Разработка модели биполярного расстройства на крысах

В данной статье представлен протокол индукции уникальной модели биполярного расстройства у крыс, которая охватывает как манийное, так и депрессивное поведение.

Биполярное расстройство — это психическое расстройство, характеризующееся экстремальными перепадами настроения, включая периоды эмоциональных подъемов (мания) и спадов (депрессия). В то время как точная нейробиология, лежащая в ее основе, еще не до конца понятна, дисбаланс в нейротрансмиттерных системах, особенно дофамин, по-видимому, играет центральную роль. По этой причине манипуляции дофаминергическими путями использовались для моделирования мании или депрессии у грызунов. Тем не менее, модели, которые точно представляют типичный переход между этими двумя эпизодами, встречаются редко, что ограничивает лицевую валидность. В уникальной модели используются современные методы для временного увеличения экспрессии рецептора дофамина D1, который был вовлечен в патологию биполярного расстройства. Лентивирусная конструкция, индуцируемая тетрациклином, которая экспрессирует рецептор дофамина D1 под контролем промотора кальмодулинкиназы II альфа, стереотаксически вводится в медиальную префронтальную кору взрослых крыс. Сверхэкспрессия рецептора дофамина D1 достигается путем добавления аналога тетрациклина доксициклина в питьевую воду животных, что приводит к увеличению импульсивного и рискованного поведения, связанного с вознаграждением, а также к снижению тревожности. Такое поведение напоминает фенотип, похожий на манию. При удалении доксициклина из питьевой воды у одного и того же животного может возникнуть депрессивный фенотип, характеризующийся повышенной беспомощностью и ангедонией. В этой статье представлен пошаговый протокол проведения операции, а также процедуры для индукции фенотипа биполярного расстройства. Кроме того, описываются соображения по оценке поведенческих изменений, связанных с манийным и депрессивным поведением. Эта многообещающая модель, которая демонстрирует хорошую конструкцию и валидность лица, предлагает ценный инструмент для дальнейшего исследования патофизиологических механизмов биполярного расстройства.

Биполярное расстройство (ББ) — это тяжелое расстройство настроения, которым страдает около 1% населения мира¹. Для него характерны эпизоды крайнего настроения, депрессии и мании, а также эутимические состояния. Симптомы депрессивных эпизодов при ББ напоминают симптомы униполярной депрессии. Пациенты проявляют сниженный интерес и удовольствие от деятельности, а также чувство грусти, безнадежности и никчемности. Кроме того, часто могут наблюдаться изменения аппетита, поведения во время сна, а также когнитивные нарушения². Маниакальные эпизоды характеризуются аномально повышенным настроением, снижением потребности во сне, социальной расторможенностью, повышением самооценки и чувством грандиозности, а также повышенной склонностью к риску и раздражительностью.

Этиология заболевания ББ, по-видимому^{, представляет} собой сложное взаимодействие генетических факторов и факторов развития3, но точные механизмы, участвующие в его патофизиологии, до сих пор до конца не изучены. Считается, что симптомы возникают из-за дисбаланса в нейротрансмиттерных системах⁴ и, в частности, исследования, посвященные дофаминовой системе, оказали влияние⁵. Например, Berk et ^al.6 постулировали дофаминовую гипотезу, предположив, что в основе мании лежит гипердофаминергическое состояние, в то время как депрессия возникает из гиподофаминергии. С тех пор данные на животных моделях, а также фармакологические и визуализирующие исследования собрали убедительную поддержку связи между маниакальными симптомами и гипердофаминергией. Кроме того, была обнаружена связь между снижением дофаминергической сигнализации и эпизодами депрессии, хотя и в меньшей степени⁷. Кроме того, результаты генетических исследований укрепили идею о дофаминовой гипотезе BD⁸.

Чтобы еще больше пролить свет на роль дофаминовой системы при ББ, животные модели могут быть использованы для исследования нейробиологических механизмов, лежащих в основе симптомов. Применение и ограничения моделей заболеваний часто оцениваются на основе трех критериев валидации, первоначально предложенных Willner⁹. К ним относятся лицевая валидность, конструктивная и прогностическая валидность. Валидность лица описывает способность модели имитировать поведенческие характеристики расстройства. Конструктная валидность достигается, когда патофизиология и этиология расстройства являются основой модели, в то время как прогностическая валидность подразумевает, что фармакологическое лечение расстройства может быть воспроизведено в рамках модели.

До сих пор различные модели грызунов внесли свой вклад в понимание BD¹⁰ и включают в себя широкий спектр генетических модификаций, фармацевтических вмешательств, а также манипуляций с окружающей средой¹¹.

Например, было показано, что экспериментальные манипуляции с геном Clock вызывают у мышей феномен, похожий на манию. Фактор транскрипции CLOCK играет важную роль в регулировании циркадных ритмов, а генетически измененные мыши, экспрессирующие белок, который не может активировать транскрипцию Clock, характеризуются гиперактивностью и повышенными реакциями на вознаграждение¹². Полученный фенотип, по-видимому, опосредован дифференциально регулируемыми генами дофаминергической сигнализации в вентральной тегментальной области мозга¹³.

Было показано, что прямое влияние на передачу сигналов дофамина через прием препаратов, повышающих уровень дофамина, таких как психостимулятор амфетамин, вызывает гиперлокомоцию, а последующая отмена была связана с депрессивными симптомами, включая ангедонию¹⁴. Также было показано, что фармакологические проблемы, связанные с кетамином или агонистом дофаминовых D2/D3 рецепторов хинпиролом, индуцируют поведение, соответствующее BD^15,16.

В дополнение к фармакологическому вмешательству, манипуляции с окружающей средой, такие как лишение сна, могут быть использованы для индуцирования поведенческих фенотипов, относящихся к BD¹⁷. Животные, лишенные сна, демонстрируют феномен, похожий на манию^, характеризующийся усилением локомоции и излучением ультразвуковых вокализаций, которые связаны с изменениями в передаче сигналов дофамина.

Существует множество других моделей грызунов для изучения депрессивного¹⁹ или манийного²⁰ поведения. Однако, несмотря на то, что все эти модели внесли значительный вклад в понимание патологии BD, они ограничены изучением только одного эпизода за раз или краткосрочных эффектов. В отличие от этого, моделирование характеристического переключения между аффективными состояниями оказалось труднодостижимым.

Здесь представлен протокол уникальной модели крысы для BD. Он демонстрирует повышенную лицевую валидность путем индуцирования обоих эпизодов у одного животного с использованием одной целенаправленной манипуляции с дофаминовой системой, т.е. условной сверхэкспрессии дофаминового рецептора D1 (DRD1) в медиальной префронтальной коре (mPFC) из тетрациклин-индуцируемой лентивирусной конструкции. Управляя транскрипцией гена под контролем промотора кальмодулинкиназы II альфа (CamKIIa), DRD1 в основном экспрессируется в глутаматергических нейронах, тем самым повышая специфичность генетической манипуляции.

Оригинальный костяк лентивируса pRRL.cPPT.WPRE.Sin был предоставлен доктором Дидье Троно (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Швейцария)²¹ и модифицирован путем замены минигена GFP на сайт полилинкера (лентивирусный вектор PL13). Затем PL13 был использован для производства PL13.pTRE2.DRD1.CamKIIa.rtTA3 или PL13.pTRE2.dsRedExpress.CamKIIa.rtTA3. КДНК DRD1 крысы была получена от д-ра Дэвида Сибли (NINDS/NIH)²², а кДНК обратного тетрациклина-контролируемого активатора 3 (rtTA3) от д-ра Атце Даса и Бена Беркхаута (Академический медицинский центр, Амстердамский университет)²³. ДНК-промотор CamKIIa была предоставлена доктором Карлом Дейссеротом (Стэнфордский университет, Калифорния), а последовательности dsRedExpress и тетрациклинового ответного элемента 2 (pTRE2) были субклонированы из собственных плазмид pcDNA3.1-dsRedExpress и pcDNA3.1-pTRE2 соответственно. Вирусные векторы были получены путем субклонирования ПЦР-амплифицированных последовательностей ДНК, фланкированных сайтами рестрикции.

Модель, использующая этот вирусный вектор, продемонстрировала, что сверхэкспрессия DRD1 в mPFC CamKIIa-положительных нейронах приводит к феномену, подобному мании^24,25, в то время как последующее подавление экспрессии генов индуцирует депрессивное поведение²⁶. Поскольку болезнеподобный фенотип может быть повторно индуцирован у одного животного²⁷, модель отражает высокий уровень лицевой валидности. Кроме того, манипуляции с дофаминовой системой имеют сильную конструктную валидность для животных моделей BD⁷, поскольку изменения уровней DRD1^28,29 или полиморфизмов DRD1 были связаны с патологией BD^30,31,32.

Другие исследования на животных также привели к лучшему пониманию функций префронтального DRD1. Например, снижение DRD1 было последовательным результатом в моделях депрессии^33,34, в то время как оптогенетическая стимуляция DRD1 в глутаматергических нейронах mPFC снижает тревожность и индуцирует антидепрессивные^{эффекты}. В недавней публикации Wu et ^al.36 была продемонстрирована роль mPFC DRD1 в переходе в аффективное состояние. Это исследование подчеркивает, что эти рецепторы имеют решающее значение для основных изменений в пластичности возбуждающих синапсов.

В целом, использование крысиной модели ББ, состоящей из целенаправленных и условных манипуляций с DRD1 в CamKIIa-позитивных нейронах mPFC, представляет собой модельную систему с высокой конструкционной и лицевой валидностью и, таким образом, демонстрирует большой потенциал для трансляционных исследований ББ.

Ниже описаны хирургические процедуры для создания модели. Кроме того, будут представлены методологические соображения по модельной индукции и поведенческой оценке наряду с репрезентативными результатами результирующего болезненного фенотипа. Обсуждаются возможные препятствия и влияющие факторы на формирование модели и оценку поведения, а также дается прогноз на будущие направления.

Описанный здесь протокол стереотаксической инъекции был одобрен LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Северный Рейн-Вестфалия, Германия). Использовали взрослых самцов крыс Sprague Dawley (масса тела 350-650 г). Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Лентивирусные конструкции

Примечание: Лентивирусная система третьего поколения используется для условной экспрессии DRD1 или красного флуоресцентного белка (dsRed) в качестве контрольного условия^25,27.

1. Получить лентивирус на основе протокола Stewart et ^al.37 с упаковкой плазмид 8454 и 8455 из репозитория Addgene.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если производство вируса не планируется самостоятельно, многие основные предприятия, такие как Charité Berlin, Германия, поставляют лентивирус с высоким титром.
2. Титровать концентрированные вирусы и хранить их при температуре -80 °C.
3. Подготовьте 2 × 10⁷ преобразователей (TU) на мкл для инъекций.
4. Транспортировка вирусов в операционный кабинет на сухом льду.

2. Животные

ПРИМЕЧАНИЕ: Крысиная модель BD была установлена на взрослых самцах крыс Sprague Dawley (масса тела 350-650 г). Для исследования самок крыс или более ранних временных точек развития крайне важно учитывать, что экспрессия DRD1 в mPFC изменяется во время развития и может зависеть от эстрального цикла 38,39,40.

1. Парные домашние крысы с животными одинаковых условий получают пищу и воду в неограниченном количестве при постоянной температуре и влажности (относительная влажность 45%-65%, температура 22 °C ± 2 °C).
2. Держите крыс в обратном 12-часовом цикле свет-темнота (свет выключается в 11 часов утра), так как поведенческое исследование должно проводиться во время активной фазы животных в темноте.
3. Дайте животным не менее семи дней на акклиматизацию к помещению и обращению с экспериментаторами до начала любых экспериментов.

3. Стереотаксическое введение вирусной конструкции

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите операцию под защитным колпаком (мера предосторожности при работе с лентивирусом) и в асептических условиях.

1. Подготовка
   1. Убедитесь, что все необходимые материалы доступны и функциональны (Таблица материалов).
   2. Установите стереотаксическую рамку с держателем шприца, прикрепленным к стереотаксической руке. Подсоедините держатель шприца к шприцевому насосу.
   3. Установите бормашину и установите заусенец диаметром 0,9 мм.
   4. Постелите грелку и установите ее на 37 °C. Поднимите грелку на соответствующую высоту, чтобы крысе было удобнее ее разместить.
   5. Накройте грелку впитывающей простыней.
   6. Подготовьте автоклавные хирургические инструменты на стерильной поверхности.
   7. Установите стереотаксический инъекционный шприц объемом 10 мкл с инъекционной иглой 33 G к держателю шприца.
   8. Выводят 2,3 мкл вирусной суспензии для двусторонних инъекций по 1 мкл каждая. Визуально подтвердите успешный вывод средств. Обязательно выполните этот шаг в качестве последнего подготовительного шага, чтобы свести к минимуму время, необходимое для того, чтобы лентивирус находился при комнатной температуре.
2. Анальгезия и индукция анестезии
   1. Утром в день операции введите мелоксикам (1 мг/кг массы тела, су..).
   2. За 20 минут до начала хирургических процедур по обезболиванию введите крысе бупренорфин (0,5 мг/кг массы тела, сук.).
   3. Включите наркозный аппарат с потоком кислорода 0,8-1 л/мин.
   4. Залейте индукционную камеру 4 % изофлураном и поместите крысу в индукционную камеру.
   5. После успешной индукции анестезии, заметной по замедленному дыханию и потере сознания, извлеките крысу из индукционной камеры и переместите ее в стереотаксическую рамку.
3. Позиционирование крысы
   1. Убедитесь, что поток анестезии переключился на маску для носа.
   2. Перенесите крысу из индукционной камеры в стереотаксическую рамку, поместив ее передние зубы в держатель.
   3. Правильно наденьте маску для анестезии на нос и поверните изофлуран до 1,5-2,3% для поддержания.
   4. Защитите глаза с помощью стерильного крема для глаз.
   5. Не менее чем за 10 минут до того, как будет сделан разрез, местно введите крысе лидокаин (10 мг/кг массы тела, с.к.) непосредственно ниже запланированного места разреза.
   6. Закрепите крысу в стереотаксической рамке с помощью ушных ушей. Убедитесь, что ушные планки расположены ровно и находятся в ровном положении головы.
   7. Подстригите шерсть вокруг места разреза с помощью ножниц. Снимите меховые пучки с помощью целлюлозной прокладки, смоченной в антисептике для кожи.
   8. Продезинфицируйте операционное поле с помощью кожного антисептика.
4. Краниотомия и инъекция вирусной конструкции
   1. Обеспечьте надлежащую анестезию, проверив отсутствие рефлекса на палец стопы.
   2. Продезинфицируйте руки и переденьте стерильные перчатки перед прикосновением к любому оборудованию.
   3. Сделайте небольшой медиальный разрез (~1,5 см) с помощью лезвия скальпеля.
   4. Обеспечьте безопасный доступ к операционному полю, сдвинув кожу в стороны с помощью бульдожьих зажимов.
   5. Очистите операционное поле от крови и остатков тканей с помощью стерильных замен. Обеспечьте правильное зрение брегмы и достаточное переднее пространство.
   6. Установите координаты A/P и M/L в ноль на основе брегмы.
   7. Переместите стереотаксический манипулятор в координаты A/P + 2,7 и M/L ± 0,4 и визуализируйте с помощью продезинфицированного карандаша.
   8. Просверлите отверстие диаметром ~1 мм, охватывающее стороны впрыска для обеих полусфер.
   9. Удалите кровь с помощью стерильной подкачки.
   10. Установите координаты D/V равными нулю на поверхности мозга и медленно опустите иглу для инъекции до -2,8 для инъекции в прелимбическую область mPFC.
   11. Подождите 5 минут, чтобы дать возможность расслабиться ткани.
   12. Введите 1 мкл вирусной суспензии со скоростью 0,1 мкл/мин.
   13. Подождите 5 минут для впитывания, прежде чем медленно извлекать иглу.
   14. Повторите инъекцию в другое полушарие.
5. Закрытие и послеоперационный уход
   1. Извлеките иглу и закройте отверстие в черепе с помощью костного воска.
   2. Снимите бульдожьи зажимы и зашите кожу (хирургический шов 3-0).
   3. Введите крысе мелоксикам (1 мг/кг, а.к.) для послеоперационной анальгезии.
   4. Выключите анестезию, извлеките животное из стереотаксической рамки и поместите его в домашнюю клетку. Следите за тем, чтобы крыса полностью проснулась.
   5. Промойте шприц 100% этанолом, чтобы деактивировать оставшийся лентивирус, с последующим дистиллированием H₂O при подготовке к следующей инъекции.
   6. Проводите послеоперационную анальгезию мелоксикамом (1 мг/кг, сутб.) каждые 24 ч в течение 3 дней и оценивайте состояние здоровья животных в течение 1 недели.
   7. Одиночные домашние животные в течение первых 24 часов после операции, чтобы предотвратить повреждение швов другими людьми. После этого поместите их обратно к соседям по клетке.

4. Лечение доксициклином для модельной индукции

ПРИМЕЧАНИЕ: Начните индукцию модели уже через 24 часа после инъекции. Можно также подождать более длительные периоды времени между инъекцией и индукцией до нескольких месяцев, например, чтобы одновременно протестировать большие когорты животных. Было показано, что это не влияет на функциональность вирусной конструкции.

1. Введение в действие эпизода, похожего на манию
   1. Чтобы вызвать манийный фенотип, давайте животным 0,5 г/л доксициклина гиклата, добавляя его в питьевую воду. Это индуцирует вирусную транскрипцию и сверхэкспрессию дополнительного DRD1.
   2. Готовьте воду, содержащую доксициклин, в свежем виде каждые 48-72 часа, в течение которого стабильность доксициклина не изменяется, даже в непрозрачных бутылках для воды⁴¹.
      Примечание: После лечения доксициклином в течение семи дней вирус-опосредованная гиперэкспрессия достигнет своего максимума, и можно будет проводить поведенческое исследование во время эпизода, похожего на манию.
2. Индукция депрессивного эпизода
   1. Переключите животных обратно на обычную питьевую воду, чтобы вызвать депрессивный эпизод.
   2. Подождите 4 дня, пока вирусная транскрипция не прекратится, затем проведите поведенческую оценку депрессивного эпизода.
   3. Проводите последующие индукции эпизодов по той же схеме.

5. Поведенческая оценка

ПРИМЕЧАНИЕ: После модельной индукции можно оценить биполярное поведение. Были предложены различные рамки перевода от клинических симптомов к поведенческим моделям, наблюдаемым у грызунов. Одним из наиболее влиятельных является критерий⁴² исследовательской области, в рамках которого изучаются изменения в сферах функционирования и поведения, которые могут быть затронуты психическими расстройствами. Однако важно отметить, что из-за видового барьера некоторые симптомы, например, суицидальность, не могут быть исследованы у грызунов⁴³. Благодаря своим развитым когнитивным и эмоциональным способностям, крысиные модели обладают особенно сильным потенциалом для оценки трансляционных^{симптомов44}, что позволяет проводить более сложные процедуры тестирования. Соображения по оценке поведения описаны в таблице 1.

1. Планируйте поведенческое исследование в виде батареи поведенческих тестов⁴⁵, чтобы получить полную картину результирующего фенотипа.
2. Обратите внимание на проведение более инвазивных тестов в последнюю очередь.
3. Учитывайте изменения в поведении, которые могут возникнуть в результате предыдущего опыта испытаний, когда вы пытаетесь протестировать одно животное в обоих эпизодах, подобных болезни.
   Примечание: В зависимости от поставленного вопроса, может быть полезно тестировать различные группы крыс либо во время манийного, либо во время депрессивного эпизода, что также позволит собрать ткани во время соответствующего эпизода. Опыт показывает, что тестирование наивных в поведении животных может привести к более выраженному фенотипу в определенных поведенческих тестах.
4. Также следует учитывать и другие факторы, такие как жилищные условия⁴⁶ или пол экспериментатора⁴⁷.
5. Принять все возможные меры для снижения нежелательного стресса у животных, не только для благополучия животных, но и для исключения возможного взаимодействия психических фенотипов^{со стрессом}.
6. Обратите особое внимание на циркадный ритм, так как нарушения циркадного ритма являются симптомом BD¹⁷. Поскольку крысы наиболее активны в сумерках и на рассвете, следует проводить испытания при тусклом красном свете с животными, содержащимися в обратном^цикле света и темноты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство репрезентативных результатов, представленных здесь, были собраны с использованием этого подхода. Тем не менее, болезненный фенотип все еще можно наблюдать, если поведенческую оценку проводить без переключения цикла дня и ночи у^{животных.}
7. Всегда предварительно регистрируйте и проводите эксперимент и описывайте следующие рекомендации PREPARE⁵⁰ и^ARRIVE51 .

Когда доксициклин добавляется в питьевую воду животных, дополнительный DRD1 будет экспрессироваться, и через 7 дней будет наблюдаться достаточная сверхэкспрессия, чтобы проверить животное на манийное поведение. До сих пор было продемонстрировано увеличение поведения, связанного с вознаграждением. Животные, похожие на манию, пьют больше раствора сахарозы по сравнению с водой в тесте на выбор из двух бутылок по сравнению с контрольной^{группой 25}. При помещении в камеру для наблюдения с восприимчивой самкой и наблюдении в течение 25 минут, животные, похожие на манию, демонстрируют больше сексуальных наклонностей по сравнению с контрольной группой²⁷ (рисунок 1А). В парадигме самостоятельного введения кокаина они вводят больше кокаина по схеме с фиксированным соотношением и демонстрируют более высокую точку разрыва при схеме с прогрессивным соотношением. Их кривая «доза-реакция» смещена в сторону более высокой чувствительности к низким дозам²⁵. Этот сдвиг в чувствительности также наблюдается в повышении мотивационной значимости в парадигмах обусловливания в нескольких местах. Животные, похожие на манию, проводили больше времени в кондиционированных сторонах для никотина, алкоголя и кокаина по^{сравнению с} контрольной группой. Также было обнаружено увеличение поиска новизны и более импульсивный выбор в тесте на основе Т-лабиринта с отсроченным дисконтированием²⁵. В оперантной версии задания на азартные игры в Айове животные, похожие на манию, чаще выбирают невыгодные варианты (высокий риск, высокая прибыль) по сравнению с контрольной группой²⁴ (рисунок 1B). Тревожность у животных, похожих на манию, снижается, о чем свидетельствует большее время, проведенное на распростертых объятиях в лабиринте с возвышенностью^{плюс 25}.

Депрессивный фенотип может быть индуцирован прекращением сверхэкспрессии DRD1. В депрессивном эпизоде можно было наблюдать нарастание беспомощности. В триадической парадигме беспомощности группа, которой впервые был представлен удар электрическим током (рис. 1В), а также группа, научившаяся контролировать удар током, были более беспомощны с увеличенными задержками побега по сравнению^{с контрольной} группой. Группы, в которых была вызвана беспомощность, не показали никаких различий между экспериментальным и контрольным животным. Ангедония была обнаружена в тесте выбора двух флаконов на сахарозу²⁷ и в сексуальном поведении (неопубликованные данные). В тесте на захоронение мрамора депрессивные животные также были более тревожными²⁶ (рис. 1D).

Описанная животная модель не только дает возможность исследовать маниакальное или депрессивное поведение, но также предоставляет уникальную возможность наблюдать изменение в поведении при прекращении гиперэкспрессии DRD1, напоминающее переключение от мании к депрессии у пациентов. Здесь важно помнить о привычке к определенному поведению и выбирать тесты с минимальным привыканием. Например, было показано увеличение сексуального поведения в эпизоде, похожем на манию, и в депрессивном эпизоде, снижение такого поведения до уровней, наблюдаемых у животных контрольной группы. В этом эксперименте у^{одного и того} же животного были вызваны три манийно-депрессивных цикла. При употреблении сахарозы предпочтение раствора сахарозы в маниакальном состоянии не только снижалось до контрольного уровня при переходе в депрессивное состояние, но и снижалось²⁷. В версии азартной задачи на крысах в Айове количество невыгодных вариантов было увеличено у животных с манией, но существенно не отличалось от контрольной группы, когда животные находились в депрессивном состоянии. В последнем состоянии, общее количество заработанных гранул, было уменьшено по сравнению с контрольными животными²⁴.

В целом, животные демонстрируют устойчивый биполярный фенотип, наблюдаемый в различных поведенческих доменах в течение обоих эпизодов. Переключение между эпизодами в этой модели способствует повышению валидности лица. Обзор затронутых поведенческих доменов представлен на рисунке 2.

Рисунок 1: Поведенческие изменения в состояниях, подобных мании и депрессии, после гиперэкспрессии вирусного DRD1. Во время гиперэкспрессии вирусного DRD1, в состоянии, подобном мании, животные демонстрируют больше сексуальных наклонностей (А) и увеличение рискованных выборов в Айове (Игорное задание) (В) по сравнению с контрольной группой. После прекращения гиперэкспрессии животные переходят в депрессивное состояние. Они демонстрируют увеличение беспомощности (C) и тревожности (D). *p < 0,05; **p < 0,01; Полосы погрешностей указывают на стандартную погрешность среднего значения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Поведенческий фенотип модели. В эпизоде, похожем на манию, наблюдается увеличение поведения, связанного с вознаграждением (например, сексуальное поведение), импульсивности и принятия риска. Тревожность была снижена в тесте лабиринта с повышенным плюсом. Во время депрессивного эпизода тревожность была повышена в тесте на захоронение мрамора, сексуальное поведение было снижено, а животные проявляли большую беспомощность. Изображение крысы на рисунке было взято из компании Servier Medical Art и доступно по лицензии CC BY 4.0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Соображения по поведенческой оценке. В таблице выделены важные соображения относительно основных экспериментальных этапов во время поведенческой оценки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Здесь представлена новая модель крысы для ББ с повышенной валидностью лица. Целенаправленное манипулирование DRD1 в mPFC позволяет вызвать маниа- и депрессивный фенотип у одного и того же животного. Репрезентативные результаты подчеркивают наблюдаемый болезненный фенотип в обоих эпизодах. Модель относительно проста в применении. Необходимы два индуцируемых лентивирусных вектора, экспрессирующих либо DRD1, либо dsRed в качестве контроля. Для производства и использования лентивирусных систем у животных требуются определенные уровни безопасности, которые должны быть соблюдены. Если необходимого оборудования для производства вирусов нет, опыт работы с профильными объектами оказался положительным.

Наиболее важным этапом для создания модели является стереотаксическая инъекция лентивирусной системы. Стереотаксические операции являются хорошо зарекомендовавшими себя процедурами в нейробиологии, и показатели успеха среди обученных исследователей высоки. Существует два основных возможных источника ошибок. Проблемы с анестезией могут привести к летальному исходу во время хирургической процедуры. В этом случае использование ингаляционной анестезии изофлураном, как описано в протоколе, оказалось лучшим подходом, поскольку легко регулируемые уровни препарата представляют собой явное преимущество по сравнению с инъекционной анестезией. Поскольку изофлуран не оказывает анальгетических эффектов, а менингеальные ноцицепторы чувствительны к стимуляции⁵², рекомендуется использовать опиоид для интраоперационной анальгезии. В сочетании с соответствующими послеоперационными препаратами, как описано в протоколе, не наблюдаются признаки послеоперационной боли. Тем не менее, всегда следует учитывать возможное влияние на исследовательские вопросы, например, в отношении взаимодействия дофамина с опиоидной системой, и соответственно следует выбирать соответствующий режим^{лечения.} Если операция проводится в асептических условиях, возникновение инфекций или нарушение заживления ран происходит редко. Если во время операции или восстановления возникают проблемы, устранение неполадок должно быть сосредоточено на правильном выполнении описанного протокола. Обеспечение асептических условий труда и точное дозирование лекарств имеют важное значение. Введение жидкостных растворов или растворов глюкозы может дополнительно способствовать выздоровлению. При возникновении инфекций лечение не должно включать тетрациклины, так как они будут взаимодействовать с транскрипцией вирусных систем. Первой линией лечения послеоперационных раневых инфекций будет энрофлоксацин, возможно, в сочетании с карпрофеном.

Еще одним возможным источником ошибки во время операции является размещение инъекции за пределами целевой области. Это, однако, редко происходит, когда протокол соблюдается правильно и обеспечивается правильное положение головы животного. Успешное размещение всегда должно быть проверено. В то время как размещение вируса, экспрессирующего dsRed, легко обнаруживается у контрольных животных, проверка размещения вирусов, экспрессирующих DRD1, требует дополнительных действий. Окрашивание антителами в отношении различных частей вирусной конструкции не дало удовлетворительных результатов. Рекомендуется проверить размещение вируса путем препарирования mPFC и проведения ПЦР для обнаружения транскриптов rtTA3, как описано в Beyer et ^al.24. Также важно отметить, что инъекция вируса должна быть двусторонней с равным количеством вируса. Было показано, что церебральная и поведенческая латерализация различаются у пациентов с биполярным расстройством^54,55, и односторонние инъекции вируса могут не вызывать желаемого поведенческого фенотипа.

Индукция вирусной экспрессии DRD1 и эпизода, похожего на манию, путем добавления доксициклина в питьевую воду работает очень хорошо. Было доказано, что замена обычной питьевой воды доксициклином не вызывает заметных изменений в питьевом поведении. Тем не менее, расход жидкости следует контролировать. Модуляция возможна, если другие вещества, например, лекарства, предназначены для введения через питьевую воду. Введение доксициклина также может осуществляться в виде пищевых гранул. Но это еще не подтверждено.

Для поведенческого исследования в таблице 1 перечислены некоторые соображения. В частности, при планировании эксперимента необходимо оценить требования, специфичные для модели. Например, следует решить, будут ли тестироваться две группы животных или одно животное будет проходить поведенческую оценку во время обоих эпизодов, что может потребовать повторного тестирования. Если биполярный фенотип не обнаруживается во время поведенческого исследования, хотя размещение может быть проверено, устранение неполадок может быть сосредоточено на различных факторах, которые могут повлиять на поведенческий результат. Изменения в экспериментаторах или циркадном ритме должны быть критически оценены во время процесса, так как стрессовые условия в окружающей среде могут влиять на поведенческие результаты.

Несмотря на то, что модель демонстрирует хорошую конструкционную и лицевую валидность, прогностическую валидность все еще необходимо оценить. Хроническое введение лития в качестве первой линии лечения BD⁵⁶ должно быть успешным в предотвращении модельных изменений в поведении. Реакция на другие лекарства, используемые при ББ, такие как антипсихотические или противосудорожные препараты, может быть исследована для полной проверки прогностической валидности модели.

Кроме того, текущим ограничением является то, что валидность модели на самках животных все еще нуждается в оценке в будущих исследованиях. Несмотря на то, что существует тенденция включать самок животных в доклинические исследования, этим часто пренебрегают. Для представленной модели следует ожидать взаимодействия дофаминовой системы с эстральным циклом. Однако неясно, в какой степени они будут происходить. Также важно помнить об общих ограничениях психиатрических моделей на животных. В то время как возможность индуцировать оба болезнеподобных эпизода у одной крысы обеспечивает повышенную лицевую валидность, внешне индуцированные изменения все же отличаются от спонтанного возникновения и цикличности эпизодов заболевания у пациентов с ББ. Поскольку модель основана исключительно на целенаправленных манипуляциях с дофаминовой системой, основные эффекты будут вызваны изменениями в передаче дофамина и связанными с ними вторичными эффектами. Таким образом, вклад других систем в симптомологию ББ не учитывается.

В заключение следует отметить, что представленная модель обладает большим потенциалом для исследования ББ, поскольку оба эпизода заболевания могут быть изучены на одном животном. Это предоставляет уникальные возможности для исследования переходов между эпизодами по сравнению с большинством устоявшихся моделей. Представленный протокол требует оборудования и технических навыков, которые имеются в большинстве лабораторий доклинических исследований, что делает его широко применимым. До сих пор результирующий поведенческий фенотип был устойчивым при различных формах поведения. Другие области, такие как социальное поведение или когнитивные функции^, еще предстоит исследовать. В то время как представленный протокол сосредоточен на поведенческих результатах, существуют различные возможности для будущих применений для дальнейшего исследования молекулярных механизмов. Расширение исследований для понимания основных механизмов патогенеза ББ, особенно в отношении перехода между эпизодами, может привести к идентификации терапевтических мишеней, которые в конечном итоге могут быть переведены в будущие клинические приложения.

Авторам нечего раскрывать.

Работа выполнена при поддержке грантов Немецкого научно-исследовательского общества (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG): проект No 552842155 и GRK2862/1, проект: 492434978. JA получил финансирование от исследовательского фонда FoRUM медицинского факультета Рурского университета в Бохуме (грант No P109-24). Изображение крысы на рисунке 2 было взято из сайта Servier Medical Art и доступно по лицензии CC BY 4.0.