Metillenmiş DNA Immunoprecipitation

Bu video metillenmiş DNA immunoprecipitation (MeDIP) için protokol göstermektedir. MeDIP seçici (anti-5 mC) 5-methylcytosine özgüllüğü antikorlar kullanılarak genomik DNA örneği metillenmiş DNA parçaları ayıklar iki günlük bir işlemdir.

DNA metilasyon paternlerinin belirlenmesi epigenetik çalışma metilasyon gen ekspresyonu üzerinde önemli etkileri olduğu bilindiği gibi, ortak bir prosedür ve hastalığın yanı sıra normal gelişimi ile ilgili

DNA EKSTRAKSİYON VE ÖRNEK HAZIRLAMA

Farklı örnekleri çeşitli DNA (kültür hücreleri, taze yanı formalin ile fikse parafine gömülü dokularda dondurulmuş) MeDIP için kullanılabilir. Yüksek derecede saflaştırılmış DNA, histon gibi ilişkili proteinlerin olmadan kullanmak önemlidir. DNA kantitatif ve antikor bağlanma ile müdahale örnek olarak, mümkün olduğunca çok RNA kaldırmak için de önemlidir. MeDIP için kullanılan DNA miktar 200 ng kullanılabilir DNA miktarına bağlı olarak 1 mg arasında olabilir. Bu protokol göstermek için, 1 mg DNA kullanılır. Aşağıdaki protokol kültürlü hücreler yüksek kaliteli çift iplikli DNA sağlayacaktır. Diğer protokoller, diğer örnek türlerinin DNA ekstraksiyonu için istihdam edilmelidir.

1. 1.7 ml Eppendorf tüp bir hücre pelet sindirim tampon 400 ul ekleyin.
2. Tüp proteinaz K 100 mikrogram ve 50 gece inkübe ° C
3. 500 ul fenol pH 7 ekleyin ve alt üst edilerek yavaşça ama iyice karıştırın.
4. Oda sıcaklığında 10 dakika için 13 000 g Spin.
5. Yeni bir tüp sulu (üst) kesir çıkarın.
6. Tekrar bir kez 3 ile 5 arasındaki adımları.
7. 500 ul 01:01 fenol / kloroform pH 7 ekleyin ve alt üst edilerek yavaşça ama iyice karıştırın.
8. Oda sıcaklığında 10 dakika için 13 000 g Spin.
9. Yeni bir tüp sulu (üst) kesir çıkarın.
10. RNaz A 40 mikrogram ekleyin ve 37 az 1 saat inkübe ° C.
11. 500 ul fenol pH 7 ekleyin ve alt üst edilerek yavaşça ama iyice karıştırın.
12. Oda sıcaklığında 10 dakika için 13 000 g Spin.
13. Yeni bir tüp sulu (üst) kesir çıkarın.
14. Tekrar bir kez, 13 üzerinden 11 Adımlar.
15. 500 ul 01:01 fenol / kloroform pH 7 ekleyin ve alt üst edilerek yavaşça ama iyice karıştırın.
16. Oda sıcaklığında 10 dakika için 13 000 g Spin.
17. Yeni bir tüp sulu (üst) kesir çıkarın.
18. 1/10th hacim 3 M sodyum asetat (40 ul) ekleyin ve iyice karıştırın.
19. % 100 etanol 2 cilt (900 ul) -20 ° C'de, 20 dakika boyunca iyice karıştırın ve yer.
20. 20 dakika için 13 000 gr az Spin 4 ° C
21. , Etanol çıkarın darbe spin ve artık etanol çıkarın.
22. Yıkamak için 500 ul soğuk% 70 etanol ekleyin. 20 dakika için 13 000 gr az Spin 4 ° C
23. % 70 etanol çıkarın darbe spin ve pipetleme kalan etanol kaldırmak.
24. Hava pelet kalan etanol tüm izlerini silmek için oda sıcaklığında 10 dakika açık kapak ile kurulayın.
25. 4 gecede sterilize dH2O 50 ul yeniden süspanse DNA ° C
26. NanoDrop Spektrofotometre ile DNA kantitatif olarak tanımlanmaktadır. A _260: 1.8 ₂₈₀ oranı idealdir.
27. 100 baz puan (bp) merdiven ile bir agaroz jel üzerinde DNA kalitesi ve boyut aralığı belirleyin. SYBR Altın gibi DNA az miktarda son derece duyarlı bir boya ile boyanarak az 10 ng genomik DNA,% 1.7 agaroz jel üzerinde çalıştırılabilir.
28. Başına bir örnek silikonlu tüp, steril dH ₂ O hacmi kalan 50 ul toplam hacmi 1 mg DNA hazırlamak

DNA Sonikasyon

DNA sonication ve MeDIP protokol tüp duvarları olmayan belirli bağlayıcı proteinlerin önlemek için siliconzied tüpler yapılmalıdır. DNA örnekleri için en uygun sonication kez jel elektroforezi (Adım 27) belirlenen DNA örneği parçalanma derecesine dayanır. Örneğin, kültürlü hücrelerinden çıkarılan DNA, çok yüksek molekül ağırlığı olmalı ve daha sonra genellikle kısmen bozulmuş arşiv örneklerden çıkarılan DNA daha fazla sonication gerekecektir. Örnekleri düzgün yüksek molekül ağırlığı varsa, tek tek her bir numune kontrol etmeden bu protokolü olarak açıklanan sonication ile devam etmek için bu noktada mantıklı. Örnekleri arşiv örnekleri ile parçalanmış iseniz, 300 100bp parçaları elde etmek için sonication kez azaltarak muhtemel sonication prosedürü uyum için gerekli olacaktır. Kısmen bozulmuş, sonication parametreleri optimizasyonu ilgi temsil eden bir örneklem üzerinde yapılan numunelerde süreci bekliyoruz. Jel elektroforezi (Adım 27) gözlenen DNA parçalanma derecesine göre, deneyci örnek için en uygun sonication zaman önceden hesaplamak. Burada yüksek molekül ağırlıklı DNA kullanılarak otomatik bir sonicating cihazı (Diagenode gelen Bioruptor, UCD-200 TM) ile sonication 300-1000 bp DNA parçalarının elde etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

1. Biorupter içinde su, 4 ° C olması gerekir
2. Otomatik ayarları 7 dakika (30 sn 30 sn maksimum güç kapalı) sonikasyon.
3. Silikonlu 1.7 ml santrifüj tüpüne immunoprecipitation (IP) reaksiyonu için sonicated ürün ve yeri (40 ul) 800 ng çıkarın.
4. Girdi olarak hizmet kalan 200 ng (10 ul) () (4 mağaza ° C) referans DNA kenara koyun.

Metillenmiş DNA OF IMMUNOPRECIPITATON

1. 95 ° C'de su banyosunda 10 dakika süreyle IP reaksiyonu (800 ng) için kullanılacak olan DNA denatüre.
2. Hemen buz üzerinde soğutun. Sonraki adıma geçmeden önce (yaklaşık 5 dakika buz üzerinde) tamamen DNA soğumasını bekleyin.
3. 5 mikrogram monoklonal antikor ekleyin.
4. IP tampon (Bu protokol boyunca oda sıcaklığında) 500 ul nihai hacmi ekleyin.
5. Tüp tutucu dönen 2 saat 4 ° C'de inkübe edin.
6. 5. adımı tamamlandıktan hemen önce, yıkama (Adımlar 6-11) Dynabeads hazırlar. Öncelikle, iyice karıştırın tarafından flakon boncuk tekrar süspansiyon haline getirin.
7. Yeni silikonlu bir tüp içine (örneğin, 8 reaksiyon yaparsa, 9, yani 270 ul için yeterli boncuk kaldırmak), 30 ul reaksiyon başına yeniden süspanse Dynabeads artı 1 (~ 2 x 10 ⁷⁾ aktarın.
8. Oda sıcaklığında 2 dakika manyetik raf tüp yerleştirin.
9. Süpernatantı Pipet. Süpernatant çıkarırken, pipet ucu ile iç duvar (mıknatıs boncuk çekmek) karşı boncuk dokunmaktan kaçının.
10. Mıknatıs tüp çıkarın, boncuklar ve IP tampon aşırı miktarda (750-1000 ul ul) tekrar süspansiyon haline getirin. Oda sıcaklığında 2 dakika geri manyetik raf tüp yerleştirin.
11. Yıkama bir kez daha tekrarlayın ve sonra Adım 7 kaldırıldı orijinal hacminin IP tampon yıkanmış boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin.
12. Her IP reaksiyon yıkanmış Dynabeads 30 ul ekle
13. 2 saat için dönen bir tüp tutucu inkübe 4 ° C
14. Inkübasyon tamamlandıktan sonra, oda sıcaklığında 2 dakika manyetik rafa yerleştirilir.
15. Süpernatantı Pipet. Pipet ucu ile tüpün iç duvarına (mıknatıs boncuk çekmek) dokunmaktan kaçının. IP tampon 500 ul ekleyin. Tüp içindekileri karıştırın ve 2 dakika için manyetik rafa geri koymak. 500 ul IP tampon bir kez yıkayın tekrarlayın.
16. Son yıkama süpernatantı çıkardıktan sonra, sindirim tampon 400 ul boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin.
17. Proteinaz K 100 mikrogram ile reaksiyon davranın ve 50 gece inkübe ° C

IMMUNOPRECIPITATED DNA SAFLAŞTIRMA

1. 500 ul 01:01 fenol / kloroform pH 7 ve iyice vorteks ekleyin.
2. Oda sıcaklığında 10 dakika için 13 000 g Spin.
3. Yeni bir tüp sulu (üst) kesir çıkarın.
4. Sulu ve organik katmanları arasında interfaz bulutlu görünürse, 1 ile 3 arasındaki adımları tekrarlayın.
5. 1 / 10 hacim 3 M sodyum asetat (40 ul) ve vorteks ekleyin.
6. 1 glikojen ul (20 mg / ml) ve vorteks ekleyin.
7. % 100 etanol, girdap ve -20 ° C'de 20 dakika yerine 2 cilt (1000 ul) ekleyin.
8. 20 dakika için 13 000 gr az Spin 4 ° C
9. , Etanol çıkarın darbe spin ve artık etanol çıkarın.
10. Yıkamak için 500 ul soğuk% 70 etanol ekleyin. 4. 20 dakika boyunca 13 000 g Vortex kısaca, ve spin ° C
11. % 70 etanol çıkarın darbe spin ve pipetleme kalan etanol kaldırmak.
12. Hava pelet kalan etanol tüm izlerini silmek için oda sıcaklığında 10 dakika açık kapak ile kurulayın.
13. 10 ul yeniden süspanse DNA pelet dH ₂ 0 sterilize edilmelidir.

PCR ile doğrulama

1. MeDIP prosedürü kullanarak, normal bir insan DNA (erkek veya kadın) MeDIP protokol yaparak çalışma, metilasyon için zenginleştirilmiş olarak bilinen bir bölge ve daha sonra assaying olduğundan emin olmak için test edebilir.
2. PCR tüp MeDIP ürünün% 30, ve başka bir PCR tüpüne, MeDIP ürünün başka bir% 30 çıkarın.
3. DNA'nın PCR tüp içine 10 ng ve 10 ng DNA'nın başka bir PCR tüpünün içine koyun. Artık dört ayrı PCR reaksiyonları kurmak olmalıdır.
4. Tablo 1'de belirtildiği gibi PCR H19 ve CTRL primerleri kullanarak gerçekleştirin.
5. Tablo 2'de belirtildiği gibi 12.5 ul toplam hacmi ile PCR reaksiyonlar için iki mastermixes (her astar kümesi için biri) hazırlayın.
6. Thermocycle PCR Tablo 3'te belirtilen şartlara.
7. PCR ürünlerinin görünüm için% 2'lik agaroz jel üzerinde 5 ul çalıştırın.
8. Başarılı MeDIP için beklenen sonuçlar Tablo 4'te gösterilmiştir.

Tablolar

Tablo 1: H19 ve PCR doğrulama için CTRL primerleri.

Tablo 2. PCR reaksiyonları için Mastermixes.

Tablo 3. PCR thermocyling.

Tablo 4. Beklenen başarılı MeDIP PCR sonuçları.

Hastalığında önemli rol DNA metilasyon oynar büyüyen bir farkındalık vardır, bu nedenle testlerin geliştirilmesi, bu değişikliği ^{ölçmek için 13, 12,} 3 giderek daha önemli hale gelmektedir. MeDIP teknik tüm genomu ve lokus spesifik seviyesi ^{6, 7,} tarama için bir mükellef araçtır . Bu teknik, DNA başlayan sınırlı miktarda kullanarak DNA metilasyon seviyelerini hızlı bir görünüm sağlar ve farklı kaynaklardan arasında kolay karşılaştırma için sağlar. MeDIP ürün kullanarak Downstream uygulamalar tüm genom ve CpG ada oligonükleotid dizileri, faiz lokusların için PCR testi, yanı sıra, sıralama gibi microarrays bir yelpazede yer alıyor.

MeDIP, metillenmiş ^DNA 6 unmethylated ayırt etmek için antikorlar dayanmaktadır DNA metilasyon tespiti için farklı bir yaklaşım sağlar . MeDIP, geleneksel bisülfit sıralama yaklaşımlara göre daha hızlı ve restriksiyon enzimi analizi gibi özel dizilerinin analizi ile sınırlı olmasa da, immunoprecipitation CpG yoğunluğu, tekrarlayan eleman varlığı ve kompozisyon da dahil olmak üzere DNA dizisi bağımlı olacaktır. Böylece, uygun kontroller, her deneyde olduğu gibi, MeDIP sonuçlarının analizi ve yorumlanması önemlidir.

Ekstra bakım alınmalıdır MeDIP tekniği boyunca çeşitli adımlar vardır. Bunlar: silikonlu tüpler tüp duvarları non-spesifik DNA bağlama önlemek için kullanılması; sonication sonra DNA yeterli parçalanma sağlanması ve DNA'nın sağlanması tamamen denatüre. Ayrıca, sınırlı bir miktarda malzeme ve DNA miktarı, böyle bir spektrofotometri olarak tahmin etmek için pek çok ortak teknikler var, çünkü tek telli MeDIP ürün ölçümü zor olabilir, çift iplikli DNA ile daha iyi çalışır. Ayrıca, özellikle fenol gibi yakıcı maddeler kullanıldığı zaman, her zaman uygun laboratuvar güvenliği uygulamaları gözlemlemek önemlidir.

MeDIP tekniği de birkaç adım modifiye edilebilir. Önemlisi protokol sınırlı örneklem büyüklüğü ile artan verim veya çalışma izin veya aşağı yukarı ölçekli olabilir. Restriksiyon enzim kullanımı (örneğin Alu I sindirim) gibi alternatif bir parçalanma yaklaşım, ekipman ihtiyaçlarını azaltır, aynı zamanda potansiyel DNA bazı bölgelerde aşağı çekme sınırlayıcı önyargıları tanıtmak. Herhangi bir yaklaşım olduğu gibi, sonuçlar en iyi DNA metilasyon algılama ^{1, 14} için alternatif bir yaklaşım kullanılarak doğrulanır.

Biz, bu video ve makale eleştirmeyi katılımları için Brown ve Lam laboratuvarları üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma ve Michael Smith Sağlık Araştırma Vakfı Enstitüsü'nün fonları tarafından desteklenmiştir.