Immunoprécipitation ADN méthylé

Cette vidéo montre le protocole pour immunoprécipitation ADN méthylé (MeDIP). MeDIP est une procédure de deux jours qui extrait sélectivement des fragments d'ADN méthylé à partir d'un échantillon d'ADN génomique en utilisant des anticorps avec une spécificité pour la 5-méthylcytosine (anti-5 MC).

L'identification de modèles de méthylation d'ADN est une procédure commune à l'étude de l'épigénétique, la méthylation est connu pour avoir des effets significatifs sur l'expression des gènes, et est impliqué dans le développement normal ainsi que les maladies

EXTRACTION D'ADN et préparation des échantillons

L'ADN d'une variété de différents échantillons (cellules en culture, frais congelé ainsi que des tissus de paraffine fixés au formol intégrés) peut être utilisé pour MeDIP. Il est important d'utiliser l'ADN hautement purifié, sans protéines associées telles que les histones. Il est également important de retirer l'ARN autant que possible de l'échantillon, car il peut interférer avec une quantification ADN et liaison à l'anticorps. La quantité d'ADN utilisée pour MeDIP peut varier de 200 ng à 1 pg en fonction de la quantité d'ADN disponibles. Pour démontrer ce protocole, 1 pg d'ADN sera utilisé. Le protocole suivant permettra de haute qualité d'ADN double brin à partir des cellules cultivées. D'autres protocoles devraient être employées pour l'extraction de l'ADN d'autres types d'échantillons.

1. Ajouter 400 ul de tampon de digestion d'un culot cellulaire dans un tube de 1,7 ml Eppendorf.
2. Ajouter 100 ug de la protéinase K dans le tube et incuber une nuit à 50 ° C.
3. Ajouter 500 ul de phénol pH 7 et mélanger délicatement mais soigneusement en renversant.
4. Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante.
5. Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube.
6. Répétez les étapes 3 à 5 fois.
7. Ajouter 500 ul 01h01 pH phénol / chloroforme 7 et mélanger délicatement mais soigneusement en renversant.
8. Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante.
9. Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube.
10. Ajouter 40 ug de RNase A et incuber 1 h à 37 ° C.
11. Ajouter 500 ul de phénol pH 7 et mélanger délicatement mais soigneusement en renversant.
12. Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante.
13. Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube.
14. Répétez les étapes 11 à 13 fois.
15. Ajouter 500 ul 01h01 pH phénol / chloroforme 7 et mélanger délicatement mais soigneusement en renversant.
16. Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante.
17. Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube.
18. Ajouter le volume 1/10ème acétate de sodium 3 M (40 pi) et bien mélanger.
19. Ajouter 2 volumes (900 pi) d'éthanol à 100%, bien mélanger, et placer à -20 ° C pendant 20 min.
20. Centrifuger à 13 000 g pendant 20 min à 4 ° C.
21. Enlever l'éthanol, le spin d'impulsion, et éliminer l'éthanol résiduel.
22. Ajouter 500 ul d'éthanol froid à 70% pour se laver. Centrifuger à 13 000 g pendant 20 min à 4 ° C.
23. Enlever l'éthanol à 70%, le spin d'impulsion, et éliminer l'éthanol résiduel par pipetage.
24. Sécher à l'air le culot avec le bouchon ouvert pour 10 min à température ambiante pour enlever toute trace d'éthanol résiduelle.
25. Resuspendre l'ADN dans 50 ul de dH2O stérilisés nuit à 4 ° C.
26. Quantifier l'ADN à l'aide d'un spectrophotomètre NanoDrop. Un A _260: Un ratio de 1,8 ₂₈₀ est idéal.
27. Déterminer la qualité de l'ADN et gamme de taille sur un gel d'agarose avec 100 pb échelle. Aussi peu que 10 ng d'ADN génomique peut être exécuté sur un gel d'agarose 1,7% suivie d'une coloration à l'aide d'un colorant qui est très sensible à de petites quantités d'ADN tels que SYBR Gold.
28. Dans un tube siliconé par échantillon, préparer 1 pg d'ADN dans un volume total de 50 pi avec le reste du volume faite avec stérilisés dH ₂ O.

L'ADN SONICATION

Sonication de l'ADN et le protocole MeDIP doit être effectuée dans des tubes siliconzied pour empêcher la liaison non spécifique des protéines à parois du tube. Fois sonication optimale pour les échantillons d'ADN sont basées sur le degré de fragmentation échantillon d'ADN tel que déterminé par électrophorèse sur gel (étape 27). Par exemple, l'ADN extrait de cellules cultivées devraient être de très haut poids moléculaire, et sera par la suite besoin de plus de sonication que l'ADN extrait d'échantillons d'archives qui sont souvent partiellement dégradés. Si les échantillons sont de poids moléculaire élevé et uniforme, il est raisonnable à ce stade de procéder à la sonication comme décrit dans le présent Protocole sans vérifier chaque échantillon individuellement. Si les échantillons sont fragmentés avec des échantillons d'archives, il sera nécessaire d'adapter la procédure sonication vraisemblablement en diminuant les temps sonication pour obtenir 300 100 points de base de fragments. Si vous envisagez de traiter des échantillons qui sont partiellement dégradés, l'optimisation des paramètres de sonication peut être effectuée sur un échantillon représentatif de ceux qui vous intéressent. Basé sur le degré de fragmentation de l'ADN observée de l'électrophorèse sur gel (étape 27), l'expérimentateur peut prédéterminer le temps de sonication optimale pour l'échantillon. Nous décrivons ici une méthode pour obtenir des fragments d'ADN 300-1000 pb par sonication avec un dispositif automatisé sonication (Bioruptor partir Diagenode, UCD-200 TM) en utilisant l'ADN de haute masse moléculaire.

1. L'eau dans Biorupter doit être à 4 ° C.
2. Soniquer pour 7 minutes sur les réglages automatiques (30 sec 30 sec sur le descendre à puissance maximale).
3. Retirer 800 ng (40 pi) de produit et le placer dans soniqué siliconé 1,7 ml tube de centrifugeuse pour l'immunoprécipitation (IP) de réaction.
4. Mettez de côté restante de 200 ng (10 pi) pour servir d'entrée (IN) d'ADN de référence (conserver à 4 ° C).

IMMUNOPRECIPITATON D'ADN méthylé

1. Dénaturer l'ADN qui sera utilisé pour la réaction de propriété intellectuelle (800 ng) à 95 ° C pendant 10 min dans un bain d'eau.
2. Refroidir immédiatement sur la glace. Laissez refroidir complètement l'ADN (environ 5 minutes sur la glace) avant de procéder à l'étape suivante.
3. Ajouter 5 g d'anticorps monoclonaux.
4. Ajouter tampon IP (utilisé à la température ambiante au long de ce protocole) pour un volume final de 500 pl.
5. Incuber pendant 2 heures à 4 ° C en rotation porte-tube.
6. Juste avant l'étape 5 est terminée, préparer Dynabeads par lavage (étapes 6-11). Tout d'abord, remettre en suspension les perles à fond dans le flacon au vortex.
7. Transfert 30 pl (~ 2 x 10 ⁷⁾ du Dynabeads resuspendu par réaction plus 1, dans un nouveau tube siliconé (par exemple, si, ce faisant 8 réactions, enlever assez de billes pour le 9, soit 270 pl).
8. Placer le tube sur le support magnétique pour 2 minutes à température ambiante.
9. Pipeter le surnageant. Lors du retrait de surnageant, évitez de toucher les billes de l'intérieur contre le mur (où les perles attirent l'aimant) avec la pointe de la pipette.
10. Enlevez le tube de l'aimant, et remettre en suspension les perles dans un volume de plus de mémoire tampon IP (750 ul ul-1000). Placer le tube de retour sur la grille magnétique pour 2 minutes à température ambiante.
11. Répétez le laver une fois de plus, puis remettre en suspension les billes lavées dans un tampon de propriété intellectuelle dans le premier volume retiré à l'étape 7.
12. Ajouter 30 ul de Dynabeads lavés à chaque réaction IP
13. Incuber dans un porte-tube en rotation pendant 2 heures à 4 ° C.
14. Après incubation est terminée, placer le tube sur le support magnétique pour 2 minutes à température ambiante.
15. Pipeter le surnageant. Evitez de toucher le mur à l'intérieur du tube (où les perles attirent l'aimant) avec la pointe de la pipette. Ajouter 500 pi de tampon de propriété intellectuelle. Mélanger le contenu du tube et de le remettre sur la grille magnétique pour 2 mn. Répétez laver avec tampon de 500 ul IP en même temps.
16. Après avoir retiré le surnageant du dernier lavage, remettre en suspension les perles dans 400 ul de tampon de digestion.
17. Traiter la réaction avec 100 ug de protéinase K et incuber une nuit à 50 ° C.

Purification de l'ADN immunoprécipité

1. Ajouter 500 ul 01h01 pH phénol / chloroforme et vortex 7 à fond.
2. Centrifuger à 13 000 g pendant 10 min à température ambiante.
3. Retirer aqueuse (en haut) fraction dans un nouveau tube.
4. Répétez les étapes 1 à 3 si l'interphase entre les phases aqueuse et organique semble brouillée.
5. Ajouter 1 / 10 ^ème de volume d'acétate de sodium 3 M (40 pi) et de vortex.
6. Ajouter 1 l de glycogène (20 pg / pl) et vortex.
7. Ajouter 2 volumes (1000 pi) de l'éthanol à 100%, vortex, et au lieu de -20 ° C pendant 20 min.
8. Centrifuger à 13 000 g pendant 20 min à 4 ° C.
9. Enlever l'éthanol, le spin d'impulsion, et éliminer l'éthanol résiduel.
10. Ajouter 500 ul d'éthanol froid à 70% pour se laver. Brièvement au vortex et spin à 13 000 g pendant 20 min à 4 ° C.
11. Enlever l'éthanol à 70%, le spin d'impulsion, et éliminer l'éthanol résiduel par pipetage.
12. Sécher à l'air le culot avec le bouchon ouvert pour 10 min à température ambiante pour enlever toute trace d'éthanol résiduelle.
13. Resuspendre culot d'ADN dans 10 ul stérilisés dH ₂ 0.

VALIDATION PAR PCR

1. Vous pouvez tester afin de s'assurer que votre procédure MeDIP travaille en effectuant le protocole MeDIP aide normale de l'ADN humain (homme ou femme), et ensuite doser une région connue pour être enrichi pour la méthylation.
2. Retirer 30% du produit MeDIP au tube de PCR, et un autre 30% du produit MeDIP à un autre tube de PCR.
3. Mettez 10 ng de l'ADN EN dans un tube PCR, et 10 ng de l'ADN EN dans un autre tube de PCR. Vous devriez maintenant avoir quatre réactions PCR séparées de mettre en place.
4. Effectuer PCR en utilisant H19 et CTRL amorces comme indiqué dans le tableau 1.
5. Préparer deux mastermixes (un pour chaque ensemble d'amorces) pour les réactions PCR avec 12,5 ul volume total comme indiqué dans le tableau 2.
6. Thermocycle la PCR en utilisant les conditions décrites dans le Tableau 3.
7. Exécuter 5 pl de produits de PCR sur un gel agarose à 2% pour la visualisation.
8. Les résultats attendus pour MeDIP succès sont présentés dans le Tableau 4.

Tableaux

Tableau 1: H19 et CTRL amorces pour la validation de la PCR.

Tableau 2. Mastermixes pour les réactions PCR.

Tableau 3. PCR conditions thermocyling.

Tableau 4. Résultats attendus PCR pour MeDIP succès.

Il ya une conscience croissante de la joue rôle important dans la maladie de méthylation de l'ADN, donc le développement de tests pour mesurer cette modification sont de plus en plus important ^{3, 12, 13.} La technique est un outil MeDIP prête pour le dépistage à la fois l'ensemble du génome et spécifiques de locus niveau ^{6, 7.} Cette technique offre une vue rapide des niveaux de méthylation de l'ADN en utilisant des quantités limitées de démarrage de l'ADN et permet des comparaisons faciles entre les différentes sources. Applications en aval qui utilisent le produit MeDIP comprennent une variété de biopuces, comme tout le génome et de CpG puces d'oligonucléotides île, directement PCR pour les loci d'intérêt, ainsi que le séquençage.

MeDIP fournit une approche distincte à la détection de la méthylation de l'ADN qui repose sur des anticorps de distinguer l'ADN méthylé et non méthylé ^6. Bien MeDIP est plus rapide que les approches traditionnelles du bisulfite de séquençage et il n'est pas limité à l'analyse des séquences spécifiques comme l'analyse d'enzyme de restriction, l'immunoprécipitation seront dépendants de séquences d'ADN dont la densité CpG, la présence de l'élément répétitif et la composition. Ainsi, des contrôles appropriés, comme avec toutes les expériences, sont importants pour l'analyse et l'interprétation des résultats MeDIP.

Il ya plusieurs étapes à travers la technique MeDIP où les soins supplémentaires doivent être prises. Il s'agit notamment: l'utilisation de tubes siliconés pour empêcher la liaison non spécifique de l'ADN aux parois du tube; assurer la fragmentation de l'ADN suffisante après sonication, et veillant à ce que l'ADN est complètement dénaturé. En outre, notez que la quantification des produits MeDIP simple brin peut être difficile parce qu'il ya une quantité limitée de matériel et de nombreuses techniques communs pour estimer la quantité d'ADN, telles que la spectrophotométrie, fonctionnent mieux avec l'ADN double brin. En outre, il est important d'observer des pratiques appropriées de sécurité en laboratoire, en tout temps, surtout lorsque des substances caustiques tels que le phénol sont utilisés.

La technique MeDIP peut également être modifié à plusieurs étapes. Surtout le protocole peut être agrandie ou réduite pour permettre une augmentation des rendements, ou de travailler avec des échantillons limités. Une approche de fragmentation alternatives, telles que l'utilisation d'enzymes de restriction (par exemple, la digestion Alu I), réduit les besoins en équipement, mais il peut aussi introduire des biais potentiellement limitant l'ADN tirer vers le bas dans certaines régions. Comme pour toute approche, les résultats sont meilleurs validée en utilisant une approche alternative à la détection de la méthylation de l'ADN ^{1, 14.}

Nous tenons à remercier les membres de la Brown et laboratoires Lam pour leur participation à la critique de cette vidéo et de l'article. Ce travail a été soutenu par des fonds des Instituts canadiens de recherche en santé et de la Fondation Michael Smith pour la recherche en santé.