador. As micropipetas de vidro são feitos com um puxador de microeléctrodos. Certifique-se de que o nanopositioner é operado por uma tensão entre 0,2 e 1,5 V durante a estimulação mecânica. Uma tensão mais elevada do que 1,5 V pode resultar em danos nas células. Para cada tipo de célula e da condição, a tensão óptima para a estimulação mecânica sem danos das células deve ser cuidadosamente determinada mediante a aplicação de uma série de tensões a partir de baixo (0,2 V) a elevada (1,5 V) de tensão. A tensão é uma medida da força do estímulo uma vez que este determina a tensão de tensão mecânica e de tensão que são aplicados à membrana celular. Oforça da estimulação mecânica pode ser calculada multiplicando a tensão mecânica com a área. Uma vez que tanto a área (&lt;3,14 mM 2) e a tensão mecânica é muito baixa, a força do estímulo mecânico é baixa. (Note-se que quando uma célula é danificada, as fugas de fluorescência para fora da célula e a célula torna-se escura.) </li><li> Medir as mudanças espaciais em [Ca 2 +] i após a estimulação mecânica com o microscópio confocal. </li><li> Coletar e armazenar as imagens. </li><li> Desenhar uma região poligonal de interesse para definir a área de superfície total de células que respondem (área activa, AA), utilizando o software do microscópio confocal. </li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste artigo, nós descrevemos um método simples de medir intercelular Ca 2 + de propagação de ondas em monocamadas de células endoteliais corneanas bovinas primárias, fornecendo uma estimulação mecânica localizada e controlada usando uma micropipeta. Mecanicamente estimuladas células respondem com um aumento local intracelular IP3 e Ca 2 +, ambos os quais são moléculas de sinalização intracelular que conduzem essenciais intracelular de Ca 2 + de propagação de onda 11,67. IP 3 é transferido diretamente para as células vizinhas através de canais de junção gap 5, enquanto que Ca 2 + provoca a abertura de hemichannels ea liberação de ATP 68,69, o que desencadeia Ca 2 + sinais em células vizinhas através da ativação da proteína G acoplada P2 receptores 37-40. A contribuição relativa dos canais de junções de hiato e hemichannels neste processo pode ser caracterizado pelo uso de Cx-miméticopéptidos, enzimas degradadoras de ATP (ectonucleotidases) e inibidores da ectonucleotisdases. As propriedades de propagação intercelular Ca 2 + de onda de estimulação mecânica induzida em células endoteliais da córnea de bovino foram completamente caracterizados no nosso laboratório 25-33. Nossos resultados indicam que o Ca 2 + propagação de ondas intercelular é impulsionado principalmente por uma liberação Cx-hemichannel mediada por ATP, com Cx43 desempenhando um papel de destaque. Como tal, este método aplicado para as células endoteliais da córnea de bovino primárias é particularmente adequada para identificar ou caracterizar a regulação da Cx43 hemichannels em níveis endógenos em células nativas. Usando este método, verificou-se que a actividade de Cx43 hemichannels é criticamente controlado pelo citoesqueleto actomiosina, que pode servir como um freio impedindo excessiva endógeno e, assim, deletério, Cx43 abertura hemichannel 25,31,32. Nós elucidar os mecanismos moleculares subjacentes a esta regulação e encontrarum papel importante da malha / cauda interacções intramoleculares que são essenciais para a abertura de Cx43 hemichannels 33. Claramente, este sistema é muito adequado para o estudo da função de Cx, e baseado Panx canais de junções de hiato e hemichannels e é definitivamente não se limitando a células endoteliais da córnea de bovino, mas é adaptável para praticamente qualquer tipo de célula e também tecidos mais complexos, como tem sido demonstrado no cérebro onde a estimulação mecânica provocou grande intercelular Ca 2 +-ondas abrangendo todo o hemisfério 70. Ferramentas diferentes estão presentes para avaliar a contribuição dos canais de junção gap e hemichannels, incluindo peptídeos Cx-miméticas, enzimas que degradam ATP, inibidores de ectonucleotidases e compostos farmacológicos como carbenoxolona e 10 Panx1 (Tabela 2) 49,50. Para determinar a contribuição de um certo Cx ou Panx isoforma neste processo, sondas siRNA cuidadosamente projetados targeting duas regiões independentes do mRNA e um controlo codificado devem ser usados. A extensão do knockdown deve ser determinada ao nível da proteína total com ensaios de mancha ocidental e do nível de uma única célula por microscopia de fluorescência. A eficiência da transfecção das sondas siRNA nas monocamadas de células experimentais devem ser avaliadas através de microscopia de fluorescência. Para isso, pode-se desenvolver um siRNA duplex no qual um marcador fluorescente foi incorporado na extremidade 3 &#39;da cadeia com sentido. É importante notar que, para a análise propriamente dita, uma redução importante da Cx ou Panx isoforma (&gt; 90% de redução), bem como uma transfecção homogénea dos dúplices siRNA na monocamada de células (&gt; 90% das células transfectadas com siRNA sonda) deve ser obtida. A seletividade das sondas siRNA projetado para o alvo deve ser avaliada 71. Em suma, essas ferramentas devem ser validados de modo que elas não afetam a expressão de outros Cx ou isoformas Panx ou outro com chaveponentes de condução intercelular Ca 2 +-ondas, como receptores P2X ou P2Y. Para avaliar a contribuição de Cx43 hemichannels, que colaboram com o laboratório do Dr. Leybaert no desenvolvimento de um péptido de células-permeável que corresponde à segunda metade do anel intracelular da Cx43 (TAT-L2), que age como um selectivo, potente inibidor de Cx43 hemichannels mantendo Cx43-gap atividade do canal de junção 33. Nos nossos estudos, usamos 100 uM TAT-L2 para se obter uma inibição completa do hemichannels Cx43, mas as concentrações mais baixas podem ser suficientes 72. TAT-L2H126K/I130N é recomendado como controle negativo 73. Para avaliar a contribuição dos Panx1 canais, o péptido 10Panx1 pode ser aplicada. Estas ferramentas são importantes, não só para a exclusão de ruptura da membrana do plasma (ver abaixo), mas também para demonstrar que parácrinos ATP medeia os mecanismos de sinalização intracelular de Ca 2 + de propagação da onda de hemicanais e não por outros mecanismos (como mcanais axi-ânion ou a liberação de vesículas contendo ATP). Finalmente, como para todos os estudos em células primárias, as condições de cultura de células e do número de passagens deve ser normalizada, tal como as propriedades biológicas das células e, assim, o perfil das diferentes isoformas e Cx Panx expressão pode mudar ao longo do tempo 26. No entanto, há um número de desvantagens para este método. Uma grande desvantagem do método é que a estimulação mecânica pode provocar ruptura da membrana plasmática, que conduz para a entrada de Ca2 + extracelular e a libertação de moléculas de sinalização, como o ATP, ambos os quais estão na base bona fide de Ca2 + intercelular da onda de propagação 11. Isto definitivamente complica a análise (quantitativo) do intercelular Ca 2 + onda. Portanto, é altamente recomendável que se deve i) usar controles adequados, ou seja, linhas de células que não possuem a expressão da Cx ou Panx isoformas e ferramentas que interfere com a função de Cx e Panx como canais de junções de hiato e / ou hemichannels e ii) padronizar o procedimento de estimulação mecânica (certificar-se que, durante o estímulo mecânico da nanopositioner é operado por uma tensão entre 2 e 0,5 V). Além disso, é importante notar que este método não se sustenta por si só, mas deve ser sustentada por abordagens experimentais adicionais para estudar canais Cx e Panx. Isto pode ser conseguido através de um aumento local de moléculas de sinalização intracelular que participam na propagação intercelular de Ca 2 + da onda mecânica-estimulação mediada, como o uncaging de IP 3 intracelular ou Ca 2 + 11,74. Para iniciar intercelular de Ca2 + independente da onda de estimulação mecânica, pode-se utilizar a micro-injecção, tal como recombinante pró-apoptótica Bax 11,75 e foto-activável de Ca 2 +-buffers como diazo-2, que provoca uma queda local na extracelular [Ca 2 + </sup&gt;] 76, um gatilho conhecido para a abertura hemichannel. Alternativamente, pode-se utilizar a electroporação em in situ de moléculas de sinalização de células impermeáveis ​​que desencadear intracelular de Ca2 + intercelular e libertação de Ca 2 +-ondas, tais como IP3 67,68. A última técnica é também usada para investigar a difusão de morte celular de 5,77. Esses estímulos não-mecânicos proporcionar uma melhor avaliação da intensidade de estímulo-resposta. Em adição a estes métodos de propagação de Ca 2 + de onda, é importante para determinar a actividade dos canais de Cx Panx ou utilizando outras abordagens, incluindo a determinação da absorção do corante hidrófilo (como Lucifer Yellow) 78 e a libertação de ATP, não só em resposta a estimulação mecânica, mas também em resposta a extracelular de Ca 2 +-tampões (como o EGTA) e Ca 2 + moléculas intracelulares de libertação (como o Ca2 + ionóforo A23187) 11,74. Além disso, tele melhor prova para a regulamentação no nível dos canais é fornecido por meio de experimentos eletrofisiológicos, tanto os sistemas de fixação de dupla tensão ou braçadeira caminho de célula inteira de Xenopus oócitos injetados com Cx ou Panx mRNA ou de células HeLa ectópica expressar isoformas Cx junto com um marcador como GFP 79-84. Para concluir, o uso do estímulo mecânico para a indução de Ca2 + intercelular-ondas proporciona um método simples e fiável para investigar a comunicação intracelular e examinar a contribuição e as propriedades dos canais de Cx e Panx.

Comunicação intercelular e de sinalização são essenciais para a coordenação dos processos fisiológicos em resposta aos agonistas extracelulares no tecido e nível de 1,2-órgão inteiro. A maneira mais direta de comunicação intercelular é criado pela ocorrência de junções. Junções são placas de canais de junção gap, que são canais protéicos formados pelo acoplamento cabeça-de-cabeça de dois (Cx) hemichannels conexina de células adjacentes 3,4 (Figura 1). Junções de hiato permitir a passagem de pequenas moléculas de sinalização, com um peso molecular de menos de 1,5 kDa, incluindo Ca 2 + ou de IP 3 5, causando modulação e Ca 2 + de libertação a partir das reservas intracelulares das células vizinhas 6 (Figura 2). Canais de junções são fortemente regulados por intra e intermolecular interações proteína e por processos de sinalização celular, como modificação redox efosforilação 7. GJS facilitar a resposta coordenada de células conectadas, agindo assim como um sincício elétrica e química. Por exemplo, a propagação do potencial de acção cardíaca entre os miócitos atriais e ventriculares é mediada pelos canais GJ baseados Cx 85. Cxs não só tem um papel como canais de junções de hiato, mas também formar hemichannels desemparelhados, funcionando desse modo como os canais de membranas de forma semelhante aos canais de iões regulares 8-10 (Figura 1). Hemichannels participar na sinalização parácrinas entre células vizinhas por controlar a troca de iões e moléculas de sinalização entre o ambiente intra-e extracelulares. Em muitos tipos de células (como células epiteliais, células osteoblásticas, astrócitos, células endoteliais, etc) e órgãos (como o cérebro, o fígado, retina, cóclea e na vasculatura), intercelular Ca 2 +-ondas são fundamentais para a coordenação das respostas multicelulares <sup&gt; 11. Aumentos nos níveis de Ca2 + intracelular em células de um determinado não estão limitados a esta célula, mas para propagar as células vizinhas adjacentes, estabelecendo assim uma intercelular Ca 2 + onda 12,13. Estes intercelular Ca 2 +-ondas são importantes para a regulação fisiológica normal de camadas de células como um sincício e sua desregulação tem sido associado com os processos patofisiológicos 11. No endotélio corneano e epitélio, diferentes grupos 14-24, incluindo o nosso próprio 25-33, estudou os mecanismos e as funções de comunicação intercelular. Em células não-excitáveis, como as células endoteliais corneanas, dois modos distintos de comunicação intercelular ocorrer 28,29, nomeadamente lacuna juncional comunicação intercelular e comunicação intercelular parácrina. Gap juncional comunicação intercelular envolve uma troca direta de moléculas de sinalização via junções gap 7. Gap junccomunicação intercelular internacional é fundamental para a manutenção da homeostase do tecido, controle da proliferação celular, e estabelecer uma resposta sincronizada ao estresse extracelular 10,34,35. Em uma série de patologias, acoplamento junção gap é reduzida devido à Cxs com defeito, e vem afetando lacuna juncional comunicação intercelular 36. Isto enfatiza a importância ea influência do fosso juncional comunicação intercelular em organismos multicelulares. Em contraste com a abertura juncional comunicação intercelular, a comunicação intercelular parácrina não é dependente de aposição célula-célula, uma vez que implica a libertação de mensageiros extracelulares difusíveis (Figura 2). Diferentes tipos de moléculas sinalizadoras são libertadas no meio extracelular pelas células de sinalização. A molécula é então transportado para a célula alvo, onde é detectado por uma proteína receptor específico. Subsequentemente, o complexo receptor de sinal induz uma resposta celular, queé terminada por remoção do sinal, ou inactivação de dessensibilização. Lançamentos lipofílicos mensageiros de sinalização extracelular penetrar a membrana e agem sobre os receptores intracelulares. Em contraste, os mensageiros hidrofílicas não atravessar a membrana plasmática da célula responder, mas actuar como um ligando que se liga a proteínas receptoras expressas na superfície, que então retransmitem o sinal para o ambiente intracelular. Três grandes famílias de proteínas receptoras de superfície celular participar neste processo: canais de íons ligados, enzyme-linked e proteína G ligada. A molécula mensageira libertados podem actuar sobre os receptores da mesma célula (autócrino), sobre as células-alvo, em estreita proximidade (parácrina), ou nas células alvo distantes que exigem que o sistema circulatório (endócrina). Em muitos tipos de células, incluindo endotélio corneano 28,29, o ATP é um dos principais factores parácrinos, hidrofílicos que conduzem à propagação intercelular da Ca2 +-ondas 37-40. During deformação mecânica, a hipoxia, a inflamação ou a estimulação por vários agentes, o ATP pode ser libertado a partir de células saudáveis ​​41-44, em resposta à tensão de corte, estiramento, ou inchaço osmótico 44,45. Mecanismos de libertação de ATP diferentes têm sido postulada, incluindo exocitose vesicular 44 e uma multiplicidade de mecanismos de transporte, tais como a cassete (ABC) transportadores de ligação a ATP, canais dependentes da voltagem aniónica plasmalemmal 46 canais dos receptores P2X7, 47,48, bem como conexina hemichannels 49-52 e pannexin hemichannels 43,49,53. O ATP extracelular pode ser rapidamente hidrolisado para o ADP, AMP e adenosina 54,55 por ectonucleotidases que estão presentes no ambiente extracelular. O ATP extracelular liberado e seu metabólito ADP 56 vai se espalhar por meio de difusão. A interacção subsequente destes nucleótidos com receptores purinérgicos nas células vizinhas tem sido implicada na propagation intercelular de Ca 2 +-ondas 28,37,51. Duas classes diferentes de receptores purinérgicos estão presentes: adenosina é o principal ligando natural para P1-purinoceptors, enquanto ambos purina (ATP, ADP) e pirimidina (UTP, UDP) nucleótidos actuar em mais purinoceptors P2-57. Comunicação intercelular pode ser investigada por vários métodos, tais como a carga raspagem, a transferência de corantes, uncaging locais de agonistas como IP3 e Ca 2 +, estimulação mecânica, etc. Aqui descrevemos o estudo de Ca 2 + de propagação da onda induzida por estimulação mecânica de uma única célula. A vantagem de se estudar Ca 2 + de propagação da onda de estimulação mecânica é que ela fornece uma ferramenta fácil de quantificar a propagação do Ca 2 + onda ao longo do tempo e que permite comparar quantitativamente diferentes pré-tratamentos das células. Nas endotélio corneano, estes intercelular Ca 2 +-ondas permitir um coresposta coordenada a partir da monocamada, actuando por este meio como um possível mecanismo de defesa do endotélio corneal não regenerativos ajudando o endotélio para suportar tensões extracelular durante a cirurgia intra-ocular, ou por exposição a mediadores inflamatórios, durante a rejeição imunológica ou uveíte 58,59.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Column1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14155-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>38060-1EA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>11960-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine (Glutamax)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amphotericin-B</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A2942</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic-antimycotic mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>15240-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>25300-054</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14190-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4 AM</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>F14217</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A265</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VII</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two chambered glass slides</td>
 <td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td>
 <td>155380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope </td>
 <td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td>
 <td>LSM510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>P-280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HVPZT-amplifier</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>E463 HVPZT-amplifier</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td>
 <td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td>
 <td>4878</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microelectrode puller </td>
 <td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td>
 <td>WZ DMZ-Universal Puller</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells

Comunicação intercelular é essencial para a coordenação dos processos fisiológicas entre as células de uma variedade de órgãos e tecidos, incluindo o cérebro, o fígado, a retina, na cóclea e vasculatura. Em condições experimentais, intercelular Ca 2 +-ondas pode ser obtida através da aplicação de um estímulo mecânico para uma única célula. Isto conduz à libertação das moléculas sinalizadoras intracelulares de IP 3 e Ca 2 + que iniciam a propagação do Ca 2 + onda concêntrica a partir da célula estimulada mecanicamente para as células vizinhas. As principais vias moleculares que controlam intercelular Ca 2 + propagação de ondas são fornecidos por canais de derivação lacuna através da transferência direta de IP 3 e por hemichannels através da liberação de ATP. A identificação e caracterização das propriedades de regulação e das diferentes isoformas de conexinas e pannexin como canais de junções de hiato e hemichannels são permitidas pelo quantification da disseminação intercelular do Ca 2 + onda, siRNA, e o uso de inibidores dos canais de junções de hiato e hemichannels. Aqui, nós descrevemos um método para medir intercelular Ca 2 + onda em monocamadas de células endoteliais da córnea primárias carregado com Fluo4-AM em resposta a um estímulo mecânico controlado e localizado provocado por uma deformação aguda de curta duração, da célula como resultado de tocar na membrana celular com uma micropipeta de vidro controlada por micromanipulador com um diâmetro de ponta de menos de 1 um. Descrevemos também o isolamento de bovinos células endoteliais corneanas primários e sua utilização como sistema modelo para avaliar a atividade Cx43-hemichannel como a força orientada para intercelular Ca 2 +-ondas através da liberação de ATP. Finalmente, discute-se a utilização, vantagens, limitações e alternativas deste método no contexto do canal de junção gap e pesquisa hemichannel.

Todos os experimentos são executados em conformidade com todas as diretrizes, regulamentos e agências reguladoras e do protocolo que está sendo demonstrado é realizada sob a orientação e aprovação do comitê de cuidados com os animais e uso da KU Leuven. Em células endoteliais da córnea de bovino (BCEC), para junções de hiato funcionais e ambos são expressos lacuna juncional comunicação intercelular e comunicação intercelular parácrina contribuir significativamente para a comunicação intercelular, de uma forma interactiva, mas a via principal foi mostrado ser a via de comunicação intercelular mediada por parácrina libertação de ATP através de hemicanais baseados Cx43 28,29. ATP e ADP são hidrolisados ​​para monofosfato de adenosina (AMP) pelo E-ectonucleotidases NTPD1 (ectonucleoside trifosfato difosfohidrolase 1, CD39 difosfohidrolase ATP) e, subsequentemente, pela adenosina 5&#39;-ectonucleotidases CD73 28,29. ATP e ADP contribuir paraa Ca 2 + propagação da onda através da ligação a receptores de P2Y1 e P2Y2 28,29. Ambos os receptores par de PLC através Gq e assim evocar IP3 induzida por Ca 2 + de libertação (Figura 2). Em BCEC, a estimulação dos receptores purinérgicos P2Y resulta em um aumento rápido na [Ca2 +] i, que é insensível à remoção de [Ca 2 +] o 60. [Ca 2 +] i evocados por estimulação picos agonista são seguidos por um [Ca 2 +] i redução que pode levar a um estábulo, altura agonista-dependente, [Ca 2 +] flutuações oscilatórios o-dependente, ou um retorno aos valores basais 60-62. Em BCEC, tem havido evidência que o Ca 2 + de libertação ocorre através de uma via envolvendo PLC e IP 3 29. O esvaziamento dos armazéns 3-IP sensíveis leva a um pico inicial de [Ca 2 +] i, que se seguiu uma cApacitative Ca 2 + afluxo levando ao aparecimento da fase de patamar 63. A estimulação mecânica provoca uma subida inicial rápida de Ca 2 + que se origina a partir do ponto de estimulação e depois se espalha por toda a célula estimulada mecanicamente. Finalmente, o Ca 2 + intracelular-níveis diminuem lentamente de volta ao nível da linha de base. Ao atingir os limites da célula, as intercelulares de Ca 2 + de onda se propaga para as células circundantes vizinhas (NB), de uma forma de onda similar como Ca 2 + transitória, que decai para o nível basal (Figura 3). Em condições de controlo, o Ca 2 +-transientes foram observados até cerca de 4 a 8 camadas de células de distância a partir da célula estimulada mecanicamente (Figura 3). O gráfico linear (no lado direito dos painéis na Figura 3) mostra a evolução no tempo da Ca2 +-transientes (representados como valores normalizados de fluorescência (NF)), ema célula estimulada mecanicamente e nas camadas de células adjacentes 1-5 (NB1, NB2, NB3, NB4 e Nota 5). A partir da Figura 3, é evidente que as diminuições normalizados de fluorescência, enquanto que o atraso de tempo para o aparecimento de [Ca 2 +] i-rise aumenta com o aumento da distância a partir da célula estimulada mecanicamente. A fluorescência máxima normalizada na célula estimulada mecanicamente foi atingido em 0,95 ± 0,04 seg. Depois de atingir um valor de fluorescência máxima normalizada, a fluorescência normalizado mostrou um declínio muito lenta e gradual, retornando ao valor basal 152 ± 6 segundos após a aplicação do estímulo 25. A inibição da via de comunicação intercelular parácrina, usando uma combinação de apirase exógeno VI (5 U / ml durante 30 min) e apirase VII (5 U / ml durante 30 min) causou uma redução de 7,5 vezes na área coberta pelo Ca2 +-ondas, a assim chamada zona activa (AA, P &lt;0,001, n = 7, N = 35) (Figura 4A). Apirase é conhecida por hidrolisar ATP e ADP. Apirase VI tem uma alta taxa de ATPase / ADPásica e apirase VII preferencialmente hydrolyzes ADP 56. Uma vez que a comunicação intercelular parácrina no endotélio da córnea ocorre em grande parte através da libertação de ATP, 28,29 e ATP é hidrolisado no espaço extracelular por ectonucleotidases, conhecidos a ser expresso no endotélio corneano, 29,64,65 investigamos o efeito sobre a AA em condições onde a hidrólise do ATP é inibida utilizando inibidores ectonucleotidases. Inibição da ectonucleotidases com ARL-67156 (ARL, 100 uM durante 30 min) resultou em forte aumento do Ca 2 + de propagação da onda, conforme já foi anteriormente demonstrada em BCEC 25,26,28,29. A exposição de BCEC ao LRA causou um aumento de 3,5 vezes da AA em comparação com as condições de controle (P &lt;0,001, n = 12, n = 60) (Figura 4B). Na prériores estudos no nosso laboratório, de conexina péptidos miméticos (Gap26 e Gap27, Tabela 2) foram usadas para distinguir as contribuições relativas das junções de hiato e a comunicação intercelular comunicação intercelular parácrino para propagação intercelular de Ca 2 + de onda após a estimulação mecânica, com um péptido inactivo ( Tabela 2) como um controlo 28,29. A inibição dos canais de junções de hiato com Gap27 diminuiu significativamente a propagação do Ca 2 + onda em BCEC 30. A AA foi significativamente reduzida após pré-tratamento com Gap27 (300 uM durante 30 min) (P &lt;0,001, n = 8, n = 40) 25 (Tabela 1). Inibição de hemicanais conexina conexina com o péptido mimético de Gap26 28,30 reduziu significativamente a propagação do Ca 2 + onda em BCEC 28. O AA foi significativamente reduzida após pré-tratamento com Gap26 (300 mM por 30 min)(P &lt;0,001, n = 8, n = 40) 25 (Tabela 1). Também mostrou que o 43-kDa Cx isoforma foi um componente principal subjacente à libertação mediada por ATP hemichannel que provoca intercelular Ca 2 +-ondas. Usando duas moléculas de siRNA concebidos independentemente objectivo Cx43, verificou-se que o AA foi reduzida em cerca de 65 33% (Tabela 1). Isto foi adicionalmente sustentado por experiências utilizando TAT-L2 (100 uM, 30 min), um péptido de células-permeável que corresponde à segunda metade do anel intracelular da conexina 43 (Tabela 2), o que provocou uma redução significativa na AA (P &lt;0,001 , N = 3, n = 30) (Tabela 1). Mais importante, esta redução da AA pela TAT-L2 de incubação não foi observada na ausência de sinalização parácrinos, suportando o conceito de que a TAT-L2 inibe selectivamente hemichannels baseados Cx43, mas não os canais de junções de hiato 33. Além disso, um inactivo TAT-L2 mutante (TAT-L2 H126K/I130N) pode ser utilizado como um controlo (Tabela 2). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50443/50443fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig1.jpg" /> Figura 1. Formação de canais de junção gap e hemichannels: representação esquemática. A. Uma conexina ou pannexin hemichannel é formado quando seis conexinas ou pannexins, que são proteínas que contêm quatro domínios transmembranares, são dispostas radialmente em torno de uma poro central. Hemichannels estão localizadas na membrana plasmática. Podem consistir em subtipos de proteínas idênticas (hemichannels homomeric) ou podem consistir em diferentes subtipos de proteína, quando duas ou mais isoformas são expressas na mesma célula (hemichannels heteroméricos). Um canal de junção gap homotipica resulta do encaixe de dois homomeric idêntico ou hemichannels heteroméricos. Um canal de junções de hiato heterotípicos resultados do docking de dois canais homomeric ou heteromérico diferentes. estrutura da conexina e pannexin canais de junções de hiato ligam duas células adjacentes e hemichannels Esquema B.. (Parcialmente modificado a partir do 66) Esta figura foi originalmente publicado em BioEssays. Catheleyne D&#39;Hondt, Raf Ponsaerts, Humbert De Smedt, Geert Bultynck, e Bernard Himpens. Pannexins, parentes distantes da família conexina com funções celulares específicas. BioEssays. 2.009, 31, 953-974 (2009). BioEssays. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50443/50443fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50443/50443fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig2.jpg" /> Figura 2. Em células não-excitáveis, o emtercellular Ca 2 + de propagação de ondas envolve tanto a lacuna juncional comunicação intercelular e comunicação intercelular parácrina. Por estimulação mecânica de uma única célula, com Ca 2 + subida ocorre na célula estimulada mecanicamente (MS) por meio de Ca 2 + influxo e / ou Ca 2 +-release. Posteriormente, o Ca 2 + propaga-céus da estimulado mecanicamente as células vizinhas (NB) como Ca 2 +-wave intercelular. A propagação intercelular envolve dois mecanismos, a comunicação intercelular juncional nomeadamente lacuna e comunicação intercelular parácrina. No fosso juncional comunicação intercelular, uma troca directa de um mediador (IP 3 e / ou Ca 2 +) ocorre entre os citoplasmas das células adjacentes por meio de junções de hiato (GJS). Na comunicação intercelular parácrina, um mensageiro (eg ATP) é liberado para o espaço extracelular, atuando assim em receptores localizados no the superfície das células vizinhas. Hemichannels (HCs) ou outros mecanismos de mediar esta versão ATP (ver texto). Ectonucleotidases hidrólise de ATP para ADP e AMP. ATP e ADP ato em P2Y e / ou receptores P2X em células vizinhas. (Extraído de 66.) Esta figura foi originalmente publicado em BioEssays. Catheleyne D&#39;Hondt, Raf Ponsaerts, Humbert De Smedt, Geert Bultynck, e Bernard Himpens. Pannexins, parentes distantes da família conexina com funções celulares específicas. BioEssays. 2.009. 31, 953-974 (2009). BioEssays. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig3.jpg" /> Figura 3. Propagação de ondas de cálcio em condições de controle em BCEC. Estimulação mecânica transientes de cálcio induzidos são mostrados em diferentes pontos temporais em condições de controle em BCEC por imagens representativas de fluorescência pseudo-coloridas. O fluoreintensidades scence antes do estímulo são mostrados na primeira imagem. A seta branca na segunda imagem identifica a célula estimulada mecanicamente. A onda de cálcio propaga a seis camadas de células vizinhas, com uma área total de células alcançados pela onda (área ativa: AA) de 62,870 mM 2. O painel da direita com os gráficos de linha mostra a evolução no tempo do valor normalizado de fluorescência (NF) na célula estimulada mecanicamente (MS) e o valor médio de NF nas células vizinhas (NB) as camadas de 1 a 5 (NB1 a Nota 5). (Parcialmente modificado a partir do 25.) Esta figura foi originalmente publicado em Oftalmologia Investigativa e Ciência Visual. Catheleyne D&#39;Hondt, Raf Ponsaerts, Sangly P Srinivas, Johan Vereecke, e Bernard Himpens. Trombina inibe a propagação de ondas de cálcio intracelular em células endoteliais corneanas pela modulação de hemichannels e junções gap. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2.007. <strong&gt; 48 (1), 120-33 (2007). Oftalmologia Investigativa e Ciência Visual. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50443/50443fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig4.jpg" /> Figura 4. Mudanças significativas na propagação do intercelular Ca 2 +-ondas após o tratamento com nucleotidases exógenos (à esquerda) e com inibidores ectonucleotidases (à direita) em BCEC. A. Diminuição significativa em AA após tratamento com BCEC apyrases exógenas (apirase VI (5 U / ml) e apirase VII (5 U / ml) durante 30 min), que hidrolisam ATP e ADP, por este meio da inibição da via de comunicação intercelular parácrino (N = 7, n = 35). * Indica P &lt;0,001 comparada na presença ausência de apirase B. Aumento significativo na AA BCEC após tratamento com um inibidor selectivo ectonucleotidases ARL-67156 (ARL, 100 uM durante 30 min.), Ervoso enhancing o caminho de comunicação intercelular parácrino (N = 12, n = 60). * Indica P &lt;0,001 comparada na presença ausência de ARL. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Normalizada AA </td><td> St. erro </td><td> N </td><td> n </td><td> Estatística </td></tr><tr><td> controlar </td><td> 100 </td><td> 8.31 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td></td></tr><tr><td> siScramble </td><td> 87.97 </td><td> 9.3 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td></td></tr><tr><td> siCx43-1 </td><td> 32,45 </td><td> 8.23 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td> * </td></tr><tr><td> siCx43-2 </td><td> 35.49 </td><td> 7.06 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td> * </td></tr><tr><td> Peptídeo de controle </td><td> 91,68 </td><td> 6.5 </td><td> 8 </td><td> 40 </td><td></td></tr><tr><td> Gap 26 </td><td> 46.67 </td><td> 4.24 </td><td> 8 </td><td> 40 </td><td> * </td></tr><tr><td> Gap 27 </td><td> 53 </td><td> 4.76 </td><td> 8 </td><td> 40 </td><td> * </td></tr><tr><td> TAT-L2 </td><td> 6.99 </td><td> 0,71 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td> * </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Efeito de moléculas de siRNA segmentação Cx43, conexina péptidos miméticos e o péptido de células-permeável TAT-L2 na área activa normalizada (AA) em BCEC. N representa o número de dias de ensaios, o símbolo n representa o número de estímulos mecânicos. * Indica P &lt;0,001 em comparação com as condições de controlo. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Seqüência de AA </td></tr><tr><td> Peptídeo de controle </td><td> SRGGEKNVFIV </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Gap26 </td><td> VCYDKSFPISHVR </td></tr><tr><td> Gap27 </td><td> SRPTEKTIFII </td></tr><tr><td> TAT-L2 </td><td> YGRKKRRQRRR-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK </td></tr><tr><td> TAT-L2H126K/I130N </td><td> YGRKKRRQRRR-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK </td></tr><tr><td> 10Panx1 </td><td> WRQAAFVDSY </td></tr></tbody></table> Tabela 2. As sequências de aminoácidos dos péptidos utilizados.

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Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Ondas são conduzidos por canais de junção gap e hemichannels. Aqui, descrevemos um método para medir intercelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Ondas em monocamadas de células em resposta a um estímulo mecânico de uma única célula local e sua aplicação a investigar as propriedades e regulação dos canais de junções gap e hemichannels.

A estimulação mecânica induzida por cálcio Propagação de Ondas em monocamadas de células: O Exemplo de Bovinos endotélio corneano

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

mechanical-stimulation-induced-calcium-wave-propagation-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K visualizações.  KU Leuven. Intercelular Ca 2 +-Ondas são conduzidos por canais de junção gap e hemichannels. Aqui, descrevemos um método para medir intercelular Ca 2 +-Ondas em monocamadas de células em resposta a um estímulo mecânico de uma única célula local e sua aplicação a investigar as propriedades e regulação dos canais de junções gap e hemichannels.

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Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

Propagação de-tronco embrionárias humanas (ES) Células

Biologia

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e expansão em grande escala de Adulto Humanos endotelial Colony Células Progenitoras Forming

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endotelial Tubo celular Formação ensaio para a<em&gt; In Vitro</em&gt; Estudo da angiogênese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Medindo o Coeficiente de Permeabilidade osmótica de água (P<sub&gt; F</sub&gt;) De células esféricas: protoplastos planta isolada como um exemplo

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

O isolamento de células endoteliais de Murino Válvula

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

A quantificação da Adesividade celular endotelial<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...