Bipolar Bozukluk için Bir Sıçan Modeli Geliştirme

Bu makale, hem mani benzeri hem de depresif benzeri davranışları yakalayan benzersiz bir sıçan bipolar bozukluk modelinin indüksiyonu için bir protokol sunmaktadır.

Bipolar bozukluk, duygusal inişler (mani) ve alçaklar (depresyon) dönemleri dahil olmak üzere aşırı ruh hali değişimleri ile karakterize bir zihinsel sağlık durumudur. Altta yatan nörobiyoloji henüz tam olarak anlaşılmamış olsa da, nörotransmitter sistemlerindeki dengesizlikler, özellikle dopamin, merkezi bir rol oynuyor gibi görünmektedir. Bu nedenle, kemirgenlerde mani veya depresyonu modellemek için dopaminerjik yolların manipülasyonları kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu iki bölüm arasındaki tipik geçişi doğru bir şekilde temsil eden modeller nadirdir ve yüz geçerliliğini sınırlar. Eşsiz bir modelde, bipolar bozukluğun patolojisinde rol oynayan dopamin D1 reseptör ekspresyonunu geçici olarak arttırmak için modern teknikler kullanılır. Kalmodulin kinaz II alfa promotörü kontrolü altında dopamin D1 reseptörünü eksprese eden tetrasiklin ile indüklenebilir bir lentiviral yapı, yetişkin sıçanların medial prefrontal korteksine stereotaktik olarak enjekte edilir. Dopamin D1 reseptörü aşırı ekspresyonu, hayvanların içme suyuna tetrasiklin analog doksisiklin eklenerek elde edilir, bu da ödülle ilgili, dürtüsel ve risk alma davranışlarında bir artışa ve kaygıda bir azalmaya yol açar. Bu davranışlar mani benzeri bir fenotipe benzer. Doksisiklin içme suyundan uzaklaştırılarak, aynı hayvanda artan çaresizlik ve anhedoni ile karakterize depresif benzeri bir fenotip indüklenebilir. Bu makale, ameliyatın gerçekleştirilmesi için adım adım bir protokolün yanı sıra bipolar bozukluk benzeri fenotipin indüklenmesi için prosedürler sunmaktadır. Ek olarak, mani benzeri ve depresif benzeri davranışlarla ilişkili davranış değişikliklerini değerlendirmek için dikkate alınması gereken hususlar açıklanmaktadır. İyi bir yapı ve yüz geçerliliği gösteren bu umut verici model, bipolar bozukluğun patofizyolojik mekanizmalarını daha fazla araştırmak için değerli bir araç sunmaktadır.

Bipolar bozukluk (BH), dünya nüfusunun yaklaşık %1'ini etkileyen ciddi bir duygudurum bozukluğudur¹. Ötimik durumların yanı sıra aşırı ruh hali, depresyon ve mani atakları ile karakterizedir. Behçet hastalığındaki depresif atakların belirtileri unipolar depresyonunkilere benzer. Hastalar aktivitelere ve üzüntü, umutsuzluk ve değersizlik duygularına karşı azalmış ilgi ve zevk gösterirler. Ek olarak, iştahta, uyku davranışında ve bilişsel bozukluklarda değişiklikler sıklıkla gözlenebilir². Manik ataklar, anormal derecede yüksek ruh hali, azalmış uyku ihtiyacı, sosyal disinhibisyon, artmış benlik saygısı ve büyüklenme duygularının yanı sıra artan risk alma ve sinirlilik ile karakterizedir².

Behçet hastalığının etiyolojisi, genetik ve gelişimsel faktörlerin karmaşık bir etkileşimi gibi görünmektedir³, ancak patofizyolojisinde yer alan kesin mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır. Semptomların nörotransmitter sistemlerindeki dengesizliklerden^{kaynaklandığı} düşünülmektedir 4 ve özellikle dopamin sistemine odaklanan çalışmalar^{etkili olmuştur 5}. Örneğin, Berk ve ^ark.6 , hiperdopaminerjik bir durumun maninin altında yattığını, depresyonun ise hipodopaminerjiden kaynaklandığını varsayarak dopamin hipotezini öne sürdüler. O zamandan beri, hayvan modellerinden elde edilen kanıtlar, farmakolojik ve görüntüleme çalışmalarının yanı sıra, manik semptomlar ve hiperdopaminerji arasındaki ilişki için güçlü bir destek topladı. Ayrıca, azalmış dopaminerjik sinyalleşme ile depresif ataklar arasında bir bağlantı bulunabilir, ancak^{daha az ölçüde 7}. Ek olarak, genetik araştırmalardan elde edilen sonuçlar, BD^8'in dopamin hipotezi fikrini güçlendirmiştir.

Behçet hastalığında dopamin sisteminin rolüne daha fazla ışık tutmak için, semptomların altında yatan nörobiyolojik mekanizmaları araştırmak için hayvan modelleri kullanılabilir. Hastalık modellerinin uygulamaları ve sınırlamaları genellikle başlangıçta Willner⁹ tarafından önerilen üç doğrulama kriterine göre değerlendirilir. Bunlar yüz, yapı ve tahmine dayalı geçerliliği içerir. Yüz geçerliliği, modelin bozukluğun davranışsal özelliklerini taklit etme yeteneğini tanımlar. Bozukluğun patofizyolojisi ve etiyolojisi modelin temeli olduğunda yapı geçerliliğine ulaşılırken, öngörücü geçerlilik, bozukluğun farmakolojik tedavisinin model içinde yeniden üretilebileceğini ima eder.

Şimdiye kadar, çeşitli kemirgen modelleri BD^10'un anlaşılmasına katkıda bulunmuştur ve çok çeşitli genetik modifikasyonlar, farmasötik müdahaleler ve çevresel manipülasyonları içerir¹¹.

Örneğin, Saat geninin deneysel manipülasyonlarının, farelerde mani benzeri bir fenotipe neden olduğu gösterilmiştir. Transkripsiyon faktörü CLOCK, sirkadiyen ritimlerin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar ve saat transkripsiyonunu aktive edemeyen bir proteini ifade eden genetik olarak değiştirilmiş fareler, hiperaktivite ve artan ödül tepkileri ile karakterize edilir¹². Ortaya çıkan fenotipe, beynin ventral tegmental alanındaki dopaminerjik sinyalleşme için diferansiyel olarak düzenlenmiş genler aracılık ediyor gibi görünmektedir¹³.

Psikostimulan amfetamin gibi dopamin arttırıcı ilaçların uygulanması yoluyla dopamin sinyalini doğrudan etkilemenin hiperlokomosyona neden olduğu gösterilmiştir ve daha sonra geri çekilme, anhedoni¹⁴ dahil olmak üzere depresif benzeri semptomlarla ilişkilendirilmiştir. Ketamin veya dopamin D2 / D3 reseptör agonisti quinpirole ile ilgili farmakolojik zorlukların da BD^15,16 ile ilgili davranışı indüklediği gösterilmiştir.

Farmakolojik müdahaleye ek olarak, uyku yoksunluğu gibi çevre manipülasyonları, BD¹⁷ ile ilgili davranışsal fenotipleri indüklemek için kullanılabilir. Uykudan mahrum bırakılmış hayvanlar, dopamin sinyalindeki değişikliklerle ilişkili artan hareket ve ultrasonik seslendirmelerin emisyonu ile karakterize mani benzeri bir fenotip gösterir¹⁸.

Depresif¹⁹ veya mani benzeri²⁰ davranışı incelemek için çok sayıda başka kemirgen modeli vardır. Bununla birlikte, tüm bu modeller Behçet hastalığının anlaşılmasına güçlü bir şekilde katkıda bulunmuş olsa da, bir seferde yalnızca bir epizodu veya kısa vadeli etkileri inceleyerek sınırlıdırlar. Buna karşılık, duygusal durumlar arasındaki karakteristik geçişi modellemek zor olmuştur.

Burada, BD için benzersiz bir sıçan modeli için bir protokol sunulmaktadır. Dopamin sisteminin tek bir hedefli manipülasyonunu kullanarak, yani medial prefrontal korteksteki (mPFC) dopamin D1 reseptörünü (DRD1) tetrasiklin ile indüklenebilir bir lentiviral yapıdan şartlı olarak aşırı eksprese ederek bir hayvanda her iki olayı da indükleyerek artan yüz geçerliliğini gösterir. Kalmodulin kinaz II alfa (CamKIIa) promotörün kontrolü altında gen transkripsiyonunu sürdürerek, DRD1 esas olarak glutamaterjik nöronlarda eksprese edilir, böylece genetik manipülasyonun özgüllüğünü arttırır.

Orijinal lentivirüs omurgası pRRL.cPPT.WPRE.Sin, Dr. Didier Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, İsviçre)²¹ tarafından sağlandı ve GFP minigeninin bir polilinker bölgesi (lentivirus vektörü PL13) ile değiştirilmesiyle modifiye edildi. PL13 daha sonra PL13.pTRE2.DRD1.CamKIIa.rtTA3 veya PL13.pTRE2.dsRedExpress.CamKIIa.rtTA3 üretmek için kullanıldı. Sıçan DRD1'in cDNA'sı Dr. David Sibley'den (NINDS / NIH) ^{elde edildi22} ve ters tetrasiklin kontrollü aktivatör 3 (rtTA3) cDNA, Dr. Atze Das ve Ben Berkhout'tan (Akademik Tıp Merkezi, Amsterdam Üniversitesi)²³. CamKIIa promotör DNA'sı Dr. Karl Deisseroth (Stanford Üniversitesi, CA) tarafından sağlandı ve dsRedExpress ve tetrasiklin yanıt elemanı 2 (pTRE2) dizileri, sırasıyla kurum içi plazmitler pcDNA3.1-dsRedExpress ve pcDNA3.1-pTRE2'den alt klonlandı. Viral vektörler, kısıtlama bölgeleri ile çevrili PCR ile çoğaltılmış DNA dizilerinin alt klonlanmasıyla üretildi.

Bu viral vektörü kullanan model, mPFC CamKIIa-pozitif nöronlarda DRD1'in aşırı ekspresyonunun mani benzeri bir fenotipe^24,25 yol açtığını, gen ekspresyonunun müteakip aşağı regülasyonunun depresif benzeri davranışa neden olduğunu göstermiştir²⁶. Hastalık benzeri fenotip bir hayvanda tekrar tekrar indüklenebildiğinden²⁷, model yüksek düzeyde bir yüz geçerliliğini yansıtır. Ek olarak, dopamin sisteminin manipülasyonları, DRD1 seviyeleri^28,29 veya DRD1 polimorfizmlerindeki değişiklikler BD patolojisi^30,31,32 ile ilişkilendirildiğinden, BD^7'nin hayvan modelleri için güçlü yapı geçerliliğine sahiptir.

Diğer hayvan çalışmaları da prefrontal DRD1'in işlevlerinin daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır. Örneğin, DRD1'deki bir azalma, depresyon^{modellerinde 33,34} tutarlı bir bulgu iken, mPFC glutamaterjik nöronlarda DRD1'in optogenetik stimülasyonu kaygıyı azaltır ve antidepresif etkilere^{neden olur 35}. Wu ve ^ark.36 tarafından yakın zamanda yayınlanan bir yayında, mPFC DRD1'in duygusal durum geçişlerindeki rolü gösterilmiştir. Bu çalışma, bu reseptörlerin uyarıcı sinaps plastisitesindeki altta yatan değişiklikler için çok önemli olduğunu vurgulamaktadır.

Toplamda, mPFC'nin CamKIIa-pozitif nöronlarında DRD1'in hedefli ve koşullu manipülasyonundan oluşan bir sıçan BD modelinin kullanılması, yüksek yapı ve yüz geçerliliğine sahip bir model sistem oluşturur ve bu nedenle, Behçet hastalığı üzerinde translasyonel araştırma için güçlü bir potansiyel sergiler.

Aşağıda, model oluşturma için cerrahi prosedürler açıklanmaktadır. Ek olarak, model indüksiyonu ve davranışsal değerlendirmeler için metodolojik hususlar, ortaya çıkan hastalık benzeri fenotipin temsili sonuçlarının yanı sıra sunulacaktır. Model oluşturma ve davranışsal değerlendirmedeki olası engeller ve etkileyen faktörler tartışılır ve gelecekteki yönlere ilişkin bir bakış açısı verilir.

Burada tarif edilen stereotaktik enjeksiyon protokolü LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Northrhine-Westfalia, Almanya) tarafından onaylanmıştır. Erişkin erkek Sprague Dawley cinsi sıçanlar (350-650 g canlı ağırlık) kullanıldı. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Lentiviral yapılar

NOT: Kontrol koşulu olarak DRD1 veya kırmızı floresan proteinin (dsRed) koşullu ekspresyonu için üçüncü nesil bir lentiviral sistem kullanılır^25,27.

1. Stewart ve ^ark.37 tarafından hazırlanan protokole dayalı olarak lentivirüsü, Addgene deposundan 8454 ve 8455 ambalaj plazmitleri ile üretin.
   NOT: Virüs üretimi bağımsız olarak planlanmazsa, Charité Berlin, Almanya gibi birçok çekirdek tesis yüksek titreli lentivirüs sağlar.
2. Konsantre virüsleri titre edin ve -80 °C'de saklayın.
3. Enjeksiyonlar için μL başına 2 × 10⁷ dönüştürücü birim (TU) hazırlayın.
4. Virüsleri kuru buz üzerindeki cerrahi odaya taşıyın.

2. Hayvanlar

NOT: Behçet hastalığı için sıçan modeli, yetişkin erkek Sprague Dawley sıçanlarında (350-650 g vücut ağırlığı) kurulmuştur. Dişi sıçanların veya daha erken gelişimsel zaman noktalarının araştırılması için, mPFC'deki DRD1 ekspresyonunun gelişim sırasında değiştiğini ve östrus döngüsünden^{etkilenebileceğini düşünmek çok önemlidir} 38,39,40.

1. Sabit sıcaklık ve nem koşullarında (% 45 -% 65 bağıl nem, sıcaklık 22 ° C ± 2 ° C) yiyecek ve su ile aynı durumdaki hayvanlarla çift ev sıçanları.
2. Fareleri ters 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngüsü altında tutun (ışıklar saat 11'de kapalı), çünkü davranışsal araştırma, hayvanların karanlıkta aktif fazı sırasında yapılmalıdır.
3. Herhangi bir deneyin başlamasından önce hayvanlara tesise alışmaları ve deneyciler tarafından ele alınmaları için en az yedi gün verin.

3. Viral yapının stereotaktik enjeksiyonu

NOT: Ameliyatı bir güvenlik başlığı (lentivirüs ile çalışmak için önlem) ve aseptik koşullar altında gerçekleştirin.

1. Hazırlık
   1. Gerekli tüm malzemelerin mevcut ve işlevsel olduğundan emin olun (Malzeme Tablosu).
   2. Şırınga tutucu stereotaktik kola takılıyken stereotaktik çerçeveyi ayarlayın. Şırınga tutucusunu şırınga pompasına bağlayın.
   3. Diş matkabını kurun ve 0,9 mm'lik bir çapak monte edin.
   4. Isıtma yastığını yerleştirin ve 37 °C'ye ayarlayın. Farenin daha kolay konumlandırılması için ısıtma yastığını uygun bir yüksekliğe yükseltin.
   5. Isıtma yastığını emici bir örtü ile örtün.
   6. Steril bir yüzeyde otoklavlanmış cerrahi aletler hazırlayın.
   7. Şırınga tutucusuna 33 G enjeksiyon iğnesi ile 10 μL'lik bir stereotaksik enjeksiyon şırıngası monte edin.
   8. Her biri 1 μl'lik bilateral enjeksiyonlar için 2.3 μL viral süspansiyon çekin. Başarılı para çekme işlemini görsel olarak onaylayın. Lentivirüsün oda sıcaklığında olması için geçen süreyi en aza indirmek için bu adımı son hazırlık adımı olarak gerçekleştirdiğinizden emin olun.
2. Analjezi ve anestezi indüksiyonu
   1. Ameliyat sabahı meloksikam uygulayın (1 mg / kg vücut ağırlığı, p.o.).
   2. Analjezi için cerrahi prosedürlerin başlamasından yirmi dakika önce, sıçana buprenorfin (0.5 mg / kg vücut ağırlığı, s.c.) enjekte edin.
   3. Anestezi makinesini 0,8-1 L/dk oksijen akışı ile açın.
   4. İndüksiyon odasını %4 İzofluran ile doldurun ve fareyi indüksiyon odasına yerleştirin.
   5. Anestezinin başarılı bir şekilde indüksiyonundan sonra, yavaş solunum ve bilinç kaybı ile görülebilen, fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve stereotaktik çerçeveye taşıyın.
3. Sıçanın konumlandırılması
   1. Anestezi akışının burun maskesine geçtiğinden emin olun.
   2. Fareyi indüksiyon odasından stereotaktik çerçeveye aktarın ve ön dişlerini tutucuya yerleştirin.
   3. Anestezi maskesini burnun üzerine düzgün bir şekilde yerleştirin ve bakım için izofluranı %1.5-2.3'e çevirin.
   4. Steril göz kremi kullanarak gözleri koruyun.
   5. Herhangi bir insizyon yapmadan en az 10 dakika önce, fareye lokal olarak lidokain (10 mg / kg vücut ağırlığı, s.c.) planlanan insizyon bölgesinin hemen altına enjekte edin.
   6. Kulak çubukları kullanarak fareyi stereotaktik çerçeveye sabitleyin. Kulak çubuklarının eşit ve düz bir baş konumunda olduğundan emin olun.
   7. Makas kullanarak kesi yerinin etrafındaki kürkü kesin. Cilt antiseptiği ile nemlendirilmiş bir selüloz ped kullanarak kürk parçalarını çıkarın.
   8. Bir cilt antiseptiği kullanarak cerrahi alanı dezenfekte edin.
4. Kraniotomi ve viral yapı enjeksiyonu
   1. Ayak refleksi olup olmadığını kontrol ederek uygun anesteziyi sağlayın.
   2. Herhangi bir ekipmana dokunmadan önce ellerinizi dezenfekte edin ve steril eldivenlere geçin.
   3. Bir neşter bıçağı kullanarak küçük bir medial kesi (~ 1,5 cm) yapın.
   4. Bulldog kelepçeleri ile cildi yanlara doğru iterek cerrahi alana güvenli erişim.
   5. Steril takaslar kullanarak cerrahi alanı kandan ve kalan dokudan temizleyin. Bregmanın doğru görüşünü ve yeterli ön boşluğu sağlayın.
   6. A/P ve M/L koordinatlarını bregma'ya göre sıfıra ayarlayın.
   7. Stereotaktik kolu A/P + 2.7 ve M/L ± 0.4 koordinatlarına getirin ve dezenfekte edilmiş bir kalem kullanarak görselleştirin.
   8. Her iki yarım küre için enjeksiyon kenarlarını kaplayan ~ 1 mm çapında bir delik açın.
   9. Steril bir takas kullanarak kanı alın.
   10. Beynin yüzeyinde D / V koordinatlarını sıfıra ayarlayın ve mPFC'nin prelimbik alanına enjekte etmek için enjeksiyon iğnesini yavaşça -2.8'e indirin.
   11. Dokunun gevşemesi için 5 dakika bekleyin.
   12. 0.1 μL / dak oranında 1 μL viral süspansiyon enjekte edin.
   13. İğneyi yavaşça çıkarmadan önce emilim için 5 dakika bekleyin.
   14. Enjeksiyonu diğer yarım kürede tekrarlayın.
5. Kapanış ve ameliyat sonrası bakım
   1. İğneyi çıkarın ve kemik mumu kullanarak kafatasındaki açıklığı kapatın.
   2. Bulldog kelepçelerini çıkarın ve cildi dikin (3-0 cerrahi sütür).
   3. Postoperatif analjezi için sıçana meloksikam (1 mg / kg, sc) enjekte edin.
   4. Anesteziyi kapatın, hayvanı stereotaktik çerçeveden çıkarın ve ev kafesine yerleştirin. Farenin tamamen uyandığından emin olun.
   5. Kalan lentivirüsü etkisiz hale getirmek için şırıngayı% 100 etanol ile durulayın, ardından bir sonraki enjeksiyona hazırlık olarak damıtılmış H₂O ekleyin.
   6. 3 gün boyunca her 24 saatte bir meloksikam (1 mg / kg, p.o.) ile postoperatif analjezi yapın ve hayvanların sağlık durumunu 1 hafta boyunca puanlayın.
   7. Ameliyattan sonraki ilk 24 saat boyunca başkalarının dikişleri kurcalamasını önlemek için tek ev hayvanları. Daha sonra onları kafes arkadaşlarıyla birlikte geri yerleştirin.

4. Model indüksiyonu için doksisiklin tedavisi

NOT: Enjeksiyondan 24 saat sonra model indüksiyonunu başlatın. Ayrıca, enjeksiyon ve indüksiyon arasında birkaç aya kadar daha uzun süreler beklenebilir, örneğin aynı anda daha büyük hayvan kohortlarını test etmek için. Bunun viral yapının işlevselliğini etkilemediği gösterilmiştir.

1. Mani benzeri bir bölümün indüksiyonu
   1. Mani benzeri bir fenotipi indüklemek için, hayvanlara içme suyuna ekleyerek 0,5 g / L doksisiklin hyclate verin. Bu, viral transkripsiyonu ve ek DRD1'in aşırı ekspresyonunu indükler.
   2. Doksisiklin içeren suyu, opak olmayan su şişelerinde bile doksisiklin stabilitesinin etkilenmediği bir zaman aralığı olan her 48 saat ila 72 saatte bir taze olarak hazırlayın⁴¹.
      NOT: Yedi gün boyunca doksisiklin tedavisinden sonra, virüs aracılı aşırı ekspresyon maksimuma ulaşmış olacaktır ve mani benzeri atak sırasında davranışsal bir araştırma yapılabilir.
2. Depresif benzeri bir epizodun indüksiyonu
   1. Depresif benzeri bir atak başlatmak için hayvanları normal içme suyuna geri döndürün.
   2. Viral transkripsiyon durana kadar 4 gün bekleyin, ardından depresif benzeri epizodun davranışsal bir değerlendirmesini yapın.
   3. Aynı modeli takip ederek sonraki bölüm indüksiyonlarını gerçekleştirin.

5. Davranışsal değerlendirme

NOT: Model indüksiyonunu takiben, bipolar benzeri davranış değerlendirilebilir. Klinik semptomlardan kemirgenlerde gözlemlenebilen davranış kalıplarına kadar farklı çeviri çerçeveleri önerilmiştir. En etkili olanlardan biri, muhtemelen psikiyatrik bozukluklarda etkilenen işlevsellik ve davranış alanlarındaki değişikliklerin incelendiği araştırma alanı kriterleri^42'dir. Bununla birlikte, tür bariyeri nedeniyle, intihar eğilimi gibi bazı semptomların kemirgenlerde araştırılamayacağını belirtmek önemlidir⁴³. Gelişmiş bilişsel ve duygusal yetenekleri nedeniyle, sıçan modelleri, translasyonel semptom değerlendirmesi⁴⁴ için özellikle güçlü bir potansiyele sahiptir ve bu da daha ayrıntılı test prosedürlerine izin verir. Davranışsal değerlendirme için dikkat edilmesi gereken hususlar Tablo 1'de açıklanmıştır.

1. Ortaya çıkan fenotipin kapsamlı bir resmini sağlamak için davranışsal araştırmayı bir dizi davranışsal testler⁴⁵ olarak planlayın.
2. En son daha invaziv testler yapmaya dikkat edin.
3. Her iki hastalık benzeri atakta da bir hayvanı test etmeye çalışırken, potansiyel olarak önceki test deneyiminden kaynaklanan davranış değişikliklerini göz önünde bulundurun.
   NOT: Eldeki soruya bağlı olarak, mani veya depresif benzeri atak sırasında farklı sıçan gruplarını test etmek faydalı olabilir, bu da ilgili epizod sırasında doku toplanmasına izin verecektir. Deneyimler, davranışsal olarak saf hayvanların test edilmesinin, bazı davranışsal testlerde daha belirgin bir fenotiple sonuçlanabileceğini göstermiştir.
4. Ayrıca, barınma koşulları⁴⁶ veya deneycinin cinsiyeti⁴⁷ gibi diğer faktörleri de hesaba katın.
5. Sadece hayvan refahı için değil, aynı zamanda psikiyatrik fenotiplerin stresle olası etkileşimlerini dışlamak için hayvanlara istenmeyen stresi azaltmak için mümkün olan tüm önlemleri alın⁴⁸.
6. Sirkadiyen ritme özellikle dikkat edin, çünkü sirkadiyen ritmin bozulması BD^17'nin bir belirtisidir. Sıçanlar alacakaranlıkta ve şafakta en aktif olduklarından, ters aydınlık-karanlık döngüsü altında barındırılan hayvanlarla loş kırmızı ışık altında test edilmelidir⁴⁹.
   NOT: Burada sunulan temsili sonuçların çoğu bu yaklaşım izlenerek toplanmıştır. Bununla birlikte, davranışsal değerlendirme hayvanların gündüz-gece döngüsünü değiştirmeden yapılırsa, hastalık benzeri bir fenotip hala gözlemlenebilir²⁷.
7. Her zaman deneyi önceden kaydedin ve PREPARE⁵⁰ ve ARRIVE⁵¹ yönergelerini izleyerek yürütün ve açıklayın.

Hayvanların içme suyuna doksisiklin eklendiğinde, ek DRD1 eksprese edilecek ve 7 gün sonra, hayvanı mani benzeri davranış açısından test etmek için yeterli aşırı ekspresyon olacaktır. Şimdiye kadar, ödülle ilgili davranışlarda bir artış olduğu gösterilmiştir. Mani benzeri hayvanlar, kontrollere kıyasla iki şişeli bir seçim testinde suya göre daha fazla sükroz çözeltisi içerler²⁵. Alıcı bir dişi ile bir gözlem kutusuna konulduğunda ve 25 dakika boyunca gözlemlendiğinde, mani benzeri hayvanlar kontrollere kıyasla daha fazla cinsel uyum gösterir²⁷ (Şekil 1A). Kokainin kendi kendine idare paradigmasında, sabit oranlı bir program altında daha fazla kokain uygularlar ve aşamalı oranlı bir programda daha yüksek bir kırılma noktası gösterirler. Doz-yanıt eğrileri, düşük dozlara karşı daha yüksek duyarlılığa doğru kaydırılır²⁵. Duyarlılıktaki bu değişim, çeşitli yer koşullandırma paradigmalarında artan motivasyonel belirginlikte de gözlenir. Mani benzeri hayvanlar, kontrollere kıyasla nikotin, alkol ve kokain için şartlandırılmış taraflarda daha fazla zaman harcadılar²⁵. Gecikmeli indirime ilişkin T-labirent tabanlı bir testte artan yenilik arayışı ve daha dürtüsel seçimler de bulunmuştur²⁵. Iowa Kumar Görevinin edimsel sıçan versiyonunda, mani benzeri hayvanlar, kontrollere kıyasla dezavantajlı (yüksek risk, yüksek kazanç) seçeneklere daha sık karar verir²⁴ (Şekil 1B). Mani benzeri hayvanlarda kaygı, yükseltilmiş artı labirentte açık kollarda daha fazla zaman harcanmasıyla gösterildiği gibi azalır²⁵.

Depresif benzeri bir fenotip, DRD1 aşırı ekspresyonunun sonlandırılmasıyla indüklenebilir. Depresif benzeri dönemde, çaresizlikte bir artış gözlenebilir. Üçlü bir çaresizlik paradigmasında, ilk kez bir elektrik şoku ile karşılaşan grup (Şekil 1C) ve şoku kontrol etmeyi öğrenen grup, kendi kontrollerine kıyasla artan kaçış gecikmeleri ile daha çaresizdi²⁷. Çaresizliğin indüklendiği gruplar, deney ve kontrol hayvanı arasında herhangi bir fark göstermedi. Anhedonia, sakaroz²⁷ için iki şişe seçim testinde ve cinsel davranışta (yayınlanmamış veriler) bulundu. Mermer gömme testinde, depresif benzeri hayvanlar da daha endişeliydi²⁶ (Şekil 1D).

Tarif edilen hayvan modeli sadece mani veya depresif benzeri davranışları araştırma imkanı sunmakla kalmaz, aynı zamanda hastalarda maniden depresyona geçişe benzeyen DRD1 aşırı ekspresyonunu sonlandırırken davranıştaki bir değişikliği gözlemlemek için eşsiz bir fırsat sağlar. Burada, belirli davranışlara alışmayı akılda tutmak ve minimum alışkanlık ile testleri seçmek önemlidir. Örneğin, mani benzeri atakta ve depresif benzeri epizodda artan cinsel davranış, bu tür davranışların kontrol hayvanlarında görülen seviyelere indirgendiği gösterilmiştir. Bu deneyde, aynı hayvanda üç mani / depresif benzeri döngü indüklenmiştir²⁷. Sükroz içme için, mani benzeri durumda sükroz çözeltisinin tercihi, depresif benzeri duruma geçildiğinde sadece kontrol seviyelerine düşürülmekle kalmadı, aynı zamanda azaldı²⁷. Iowa kumar görevinin sıçan versiyonunda, mani benzeri hayvanlarda dezavantajlı seçeneklerin sayısı artmıştır, ancak hayvanlar depresif benzeri durumdayken kontrollerden önemli ölçüde farklı değildir. İkinci durumda, toplam kazanılan pelet sayısı, kontrol hayvanlarına kıyasla azalmıştır²⁴.

Genel olarak, hayvanlar her iki atak sırasında farklı davranışsal alanlarda gözlemlenebilen sağlam bir bipolar benzeri fenotip gösterir. Bu modeldeki bölümler arasındaki geçiş, gelişmiş yüz geçerliliğine katkıda bulunur. Etkilenen davranışsal alanlara genel bir bakış Şekil 2'de verilmiştir.

Şekil 1: Viral DRD1 aşırı ekspresyonunu takiben mani ve depresyon benzeri durumlardaki davranış değişiklikleri. Viral DRD1 aşırı ekspresyonu sırasında, mani benzeri durumda, hayvanlar kontrollere kıyasla daha fazla cinsel montaj (A) ve Iowa Kumar Görevinde (B) riskli seçimlerde artış gösterir. Aşırı ifadenin sona ermesinden sonra, hayvanlar depresif benzeri bir duruma geçer. Çaresizlik (C) ve kaygı (D) artışını gösterirler. *p < 0.05; **p < 0.01; Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Modelin davranışsal fenotipi. Mani benzeri epizodda, ödülle ilgili davranışlarda (örneğin cinsel davranış), dürtüsellikte ve risk almada bir artış vardır. Yükseltilmiş artı labirent testinde kaygı azaldı. Depresif benzeri dönem sırasında, mermer gömme testinde kaygı artmış, cinsel davranış azalmış ve hayvanlar daha fazla çaresizlik göstermiştir. Şekildeki sıçanın görüntüsü Servier Medical Art'tan alınmıştır ve CC BY 4.0 altında lisanslanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Davranışsal değerlendirme için dikkat edilmesi gereken hususlar. Tablo, davranışsal değerlendirme sırasında ana deneysel adımlar için önemli hususları vurgulamaktadır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Burada, Behçet hastalığı için artmış yüz geçerliliğine sahip yeni bir sıçan modeli sunulmuştur. mPFC'de DRD1'in hedefli bir manipülasyonu, aynı hayvanda mani ve depresif benzeri bir fenotipin indüksiyonuna izin verir. Temsili sonuçlar, her iki atakta da gözlemlenebilir hastalık benzeri bir fenotipi vurgulamaktadır. Modelin uygulanması nispeten kolaydır. Kontrol olarak DRD1 veya dsRed'i ifade eden iki indüklenebilir lentiviral vektöre ihtiyaç vardır. Hayvanlarda lentiviral sistemlerin üretimi ve kullanımı için, yerinde olması gereken belirli güvenlik seviyeleri gereklidir. Virüs üretimi için gerekli ekipman mevcut değilse, çekirdek tesislerle çalışma deneyimi olumlu olmuştur.

Modeli oluşturmak için en önemli adım, lentiviral sistemin stereotaktik enjeksiyonudur. Stereotaktik ameliyatlar nörobilimde iyi bilinen prosedürlerdir ve eğitimli araştırmacılar arasında başarı oranları yüksektir. İki ana olası hata kaynağı vardır. Anestezi ile ilgili sorunlar cerrahi işlem sırasında ölümlere yol açabilir. Burada, protokolde tarif edildiği gibi izofluran inhalasyon anestezisinin kullanılması, kolayca ayarlanabilen ilaç seviyelerinin enjeksiyon anestezisine kıyasla net bir fayda sağlaması nedeniyle en iyi yaklaşım olduğunu kanıtlamıştır. İzofluran herhangi bir analjezik etki sağlamadığından ve meningeal nosiseptörler stimülasyona^{duyarlı olduğundan 52}, intraoperatif analjezi için bir opioid kullanılması önerilir. Protokolde tarif edildiği gibi uygun postoperatif ilaç tedavisi ile kombine edildiğinde, postoperatif ağrının gözlemlenebilir bir belirtisi yoktur. Bununla birlikte, araştırma soruları üzerindeki olası etkiler, örneğin dopaminin opioid sistemi ile etkileşimleri ile ilgili olarak, her zaman göz önünde bulundurulmalı ve buna göre uygun bir ilaç rejimi seçilmelidir⁵³. Ameliyat aseptik koşullar altında yapılırsa, enfeksiyonların ortaya çıkması veya yara iyileşmesinin bozulması nadirdir. Ameliyat veya iyileşme sırasında sorunlar ortaya çıkarsa, sorun giderme açıklanan protokolün doğru şekilde uygulanmasına odaklanmalıdır. Aseptik çalışma koşullarının sağlanması ve ilaçların hassas dozlanması çok önemlidir. Sıvı veya glikoz çözeltilerinin uygulanması ayrıca iyileşmeye yardımcı olabilir. Enfeksiyonlar meydana gelirse, tedavi herhangi bir tetrasiklin içermemelidir, çünkü bunlar viral sistemlerin transkripsiyonu ile etkileşime girecektir. Postoperatif yara enfeksiyonları için ilk basamak tedavi, muhtemelen carprofen ile kombine edilen enrofloksasin olacaktır.

Ameliyat sırasında bir başka olası hata kaynağı, enjeksiyonun hedef alanın dışına yerleştirilmesidir. Bununla birlikte, bu, protokol doğru bir şekilde takip edildiğinde ve hayvanın kafasının uygun şekilde konumlandırılması sağlandığında nadiren ortaya çıkar. Başarılı yerleştirme her zaman doğrulanmalıdır. dsRed eksprese eden virüsün yerleşimi kontrol hayvanlarında kolayca tespit edilebilirken, DRD1 eksprese eden virüslerin yerleşim doğrulaması ekstra adımlar gerektirir. Viral yapının farklı kısımlarına karşı antikor boyaması yapılması tatmin edici sonuçlar vermedi. Beyer ve ^ark.24'te açıklandığı gibi rtTA3 transkriptlerini tespit etmek için mPFC'yi diseke ederek ve bir PCR gerçekleştirerek virüs yerleşiminin doğrulanması önerilir. Virüsün enjeksiyonunun eşit miktarda virüs ile iki taraflı olması gerektiğine dikkat etmek de önemlidir. Bipolar bozukluğu olan hastalarda serebral ve davranışsal lateralizasyonun farklı olduğu gösterilmiştir^54,55 ve tek taraflı viral enjeksiyonlar istenen davranışsal fenotipi indüklemeyebilir.

Viral DRD1 ekspresyonunun indüksiyonu ve içme suyuna doksisiklin ekleyerek mani benzeri atak çok iyi çalışır. Normal içme suyunun doksisiklin ile değiştirilmesinin, içme davranışında belirgin değişikliklere neden olmadığı kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, sıvı tüketimi izlenmelidir. Diğer maddelerin, örneğin ilaçların, içme suyu yoluyla uygulanması amaçlanıyorsa, modülasyonlar mümkündür. Doksisiklin uygulaması, gıda peletleri yoluyla da gerçekleştirilebilir. Ancak bu henüz doğrulanmadı.

Davranışsal araştırma için, Tablo 1'de çeşitli hususlar listelenmiştir. Bir deney planlanırken özellikle modele özgü gereksinimlerin değerlendirilmesi gerekir. Örneğin, iki grup hayvanın test edilip edilmeyeceğine veya bir hayvanın her iki atak sırasında da davranışsal değerlendirmeye tabi tutulup tutulmayacağına karar verilmelidir, bu da yeniden test edilmesi gerektirebilir. Davranışsal araştırma sırasında bipolar benzeri fenotip tespit edilemezse, yerleştirme doğrulanabilse de, sorun giderme, davranışsal sonucu etkileyebilecek çeşitli faktörlere odaklanabilir. Deneycilerdeki veya sirkadiyen ritimdeki değişiklikler, ortamdaki stresli koşullar davranışsal sonuçları etkileyebileceğinden, süreç boyunca eleştirel olarak değerlendirilmelidir.

Model iyi bir yapı ve yüz geçerliliği gösterse de, tahmine dayalı geçerliliğin hala değerlendirilmesi gerekir. BD^56'nın birinci basamak tedavisi olan kronik lityum uygulaması, modele bağlı davranış değişikliklerini önlemede başarılı olmalıdır. Antipsikotik veya antikonvülsif ilaçlar gibi Behçet hastalığında kullanılan diğer ilaçlara verilen yanıtlar, modelin öngörücü geçerliliğini tam olarak test etmek için araştırılabilir.

Ek olarak, mevcut bir sınırlama, dişi hayvanlarda model geçerliliğinin gelecekteki çalışmalarda hala değerlendirilmesi gerektiğidir. Klinik öncesi araştırmalara dişi hayvanları dahil etme eğilimi olsa da, bu genellikle hala ihmal edilmektedir. Sunulan model için, dopamin sisteminin östrus döngüsü ile etkileşimleri beklenmektedir. Bununla birlikte, ne ölçüde meydana gelecekleri belirsizdir. Psikiyatrik hayvan modellerinin genel sınırlamalarını akılda tutmak da önemlidir. Bir sıçanda her iki hastalık benzeri epizodun indüklenme olasılığı artmış yüz geçerliliği sağlarken, harici olarak indüklenen değişiklikler hala Behçet hastalarında hastalık ataklarının spontan oluşumu ve döngüsünden farklıdır. Model yalnızca dopamin sisteminin hedefli manipülasyonuna dayandığından, ana etkiler dopamin iletimindeki değişiklikler ve ilgili ikincil etkilerden kaynaklanacaktır. Bu nedenle diğer sistemlerin Behçet hastalığının semptomolojisine katkıları hesaba katılmamaktadır.

Sonuç olarak, sunulan model, her iki hastalık atağı da tek bir hayvanda incelenebildiğinden, Behçet hastalığını araştırmak için güçlü bir potansiyele sahiptir. Bu, çoğu yerleşik modele kıyasla bölümler arasındaki geçişlerin araştırılması için benzersiz olanaklar sunar. Sunulan protokol, çoğu klinik öncesi araştırma laboratuvarında mevcut olan ekipman ve teknik beceriler gerektirir ve bu da onu yaygın olarak uygulanabilir hale getirir. Şimdiye kadar, ortaya çıkan davranışsal fenotip, farklı davranışlar arasında sağlam olmuştur. Sosyal davranış⁵⁷ veya bilişsel işlevler gibi diğer alanlar henüz keşfedilmemiştir. Sunulan protokol davranışsal sonuçlara odaklanırken, moleküler mekanizmaları daha fazla araştırmak için gelecekteki uygulamalar için çeşitli olasılıklar vardır. Behçet hastalığı patogenezinde altta yatan mekanizmaları, özellikle ataklar arasındaki geçişi anlamak için araştırmaların genişletilmesi, sonunda gelecekteki klinik uygulamalara çevrilebilecek terapötik hedeflerin belirlenmesine yol açabilir.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı'nın (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG) hibeleri ile desteklenmiştir: 552842155 numaralı proje ve GRK2862/1, proje no: 492434978. JA, Bochum Ruhr-Universität Tıp Fakültesi FoRUM Araştırma Fonu'ndan fon aldı (Hibe no. P109-24). Şekil 2'deki sıçanın görüntüsü Servier Medical Art'tan alınmıştır ve CC BY 4.0 altında lisanslanmıştır.