Methylierte DNA Immunpräzipitation

Dieses Video zeigt das Protokoll für die methylierte DNA Immunpräzipitation (MeDIP). MeDIP ist eine zweitägige Verfahren, die selektiv extrahiert methylierte DNA-Fragmente aus einer genomischen DNA-Probe unter Verwendung von Antikörpern mit Spezifität für 5-Methylcytosin (anti-5 mC).

Die Identifizierung von DNA-Methylierungs-Muster ist ein übliches Verfahren in der Studie der Epigenetik, wie Methylierung ist bekannt, dass mit erheblichen Auswirkungen auf die Genexpression haben, und ist mit der normalen Entwicklung sowie Krankheit beteiligt

DNA-Extraktion und Probenvorbereitung

DNA aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Proben (kultivierten Zellen, Frischplasma sowie Formalin-fixierten Paraffin eingebetteten Gewebe) kann für MeDIP verwendet werden. Es ist wichtig, hochreine DNA ohne assoziierte Proteine ​​wie Histone verwenden. Es ist auch wichtig, so viel wie möglich zu entfernen RNA aus der Probe, wie es mit den beiden DNA-Quantifizierung und Antikörperbindung stören können. Die DNA-Menge für MeDIP verwendet werden kann von 200 ng bis 1 ug je nach der Menge der DNA verfügbaren Bereich. Um dies zu demonstrieren Protokoll wird 1 pg DNA verwendet werden. Das folgende Protokoll wird eine hohe Qualität doppelsträngigen DNA aus kultivierten Zellen. Andere Protokolle sollten für die Extraktion von DNA aus anderen Probentypen eingesetzt werden.

1. Add 400 ul der Verdauung Puffer, um sich ein Zellpellet in einem 1,7 ml Eppendorf-Röhrchen.
2. Add 100 ug Proteinase K, um das Rohr, beimpft und über Nacht bei 50 ° C.
3. Add 500 ul Phenol pH 7 und vorsichtig mischen, aber gründlich durch Invertieren.
4. Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen.
6. Wiederholen Sie die Schritte 3 bis 5 einmal.
7. Add 500 ul 01.01 Phenol / Chloroform pH 7 und vorsichtig mischen, aber gründlich durch Invertieren.
8. Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
9. Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen.
10. Add 40 ug RNase A und Inkubation 1 Stunde bei 37 ° C.
11. Add 500 ul Phenol pH 7 und vorsichtig mischen, aber gründlich durch Invertieren.
12. Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
13. Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen.
14. Wiederholen Sie die Schritte 11 bis 13 einmal.
15. Add 500 ul 01.01 Phenol / Chloroform pH 7 und vorsichtig mischen, aber gründlich durch Invertieren.
16. Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
17. Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen.
18. Add 1:10 Volumen 3 M Natriumacetat (40 ul) und gut mischen.
19. Add 2 Bände (900 ul) von 100% Ethanol, gut mischen und bei -20 ° C für 20 Minuten.
20. Spin bei 13 000 g für 20 Minuten bei 4 ° C.
21. Entfernen Ethanol, pulszentrifugieren, und entfernen Sie Rest-Ethanol.
22. Add 500 ul kaltem 70% igem Ethanol zu waschen. Spin bei 13 000 g für 20 Minuten bei 4 ° C.
23. Nehmen Sie 70% Ethanol, Puls spinnen, und entfernen Sie Restethanol durch Pipettieren.
24. An der Luft trocknen Pellet mit der Kappe öffnen für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um alle Spuren von Rest-Ethanol zu entfernen.
25. Resuspendieren DNA in 50 ul sterilisiert dH2O Nacht bei 4 ° C.
26. Quantifizierung der DNA mit einem Spektralphotometer NanoDrop. Ein A _​​260: A _{280-Verhältnis} von 1,8 ist ideal.
27. Bestimmen DNA Qualität und Größenordnung auf einem Agarosegel mit 100 bp Leiter. So wenig wie 10 ng der genomischen DNA kann auf einem 1,7% Agarosegel laufen gelassen werden, gefolgt von Färbung mit einem Farbstoff, der sehr empfindlich auf kleine Mengen an DNA wie SYBR Gold ist.
28. In einem silikonisierten Röhrchen pro Probe vorzubereiten 1 ug DNA in einem Gesamtvolumen von 50 ul mit dem Rest der Band machte sich mit einem sterilisierten dH ₂ O.

DNA Beschallung

DNA Beschallung und die MeDIP Protokoll muss in siliconzied Rohren durchgeführt werden, um unspezifische Bindung von Proteinen an Rohrwandungen zu verhindern. Optimale Beschallung Zeiten für die DNA-Proben werden nach dem Grad der DNA-Probe Fragmentierung von Gel-Elektrophorese (Schritt 27) bestimmt wird. Zum Beispiel sollten DNA aus kultivierten Zellen extrahiert von sehr hohem Molekulargewicht, und wird nachträglich verlangen mehr Beschallung als DNA von Archivalien Proben, die oft teilweise abgebaut extrahiert. Wenn Proben gleichmäßig hohem Molekulargewicht sind, ist es an dieser Stelle sinnvoll, mit der Beschallung in diesem Protokoll, ohne zu überprüfen jede Probe einzeln beschrieben vorgehen. Wenn Proben mit archivalischen Proben fragmentiert sind, wird es notwendig sein, um die Beschallung Verfahren wahrscheinlich durch eine Verringerung der Beschallung mal bis 300-100bp Fragmente erhalten anzupassen. Wenn Sie erwarten, dass Proben, die teilweise abgebaut, Optimierung von Ultraschall-Parameter können auf einer repräsentativen Stichprobe von denen Interesse durchgeführt werden, zu verarbeiten. Basierend auf den Grad der DNA-Fragmentierung von Gel-Elektrophorese (Schritt 27) beobachtet, kann der Experimentator im Voraus die optimale Beschallung Zeit für die Probe. Hier beschreiben wir eine Methode, um 300-1000 bp DNA-Fragmente durch Beschallung erhalten eine automatisierte Beschallung Gerät (Bioruptor aus Diagenode, UCD-200 TM) mit hohem Molekulargewicht DNA.

1. Wasser in Biorupter müssen bei 4 ° C.
2. Mit Ultraschall für 7 Minuten auf die automatischen Einstellungen (30 sec auf 30 sec off bei maximaler Leistung).
3. Entfernen 800 ng (40 ul) beschallt Produkt und in silikonisierten 1,7 ml Zentrifugenröhrchen für die Immunpräzipitation (IP)-Reaktion.
4. Beiseite restlichen 200 ng (10 ul), die als Eingabe dienen (IN) Referenz-DNA (lagern bei 4 ° C).

IMMUNOPRECIPITATON von methylierter DNA

1. Denaturieren die DNA, die für IP Reaktion (800 ng) bei 95 ° C wird für 10 Minuten in einem Wasserbad verwendet.
2. Coole sofort auf Eis. Lassen DNA vollständig abkühlen lassen (ca. 5 min auf Eis), bevor Sie fortfahren mit dem nächsten Schritt.
3. Add 5 ug monoklonaler Antikörper.
4. Fügen Sie IP-Puffer (verwendet bei Raumtemperatur in diesem Protokoll) auf ein Endvolumen von 500 ul.
5. Inkubieren für 2 Stunden bei 4 ° C in Drehrohr Inhaber.
6. Kurz vor Schritt 5 abgeschlossen ist, bereiten Dynabeads durch Waschen (Schritte 6-11). Zunächst resuspendieren die Perlen gründlich in die Flasche durch Vortexen.
7. Transfer-30 pl (~ 2 x 10 ⁷⁾ des resuspendierten Dynabeads pro Reaktion plus 1, in eine neue silikonisierten Röhrchen (zum Beispiel, wenn dabei 8 Reaktionen, entfernen Sie genug Kugeln für 9, als 270 ul).
8. Das Röhrchen wird auf die magnetische Ablage für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
9. Pipette aus dem Überstand. Beim Entfernen Überstand, berühren Sie die Perlen gegen Innenwand (wo die Perlen der Magnet anziehen) mit der Pipettenspitze.
10. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem Magneten und resuspendieren die Perlen in einem Überschuss Volumen von IP-Puffer (750 ul-1000 ul). Das Röhrchen wieder auf den magnetischen Halter für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
11. Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal, und dann resuspendieren gewaschenen Beads in IP-Puffer in das ursprüngliche Volumen in Step 7 entfernt.
12. Add 30 ul gewaschen Dynabeads jedem IP Reaktion
13. Inkubieren in einem Drehrohr Halter für 2 Stunden bei 4 ° C.
14. Nach der Inkubation abgeschlossen ist, setzen Sie den Schlauch auf den magnetischen Halter für 2 Minuten bei Raumtemperatur.
15. Pipette aus dem Überstand. Berühren Sie nicht die Innenwand des Rohres (wo die Perlen der Magnet anziehen) mit der Pipettenspitze. Add 500 ul von IP-Puffer. Mix der Inhalt des Röhrchens und legte sie zurück auf die magnetische Ablage für 2 Minuten. Wiederholen Sie die Wäsche mit 500 ul IP-Puffer einmal.
16. Nach dem Entfernen der Überstand aus der letzten Waschung resuspendieren die Perlen in 400 ul der Verdauung Puffer.
17. Behandeln Sie die Reaktion mit 100 ug Proteinase K und Inkubation über Nacht bei 50 ° C.

REINIGUNG VON immunpräzipitiert DNA

1. Add 500 ul 01.01 Phenol / Chloroform pH 7 und gründlich vortexen.
2. Spin bei 13 000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
3. Entfernen wässrige (obere) Teil in ein neues Röhrchen.
4. Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 3, wenn die Grenzfläche zwischen der wässrigen und der organischen Schichten trüb erscheint.
5. Add 1 / 10 ^th Volumen 3 M Natriumacetat (40 ul) und Wirbel.
6. Add 1 ul Glykogen (20 ug / ul) und Wirbel.
7. Add 2 Bände (1000 ul) von 100% Ethanol, vortexen und bei -20 ° C für 20 Minuten.
8. Spin bei 13 000 g für 20 Minuten bei 4 ° C.
9. Entfernen Ethanol, pulszentrifugieren, und entfernen Sie Rest-Ethanol.
10. Add 500 ul kaltem 70% igem Ethanol zu waschen. Vortex kurz und drehen sich mit 13 000 g für 20 Minuten bei 4 ° C.
11. Nehmen Sie 70% Ethanol, Puls spinnen, und entfernen Sie Restethanol durch Pipettieren.
12. An der Luft trocknen Pellet mit der Kappe öffnen für 10 Minuten bei Raumtemperatur, um alle Spuren von Rest-Ethanol zu entfernen.
13. Resuspendieren DNA-Pellet in 10 ul sterilisiert dH ₂ 0.

VALIDIERUNG VON PCR

1. Sie können testen, um sicherzustellen, dass Ihre MeDIP Verfahren wird durch Ausführen der MeDIP Protokoll mit normalen menschlichen DNA (männlich oder weiblich) arbeiten, und anschließend Testen einer Region bekannt für Methylierung angereichert werden.
2. Nehmen Sie 30% der MeDIP Produkt PCR-Röhrchen, und weitere 30% der MeDIP Produkt auf ein anderes PCR-Röhrchen.
3. Setzen Sie 10 ng IN DNA in ein PCR-Röhrchen und 10 ng IN DNA in eine andere PCR-Röhrchen. Sie sollten nun vier separate PCR-Reaktionen einzurichten.
4. Führen Sie die PCR mit H19 und STRG-Primer wie in Tabelle 1 angegeben.
5. Bereiten Sie zwei Mastermix (eine für jedes Primer-Set) für PCR-Reaktionen mit 12,5 ul Gesamtvolumen wie in Tabelle 2 dargestellt.
6. Thermocycle der PCR unter Verwendung der in Tabelle 3 dargestellt.
7. Run 5 ul der PCR-Produkte auf einem 2% Agarosegel für die Visualisierung.
8. Die erwarteten Ergebnisse für eine erfolgreiche MeDIP sind in Tabelle 4 dargestellt.

Tabellen

Tabelle 1: H19 und STRG-Primer für PCR-Validierung.

Tabelle 2. Mastermix für die PCR-Reaktionen.

Tabelle 3. PCR thermocyling Bedingungen.

Tabelle 4. Erwartete PCR-Ergebnisse für eine erfolgreiche MeDIP.

Es gibt ein wachsendes Bewusstsein für die wichtige Rolle der DNA-Methylierung spielt in Krankheit, sind daher die Entwicklung von Assays, um diese Änderung zu messen zunehmend an Bedeutung ^{3, 12, 13.} Die MeDIP Technik ist ein Werkzeug für das Screening zugänglich sowohl den gesamten Genoms und Locus-spezifische Level ^{6, 7.} Diese Technik bietet eine schnelle Ansicht von DNA-Methylierungs-Ebenen mit begrenzten Mengen an Ausgangs-DNA und ermöglicht eine einfache Vergleiche zwischen verschiedenen Quellen. Downstream-Anwendungen mit der MeDIP Produkt umfassen eine Vielzahl von Microarrays, wie ganze Genom-und CpG-Insel-Oligonukleotid-Arrays, direkte PCR-Assays für loci von Interesse, ebenso wie die Sequenzierung.

MeDIP bietet eine deutliche Annäherung an DNA-Methylierungs-Erkennung, die auf Antikörper gegen methylierter und nicht methylierter DNA zu unterscheiden ⁶ setzt. Während MeDIP ist schneller als herkömmliche Bisulfit-Sequenzierung Ansätze und es ist nicht auf die Analyse von spezifischen Sequenzen wie Restriktionsenzymanalyse beschränkt ist, wird die Immunpräzipitation abhängig sein DNA-Sequenz einschließlich CpG Dichte, repetitive Element Anwesenheit und Zusammensetzung. So angemessene Kontrollen, wie bei jedem Experiment, sind wichtig für die Analyse und Interpretation der Ergebnisse MeDIP.

Es gibt mehrere Schritte in der MeDIP Technik, wo extra darauf geachtet werden muss. Dazu gehören: die Verwendung von silikonisierten Röhrchen, um unspezifische Bindung der DNA an Rohrwandungen zu verhindern; eine angemessene Fragmentierung der DNA nach der Beschallung, und sicherzustellen, dass DNA vollständig denaturiert. Zusätzlich ist zu beachten, dass die Quantifizierung von einzelsträngigen MeDIP Produkt kann schwierig sein, weil es nur eine begrenzte Menge an Material und viele gängige Techniken zur Abschätzung DNA-Menge, wie Spektrophotometrie, am besten mit doppelsträngigen DNA. Darüber hinaus ist es wichtig, angemessene Sicherheit im Labor Praktiken jederzeit beobachten, vor allem, wenn ätzende Substanzen wie Phenol verwendet werden.

Die MeDIP Technik kann auch in mehreren Schritten verändert werden. Wichtig ist das Protokoll kann nach oben oder unten skaliert werden, um höhere Erträge, oder arbeiten mit begrenzten Probenmengen ermöglichen. Eine alternative Fragmentierung Ansatz, wie die Verwendung von Restriktionsenzymen (zB Alu I Verdauung), reduziert Anforderungen an die Ausrüstung, kann aber auch vorstellen Vorurteile potentiell Begrenzung DNA-Pulldown in einigen Regionen. Wie bei jedem Ansatz werden die Ergebnisse am besten validierten über einen alternativen Ansatz zur DNA-Methylierungs-Erkennung ^{1, 14.}

Wir wünschen den Mitgliedern des Brown und Lam-Labors für ihre Teilnahme an der kritischen Beurteilung dieses Video und Artikel danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus der Canadian Institutes for Health Research und Michael Smith Foundation for Health Research unterstützt.