Il lavoro di ricerca svolto in laboratorio è stato sostenuto da finanziamenti della Fondazione per la Ricerca - Fiandre (FWO; numeri di sovvenzione G.0545.08 e G.0298.11), il Interuniversitario attrazione polacchi Programma (Politica Scienza belga, numero di concessione P6/28 e P7/13) ed è incorporato in una comunità di ricerca FWO supportato. CDH è un borsista post-dottorato della Fondazione di Ricerca - Fiandre (FWO). Gli autori sono molto grati a tutti i membri attuali e precedenti del Laboratorio di Molecular and Cellular Signaling (KU Leuven), Dr. SP Srinivas (Indiana University School of Optometry, USA), il laboratorio del Dr. Leybaert (Ghent University) e di Dr. Vinken (VUB) che ha fornito utili discussioni, ottimizzato procedure o sono stati coinvolti nello sviluppo di strumenti per lo studio della hemichannels connessina.

1. Isolamento di cellule endoteliali corneali Prima di iniziare: Isolare le cellule dagli occhi freschi, ottenuti da un macello locale, il più presto possibile dopo enucleare l&#39;occhio. Assicurarsi che l&#39;occhio è stato enucleato da una mucca di massimi 18 mesi di età, a cinque minuti post mortem e conservate in soluzione salina bilanciata di Earle - soluzione di iodio 1% a 4 ° C per il trasporto al laboratorio. <ol><li> Prendete l&#39;occhio di soluzione salina bilanciata del Earle - soluzione di iodio 1% e metterlo in una capsula di Petri (100 x 20 mm). </li><li> Sterilizzare l&#39;occhio con una soluzione contenente 70% di etanolo e sciacquare con soluzione salina bilanciata di Earle contenente 1% di iodio. </li><li> Da questo punto in poi, lavorare in una cappa sterile. Sezionare con cura la cornea dall&#39;occhio e metterla in una piastra di Petri (35 x 10 mm) contenente soluzione salina bilanciata di Earle, con lo strato di cellule epiteliali verso l&#39;alto. Rimuovere con cautela qualsiasi residuo sti tessuto dell&#39;iridell attaccato alla cornea, se necessario. </li><li> Trasferire la cornea di soluzione salina bilanciata di Earle contenente un&#39;altra piastra di Petri con lo strato di cellule endoteliali verso l&#39;alto e lavare due volte con soluzione salina bilanciata di Earle. </li><li> Trasferire la cornea con lo strato endoteliale rivolta verso l&#39;alto ad una clessidra, che è un piatto a forma di coppa, e coprire con terreno di crescita. Il mezzo di crescita consiste Medio Dulbecco Modified Eagle contenente 25 glucosio mM, 10% di siero fetale bovino, 6,6% di L-glutammina, 2,5 ug / ml di amfotericina-B e 1% miscela antibiotico-antimicotico contenente 10.000 unità / ml di penicillina, 10.000 mcg / ml di streptomicina, e 25 ug / ml di amfotericina B. </li><li> Rimuovere il terreno con una pipetta di aspirazione. </li><li> Applicare 300 microlitri di una soluzione di tripsina (0,5 g / L) per lo strato endoteliale della cornea (tutti i passaggi che includono tripsina sono fatte utilizzando la stessa concentrazione). </li><li> Posizionare la clessidra contenente la cornea in una capsula di Petri coperta e metterlo nel incubator per 30 min a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Raschiare delicatamente le cellule endoteliali lontano dalla cornea con un incendio lucidato a gancio pipetta Pasteur di vetro in una cappa sterile. </li><li> Succhiare la soluzione contenente le cellule endoteliali ed aggiungerlo alla fiasche di coltura (25 cm 2) contenenti 4 ml di terreno di coltura. </li><li> Applicare 300 ml di terreno di crescita alla cornea e ripetere la raschiatura e aggiungere la soluzione contenente le cellule endoteliali al pallone cultura. </li><li> Ripetere questo passaggio finale (1.11) ancora una volta. </li><li> Posizionare la cultura flaconi contenenti le cellule endoteliali corneali nel mezzo di coltura in incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Dopo due giorni, aggiungere 6 ml di terreno di coltura. </li><li> Aggiornare il terreno di crescita ogni due giorni. </li></ol> 2. Colture Cellulari <ol><li> Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule due volte con soluzione salina bilanciata di Earle, quando viene raggiunta la confluenza (entro about 10 giorni dopo l&#39;isolamento). </li><li> Aggiungere 1,5 ml di soluzione di tripsina per le cellule per staccarli e mettere il pallone in incubatrice (37 ° C, 5% CO 2) per 3-4 min. </li><li> Aggiungere 12 ml di mezzo di crescita. Pipettare le medie tre volte dentro e fuori per disperdere le cellule e contare le cellule. </li><li> Seed le cellule con una frazione variabile a seconda della densità cellulare e metterle in incubatrice. Preparare due vetrini ben a camera (con una superficie di 4,2 cm 2) con una conta cellulare di 165.000 cellule (densità cellulare 39.286 per cm 2). Preparare 80 centimetri due fiasche di coltura per un nuovo passaggio ad una densità di 6.250 per cm 2, e aggiungere mezzo di coltura fresco fino ad un volume totale di 25 ml. </li><li> Aggiornare la media ogni due giorni. </li><li> Confluenza dello strato di cellule viene raggiunto dopo 3 o 4 giorni. Utilizzare le cellule per gli esperimenti. </li><li> Quando confluenza dello strato di cellule nelle beute viene raggiunto, ripetere i passaggi da 2.1 a 2.6. Colture cellulari fino al passaggio 2 può essere utilizzato fo esperimenti. </li></ol> 3. La stimolazione meccanica per indurre Saluto di calcio <ol><li> Caricare le cellule nella diapositiva camerata con 10 mM Fluo-4:00 in PBS per 30 min a 37 ° C, mentre scuotendo delicatamente. </li><li> Rimuovere il Fluo-04:00 soluzione, lavare le cellule cinque volte con tampone fosfato salino, incubare le cellule con PBS e lasciare le celle per almeno 5 minuti a temperatura ambiente prima della misurazione. </li><li> Eccitano a 488 nm con Argon laser e uso divisore di fascio 488 HFT, raccogliere l&#39;emissione di fluorescenza a 530 nm usando un filtro di emissione longpass LP 505, fissato il foro stenopeico al minimo. Utilizzare un olio di immersione obiettivo 40X (Aria, 1.2 NA). In esperimenti con ARL-67156, utilizzare un obiettivo 10X (Aria, 0.3 NA). </li><li> Ricerca di un campo in cui le cellule sono confluenti sul microscopio confocale. </li><li> Posizionare la pipetta in modo che sia a 45 ° rispetto alla slitta incamerata e toccando la membrana cellulare.Provocare un corto (≈ 1 sec) stimolazione meccanica ad una singola cella. La stimolazione meccanica consiste di una deformazione acuta, di breve durata della cella toccando brevemente meno dell&#39;1% della membrana cellulare con una micropipetta di vetro (diametro in punta &lt;1 um) accoppiato ad un cristallo piezoelettrico nanopositioner, operato tramite un amplificatore che è montato su un micro-manipolatore. Le micropipette di vetro sono realizzati con un estrattore microelettrodo. Assicurarsi che il nanopositioner è gestito da una tensione compresa tra 0,2 e 1,5 V durante la stimolazione meccanica. Una tensione superiore a 1,5 V può provocare danni alle cellule. Per ciascun tipo di cellula e condizione la tensione ottimale per la stimolazione meccanica senza danno cellulare deve essere accuratamente determinato applicando una serie di tensioni partire dal basso (0,2 V) ad alto (1,5 V) tensione. La tensione è una misura per la forza della stimolazione poiché questa tensione determina la sollecitazione meccanica e la tensione che vengono applicati alla membrana cellulare. Glivigore della stimolazione meccanica può essere calcolata moltiplicando la sollecitazione meccanica con la zona. Poiché sia l&#39;area (&lt;3,14 micron 2) e le sollecitazioni meccaniche sono molto bassi, la forza della stimolazione meccanica è basso. (Si noti che quando una cellula è danneggiata, le perdite di fluorescenza fuori della cellula e la cellula diventa scuro.) </li><li> Misurare le variazioni spaziali in [Ca 2 +] i in seguito a stimolazione meccanica con il microscopio confocale. </li><li> Raccogliere e conservare le immagini. </li><li> Disegnare una regione poligonale di interesse per definire la superficie totale di cellule responsive (area attiva, AA) usando il software del microscopio confocale. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo manoscritto, si descrive un metodo semplice per misurare intercellulare Ca 2 +-propagazione delle onde in monostrati di cellule endoteliali corneali bovina primarie, fornendo una stimolazione meccanica localizzato e controllato utilizzando una micropipetta. Cellule stimolate meccanicamente rispondono con un aumento locale della IP intracellulare 3 e Ca 2 +, che sono entrambi essenziali molecole di segnalazione intracellulare che guidano intercellulare Ca 2 +-propagazione delle onde 11,67. IP 3 viene trasferito direttamente cellule vicine tramite canali gap junction 5, mentre Ca 2 + provoca l&#39;apertura della hemichannels e la liberazione di ATP 68,69, che innesca Ca 2 + segnali in celle vicine attraverso l&#39;attivazione della proteina G accoppiata P2 recettori 37-40. Il contributo relativo dei canali gap junction e hemichannels in questo processo può essere caratterizzata dall&#39;uso di Cx-mimeticopeptidi, enzimi ATP-degradanti (ectonucleotidases) e inibitori di ectonucleotisdases. Le proprietà meccaniche di stimolazione indotta intercellulare Ca 2 +-propagazione delle onde in cellule endoteliali corneali bovina sono stati completamente caratterizzati nel nostro laboratorio 25-33. I nostri risultati indicano che la intercellulare Ca 2 +-propagazione dell&#39;onda è determinata essenzialmente da una release Cx-hemichannel mediata da ATP, con Cx43 giocare un ruolo di primo piano. Come tale, questo metodo applicato alle cellule endoteliali corneali bovina primarie è particolarmente adatto per identificare o caratterizzare la regolazione della Cx43 hemichannels a livelli endogeni nelle cellule native. Usando questo metodo, abbiamo trovato che l&#39;attività di Cx43 hemichannels è criticamente controllato dal citoscheletro actomiosina, che può servire come freno endogeno prevenire eccessivo, e quindi deleterio, Cx43 apertura hemichannel 25,31,32. Noi chiarire ulteriormente i meccanismi molecolari alla base di questo regolamento e troviamoun importante ruolo di interazioni loop / coda intramolecolari che sono essenziali per l&#39;apertura di Cx43 hemichannels 33. Chiaramente, questo sistema è molto adatto per studiare la funzione di Cx e Panx basata canali gap junction e hemichannels ed è sicuramente non limitata alle cellule endoteliali corneali bovina, ma è adattabile a qualsiasi tipo di cellula e anche i tessuti più complessi, come è stato dimostrato nel cervello dove stimolazione meccanica innescato grande intercellulare Ca 2 +-onde che comprende l&#39;intero emisfero 70. Diversi strumenti sono presenti per valutare il contributo dei canali gap junction e hemichannels, tra cui peptidi Cx-mimetici, enzimi ATP-degradanti, inibitori di ectonucleotidases e composti farmacologici come carbenossolone e 10 Panx1 (Tabella 2) 49,50. Per determinare il contributo di un certo Cx o Panx isoforma in questo processo, le sonde siRNA accuratamente progettati targeting due regioni indipendenti del mRNA e un controllo scrambled dovrebbe essere usato. L&#39;entità del knockdown dovrebbe essere determinato a livello proteico totale usando Western-blotting saggi e il livello di singola cellula usando la microscopia a fluorescenza. L&#39;efficienza di trasfezione delle sonde siRNA nei monostrati cellulari sperimentali dovrebbe essere valutata mediante microscopia a fluorescenza. Per questo, si può sviluppare una siRNA duplex in cui una etichetta fluorescente è stato incorporato alla estremità 3 &#39;del filamento senso. E &#39;importante notare che per una corretta analisi, una riduzione prominente della Cx o Panx isoforma (riduzione&gt; 90%), così come una trasfezione omogenea delle siRNA duplex in monostrato cellulare (&gt; 90% delle cellule trasfettate con siRNA sonda) dovrebbe essere ottenuto. La selettività delle sonde siRNA progettati verso l&#39;obiettivo dovrebbe essere valutata 71. In breve, questi strumenti devono essere convalidati in modo che essi non pregiudichino l&#39;espressione di altri Cx o isoforme Panx o altro com chiavenenti di guida intercellulare Ca 2 +-onde, come i recettori P2X o P2Y. Per valutare il contributo del Cx43 hemichannels, abbiamo collaborato con il laboratorio del Dr. Leybaert nello sviluppo di un peptide cellula permeabile corrispondente alla seconda metà del ciclo intracellulare di Cx43 (TAT-L2) che agisce come un selettivo, potente inibitore CX43 hemichannels mantenendo Cx43-divario di giunzione canale attività 33. Nei nostri studi, usiamo 100 mM TAT-L2 per ottenere una completa inibizione della Cx43 hemichannels, ma concentrazioni più basse possono essere sufficienti 72. TAT-L2H126K/I130N è raccomandato come un controllo negativo 73. Per valutare il contributo del Panx1 canali, il peptide 10Panx1 può essere applicata. Questi strumenti sono importanti non solo per l&#39;esclusione della membrana plasmatica interruzione (vedi sotto), ma anche per dimostrare che i paracrini ATP media la segnalazione dei meccanismi di propagazione intracellulare Ca 2 +-wave da hemichannels e non da altri meccanismi (come mcanali axi-anione o il rilascio di vescicole contenenti ATP). Infine, come per tutti gli studi utilizzando cellule primarie, le condizioni di coltura cellulare e il numero di passaggi devono essere standardizzati, come le proprietà biologiche delle cellule e quindi il profilo di espressione delle diverse isoforme Panx Cx e possono variare nel tempo 26. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi a questo metodo. Uno svantaggio principale di questo metodo è che la stimolazione meccanica può innescare membrana plasmatica perturbazione, verso l&#39;entrata di Ca 2 + extracellulare e il rilascio di molecole di segnalazione come ATP, entrambi i quali sottendono bona fide intercellulare Ca 2 +-onda di propagazione 11. Questo sicuramente complica l&#39;analisi (quantitativa) del intercellulare Ca 2 +-wave. Pertanto, si raccomanda vivamente che si dovrebbe i) utilizzare adeguati controlli, vale a dire le linee cellulari che non hanno la espressione di Cx o Panx isoforme, e gli strumenti che interfere con la funzione di Cx e Panx come canali divario di giunzione e / o hemichannels e ii) standardizzare la procedura di stimolazione meccanica (assicurarsi che durante lo stimolo meccanico il nanopositioner è azionato da una tensione compresa tra 0,5 e 2 V). Inoltre, è importante notare che questo metodo non sta in piedi da solo, ma deve essere sostenuta da approcci sperimentali complementari per studiare i canali Cx e Panx. Ciò può essere ottenuto utilizzando un aumento locale di molecole di segnalazione intracellulare che partecipano meccanico-stimolazione mediata intercellulare Ca 2 +-propagazione delle onde, come il uncaging intracellulare di IP 3 o Ca 2 + 11,74. Per avviare intercellulare Ca 2 +-wave indipendente stimolazione meccanica, si può usare micro-iniezione, come ricombinante pro-apoptotica Bax 11,75 e la foto-attivabile Ca 2 +-buffer come diazo-2 che causa una caduta locale in extracellulare [Ca 2 + </sup&gt;] 76, un trigger noto per l&#39;apertura hemichannel. In alternativa, si può usare in elettroporazione in situ di molecole di segnalazione cellulare impermeabili che scatenano intracellulare di Ca 2 +-rilascio e intercellulare Ca 2 +-onde, come IP 3 67,68. Quest&#39;ultima tecnica viene utilizzata anche per studiare la diffusione di morte cellulare 5,77. Questi stimoli non meccanici consentono una migliore valutazione della intensità dello stimolo-risposta. In aggiunta a questi metodi di propagazione Ca 2 +-onda, è importante determinare l&#39;attività dei canali Cx o Panx utilizzando altri approcci, compresa la determinazione di assorbimento di colorante idrofilo (come Lucifero giallo) 78 e il rilascio di ATP non solo in risposta alla stimolazione meccanica, ma anche in risposta a extracellulare di Ca 2 +-buffer (come dell&#39;EGTA) e Ca 2 + release molecole intracellulari (come il Ca 2 +-ionoforo A23187) 11,74. Inoltre, tegli prova migliore per la regolazione a livello del canale è fornito da esperimenti di elettrofisiologia, sia sistemi di bloccaggio a doppia tensione o clamp percorso a cellule di ovociti di Xenopus iniettati con Cx o Panx mRNA o di cellule HeLa ectopicamente esprimono isoforme Cx insieme con un marcatore come GFP 79-84. Per concludere, l&#39;uso della stimolazione meccanica per indurre intercellulare Ca 2 +-onde fornisce un metodo semplice e affidabile per indagare comunicazione intracellulare ed esaminare il contributo e le proprietà dei canali Cx e Panx.

Comunicazione e di segnalazione intercellulare sono essenziali per il coordinamento dei processi fisiologici in risposta ad agonisti extracellulari al tessuto e il livello di 1,2 intera-organo. Il modo più diretto di comunicazione intercellulare è creato dalla presenza di giunzioni. Giunzioni gap sono placche di canali gap junction, che sono i canali proteici formati da docking testa a testa di due connessine (Cx) hemichannels delle celle adiacenti 3,4 (Figura 1). Giunzioni permettono il passaggio di piccole molecole di segnalazione con un peso molecolare di meno di 1,5 kDa, comprese Ca 2 + 3 o 5 IP, causando e modulando Ca 2 +-liberazione dalle riserve intracellulari delle cellule vicine 6 (Figura 2). Canali gap junction sono strettamente regolati dalle interazioni delle proteine ​​intra-ed intermolecolari e da processi di segnalazione cellulare, come la modifica redox efosforilazione 7. GJs facilitano la risposta coordinata delle celle collegate, agendo quindi come un prodotto chimico e sincizio elettrico. Per esempio, la diffusione di potenziale cardiaco di tutti i miociti atriali e ventricolari è mediato da canali GJ Cx basate 85. Cxs non solo hanno un ruolo come canali giunzioni gap, ma anche formano hemichannels spaiati, così funzionando come canali in membrane similmente a canali ionici regolari 8-10 (Figura 1). Hemichannels partecipano segnalazione paracrina tra cellule adiacenti controllando lo scambio di ioni e molecole di segnalazione tra l&#39;ambiente intra ed extracellulare. In molti tipi di cellule (come le cellule epiteliali, cellule osteoblastiche, astrociti, cellule endoteliali, ecc) e di organi (come il cervello, il fegato, la retina, coclea e il sistema vascolare), intercellulare Ca 2 +-onde sono fondamentali per il coordinamento delle risposte pluricellulari <sup&gt; 11. Aumenti di Ca2 + intracellulare livelli in una certa cella non sono limitati a questa cella, ma propagano alle cellule vicine circostanti, stabilendo così un intercellulare Ca 2 +-wave 12,13. Questi intercellulare Ca 2 +-onde sono importanti per il normale regolazione fisiologica di strati di cellule come un sincizio e loro disregolazione è stato associato a processi fisiopatologici 11. Nel endotelio corneale e l&#39;epitelio, diversi gruppi di 14-24, compreso il nostro 25-33, hanno studiato i meccanismi ei ruoli della comunicazione intercellulare. In cellule non eccitabili, come le cellule endoteliali corneali, due distinte modalità di comunicazione intercellulare verificano 28,29, cioè gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrino. Gap giunzionale comunicazione intercellulare comporta uno scambio diretto di molecole di segnalazione tramite gap giunzioni 7. Gap giunzionecomunicazione intercellulare zionale è fondamentale per mantenere l&#39;omeostasi dei tessuti, il controllo della proliferazione cellulare, e stabilendo una risposta sincronizzata allo stress extracellulare 10,34,35. In un certo numero di patologie, gap accoppiamento giunzione è ridotta a causa di CXS difettosi, e con la presente colpisce gap giunzionale comunicazione intercellulare 36. Questo sottolinea l&#39;importanza e l&#39;influenza del gap giunzionale comunicazione intercellulare negli organismi multicellulari. In contrasto gap giunzionale comunicazione intercellulare, comunicazione intercellulare paracrina non dipende apposizione cellula-cellula, in quanto comporta il rilascio di messaggeri extracellulari diffusibili (Figura 2). Diversi tipi di molecole di segnalazione vengono rilasciati nello spazio extracellulare dalle cellule segnalazione. La molecola viene quindi trasportato alla cellula bersaglio dove viene rilevato da una proteina recettore specifico. Successivamente il complesso recettore-segnale induce una risposta cellulare, cheviene terminato dalla rimozione del segnale, inattivazione o desensibilizzazione. Usciti lipofile messaggeri di segnalazione extracellulare penetrano la membrana e agiscono sui recettori intracellulari. In contrasto, messaggeri idrofile non attraversano la membrana plasmatica della cellula rispondere, ma agiscono come un ligando che si lega a proteine ​​recettori di superficie espresse, che poi trasmettere il segnale per l&#39;ambiente intracellulare. Tre grandi famiglie di proteine ​​recettori di superficie delle cellule partecipano a questo processo: canale ionico-linked, enzyme-linked, e G-proteine ​​legate. La molecola messaggero rilasciato può agire sui recettori della stessa cella (autocrina), su cellule bersaglio in prossimità (paracrina) o su cellule bersaglio distanti che richiedono il sistema circolatorio (endocrino). In molti tipi cellulari, tra endotelio corneale 28,29, ATP è uno dei principali fattori paracrini idrofili, che guidano la propagazione di intercellulare Ca 2 +-onde 37-40. During deformazione meccanica, ipossia, infiammazione o stimolazione da vari agenti, ATP possono essere rilasciati dalle cellule sane 41-44 in risposta alle sollecitazioni di taglio, allungamento, o rigonfiamento osmotico 44,45. Meccanismi ATP-rilascio diverse sono state postulate, tra esocitosi vescicolare 44 e una pletora di meccanismi di trasporto, come ad esempio cassette (ABC) trasportatori ATP-binding, plasmalemmal canali anionici voltaggio-dipendenti, 46 canali del recettore P2X7 47,48, così come connessina hemichannels 49-52 e pannexin hemichannels 43,49,53. ATP extracellulare può essere rapidamente idrolizzato ad ADP, AMP, adenosina 54,55 da ectonucleotidases che sono presenti nell&#39;ambiente extracellulare. L&#39;ATP extracellulare rilasciato e il suo metabolita ADP 56 si diffonderanno in diffusione. La successiva interazione di questi nucleotidi con recettori purinergici nelle cellule vicine è stata implicata nella propagation di intercellulare Ca 2 +-onde 28,37,51. Due differenti classi di recettori purinergici sono presenti: adenosina è il ligando naturale principale per P1-recettori purinici, mentre sia purina (ATP, ADP) e pirimidine (UTP, UDP) nucleotidi agiscono su più recettori purinici P2-57. Comunicazione intercellulare può essere indagato con metodi diversi, come carico raschiare, il trasferimento di colore, uncaging locale di agonisti come IP 3 e Ca 2 +, la stimolazione meccanica, ecc. Qui si descrive lo studio di Ca 2 +-propagazione dell&#39;onda suscitata da stimolazione meccanica di una singola cellula. Il vantaggio di studiare Ca 2 +-propagazione delle onde di stimolazione meccanica è che fornisce un facile strumento per quantificare la diffusione del Ca 2 +-onda nel tempo e permette confrontando quantitativamente diversi pretrattamenti delle cellule. Nell&#39;endotelio corneale, questi intercellulare Ca 2 +-onde consentire un corisposta coordinata dal monostrato, con la presente in qualità di un possibile meccanismo di difesa del non-rigenerativa dell&#39;endotelio corneale aiutando l&#39;endotelio a resistere alle sollecitazioni extracellulari durante l&#39;intervento chirurgico intraoculare, o in caso di esposizione di mediatori infiammatori durante rigetto immunitario o uveite 58,59.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Column1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14155-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>38060-1EA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>11960-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine (Glutamax)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amphotericin-B</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A2942</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic-antimycotic mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>15240-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>25300-054</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14190-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4 AM</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>F14217</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A265</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VII</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two chambered glass slides</td>
 <td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td>
 <td>155380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope </td>
 <td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td>
 <td>LSM510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>P-280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HVPZT-amplifier</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>E463 HVPZT-amplifier</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td>
 <td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td>
 <td>4878</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microelectrode puller </td>
 <td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td>
 <td>WZ DMZ-Universal Puller</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells

Comunicazione intercellulare è essenziale per il coordinamento dei processi fisiologici tra le cellule in una varietà di organi e tessuti, compreso il cervello, fegato, retina, coclea e vascolare. In impostazioni sperimentali, intercellulare Ca 2 +-onde possono essere provocato applicando uno stimolo meccanico a una singola cella. Ciò conduce al rilascio delle molecole di segnalazione intracellulare IP 3 e Ca 2 + che avviare la propagazione del Ca 2 +-onda concentricamente dal cellulare stimolata meccanicamente alle cellule vicine. I principali meccanismi molecolari che controllano intercellulare Ca 2 +-propagazione dell&#39;onda sono forniti da gap canali di giunzione attraverso il trasferimento diretto di IP 3 e dal hemichannels attraverso il rilascio di ATP. Identificazione e caratterizzazione delle proprietà e la regolazione dei diversi connessina e isoforme pannexin come canali gap junction e hemichannels sono consentiti dalla quantification della diffusione del intercellulare Ca 2 +-onda, siRNA, e l&#39;uso di inibitori di canali gap junction e hemichannels. Qui, descriviamo un metodo per misurare intercellulare Ca 2 +-onda in monostrati di cellule endoteliali corneali primarie caricato con Fluo4-AM in risposta ad uno stimolo meccanico controllata e localizzata provocata da un acuto deformazione, di breve durata della cellula come risultato di toccare la membrana cellulare con una micropipetta di vetro micromanipolatore controllato con un diametro di punta di meno di 1 um. Abbiamo anche descrivono l&#39;isolamento delle specie bovina cellule endoteliali corneali primarie e il suo utilizzo come sistema modello per valutare l&#39;attività Cx43-hemichannel come la forza guidato per intercellulare Ca 2 +-onde attraverso il rilascio di ATP. Infine, si discute l&#39;uso, i vantaggi, i limiti e le alternative di questo metodo nel contesto di apertura di canale di giunzione e di ricerca hemichannel.

Tutti gli esperimenti sono eseguiti in conformità a tutte le direttive, i regolamenti e le agenzie di regolamentazione e il protocollo viene dimostrato viene eseguita sotto la guida e l&#39;approvazione della cura degli animali e del Comitato utilizzo del KU Leuven. Nelle cellule endoteliali corneali bovina (BCEC), giunzioni gap funzionali sono espresse e sia gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrine contribuiscono in modo significativo alla comunicazione intercellulare in modo interattivo, ma la via principale ha dimostrato di essere il paracrino percorso di comunicazione intercellulare mediata da ATP rilascio attraverso hemichannels Cx43 basati 28,29. ATP e ADP sono idrolizzato ad adenosina monofosfato (AMP) da parte del ectonucleotidase E-NTPD1 (ectonucleoside trifosfato difosfoidrolasi 1, CD39 ATP difosfoidrolasi), e successivamente alla adenosina dal 5&#39;-ectonucleotidase CD73 28,29. ATP e ADP contribuisconoil Ca 2 +-propagazione delle onde legandosi a recettori P2Y1 e P2Y2 28,29. Entrambi recettori coppia a PLC tramite Gq e quindi evocare IP 3-indotta Ca 2 +-rilascio (Figura 2). In BCEC, la stimolazione dei recettori purinergici P2Y provoca un rapido aumento della [Ca 2 +] i, che è insensibile alla rimozione di [Ca 2 +] o 60. [Ca 2 +] i picchi evocati da stimolazione agonista sono seguiti da un [Ca 2 +] i diminuzione che può portare a una stalla, altezza agonista-dipendente, [Ca 2 +] o-e oscillazioni oscillatorie o da un ritorno alla linea di base 60-62. In BCEC, c&#39;è stata la prova che Ca 2 +-release avviene tramite passaggio coinvolge PLC e IP 3 29. Svuotamento delle IP negozi 3-sensibili porta ad un picco iniziale di [Ca 2 +] i, successivamente seguito da un capacitative Ca 2 +-afflusso porta alla comparsa della fase di plateau 63. Stimolazione meccanica provoca un rapido aumento iniziale del Ca 2 + che ha origine dal punto della stimolazione e poi si diffonde in tutta la cellula stimolato meccanicamente. Infine, il intracellulare di Ca 2 +-livelli lentamente diminuire torna al livello di partenza. Dopo aver raggiunto i bordi delle celle, gli intercellulari Ca 2 +-onda si propaga verso le cellule circostanti vicini (NB) in modo ondulatorio come Ca 2 +-transitorio, che decade a livello basale (Figura 3). In condizioni di controllo, Ca 2 +-transitori sono stati osservati fino a circa 4-8 strati di cellule di distanza dal cellulare stimolata meccanicamente (Figura 3). Il grafico a linee (sul lato destro dei pannelli in figura 3) mostra l&#39;andamento temporale del Ca 2 +-transienti (rappresentati come valori normalizzati di fluorescenza (NF)) inla cella stimolato meccanicamente e degli strati cellulari confinanti 04:59 (NB1, NB2, NB3, NB4 e NB5). Dalla Figura 3, è chiaro che le diminuzioni di fluorescenza normalizzato, mentre il ritardo di tempo per l&#39;insorgenza di [Ca 2 +] i-aumento aumenta con l&#39;aumentare della distanza dalla cellula stimolata meccanicamente. La fluorescenza massima normalizzata nella cella stimolato meccanicamente stato raggiunto in 0,95 ± 0,04 sec. Dopo aver raggiunto un valore di fluorescenza normalizzato massimo, la fluorescenza normalizzata mostrato un calo molto graduale e lento, tornando al valore basale 152 ± 6 sec dopo l&#39;applicazione dello stimolo 25. Inibizione del pathway paracrina comunicazione intercellulare utilizzando una combinazione di esogeno apyrase VI (5 U / ml per 30 min) e apyrase VII (5 U / ml per 30 min) ha causato una diminuzione 7,5 volte nell&#39;area coperta dal Ca 2 +-wave, la cosiddetta area attiva (AA, P &lt;0.001; N = 7, N = 35) (Figura 4A). Apyrase è noto per idrolizzare ATP e ADP. Apirasi VI ha un alto rapporto ATPasi / ADPase e apirasi VII preferenzialmente idrolizza l&#39;ADP 56. Dal paracrino comunicazione intercellulare nel endotelio corneale avviene in gran parte attraverso il rilascio di ATP, 28,29 e ATP viene idrolizzato nello spazio extracellulare da ectonucleotidases, noti per essere espresso nel endotelio corneale, 29,64,65 abbiamo studiato l&#39;effetto sulla AA in condizioni dove idrolisi dell&#39;ATP è inibita usando inibitori ectonucleotidase. Inibizione di ectonucleotidases con ARL-67156 (ARL, 100 mM per 30 min) ha determinato una forte valorizzazione del Ca 2 +-propagazione dell&#39;onda, come è stato dimostrato in precedenza BCEC 25,26,28,29. L&#39;esposizione di BCEC ad ARL causato un aumento di 3,5 volte della AA rispetto alle condizioni di controllo (p &lt;0,001; N = 12, n = 60) (Figura 4B). In precedenti studi nel nostro laboratorio, connessina peptidi mimetici (Gap26 e Gap27, Tabella 2) sono stati utilizzati per distinguere i contributi relativi di gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrino per intercellulare Ca 2 +-propagazione dell&#39;onda dopo stimolazione meccanica, con un peptide inattivo ( Tabella 2) come controllo 28,29. L&#39;inibizione dei canali di giunzione gap con Gap27 diminuito significativamente la propagazione del Ca 2 +-wave in BCEC 30. L&#39;AA era significativamente ridotta su pretrattamento con Gap27 (300 mM per 30 min) (p &lt;0,001; N = 8, n = 40) 25 (Tabella 1). L&#39;inibizione della hemichannels connessina con la connessina-peptide mimetico Gap26 28,30 ridotto significativamente la propagazione del Ca 2 +-wave in BCEC 28. L&#39;AA è stato notevolmente ridotto su di pretrattamento con Gap26 (300 mM per 30 min)(P &lt;0,001; N = 8, n = 40) 25 (Tabella 1). Abbiamo anche dimostrato che l&#39;43-kDa Cx isoforma è stata una componente principale alla base del rilascio di ATP hemichannel-mediata che provoca intercellulare Ca 2 +-onde. L&#39;uso di due molecole di siRNA progettati in modo indipendente di targeting Cx43, abbiamo scoperto che la AA è stato ridotto di circa il 65% 33 (Tabella 1). Ciò è stato ulteriormente favorita da esperimenti usando TAT-L2 (100 mM, 30 min), un peptide cellula permeabile corrispondente alla seconda metà del ciclo intracellulare di Cx43 (Tabella 2), che ha provocato una riduzione importante AA (P &lt;0.001 , N = 3, n = 30) (Tabella 1). Importante, questa riduzione di AA da TAT-L2 incubazione non è stata osservata in assenza di segnalazione paracrini, sostenendo il concetto che TAT-L2 inibisce selettivamente hemichannels Cx43 basati ma non i canali giunzioni gap 33. Inoltre, un inattivo TAT-L2 mutante (TAT-L2 H126K/I130N) può essere utilizzato come controllo (Tabella 2). <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50443/50443fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig1.jpg" /> Figura 1. Formazione di canali gap junction e hemichannels: rappresentazione schematica. A. Un connessina o pannexin hemichannel si forma quando sei connessine o pannexins, che sono proteine ​​quattro domini transmembrana-contenenti, sono radialmente disposte intorno a un poro centrale. Hemichannels si trovano nella membrana plasmatica. Essi possono consistere in sottotipi di proteine ​​identiche (hemichannels omomerici) oppure possono consistere in diversi sottotipi di proteine, quando due o più isoforme sono espresse nella stessa cella (hemichannels eteromerici). Un omotipica divario canale incrocio risulta dalla docking di due omomerici identico o hemichannels eteromerici. A eterotipiche divario di giunzione risultati canale dal dlocco di due diversi canali omomerici o eteromerico. B. Struttura schematica di connessina e pannexin canali gap junction che collegano due celle e hemichannels adiacenti. (Parzialmente modificata da 66) Questo dato è stato originariamente pubblicato nel BioEssays. Catheleyne d&#39;Hondt, Raf Ponsaerts, Umberto De Smedt, Geert Bultynck, e Bernard Himpens. Pannexins, parenti lontani della famiglia connessina con specifiche funzioni cellulari. BioEssays. 2009, 31, 953-974 (2009). BioEssays. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50443/50443fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50443/50443fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig2.jpg" /> Figura 2. In cellule non eccitabili, l&#39;intercellular Ca 2 +-propagazione dell&#39;onda coinvolge sia gap giunzionale comunicazione intercellulare e la comunicazione intercellulare paracrino. Sotto stimolazione meccanica di una singola cella, un Ca 2 +-aumento si verifica nella cellula stimolato meccanicamente (MS) via Ca 2 +-afflusso e / o Ca 2 +-release. Successivamente, i Ca 2 + propaga-aumento dal meccanicamente stimolati alle cellule vicine (NB) in qualità di Ca 2 +-wave intercellulare. La propagazione intercellulare prevede due meccanismi, vale a dire la comunicazione intercellulare gap giunzionale e la comunicazione intercellulare paracrino. In gap giunzionale comunicazione intercellulare, uno scambio diretto di un mediatore (IP 3 e / o Ca 2 +) si verifica tra le citoplasma di cellule adiacenti tramite giunzioni gap (GJ). Nella comunicazione intercellulare paracrino, un messaggero (es. ATP) viene rilasciato nello spazio extracellulare, agendo quindi su recettori situati sulla °superficie e delle celle vicine. Hemichannels (HC) o altri meccanismi di mediare questo rilascio di ATP (vedi testo). Ectonucleotidases idrolizzano ATP a ADP e AMP. ATP e ADP agiscono su P2Y e / o recettori P2X sulle cellule vicine. (Tratto da 66.) Questo dato è stato originariamente pubblicato nel BioEssays. Catheleyne d&#39;Hondt, Raf Ponsaerts, Umberto De Smedt, Geert Bultynck, e Bernard Himpens. Pannexins, lontani parenti della famiglia connessina con specifiche funzioni cellulari. BioEssays. 2009. 31, 953-974 (2009). BioEssays. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig3.jpg" /> Figura 3. Calcio propagazione delle onde in condizioni di controllo nel BCEC. Stimolazione meccanica transienti di calcio indotti sono mostrati a diversi punti temporali in condizioni di controllo nel BCEC da immagini di fluorescenza pseudo-color rappresentativi. Il fluoreintensità scence prima della stimolazione sono mostrati nella prima immagine. La freccia bianca nella seconda immagine identifica il cellulare stimolata meccanicamente. L&#39;onda si propaga di calcio a sei strati di cellule vicine con una superficie totale di cellule raggiunte dall&#39;onda (area attiva: AA) di 62.870 micron 2. Il pannello di destra con i grafici lineari mostra l&#39;andamento temporale del valore normalizzato fluorescenza (NF) nella cella stimolato meccanicamente (MS) e il valore medio di NF nelle celle vicine (NB) 1 a 5 strati (NB1 a NB5). (Parzialmente modificata dal 25.) Questo dato è stato originariamente pubblicato nel Investigative Ophthalmology e Visual Science. Catheleyne d&#39;Hondt, Raf Ponsaerts, Sangly P Srinivas, Johan Vereecke, e Bernard Himpens. La trombina inibisce intercellulare propagazione delle onde di calcio nelle cellule endoteliali corneali attraverso la modulazione di hemichannels e giunzioni gap. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.. 2007. Investigative Ophthalmology e Visual Science&gt; 48 (1), 120-33 (2007).. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50443/50443fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig4.jpg" /> Figura 4. Cambiamenti significativi nella diffusione di intercellulare Ca 2 +-onde dopo il trattamento con nucleotidasi esogeni (a sinistra) e con inibitori ectonucleotidase (a destra) in BCEC. A. Significativa diminuzione AA dopo il trattamento di BCEC con apyrases esogeni (apirasi VI (5 U / ml) e apirasi VII (5 U / ml) per 30 minuti), che idrolizzano ATP e ADP, dichiara inibendo la paracrino percorso di comunicazione intercellulare (N = 7, n = 35). * Indica p &lt;0.001 in presenza vs assenza di apirasi B. Significativo aumento AA dopo il trattamento di BCEC con un inibitore selettivo ectonucleotidase ARL-67156 (ARL; 100 mM per 30 min)., Erbaceo enhancing il percorso di comunicazione intercellulare paracrino (N = 12, n = 60). * Significa p &lt;0.001 in presenza vs assenza di ARL. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Normalizzato AA </td><td> San errore </td><td> N </td><td> n </td><td> Statistiche </td></tr><tr><td> controllare </td><td> 100 </td><td> 8.31 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td></td></tr><tr><td> siScramble </td><td> 87.97 </td><td> 9.3 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td></td></tr><tr><td> siCx43-1 </td><td> 32.45 </td><td> 8.23 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td> * </td></tr><tr><td> siCx43-2 </td><td> 35.49 </td><td> 7.06 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td> * </td></tr><tr><td> Peptide di controllo </td><td> 91.68 </td><td> 6.5 </td><td> 8 </td><td> 40 </td><td></td></tr><tr><td> Gap 26 </td><td> 46.67 </td><td> 4.24 </td><td> 8 </td><td> 40 </td><td> * </td></tr><tr><td> Gap 27 </td><td> 53 </td><td> 4.76 </td><td> 8 </td><td> 40 </td><td> * </td></tr><tr><td> TAT-L2 </td><td> 6.99 </td><td> 0,71 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td> * </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Effetto di molecole di siRNA di targeting Cx43, connessina peptidi mimetici e la cellula-permeabile peptide TAT-L2 sull&#39;area attiva normalizzato (AA) in BCEC. N rappresenta il numero di giorni di esperimenti, n rappresenta il numero di stimolazioni meccaniche. * Significa p &lt;0.001 rispetto a condizioni di controllo. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> AA sequenza </td></tr><tr><td> Peptide di controllo </td><td> SRGGEKNVFIV </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Gap26 </td><td> VCYDKSFPISHVR </td></tr><tr><td> Gap27 </td><td> SRPTEKTIFII </td></tr><tr><td> TAT-L2 </td><td> YGRKKRRQRRR-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK </td></tr><tr><td> TAT-L2H126K/I130N </td><td> YGRKKRRQRRR-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK </td></tr><tr><td> 10Panx1 </td><td> WRQAAFVDSY </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Sequenze amminoacidiche dei peptidi utilizzati.

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Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

Intercellulare Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Onde sono guidati da canali gap junction e hemichannels. Qui, descriviamo un metodo per misurare intercellulare Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Onde in monostrati di cellule in risposta ad uno stimolo meccanico unicellulare locale e la sua applicazione per investigare le proprietà e la regolazione dei canali gap junction e hemichannels.

La stimolazione meccanica indotta calcio Wave Propagation in monostrati cellulari: l&#39;esempio di bovini cellule endoteliali corneali

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

mechanical-stimulation-induced-calcium-wave-propagation-cell

Nanyang Technological University

Research

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Biology

16.2K Views.  KU Leuven. Intercellulare Ca 2 +-Onde sono guidati da canali gap junction e hemichannels. Qui, descriviamo un metodo per misurare intercellulare Ca 2 +-Onde in monostrati di cellule in risposta ad uno stimolo meccanico unicellulare locale e la sua applicazione per investigare le proprietà e la regolazione dei canali gap junction e hemichannels.

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Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

Propagazione di staminali embrionali umane (ES) Cellule

Ricerca

Biologia

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolamento e di espansione su vasta scala di umano adulto cellule progenitrici endoteliali che formano colonie

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolamento di cellule endoteliali valvolare

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Valutazione del calcio Sparks in intatte fibre muscolari scheletriche

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endoteliali Tubo cellulare saggio Formazione per la<em&gt; In Vitro</em&gt; Studio di Angiogenesi

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analisi dello Stress Ossidativo in embrioni di zebrafish

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Misurare il osmotica dell&#39;acqua Permeabilità Coefficiente (P<sub&gt; F</sub&gt;) Di celle sferiche: protoplasti impianto isolato come un esempio

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...