実験室で行われる研究活動は、研究財団からの補助金によって支えられて - フランダース（FWO、助成番号G.0545.08とG.0298.11）、大学間の観光極プログラム（ベルギーの科学政策、助成番号P6/28とP7/13）とFWOでサポートされている研究コミュニティに埋め込まれています。フランダース（FWO） - CDHは研究財団の博士研究員である。著者は、分子·細胞内シグナル伝達（KUルーベン）、博士SPスリニバス（検眼、米国インディアナ大学）博士Leybaert（ゲント大学）との研究室の研究室のすべての現在および元メンバーに非常に感謝しています有用な議論を、最適化された手順やコネキシンヘミチャネルの研究のためのツールの開発に関与していたが提供博士Vinken（VUB）。

1。角膜内皮細胞の分離始める前にした場合：目をenucleating後できるだけ早く、地元の屠殺場から入手した、新鮮な目から細胞を分離します。目が最大18ヶ月、5分死後とアールの平衡塩類溶液中で保存の牛から、摘出されたことを確認してください - 4で1％ヨウ素溶液実験室への輸送のための°C。 <ol><li> 1％ヨウ素溶液をペトリ皿（100×20㎜）に置く - アールの平衡塩溶液の目を取り出します。 </li><li> 70％エタノールを含有する溶液と目を殺菌し、1％のヨウ素が含まれているアールの平衡塩類溶液で洗い流してください。 </li><li>でこの手順から、無菌フードで働く。注意深く目から角膜を解剖し、上向き上皮細胞層とアールの平衡塩類溶液を含むペトリ皿（35×10mm）で、中に入れてください。慎重に残っ虹彩組織のSTIを削除必要に応じて角膜に付着う。 </li><li>上向きの内皮細胞層とペトリ皿を含む別のアールの平衡塩類溶液に角膜を転送し、アールの平衡塩類溶液で2回すすいでください。 </li><li>カップ状の皿です砂時計に上向き内皮層と角膜を移し、増殖培地でそれをカバーしています。増殖培地は、25 mMグルコース、10％ウシ胎児血清、6.6％L-グルタミン、2.5μgの/ mlのアムホテリシン-Bと1％抗生物質 - 抗真菌剤混合物を10,000単位を含む/ mlペニシリン、10,000アンピシリンを含有するダルベッコ変法イーグル培地から成りストレプトマイシン/ mlで、25μgの/ mlのアムホテリシンBを</li><li>吸引ピペットで培地を除去。 </li><li>角膜の内皮層（トリプシンを含むすべてのステップが同じ濃度を使用して行われています）にトリプシン溶液（0.5グラム/ L）を300μlを適用します。 </li><li>覆われたペトリ皿に角膜を含む砂時計を置き、株式会社に入れ37℃で30分間ubator℃、5％CO 2。 </li><li>優しく無菌フード内火災研磨フック状のガラスパスツールピペットを用いて角膜から内皮細胞をこすり取る。 </li><li>内皮細胞を含む溶液を吸う、培養培地4mlを含有する培養フラスコ（25cm 2の ）に追加する。 </li><li>角膜に増殖培地300μlのを適用し、スクレイピングを繰り返し、培養フラスコに内皮細胞を含む溶液を追加します。 </li><li>もう一度、この最後のステップ（1.11）を繰り返します。 </li><li>培養物を配置し、37℃インキュベーター内で増殖培地℃、5％CO 2で角膜内皮細胞を含有するフラスコ。 </li><li> 2日後、培養培地を6 mlを加える。 </li><li>毎秒一日成長培地をリフレッシュします。 </li></ol> 2。細胞培養<ol><li>培地を取り出して、到達したコンフルエントアールの平衡塩類溶液、（アブー内で細胞を2回洗浄する分離後のtは10日）。 </li><li>それらをデタッチし、3〜4分間インキュベーター（37℃、5％CO 2）でフラスコを配置する細胞に1.5ミリリットルトリプシン溶液を加える。 </li><li>増殖培地12ミリリットルを追加します。細胞を分散させ、細胞をカウントするために内と外培地三回ピペット。 </li><li>シード細胞密度に応じて可変の端数を持つ細胞と培養器に入れます。 165,000細胞の細胞数（1cm 2当たりの細胞密度39286）を持つ2つのウェルチャンバースライドを（4.2 cm 2との面積を持つ）を準備します。 1cm 2当たり6,250の密度で新しい道を80 cm 2と培養フラスコを準備し、25ミリリットルの合計ボリュームに新鮮な培地を追加します。 </li><li> 2日ごとに培地をリフレッシュします。 </li><li>細胞層の密集度は、3〜4日後に到達する。実験のためにセルを使用。 </li><li>ときフラスコ内の細胞層の密集度に達している、2.6に手順2.1を繰り返します。通路2までの細胞培養物をfを用いることができるまたは実験。 </li></ol> 3。誘導カルシウムウェーブのために機械的刺激<ol><li>静かに振とうしながら10μMのFluo-4とチャンバースライドで細胞をロードするには、AMで37℃で30分間のためにリン酸緩衝生理食塩水。 </li><li>フルオ-4ソリューションAM削除、リン酸緩衝生理食塩水で細胞を5回洗って、リン酸緩衝生理食塩水で細胞をインキュベートし、測定前に室温で少なくとも5分間細胞を残す。 </li><li>アルゴンレーザーと使用ビームスプリッタHFT 488と488 nmで励起し、ロングパス発光フィルターLP 505を使用して530 nmで蛍光発光を収集するには、最低でもピンホールを設定します。油浸40X対物レンズ（エア、1.2 NA）を使用します。 ARL-67156を用いた実験では、10倍の対物レンズ（エア、0.3 NA）を使用します。 </li><li>細胞は共焦点顕微鏡に合流されているフィールドを検索します。 </li><li>それは位置チャンバースライドに対しては45°であり、細胞膜に触れるように、ピペットを。単一のセルに短い（≈1秒）機械的刺激を引き起こす。機械的な刺激が簡潔ですアンプを通して運営圧電結晶ナノポジショナに結合ガラスマイクロピペット（先端直径&lt;1μm）を持つ細胞膜の1％未満に触れることにより、細胞の急性、短期的な変形で構成されていますマイクロマニピュレータに取り付け。ガラスマイクロピペットは、微小電極プラーで作られています。ナノポジショナが機械的刺激の間に0.2〜1.5 Vの間の電圧によって運営されていることを確認してください。 1.5 V以上の電圧は、セルの損傷につながることができます。各セルタイプと条件については、細胞の損傷なし機械的刺激のための最適な電圧を慎重ハイ（1.5V）電圧（0.2 V）が低いから始まる一連の電圧を印加することによって決定されなければならない。この電圧が細胞膜に適用される機械的応力および歪みを決定するので、電圧は、刺激の力の尺度である。ザ機械的刺激の力は領域で機械的応力を掛けることによって算出することができる。領域（&lt;3.14ミクロン2）および機械的応力の両方が非常に低いので、機械的な刺激の力が低い。 （細胞が損傷したときに、セルとセルの外蛍光漏れが暗くなりますので注意してください。） </li><li>共焦点顕微鏡での[Ca 2 +] iの次の機械的な刺激の空間的な変化を測定する。 </li><li>画像を収集し、保管してください。 </li><li>共焦点顕微鏡のソフトウェアを使用して応答性の細胞（アクティブエリア、AA）の総表面積を定義するには、興味のある多角形領域を描画します。 </li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

本稿では、マイクロピペットを使用して、ローカライズされた、制御された機械的刺激を提供することにより、プライマリウシ角膜内皮細胞の単層の細胞内のCa 2 +波の伝播を測定するための簡単な方法を述べる。機械的に刺激された細胞では、細胞内のCa 2 +波伝播11,67を駆動する本質的な細胞内シグナル伝達分子である、どちらも細胞内のIP 3およびCa 2における局所増加+、で応答します。のCa 2 +ヘミチャネルの開口部とGタンパク質共役P2の活性化を介して隣接セル中のCa 2 +信号をトリガATP 68,69の放出を誘発しながらIP 3を直接、ギャップ結合チャネル5 を介して隣接セルに転送される受容37-40。このプロセスのギャップ結合チャネルとヘミチャネルの相対的な寄与は、Cxの模倣の使用によって特徴付けられるペプチド、ATP分解酵素（ectonucleotidases）とectonucleotisdasesの阻害剤。ウシ角膜内皮細胞における機械的刺激によって誘発される細胞内のCa 2 +波の伝播特性を徹底的に研究室25-33で特徴づけられている。我々の結果は、細胞内のCa 2 +波の伝播は主にCx43のが顕著な役割を果たして、ATPのCX-ヘミチャネル媒介放出によって駆動されていることを示す。このように、第一のウシ角膜内皮細胞に適用されるこの方法は、天然の細胞中の内在性のレベルでのCx43ヘミチャネルの調節を特定したり特徴付けるのに特に適している。この方法を使用して、我々は、Cx43のヘミチャネルの活性が決定的に過剰なので、有害な予防内因ブレーキとして機能することができるアクトミオシン細胞骨格によって制御されることを見出しCx43のヘミチャネル開口25,31,32ている。今後もこの規制の根底にある分子機構を解明し、見つけるCx43のヘミチャネル33の開口部に不可欠な分子内ループ/テールの相互作用の重要な役割。 明らかに、このシステムは、CxのとPanxベースのギャップ結合チャネルとヘミチャネルの機能を研究するために非常に適しており、間違いなくウシ角膜内皮細胞に限定されず、実質的に任意の細胞型、また、より複雑な組織に適用可能であるとして示されている機械的刺激が大きい細胞内のCa 2 +波全体の半球を取り囲む70の引き金と脳である。さまざまなツールは、CX-模倣ペプチド、ATP分解酵素、ectonucleotidasesと49,50カルベノキソロンと10 Panx1（ 表2）のような薬理学的化合物の阻害剤を含むギャップ結合チャネルとヘミチャネルの寄与を評価するために存在する。慎重に設計されたsiRNAのプローブ、このプロセスで特定のCxのかPanxアイソフォームの寄与を決定するために、TmRNAとスクランブル制御のargeting二つの独立した領域が使用されるべきである。ノックダウンの程度は、ウエスタンブロットアッセイ、蛍光顕微鏡を用いて単一細胞レベルを使用して、総タンパク質レベルで決定されるべきである。実験的な細胞単層におけるsiRNAのプローブのトランスフェクション効率は、蛍光顕微鏡検査によって評価されるべきである。このために、人は蛍光標識がセンス鎖の3 &#39;末端に組み込んだ二重鎖のsiRNAを開発することができる。適切な分析、CxのPanx又はアイソフォーム（&gt; 90％削減）の顕著な減少、ならびに細胞単層（内siRNA二本鎖の均一なトランスフェクション細胞の&gt; 90％がsiRNAでトランスフェクトことに留意することが重要であるプローブ）が得られるはずである。目標に向け設計されたsiRNAプローブの選択性は71を評価すべきである。要するに、これらのツールは、それらが他のCxのかPanxアイソフォームまたは他の重要なCOMの発現に影響を​​与えないように検証する必要がありますponentsはP2XやP2Y受容体のように、細胞内のCa 2 +波を駆動する。 Cx43のヘミチャネルの寄与を評価するために、我々は選択的に、強力な阻害剤として作用しCx43の（TAT-L2）の細胞内ループの後半に相当する細胞透過性ペプチドを開発する博士Leybaertの研究室と協力していますCx43のヘミチャネルCx43のギャップジャンクションチャネル活性を維持しながら、33。我々の研究では、Cx43のヘミチャネルの完全な阻害を得るために、100μMTAT-L2を使用するが、より低い濃度で十分72であってもよい。 TAT-L2H126K/I130Nをネガティブコントロール73として推奨されます。 Panx1チャネルの寄与を評価するために、10Panx1ペプチドを適用することができる。これらのツールは、（Mのような形質膜破壊（下記参照）を除外するだけでなく、ヘミチャネルではなく、他のメカニズムによってそのパラクリンATPシグナリングを仲介する細胞内のCa 2 +波の伝播のメカニズムを実証するためだけでなく、重要なAXI-アニオンチャネルやATP含有小胞の放出）。最後に、初代培養細胞を用いた全ての研究に関しては、細胞培養条件と通路の数は、細胞の生物学的特性として、標準化されなければならないため、異なるCxのとPanxアイソフォームの発現プロファイルは、時間とともに変化することができる26。 それにもかかわらず、この方法には欠点がいくつかあります。メソッドへの主要な欠点は、機械的な刺激が、細胞外のCaエントリ2 +と+波の伝播11善意の細胞間のCa 2の根底どちらもATPのようなシグナル伝達分子の放出につながる、原形質膜の混乱を引き起こす可能性がある。これは間違いなく細胞内のCa 2 +波の（定量）分析が複雑になる。したがって、それは非常に1）が適切なコントロール、CxのかPanxアイソフォームの発現を欠いすなわち細胞株、およびツールを、私を使用することが推奨されている統合ギャップ結合チャネルおよび/またはヘミチャネル及びiiとしてCxのとPanxの機能を持つrfere）は（機械的刺激中ナノポジショナが0.5と2 Vの間の電圧によって運営されていることを確認してください）​​機械的刺激の手順を標準化する。 さらに、この方法自体が立っていないことに注意することは重要ですが、CxのとPanxチャネルを研究するために、追加の実験的アプローチによって支えられなければならない。これは、細胞内のIP 3又はCa 2 + 11,74のアンケージングのように、機械的な刺激媒介性細胞間のCa 2 +波の伝播に関与細胞内シグナル伝達分子の局所的な増大を使用することによって達成することができる。機械的刺激の細胞内のCa 2 +波の独立を開始するためには、このような組換えプロアポトーシスバックス11,75と外で地元低下します+バッファジアゾ-2のような写真の活性化のCa 2として、マイクロインジェクションを使用することができます[Ca 2 +の</&gt;] 76、ヘミチャネル開口の既知のトリガー（商標）。また、人は細胞内Ca 2 +放出と細胞間をトリガーすること、細胞浸透性シグナル分子のその場でのエレクトロポレーションに使用できるのCa 2などのIP 3 67,68として+波、。後者の技術はまた、細胞死5,77の広がりを調査するために使用される。これらの非機械的刺激は、刺激強度応答のより良い評価を提供。これらのCa 2 +波伝播方法に加えて、それは（ルシファーイエロー等）の親水性染料吸収の決定を含む他のアプローチを使用して、Cxの又はPanxチャネルの活性を決定することが重要である78とATPの放出だけでなくだけでなく、細胞外のCa 2 +-バッファ（EGTAなど）と細胞内Ca 2 +放出分子（のCa 2 +イオノフォアA23187など）11,74に対応して、機械的刺激に応答。また、tを彼チャネルレベルでの調節のための最高の証拠は、異所的GFPなどのマーカーと一緒にCxのアイソフォームを発現して電気生理学的実験では、デュアル電圧クランプシステムのどちらかやCxまたはPanx mRNAと注入されたアフリカツメガエル卵母細胞のまたはHeLa細胞の全細胞パスクランプによって提供されます79-84。 結論として、細胞内のCa 2 +波を誘導するための機械的刺激の使用は、細胞内の通信を調査してCxとPanxチャネルの寄与とプロパティを調べるために、シンプルで信頼性の高い方法を提供するものである。

細胞間のコミュニケーションとシグナリングは細胞外組織におけるアゴニスト及び全臓器レベル1,2に対応して生理学的プロセスの調整のために不可欠である。細胞間コミュニケーションの最も直接的な方法は、ギャップ結合の発生によって作成されます。ギャップ結合は、隣接するセル3,4（ 図1）の2コネキシン（Cxの）ヘミチャネルの頭に頭ドッキングによって形成されたタンパク性チャネルであるギャップ結合チャネルのプラークです。ギャップ結合は、隣接セル6（ 図2）の細胞内貯蔵から引き起こし、変調のCa 2 +放出のCa 2 +又はIP 3 5を含む1.5未満キロダルトンの分子量を有する小さなシグナル伝達分子の通過を可能にする。ギャップ結合チャネルはしっかりレドックス変形例のように、内および分子間相互作用によって、タンパク質と細胞内シグナル伝達プロセスによって規制されているとリン7。 GJSは、それによって化学的および電気的合胞体として作用し、接続されたセルの協調対応を容易にします。例えば、心房および心室筋細胞全体の心筋活動電位の広がりはCxに基づくGJチャネル85によって媒介される。 CXSはギャップ結合チャネルとしての役割を持っているだけでなく、対ヘミチャネルを形成することにより、定期的なイオンチャネル8-10（ 図1）と同様に膜におけるチャネルとして機能していない。ヘミチャネルは、イントラと細胞外環境との間のイオンとシグナル伝達分子の交換を制御することにより、隣接するセル間のパラクリンシグナリングに参加しています。 多くの細胞型（上皮細胞、骨芽細胞、星状細胞、内皮細胞などのような）及び器官（脳、肝臓、網膜、蝸牛および脈管構造等）において、細胞間のCa 2 +波多細胞応答の調整のための基本となる<suP&gt; 11。特定の細胞内Ca 2 +濃度の増加は、このセルに限定されるものではなく、それによって細胞内のCa 2 +波12,13を確立し 、周囲の隣接セルに伝達されない。これらの細胞内のCa 2 +波合胞体などの細胞層の正常な生理的調節のために重要であり、それらの調節不全は、病態生理学的プロセス11と関連している。角膜内皮および上皮では、私たち自身の25-33を含む異なるグループ14-24は 、細胞間コミュニケーションの仕組みや役割を学んだ。非興奮性細胞では、角膜内皮細胞のように、細胞間コミュニケーションの二つの異なるモードが28,29、すなわちギャップ結合細胞間コミュニケーションとパラクリン細胞間のコミュニケーションを発生する。ギャップ結合細胞間コミュニケーションは、ギャップジャンクション7 を介してシグナル伝達分子の直接交換を伴う。ギャップジャンクショ​​ンtional細胞間の通信は、細胞増殖を制御し、細胞外ストレス10,34,35に同期された応答を確立し、組織の恒常性を維持するために重要である。病状の数は、ギャップ結合の結合が不完全によりCXSに減少し、これによって細胞間のギャップ結合コミュニケーション36に影響を及ぼしている。これは、多細胞生物におけるギャップ結合細胞間コミュニケーションの重要性と影響力を強調している。それは、細胞外拡散性メッセンジャー（ 図2）の放出を伴うため、ギャップ結合細胞間の通信とは対照的に、傍分泌細胞間の通信は、細胞-細胞同格に依存しない。シグナル伝達分子の異なるタイプのシグナリング細胞によって細胞外空間に放出される。分子は、それが特定の受容体タンパク質によって検出される標的細胞に輸送される。その後、受容体シグナル複合体はどの細胞応答を誘導信号、不活化又は脱感作を除去することによって終了する。リリース脂溶性の細胞外シグナル伝達の使者は膜を貫通し、細胞内の受容体に作用。対照的に、親水性の使者が応答細胞の原形質膜を通過しないが、その後、細胞内環境への信号を中継する表面発現受容体タンパク質に結合するリガンドとして作用する。細胞表面受容体タンパク質の三大家族がこのプロセスに参加：イオンチャネル連結、酵素、およびGタンパク質結合した。解放メッセンジャー分子は、近接標的細胞（パラクリン）上、または循環系（内分泌）を必要とする遠隔標的細胞に、同一セル（自己分泌）の受容体に作用することができる。 角膜内皮28,29を含む多くの細胞型において、ATPは、細胞間のCa 2 +波37-40の伝播を駆動する主要な親水性、パラクリン要因の一つである。 DURる種々の薬剤による機械的変形、低酸素症、炎症または刺激ATPは44,45を膨潤せん断応力、伸張、又は浸透圧に応答して41-44健常細胞から放出させることができる。別のATP放出メカニズムは、同様に、小胞のエキソサイトー44、例えばATP結合カセット（ABC）トランスポーター、形質膜電位依存性アニオンチャネル46、P2X7受容チャネル47,48などのトランスポートメカニズムの過多を含む、仮定されている コネキシンのヘミチャネル49-52とpannexinのヘミチャネル43,49,53。細胞外ATPはADP、AMPに急速に加水分解されると細胞外環境に存在するectonucleotidasesで54,55をアデノシンができます。細胞外に放出されたATP及びその代謝ADP 56は拡散によって広がっていく。隣接するセルでプリン受容体とこれらのヌクレオチドのその後の相互作用は、pに関与している細胞内のCa 2 +波28,37,51のropagation。プリン受容体の二つの異なるクラスが存在している：両方のプリン（ATP、ADP）とピリミジン（UTP、UDP）ヌクレオチドが最もP2-57プリン受容体に作用しながら、アデノシンは、P1-プリン受容体の主要天然リガンドである。 細胞間のコミュニケーションは、スクレープ負荷、移染、IP 3およびCa 2 +、機械的刺激、 等のようなアゴニストのローカルアンケージングなどの異なる方法で調査することができる。ここでは、+波の伝播は、単一セルの機械的刺激によって誘発されるのCa 2の研究を説明します。機械的刺激によってのCa 2 +波伝播を研究することの利点は、時間をかけてのCa 2 +波の広がりを定量化する簡単なツールを提供し、それは定量的に細胞の異なる前処理とを比較可能にすることである。角膜内皮において、これらの細胞内のCa 2 +波共同を可能にする単層からコーディネートの応答は、ここに眼内手術中に細胞外の応力に耐えられるように内皮を助ける非再生角膜内皮の可能性の防御機構として機能しているか、免疫拒絶またはブドウ膜炎58,59間に炎症性メディエーターに暴露される。

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Column1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14155-048</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>38060-1EA</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>11960-044</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>L-glutamine (Glutamax)</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>35050-038</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amphotericin-B</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A2942</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Antibiotic-antimycotic mixture</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>15240-096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trypsin</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>25300-054</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dulbecco's PBS</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>14190-091</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluo-4 AM</td>
 <td>Invitrogen-Gibco-Molecular Probes (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>F14217</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ARL-67156 (6-N,N-Diethyl-b,g-dibromomethylene-D-ATP) </td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A265</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VI</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6410</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Apyrase VII</td>
 <td>Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Germany)</td>
 <td>A6535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap26 (VCYDKSFPISHVR)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gap27 (SRPTEKTIFII)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Control Peptide (SRGGEKNVFIV)</td>
 <td>Custom peptide synthesis</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA1 Cx43 (sense: 5'GAAGGAGGAGGAACU-CAAAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA2 Cx43 (sense: 5'CAAUUCUUCCUGCCGCAAUdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>siRNA scramble: scrambled sequence of siCx43-1 (sense: 5'GGUAAACG-GAACGAGAAGAdTdT) </td>
 <td>Annealed siRNA was purchased at Eurogentec (Luik, Belgium)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2 (TAT- DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK)</td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TAT-L2-H126K/I130N (TAT-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK) </td>
 <td>Thermo Electron (Ulm, Germany)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Two chambered glass slides</td>
 <td>Laboratory-Tek Nunc (Roskilde, Denmark)</td>
 <td>155380</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Confocal microscope </td>
 <td>Carl Zeiss Meditec (Jena, Germany)</td>
 <td>LSM510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Piezoelectric crystal nanopositioner (Piezo Flexure NanoPositioner)</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>P-280</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HVPZT-amplifier</td>
 <td>PI Polytech (Karlsruhe, Germany)</td>
 <td>E463 HVPZT-amplifier</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tubes (glass replacement 3.5 nanoliter)</td>
 <td>World Precision Instruments, Inc. Sarasota, Florida, USA</td>
 <td>4878</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microelectrode puller </td>
 <td>Zeitz Instrumente (Munchen, Germany)</td>
 <td>WZ DMZ-Universal Puller</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>
 </table>

mechanical stimulation-induced calcium wave propagation in cell monolayers: the example of bovine corneal endothelial cells

細胞間のコミュニケーションは、脳、肝臓、網膜、蝸牛と血管系を含む、臓器や組織の様々な細胞間の生理学的プロセスの調整のために不可欠です。実験的な設定では、細胞内のCa 2 +波単一セルに機械的刺激を印加することによって誘発することができる。これは、細胞内シグナル伝達分子のIP 3およびCa 2のリリースにつながる+隣接セルへの機械的刺激を受けた細胞から+波同心円状のCa 2の伝播を開始すること。細胞内のCa 2 +波の伝播を制御する主要な分子経路は、IP 3の直接転送を通って、ATPの放出を通じてヘミチャネルによってギャップ結合チャネルによって提供されます。プロパティと異なるコネキシンおよびギャップ結合チャネルとヘミチャネルとしてpannexinアイソフォームの規制の同定と特徴付けはquantificatioで許可されているnは細胞内のCa 2 +波は、siRNA、およびギャップ結合チャネルとヘミチャネルの阻害剤の使用の広がり。ここでは、結果として細胞内のCa 2細胞の急性、短期的な変形によって引き起こさ制御およびローカライズされた機械的刺激に応答しFluo4-AMでロードプライマリー角膜内皮細胞の単層で+波を測定するための方法を説明1μm未満の先端径を有するマイクロマニピュレータ制御されたガラスマイクロピペットで細胞膜に触れる。また、+波ATPの放出を通じて細胞内のCa 2のための駆動力としてCx43の-ヘミチャネルの活性を評価するためのモデル系として、一次ウシ角膜内皮細胞およびその使用の単離を記述している。最後に、我々は、使用、利点、制限およびギャップ結合チャネルとヘミチャネル研究の文脈におけるこの方法の選択肢を議論する。

すべての実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制機関に準拠して実行され、実証されているプロトコルは、KUルーベンの動物のケアと使用委員会の指導と承認の下で行われる。 ウシ角膜内皮細胞（BCEC）で、機能的なギャップ結合を発現させ、ギャップ結合細胞間コミュニケーションとパラクリン細胞間通信の両方は、インタラクティブな方法で細胞間のコミュニケーションに大きく貢献するが、主な経路はによって仲介パラクリン細胞間の通信経路であることが示されているされているCx43のベースヘミチャネル28,29を通じてATP放出。 ATPとADPはectonucleotidase E-NTPD1（ectonucleoside三リン酸ジホ1、CD39 ATPジホ）により一リン酸（AMP）をアデノシンために加水分解され、その後、5&#39;-ectonucleotidase CD73 28,29によってアデノシンする。 ATPとADPはに貢献P2Y1およびP2Y2受容体28,29に結合することによりCa 2 +の波の伝播。受容体Gqを介した PLCに結 ​​合して、それによってIP呼び起こす両方3誘発性のCa 2 +放出（ 図2）。 BCEC、の[Ca 2 +] O 60の除去に鈍感であるの[Ca 2 +] iの 、の急激な増加でプリンP2Y受容体の結果の刺激で。の[Ca 2 +]アゴニスト刺激により誘発されるiのピークが安定し、アゴニスト依存標高につながることができた[Ca 2 +] iの減少が続いている、の[Ca 2 +] O依存振動変動、またはベースラインに戻り60-62。 BCECでのCa 2 +放出PLCとIP 3 29が関与する経路を介して発生したことを示す証拠があった。 IP 3敏感な店を空にするの[Ca 2 +] iの 、その後カリフォルニアに続いての最初のピークにつながるpacitativeのCa 2 +流入プラトー期63の発症につながる。 機械的な刺激のCa 2の急速な立ち上がりにつながる+刺激の点に由来して、機械的に刺激し、細胞全体に広がっている。最後に、細胞内Ca 2 +レベルゆっくりベースラインレベルに戻って減少する。セル境界に到達すると、基底レベル（ 図3）に減衰するのCa 2 +のような過渡波状に取り囲む周辺セル（NB）に細胞間のCa 2 +波伝播する。制御条件ではCa 2 + -トランジェント離れて機械的に刺激された細胞（ 図3）から約4〜8細胞層まで観察された。折れ線グラフは、（ 図3のパネルの右側）+-トランジェント（正規化された蛍光（NF）値として表される）でのCa 2の経時変化を示す機械的に刺激され、セルと隣接セル層で一から五（NB1、NB2、NB3、NB4とNB5）。 図3から、機械的に刺激された細胞からの距離が増加するとの[Ca 2 +] iの高層の増加発症しながら時間遅延、正規化された蛍光が減少することは明らかである。機械的に刺激され、セル内の最大正規蛍光が0.95に到達した±0.04秒。最大の正規化された蛍光値に到達した後、正規化された蛍光は、基底値152に戻っ±6秒刺激25を塗布した後、非常に緩やかと緩やかな減少を示した。 外因性アピラーゼVI（30分間、5 U / ml）およびアピラーゼVII（30分間、5単位/ ml）の組み合わせを使用して、傍分泌細胞間の通信経路の阻害は、Ca 2がカバーするエリア内の7.5倍の減少を引き起こし+波、いわゆるアクティブエリア（AA、P &lt;0.001、N = 7はn = 35）（ 図4A）。アピラーゼは、ATPとADPを加水分解することが知られている。アピラーゼVIは高いATPアーゼ/ ADPase比とアピラーゼVII優先的に加水分解するADP 56を持っています。 角膜内皮におけるパラクリン細胞間コミュニケーションは、主にATP放出を介して行われて以来、28,29とATPは細胞外空間に加水分解される角膜内皮に発現することが知らectonucleotidases、29,64,65によって、我々の条件にAAへの影響を調べたここで、ATP加水分解はectonucleotidaseインヒビターを用いて抑制される。 ARL-67156（ARL、30分間、100μM）とectonucleotidasesの阻害はBCEC 25,26,28,29で既に実証されているように、Ca 2 +の波伝播の強力な増強をもたらした。 （ 図4B）、ARLにBCECの曝露は、条件（N = 12、N = 60、P &lt;0.001）を制御するために比較してAAの3.5倍の増加を引き起こした。 前で我々の研究室でvious研究、コネキシン模倣ペプチド（Gap26とGap27、 表2）不活性なペプチドで、機械的刺激に続く細胞内のCa 2 +波の伝播にギャップ結合細胞間コミュニケーションとパラクリン間コミュニケーションの相対的な寄与を区別するために使用された（対照28,29 表2）。 Gap27とギャップ結合チャネルの阻害はかなり+波BCEC 30中のCa 2の伝播を減少させた。 AAが著しくGap27（30分間、300μM）で前処理により減少した（P &lt;0.001、N = 8、N = 40）25（ 表1）。コネキシン模倣ペプチドとコネキシンヘミチャネルの阻害Gap26 28,30が大幅BCEC 28中のCa 2 +波の伝播を減少させた。 AAが大幅Gap26（30分間300μM）で前処理により減少した（P &lt;0.001、N = 8、N = 40）25（ 表1）。 また、43 kDaのCxのアイソフォームは細胞内のCa 2 +波を誘発ヘミチャネル媒介ATP放出の基礎となる主要なコンポーネントであることを示した。 Cx43のを対象とした2独立に設計されたsiRNA分子を用いて、AAが約65％33（ 表1）減少したことがわかった。これは、さらにAA（P &lt;0.001で大きな減少を引き起こしたTAT-L2（100μM、30分）、Cx43のの細胞内ループ（ 表2）の後半に相当する細胞透過性ペプチドを用いた実験によって支えられていた; N = 3、N = 30）（ 表1）。重要なことに、TAT-L2のインキュベーションによるAAのこの減少は、TAT-L2を選択的Cx43のベースヘミチャネルではなく、ギャップ結合チャネル33を阻害するという概念を支 ​​持し、傍分泌シグナル伝達の非存在下で観察されなかった。さらに、不活性なTAT-L2変異体（TAT-L2 H126K/I130N）は、制御（ 表2）として使用することができる。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50443/50443fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig1.jpg" /> 図1。概略図：ギャップ結合チャネルとヘミチャネルの形成。四膜貫通ドメイン含有タンパク質である6コネキシンまたはpannexinsが、放射状に中央の孔の周りに配置されたとき。A.コネキシンまたはpannexinヘミチャネルが形成されているヘミチャネルは、形質膜に配置されています。彼らは、同一のタンパク質サブタイプ（ホモメリックヘミチャネル）で構成することができますまたはそれらは二つ以上のアイソフォームは、同じセル（ヘテロヘミチャネル）で表され異なるタンパク質サブタイプから構成されます。二つの同一ホモメリックまたはヘテロヘミチャネルのドッキングから同型ギャップ結合チャネル結果。 Dからの異ギャップ結合チャネル結果二つの異なるホモメリックまたはヘテロチャネルのocking。二つの隣接するセルとヘミチャネルを接続するコネキシンとpannexinギャップ結合チャネルのB.概略構造。 （部分的に66から変更） この図はもともとBioEssaysに掲載されました。 Catheleyneドント、Smedt、ヘアートBultynck、とバーナードHimpensますDeハンバートラフPonsaerts、。 Pannexins、特定の細胞の機能を持つコネキシン家族の遠い親戚。BioEssays、2009、31、953から974（2009）。BioEssaysは <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50443/50443fig1large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50443/50443fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig2.jpg" /> 図2。非興奮性細胞では、内tercellularのCa 2 +波の伝播は、ギャップ結合細胞間コミュニケーションとパラクリン細胞間通信の両方が含まれます。単一セル、のCa 2の機械的刺激により+-上昇が機械的に刺激され、細胞内に発生した（MS）のCa 2 を介して +流入および/ ​​またはCa 2 +の放出。その後、からのCa 2 +の上昇が伝播は、機械的に細胞内のCa 2 +波として隣接セル（NB）に刺激した。細胞間伝播には2つのメカニズム、すなわちギャップ結合細胞間コミュニケーションとパラクリン細胞間のコミュニケーションを必要とする。ギャップ結合細胞間通信では、仲介者の直接交換（IP 3及び/又はCa 2 +）は、ギャップジャンクション（GJS） を介して隣接する細胞の細胞質の間で発生します。パラクリン細胞間通信では、メッセンジャー（ 例えば ATP）は、それによって、目の上にある受容体に作用して、細胞外空間に放出される隣接セルの電子表面。ヘミチャネル（HCS）または他のメカニズムは、（テキストを参照）は、このATP放出を媒介する。 ADPとAMPへEctonucleotidases加水分解ATP。 ATPとADP行為P2Y上および/または隣接セルにP2X受容体。 （66から撮影。） この図はもともとBioEssaysに掲載されました。 Catheleyneドント、Smedt、ヘアートBultynck、とバーナードHimpensますDeハンバートラフPonsaerts、。 Pannexins、特定の細胞の機能を持つコネキシンファミリーの遠い親戚。BioEssays。2009 31、953から974（2009）。BioEssays。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig3.jpg" /> 図3。 BCECにおける制御条件におけるカルシウム波伝播。機械刺激誘発性カルシウムトランジェントは代表的な疑似色の蛍光画像によってBCECにおける制御条件における異なる時間点で示されています。 fluore刺激前scence強度を最初の画像に表示されます。第二の画像に白い矢印は、機械的に刺激され、細胞を識別します。 62870μmの2：カルシウム波波（AAアクティブエリア）によって到達セルの総面積は6隣接セル層に伝播します。 折れ線グラフは、右側のパネルは機械的に刺激された細胞（MS）及び隣接細胞（NB）の層1〜5（NB1にNB5）におけるNFの平均値で正規化された蛍光値（NF）の経時変化を示している。 （部分的に25から変更しました。） この図は、もともと調 ​​査眼科と視覚科学に掲載されました。 Catheleyneドント、ラフPonsaerts、Sangly Pスリニバス、ヨハンVereecke、とバーナードHimpens。トロンビンは、ヘミチャネルおよびギャップ結合の変調によって角膜内皮細胞における細胞内カルシウム波の伝播を抑制する。 投資。 Ophthalmol。ヴィス。 SCI、2007。 <stroNG&gt; 48（1）、120から33（2007）。 調査眼科と視覚科学 。 <img alt="図4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50443/50443fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50443/50443fig4.jpg" /> 図4。 +波外因nucleotidases（左）と治療後とBCECでectonucleotidase阻害剤（右）との細胞間のCa 2スプレッドの大幅な変更。 ATPとADPに加水分解外因apyrases（アピラーゼVI（5 U / ml）およびアピラーゼVII（5 U / ml）を30分間）とBCECの治療後のAAでA.大幅な減少、ここ阻害パラクリン細胞間の通信経路（N = 7はn = 35）。 *アピラーゼの存在対不在でP &lt;0.001を意味選択ectonucleotidase阻害剤ARL-67156（ARL、30分間100μM）とBCECの治療後のAAでB.大幅に増加。、草本enhancinはgのパラクリン細胞間通信経路（N = 12、N = 60）。 * ARLの存在対不在でP &lt;0.001を意味します。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> 正規化されたAA </td><td> 聖エラー </td><td> N </td><td> N </td><td> 統計 </td></tr><tr><td> コントロール </td><td> 100 </td><td> 8.31 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td></td></tr><tr><td> siScramble </td><td> 87.97 </td><td> 9.3 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td></td></tr><tr><td> siCx43-1 </td><td> 32.45 </td><td> 8.23 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td> * </td></tr><tr><td> siCx43-2 </td><td> 35.49 </td><td> 7.06 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td> * </td></tr><tr><td> コントロールペプチド </td><td> 91.68 </td><td> 6.5 </td><td> 8 </td><td> 40 </td><td></td></tr><tr><td> ギャップ26 </td><td> 46.​​67 </td><td> 4.24 </td><td> 8 </td><td> 40 </td><td> * </td></tr><tr><td> ギャップ27 </td><td> 53 </td><td> 4.76 </td><td> 8 </td><td> 40 </td><td> * </td></tr><tr><td> TAT-L2 </td><td> 6.99 </td><td> 0.71 </td><td> 3 </td><td> 30 </td><td> * </td></tr></tbody></table> 表1。 BCECで正規化されたアクティブエリア（AA）にCx43のを標的とするsiRNA分子、コネキシン模倣ペプチドと細胞透過性ペプチドTAT-L2の効果。 Nは、実験の日数を表し、nは機械的な刺激の数を表す。 *制御条件に比べてP &lt;0.001を意味します。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> AAシーケンス </td></tr><tr><td>コントロールペプチド</td><td> SRGGEKNVFIV </td></tr> &lt;TR&gt; <td> Gap26 </td><td> VCYDKSFPISHVR </td></tr><tr><td> Gap27 </td><td> SRPTEKTIFII </td></tr><tr><td> TAT-L2 </td><td> YGRKKRRQRRR-DGANVDMHLKQIEIKKFKYGIEEHGK </td></tr><tr><td> TAT-L2H126K/I130N </td><td> YGRKKRRQRRR-DGANVDMKLKQNEIKKFKYGIEEHGK </td></tr><tr><td> 10Panx1 </td><td> WRQAAFVDSY </td></tr></tbody></table> 表2。使用されるペプチドのアミノ酸配列。

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Mechanical Stimulation-induced Calcium Wave Propagation in Cell Monolayers: The Example of Bovine Corneal Endothelial Cells

細胞間のCa<sup&gt; 2 +</sup&gt;波は、ギャップ結合チャネルとヘミチャネルによって駆動される。ここでは、細胞間のCaを測定するための方法を説明<sup&gt; 2 +</supローカル単細胞機械的刺激とプロパティとギャップ結合チャネルとヘミチャネルの規制を調査するために、そのアプリケーションに応じて、細胞単層で&gt;波。

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

Intercellular communication is essential for the coordination of physiological processes between cells in a variety of organs and tissues, including the ...

mechanical-stimulation-induced-calcium-wave-propagation-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K ビュー.  KU Leuven. 細胞間のCa 2 +波は、ギャップ結合チャネルとヘミチャネルによって駆動される。ここでは、細胞間のCaを測定するための方法を説明 2 +波。

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Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

ヒト胚性幹（ES）細胞の増殖

生物学

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

弁内皮細胞の単離

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

のための内皮細胞チューブ形成アッセイ<em&gt;体外</em&gt;血管新生に関する研究

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

浸透水透過係数（Pの測定<sub&gt; F</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

ネズミ弁内皮細胞の単離

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

内皮細胞接着性の定量<em&gt;インビトロ</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...