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* Estes autores contribuíram igualmente
Este vídeo demonstra o protocolo para imunoprecipitação DNA metilado (MEDIP). MEDIP é um procedimento dois dias que, seletivamente, extratos de fragmentos de DNA metilado partir de uma amostra do DNA genômico utilizando anticorpos com especificidade para 5-metilcitosina (anti-5 mC).
A identificação de padrões de metilação do DNA é um procedimento comum no estudo da epigenética, como a metilação é conhecido por ter efeitos significativos sobre a expressão gênica, e está envolvida com desenvolvimento normal, bem como doença
EXTRAÇÃO DE DNA E PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
DNA de uma variedade de diferentes amostras (células cultivadas fresca, congelada, bem como tecidos fixados em formalina incluído em parafina) podem ser usados para MEDIP. É importante o uso de DNA altamente purificado, sem proteínas associadas, tais como histonas. Também é importante para remover RNA, tanto quanto possível a partir da amostra, como ele pode interferir tanto com a quantificação de DNA e ligação aos anticorpos. A quantidade de DNA usado para MEDIP pode variar de 200 ng de 1 mg, dependendo da quantidade de DNA disponíveis. Para demonstrar este protocolo, 1 mg de DNA será usado. O seguinte protocolo irá proporcionar alta qualidade do DNA fita dupla a partir de células cultivadas. Outros protocolos devem ser empregados para a extração de DNA de tipos de amostra outro.
DNA sonicação
DNA sonicação eo protocolo MEDIP deve ser realizada em tubos siliconzied para evitar a ligação específica de proteínas não às paredes do tubo. Vezes sonicação ideal para as amostras de DNA são baseados no grau de fragmentação da amostra de DNA determinado a partir de eletroforese em gel (Passo 27). Por exemplo, o DNA extraído de células em cultura deve ser de muito alto peso molecular, e, posteriormente, exigir mais do que sonicação DNA extraído de amostras de arquivo que são muitas vezes parcialmente degradada. Se as amostras são de uniformemente elevado peso molecular, é razoável neste momento a proceder à sonicação, conforme descrito neste protocolo sem verificar cada amostra individualmente. Se as amostras são fragmentados com amostras de arquivo, será necessário adaptar o procedimento de sonicação provavelmente por diminuir os tempos de sonicação para obter 300-100bp fragmentos. Se você esperar para processar as amostras que são parcialmente degradadas, otimização de parâmetros de sonicação pode ser realizada em uma amostra representativa daqueles de interesse. Com base no grau de fragmentação do DNA observados de eletroforese em gel (Passo 27), o experimentador pode predeterminar o tempo de sonicação ideal para a amostra. Aqui nós descrevemos um método para obter 300-1000 fragmentos de DNA bp por sonicação com um dispositivo automatizado sonicando (Bioruptor de Diagenode, UCD-200 TM) usando DNA de alto peso molecular.
IMMUNOPRECIPITATON de DNA metilado
PURIFICAÇÃO DE DNA IMMUNOPRECIPITATED
Validação por PCR
Tabelas
Tabela 1: H19 e CTRL primers para a validação de PCR.
Definir Primer | Primer para a frente | Primer reverso | Tamanho do produto antecipado |
H19 | H19_F 5'-cgagtgtgcgtgagtgtgag | H19_R 5'-ggcgtaatggaatgcttgaa | 174 bp |
CTRL (controle) | CTRL_F5'-gagagcattagggcagacaaa | CTRL_R 5'-gttcctcagacagccacattt | 139 bp |
Tabela 2. Mastermixes para as reações PCR.
H19 Mix (por Rxn) | CTRL Mix (por Rxn) | |
2 O DDH | 6,875 | 6,875 |
Tampão 10X | 1,25 | 1,25 |
dNTP mix (10 mM cada) | 0,25 | 0,25 |
MgCl 2 (50 mM) | 0,25 | 0,25 |
Primers (H19_F / R ou CTRL_F / R) (10 mM cada F / R) | 0,625 | 0,625 |
Taq Platinum | 0,25 | 0,25 |
Tabela 3. Condições de PCR thermocyling.
95 ° C | 05:00 | |
40X | 95 ° C | 00:30 |
56 ° C | 00:30 | |
72 ° C | 00:15 |
Tabela 4. Resultados esperados para o MEDIP PCR bem sucedido.
DNA modelo | ||
Primer usados | IN | IP |
H19 | Positivo | Positivo |
CTRL | Positivo | Negativo |
Há uma consciência crescente do papel significativo desempenha na doença de metilação do DNA, portanto, o desenvolvimento de ensaios para medir esta modificação estão se tornando cada vez mais importante 3, 12, 13. A técnica MEDIP é um instrumento favorável para triagem, tanto do genoma inteiro-o e locus específico de nível 6, 7. Esta técnica oferece uma visão rápida dos níveis de metilação do DNA usando quantidades limitadas de partida DNA e permite comparações fáceis entre diferentes fontes. Aplicações a jusante de usar o produto MEDIP incluem uma variedade de microarrays, como genoma inteiro e arrays de oligonucleotídeos CpG ilha, ensaios diretos PCR para loci de interesse, bem como o seqüenciamento.
MEDIP fornece uma abordagem distinta para detecção de DNA de metilação que depende de anticorpos para distinguir metilado e não metilado de DNA 6. Enquanto MEDIP é mais rápido do que as abordagens tradicionais bissulfito seqüenciamento e não se limita à análise de seqüências específicas como análise de enzimas de restrição, a imunoprecipitação será dependente da seqüência de DNA incluindo densidade CpG, a presença de elemento repetitivo e composição. Assim, controles adequados, como com cada experiência, são importantes para a análise e interpretação dos resultados MEDIP.
Há várias etapas ao longo do MEDIP técnica onde os cuidados extras devem ser tomados. Estes incluem: o uso de mangueiras siliconizadas para prevenir não-específicos de ligação a DNA às paredes do tubo, assegurando adequada fragmentação do DNA após sonicação e garantir que o DNA é completamente desnaturado. Além disso, note que a quantificação de single-stranded MEDIP produto pode ser difícil porque há uma quantidade limitada de materiais e muitas técnicas comuns para estimar a quantidade de DNA, tais como espectrofotometria, funcionam melhor com double-stranded DNA. Além disso, é importante observar as práticas de segurança adequada de laboratório em todos os momentos, especialmente quando substâncias cáusticas, tais como fenol são utilizados.
A técnica MEDIP também podem ser modificados em várias etapas. Importante é que o protocolo pode ser escalado para cima ou para baixo para permitir maiores rendimentos, ou trabalhar com tamanhos de amostra limitada. Uma abordagem alternativa fragmentação, tais como o uso de enzimas de restrição (por exemplo, a digestão Alu I), reduz as necessidades de equipamento, mas também pode introduzir vieses potencialmente limitando DNA puxar para baixo em algumas regiões. Como acontece com qualquer abordagem, os resultados são melhores validado usando uma abordagem alternativa para detecção de DNA de metilação 1, 14.
Queremos agradecer aos membros do Brown e laboratórios Lam pela sua participação na crítica a este vídeo e artigo. Este trabalho foi financiado por fundos do Canadian Institutes for Health Research eo Michael Smith Fundação para a Pesquisa em Saúde.
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Biorupter sonicator | Tool | Diagenode | UCD-200 TM | |
1.7ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Other | Sorenson BioScience | 11510 | |
ND 3300 Spectrophotometer | Tool | NanoDrop | ||
Primary Antibody: Anti-5’-methylcytosine mouse mAb | Reagent | Calbiochem | 162 33 D3 | |
Secondary Antibody: Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Reagent | Invitrogen | 112-01D | |
Magnetic Tube Rack | Tool | Invitrogen | CS15000 | |
Mini LabRoller | Tool | Labnet International | H5500 | |
IP Buffer | 10 mM NaPO4 pH 7.0, 140 mM NaCl, 0.05% Triton X-100. Stored at room temperature | |||
Digestion Buffer | 10 mM Tris pH8.0, 100 mM EDTA, 0.5% SDS, 50 mM NaCl |
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