Keratinosit Canlı Hücre Görüntüleme için Primer Kültürlerin Oluşturulması

Bu protokol, canlı hücre görüntülemede kullanılmak üzere taze elde edilen (pasaj 0) keratinositlerin kültürünü ana hatlarıyla belirtir.

İnsan derisinde tek hücre düzeyinde kök hücrelerin ve işlenen progenitör davranışın izlenmesi hem in vivo hem de in vitro olarak zor olmuştur. Canlı hücre görüntüleme, keratinosit kök hücreleri ile işlenmiş progenitör davranış arasındaki farkları belirleme yeteneğinde önemli ilerlemelere izin vermiştir. Canlı hücre görüntüleme, keratinosit davranışını in vitro olarak incelemek için gelişen ve biraz zorlayıcı bir yöntemdir. Bu protokol, keratinositleri düşük tohumlama yoğunluğunda kültürlemek için geliştirilmiştir ve nispeten uzun süreli hızlandırılmış fotoğrafçılık ve bireysel hücre davranışının izlenmesini sağlar. Passage 0 keratinositleri klonal yoğunlukta büyütülür ve hızlandırılmış fotoğrafçılık, tek tek hücre bölünmelerinin ve bunların ortaya çıkma zamanının belgelenmesine izin verir. Maksimum biyolojik alaka için, yeni izole edilmiş insan keratinositleri in vitro olarak yerleştirilir. Bu yaklaşım çoğalmaya odaklanmaktadır. Bununla birlikte, bu protokol, hücre göçünü, yara iyileşmesini ve motiliteyi ölçmek gibi bireysel hücre davranışını ölçen diğer canlı hücre görüntüleme uygulamalarında kullanım için uyarlanabilir.

Bu protokolün amacı, düşük tohumlama yoğunlukları ve hızlandırılmış fotoğrafçılık ile mümkün kılınan nispeten uzun bir süre (birkaç hafta) boyunca kültürdeki bireysel keratinositleri izleme yeteneği sağlamaktır. Düşük yoğunlukta canlı hücre görüntüleme, araştırmacılara hücre davranışını in vitro olarak tek bir hücre düzeyinde görselleştirme fırsatı verir. Konvansiyonel hücre kültüründe mümkün olmasa da, canlı hücre görüntüleme, hücre döngüsü süresi ve bir kolonideki çoğalma ve farklılaşma bölünmelerinin oranı gibi bölünme kinetiği ile ilgili bilgilerin tespit edilebildiği etiketleme kullanılmadan gerçek zamanlı olarak soy ağaçlarının geliştirilmesini mümkün kılar. Aynı zamanda hücre göçü ve hareketliliğinin incelenmesine de izin verir. Hücre tipine ve yakalanacak verilere bağlı olarak optimizasyon gerektiren yönleriyle teknik olarak zorlayıcı olabilir. Diğer laboratuvarlarda neonatal keratinositler ve/veya büyümesi daha kolay olan pasajlı keratinositler kullanılmıştır¹.

Bununla birlikte, tekrarlanan geçişe uğrayan hücre hatları, davranış ve morfoloji açısından in vivo durumlarından önemli ölçüde farklıdır². En yakın in vivo davranışı elde etmek için en büyük biyolojik alaka düzeyi için, geçiş 0 hücreleri kullanılır. Keratinosit popülasyonlarında, kök hücre ile işlenmiş progenitör arasında sıralama veya etiketleme olmadan ayrım yapmak mümkündür, çünkü canlı hücre görüntüleme ile gözlemlenebilen bölünme davranışında belirgin farklılıklar vardır³.

Keratinosit proliferasyon kinetiğini incelemek için canlı hücre görüntülemeyi kullanıyoruz. Benzer bir yaklaşım, keratinositler⁴ ile birlikte kültürlenen kutanöz melanom hücrelerinin motilitesini, çizik deneylerinin⁵ yapışık hücre göçünü ve ROCK inhibitörlerinin keratinosit proliferasyonunu⁶ nasıl etkilediğini incelemek için kullanılmıştır. Bu protokol, başka amaçlar için uyarlanabilmesine rağmen, canlı hücre görüntüleme ile soy izlemesini kolaylaştırmak için hücrelerin kültürlenmesi için özel olarak tasarlanmıştır.

Bu protokol, canlı hücre görüntüleme amacıyla pasaj 0 keratinositlerinin izolasyonunu ana hatlarıyla belirtir, ortaya çıkabilecek komplikasyonları tartışır ve protokolde değişiklik gerektirebilecek hususları sağlar (Şekil 1).

İnsan dokusunun kullanımı için kurumun İnsan Araştırmaları Komitesi'nden onay alınması gerekmektedir. Araştırma için insan örnekleri genellikle ticari kaynaklardan elde edilir (örneğin, ATCC, Lifeline hücre teknolojisi ve Zen-Bio). Çalışmalarımızda, ameliyatlar sırasında atılan dokular veya özellikle çalışma amaçları için alınan deri biyopsi örnekleri kullanılmaktadır. Bu durumlar farklı onaylar ve onay prosedürleri gerektirir. Tüm dokular, UCSF İnsan Araştırmaları Komitesi'nin onayından sonra, yazılı bilgilendirilmiş onam kullanılarak ve Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uygun olarak elde edilir.

1. Epidermisin dermisten ayrılması

1. Çalışma için insan dokusunu kullanmak için uygun onayların alındığından emin olun.
2. Deri örneği alın ve buz torbası ile yalıtımlı bir kapta taşıyın. Numuneyi 5x konsantrasyonda penisilin, streptomisin ve amfoterisin içeren toplama ortamına yerleştirin.
   NOT: Gerekli miktar uygulamaya bağlı olacaktır. Deneyimlerimize göre,^cm2'de yaklaşık 1.000.000 keratinosit yetişkin ve yaşlı ciltten elde edilmektedir. Ancak bu, her numune için önemli ölçüde değişebilir.
   1. Yenidoğan sünnet derilerini hücre kültürü ortamına yerleştirin ve hücre ölümünü en aza indirmek için sünnetten en fazla 48 saat sonra keratinosit izolasyon prosedürüne başlayın. Dokuyu işlenene kadar 4 °C'de saklayın. Yetişkin ve yaşlı numunelerin işlenmesi tipik olarak toplandıktan sonraki birkaç saat içinde başlar.
3. Yutulması, mukoza zarı veya perkütan maruziyet yoluyla hastalığa neden olan ajanlarla çalışmak üzere tasarlanmış BS2 düzeyinde ekipmana sahip bir biyogüvenlik kabinine erişim sağlayın⁷. Kullanmadan önce biyogüvenlik kabininin en az 15 dakika UV ile sterilize edildiğinden ve tüm yüzeylere %70 alkol püskürtüldüğünden emin olun.
4. Eldiven giyin, toplama kabına %70 alkol püskürtün ve kabı çeker ocak içine yerleştirin. Oda sıcaklığına ısınmasını önlemek ve bütünlüğünü korumak için dokunun altına bir soğutma pedi yerleştirin. Doku çok büyükse, işlem için bir kısmını kesin ve geri kalanını toplama kabında nemli tutun.
   NOT: Yaşlı örneklerin çoğu ameliyatlardan kaynaklanan büyük karın veya meme derisi olduğundan, dokunun kesilmesi ve işlenmesi zaman alır. Aşırı soğuk donmasına neden olabileceğinden, doku asla doğrudan pedin üzerine yerleştirilmemelidir. Bunun yerine, mermer levha gibi bir ara yüzeye yerleştirilmelidir.
5. Kaputa iki adet 100 mm x 15 mm Petri kabı ve steril bir #23 cerrahi neşter yerleştirin.
6. Petri kaplarını açın ve her bir kabın iç yüzeyleri yukarı bakacak şekilde kabinin yüzeyine yerleştirin. Petri kaplarından birine 10 mL% 10 klorheksidin glukonat ekleyin. Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisine (HBSS; 5x) 10 mL 5x penisilin / streptomisin / amfoterisin / gentamisin ekleyin ve diğer 2 Petri kabı yarısına ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu).
7. Dispase adımı için 6 oyuklu bir plaka hazırlayın. Yenidoğan dokusu için, kuyucuk başına 3 mL Dispase kullanın. Eski doku örnekleri için 4 mL kullanın. Doku hacmi için yetersiz miktarda Dispase kullanmak, epidermisi dermisten ayırmada zorluğa neden olabilir.
8. Dokuyu daha küçük parçalara ayırmak için bir neşter kullanın, böylece Dispase tarafından daha iyi nüfuz eder. Dispase, dokunun kenarlarından sadece 5 mm'ye kadar nüfuz eder, bu nedenle 0,5-1 cm genişliğinde uzun doku şeritleri kesin. Yeterince küçük kesilmezse, epidermisin dermisten ayrılması gerçekleşmez.
   1. Daha kalın dokuyu daha küçük parçalar halinde kesin. Yenidoğan sünnet derilerini 3 veya 4 parçaya (~5 mm x 7 mm) kesin. Dispase oyuğu başına en fazla iki tam sünnet derisi kullanın. Yüzeysel abdominal flepler çok daha ince olma eğilimindedir, deri altı dokusu çok azdır veya hiç yoktur, bunları daha uzun (~ 5 mm x 15 mm şeritler) keser.
   2. Dispase kuyucuğu başına en fazla dört şerit yerleştirin. Elde edilen dokuda çok fazla deri altı yağ varsa, Dispase'in dokuya tam olarak nüfuz etmesine yardımcı olmak için deri altı dokusunu kesin. Doku çok küçük kesilirse, epidermisi soyarken hangi tarafın epidermal ve hangi tarafın dermal olduğunu belirlemek için bir diseksiyon mikroskobu gerekebilir. Cildin yanlış tarafını çekmek ek doku travmasına neden olabilir.
9. Dokuyu epidermal tarafı aşağı bakacak şekilde,% 10 klorheksidin glukonat içeren,% 10 klorheksidin glukonat içeren ilk Petri kabına 10-20 saniye boyunca yerleştirin Daha sonra doku epidermal tarafını HBSS ile 5x penisilin / streptomisin / amfoterisin (PSA) içeren ikinci Petri kabına aktarın ve 10-20 saniye boyunca çalkalayın. Doku epidermal tarafını aşağıya, yine HBSS'li 5x PSA içeren üçüncü Petri kabına aktarın ve 10 saniye daha çalkalayın. Aynı çözelti ile birden fazla numunenin işlenmesi kabul edilebilir.
10. Dokuyu epidermal tarafı aşağı bakacak şekilde adım 1.7'de hazırlanan 6 oyuklu Dispase plakasına aktarın.
    NOT: Konvansiyonumuza göre epidermal tarafı aşağı bakacak şekilde öneriyoruz. Diğer protokoller dermisi aşağı⁸ önermektedir. Tüm Dispase eşit derecede etkili değildir. Yaşlanmış ciltten epidermisin soyulması, üreticinin tavsiye ettiği seviyenin 4 katına kadar konsantrasyonlarda bile bazı ürünlerde zor oldu. Bu da zaman ve numune kaybına neden oldu. Şirketler, Dispase için standartlaştırılmamış birimler kullanır ve bu da konsantrasyonların markalar arasında nasıl farklılık gösterdiğini belirlemeyi zorlaştırır. Bu zorluklar nedeniyle, Malzeme Tablosunda listelenen Dispase markalarından birinin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
11. Dispase ve numuneleri içeren 6 oyuklu plakayı etiketleyin ve 4 °C'ye aktarın. Yenidoğan örneklerini Dispase'de 16-18 saat ve yetişkin / yaşlı örnekleri 24 saat inkübe edin.
    NOT: Numuneler için kullanılabilecek alternatif bir 2 saatlik protokol vardır, burada numune 37 ° C'de 2 saat boyunca Dispase'ye yerleştirilir ve ardından epidermisin soyulur. Ne yazık ki, bu her zaman işe yaramaz ve inkübasyondan sonra dokunun bütünlüğü tehlikeye girebilir ve bu da kayıp bir numuneye neden olabilir. Mümkün olduğunca gece inkübasyon tercih edilir.

2. Keratinositlerin izolasyonu

1. % 0.05 Tripsin-EDTA (veya TrypLE), Tripsin nötralize edici çözelti ve keratinosit ortamını bir sonraki adıma başlamadan 20 dakika önce 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin
2. 6 oyuklu bir plakayı 4 °C'den çıkarın, üzerine %70 etanol püskürtün ve hazırlanmış bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin (bkz. adım 1.3).
3. Steril dişli forsepsleri ve dişsiz forsepsleri 20 mL %70 etanol içeren 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Başlangıçta davlumbazın dışındaysa, davlumbaza koymadan önce %70 etanol ile forseps püskürtün.
4. Kimyasal olarak sterilize edilmiş forseps kullanarak, bir doku parçasını kavrayın ve epidermal tarafı yukarı bakacak şekilde steril bir yüzeye koyun (bir Petri kabı veya 6 oyuklu plakanın üst yarısının iç kısmını kullanın). Baskın olmayan elinizi kullanarak dokunun dermal kısmını dişli forseps ile tutun ve aynı anda epidermisi dişli olmayan forseps ile sıkıca kavrayın ve kenardan kenara çekin. Tek parça olarak düzgün bir şekilde çıkmalıdır.
5. Epidermisi 15 mL'lik konik bir tüpün dudağının iç kısmına yerleştirin. Her 15 mL konik tüp, maksimum iki sünnet derisinden oluşan bir epidermise sahip olmalıdır.
   1. Verimli çalışmak; Doku kurursa, verim tehlikeye girecektir. Dispas dokuya uygun şekilde nüfuz etmediyse, epidermisin soyulmasında zorluk olabilir. Böyle bir durumda, epidermisi alttaki dermisten çekin / kazıyın. Bu aynı zamanda çok daha düşük bir verimle sonuçlanır ve önerilmez.
6. 15 mL konik tüpe 4 mL %0.05 Tripsin-EDTA ekleyin, ardından tüpü kapatın ve ters çevirin, tüm epidermisin Tripsin içinde süspanse edildiğinden ve tüpün / kapağın yan tarafına yapışmadığından emin olun. 37 °C'lik bir su banyosunda 10 dakika bekletin. Hücreleri her 2 dakikada bir elle çalkalayın.
   NOT: 10 dakikadan fazla tripsinizleme, daha düşük hücre verimine neden olabilir. Ayrıca, hücre yüzey proteinlerinin bütünlüğü bir endişe ise, bölünme bölgesi için daha spesifik olduğu için TrypLE'yi kullanın, bu da hücrelere daha az zarar verir ve Tripsin-EDTA^9'a kıyasla yüzey antijen ekspresyonunu önemli ölçüde azaltmadığı gösterilmiştir. Ayrıca, su banyosu yaygın bir kirlilik kaynağıdır, bu nedenle düzenli olarak temizlendiğinden emin olun. Aquaguard-2 solüsyonu içeren deiyonize su ile suyu düzenli olarak değiştirin.
7. Biyogüvenlik kabinine 50 mL'lik bir konik tüp yerleştirin. Kapağı sökün ve konik borunun açıklığına 100 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin.
8. Sindirilmiş numuneyi içeren 15 mL'lik konik tüpü su banyosundan çıkarın, iyice kurulayın ve biyogüvenlik kabinine geri yerleştirmeden önce %70 alkol püskürtün. Konik boruyu çeker ocakın yüzeyine 3x hafifçe vurun ve ardından 6x'i ters çevirin. Kılavuz çekme-ters çevirme döngüsünü 3 kez tekrarlayın.
9. Konik tüpe 6 mL tripsin nötralize edici çözelti ekleyin. Hücre süzgecinden 2.7. adımdan itibaren 50 mL'lik konik tüpe dökün.
10. Numuneyi içeren 15 mL konik tüpü 5 mL tripsin nötralize edici solüsyon (TNS) ile durulayın. Bir hücre süzgecinden 50 mL'lik konik tüpe dökün. 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
11. Hemen santrifüjden çıkarın ve ortama hücre kaybını önlemek için süpernatanı pipetleyin. Sadece küçük bir sıvı koleksiyonu ile pelet bırakılmalıdır. Peleti daha küçük doku örneklerinden görmek zor olabilir.
    NOT: Süpernatantta Tripsin bulunur, bu nedenle peleti kaybetmeden mümkün olduğunca çıkarmak en iyisidir.
12. Keratinosit peletini 2 mL keratinosit ortamında yeniden süspanse edin.
    NOT: Burada dikkat edilmesi gereken iki husus vardır. İlk olarak, hangi medyayı kullanacağınız. Bu amaçla kolajen içermeyen serumsuz besiyerleri önerilir. Tarihsel olarak, keratinosit hücre kültürü için standart, bir fibroblast besleyici tabakası (3t3-J2s) üzerinde Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM) +% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) + Ham'ın ^{F-12'si olmuştur10}. Bununla birlikte, serumsuz ortamın ortaya çıkması ve kollajenin mevcudiyeti ile, diğer birçok olasılık geçerli olmaya devam etmektedir (tartışmaya bakınız)¹¹. İkinci husus, kültür ortamında antibiyotik kullanımının canlı hücre görüntüleme uygulaması için uygun olup olmadığıdır. Bu, görüntüleme süresine, süreye ve görüntüleme sistemiyle ilgili deneyime bağlı olacaktır. Koloniler, ortak bir görüntüleme sistemi kullanılarak birkaç hafta boyunca görüntülenir, bu da kültürler üzerindeki potansiyel etkisine rağmen antibiyotik kullanımını tercih edilen bir yaklaşım haline getirir (tartışmaya bakınız). Resüspanse sırasında penisilin, streptomisin, amfoterisin B ve gentamisin içeren keratinosit ortamı kullanılır, ardından ilk ortam değişikliğinden sonra penisilin / streptomisin içeren ortama geçilir. Bu yöntem, genişletilmiş canlı hücre görüntüleme sırasında kontaminasyonu etkili bir şekilde önlemiştir.
13. Hücreleri sayın ve plakayı tohumlayın (tohumlama yoğunluğunun seçilmesiyle ilgili yorumlar için tartışmaya bakın). Düzgün tohumlama dağılımını sağlamak için, kaplamadan önce, kaplanacak toplam ortam miktarındaki keratinosit hücrelerini yeniden süspanse edin. Ters çevirerek hafifçe çalkaladıktan sonra, 1-2 saniye boyunca hafifçe girdap yapın ve plaka. Ardından, mikroplakayı inkübatörde 3x çapraz benzeri bir düzende (yukarı-aşağı, sol-sağ) hareket ettirin.
14. 24 saat sonra, plakayı canlı hücre görüntüleme sisteminin inkübatörüne yerleştirin. Her 20 dakikada bir çekilen görüntülerle 10x'te canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. Numuneleri mikroskoba bağlı inkübatöre 37 °C ve %5 CO_2'de yerleştirin.

Bu yöntemde manipüle edilebilecek ve sonuçta çeşitli sonuçlarla sonuçlanabilecek çok sayıda değişken göz önüne alındığında, burada yaygın yanlış adımları ve bunların sonucunda ortaya çıkan sonuçları özetliyor, ayrıca örnek sonuçlar ve bunların arkasındaki koşulları sağlıyoruz.

Herhangi bir hücre kültürü tekniğinde olduğu gibi, kontaminasyon bir olasılıktır (Ek Video 1). Dikkatli steril tekniklerin yanı sıra, özellikle uzun süre kültür yapıyorsanız, ortamda antibiyotik kullanmayı düşünün. Kültürlenmiş hücreler antibiyotik kullanılmadan başka bir yerdeki bir görüntüleme sistemine taşındığında sık kontaminasyon gözlenmiştir. Antibiyotik kullanımının olumsuzlukları için lütfen tartışma bölümüne bakınız.

Protokolde de belirtildiği gibi medya seçimi kritik öneme sahiptir. Başlangıçta bir fibroblast besleyici tabakası üzerinde% 10 FBS ve Ham'ın F-12'si olan DMEM kullanıldı. Ancak, bu seçimle ilgili sorunlar vardı (Ek Video 2). Kullanılan fibroblastların ilk tohumlama yoğunluğu çok yüksekti ve zaman geçtikçe, fibroblastların genişlediği ve keratinositlerin görüşünü engellediği görüldü. Fibroblastların tohumlama yoğunluğunun azaltılması, fibroblastların gizlenmesi sorununu çözdü. Bununla birlikte, ek olarak, keratinositlerin serumsuz ortama göre daha hızlı farklılaştığı görülmüştür ve bu, soy izleme amaçları için izlenmesi zor olan tekdüze olmayan keratinosit alanlarıyla sonuçlanmıştır (Ek Video 3). DMEM tabanlı medya ile ilgili diğer konular tartışmada genişletilmiştir.

Geleneksel DMEM/FBS/Ham'ın F-12'si ile ilgili sorunlarla karşılaştıktan sonra, alternatif olarak serumsuz ortam seçildi. Klonal yoğunlukta HKGS ve keratinositler ile desteklenmiş kültür ortamı ile izlenebilir tek tip koloniler vardı (Ek Video 4, Ek Video 5). Serum serbest ortamda, farklılaşma daha yavaş gerçekleşir (muhtemelen düşük kalsiyum nedeniyle) ve birçok yapışık hücre asla bölünmez, ancak ayrılmaz (diğer ortamlarda olduğu gibi; Ek Video 4, Ek Video 3).

Tohumlama yoğunluğu, hücreleri izleme yeteneğini etkileyebilir. Çok fazla hücre, hücrelerin doğru bir şekilde izlenememesine neden olabilir ve çok az hücre, tersine, yetersiz büyümeye neden olabilir. Birçok serumsuz ortam üreticisi, tanımlanmış ortamlarını kolajen ile eşleştirmeyi önererek daha düşük tohumlama yoğunluklarına izin verir (Şekil 2). Bu konu hakkında daha fazla bilgi için tartışmaya bakın.

Keratinosit farklılaşması, morfolojik olarak büyük, düzleştirilmiş hücreler ve yığılmış morfoloji ile belirgindir. Ek Video 2'ye bakın. Terminal farklılaşmasının değerlendirilmesi, 48 saat 3,12,13'ün üzerinde bölünme eksikliğidir.

Şekil 1: Keratinosit izolasyon adımları. Bu diyagram, bu protokolde açıklandığı gibi keratinosit izolasyonunun adımlarını göstermektedir. Oluşturulma tarihi BioRender.com Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Hücre aderansı ve koloni oluşumu. Kollajenli ve kollajensiz 2 gün 23 saatte hücre yapışması ve koloni oluşumundaki fark. Kolajen, başlangıçtaki keratinosit aderansını önemli ölçüde artırır. Oluşturulma tarihi BioRender.com Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: Keratinosit kolonisinin kontaminasyonu. Canlı hücre görüntüleme ile her 20 dakikada bir çekilen görüntüler videoda harmanlanmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 2: Geleneksel besleyici ve DMEM bazlı besiyerleri kullanarak keratinositlerin hızlı büyümesi. Canlı hücre görüntüleme ile her 20 dakikada bir çekilen görüntüler videoda harmanlanmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 3: Geleneksel besleyici ve DMEM bazlı besiyeri kullanılarak artan keratinosit farklılaşması. Canlı hücre görüntüleme ile her 20 dakikada bir çekilen görüntüler videoda harmanlanmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 4: İzlenebilir keratinosit kolonisi. Canlı hücre görüntüleme ile her 20 dakikada bir çekilen görüntüler videoda harmanlanmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 5: İzlenebilir keratinosit kolonisi. Canlı hücre görüntüleme ile her 20 dakikada bir çekilen görüntüler videoda harmanlanmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Burada, canlı hücre görüntüleme amacıyla insan keratinositlerinin birincil kültürü için bir yöntemi detaylandırdık. Bu yöntem, başarılı canlı hücre görüntüleme çalışmalarına izin vermek için düşük yoğunluklu kaplama ve uzun süreli kültür kullanarak mevcut hücre kültürü tekniklerini uyarlar. Bu hücre tipinin ayrışması için tercih edilen yöntem, %3-4'ü koloni oluşturan birimler haline gelebilen keratinositlerle sonuçlandığı gösterilen iki aşamalı bir enzimatik sindirimi içerir¹⁴. Yetişkin ve yaşlı keratinosit büyümesi in vitro zordur, çünkü birçok örnek basitçe büyüyemez.

Büyümeyi iyileştirmek için verimi en üst düzeye çıkarma hedefi için birden fazla adım kritik öneme sahiptir. Doku toplandıktan sonra bu hücreler mümkün olan en kısa sürede izole edilmelidir. Cerrahlarla doğrudan bir iletişim hattı sürdürülür ve numuneler hastadan alındıktan hemen sonra toplanır. Bu yöntemi kullanarak doku bütünlüğünü korumanın yolları hakkında başka önerilerde de bulunulmuştur. Dokuyu serin tutun, dokuyu toplama ortamında tutun ve dokuyu verimli bir şekilde işleyin. Büyümeyi in vitro olarak en üst düzeye çıkarmak için küçükse numuneleri bir araya getirmeyi düşünün. Reaktifleri her zaman en az 20 dakika ısıtın. Kanıtlanmış etkinliğin Dispase'ini kullanın ve epidermisin soyulmasında sorunlar varsa daha küçük doku şeritlerini kesmeyi veya kuluçka süresini uzatmayı düşünün. Tercih edilen enzimatik bir tedavi ile sindirim için mümkün olan minimum süreyi kullanın ve inkübasyondan hemen sonra nötralize edin. Santrifüjlemeden sonra peleti mümkün olan en kısa sürede yeniden askıya alın. Tüm bunları yaptıktan sonra bile, en ideal gibi görünen koşullar altında bile, büyümeyen ara sıra yetişkin ve yaşlı insan örneklerinin olmasını bekleyin.

Amaç, keratinositleri klonal yoğunlukta veya yakınında plakalamak ve canlı hücre görüntüleme kullanarak izlemektir; Bu yöntem, bu hedeflerle iyi bir uyum sağlar. Amaç, keratinositleri izole etmek ve farklı koşullar altında motiliteyi gözlemlemek veya çizik testi gibi fonksiyonel bir test içinse, dikkate alınması gereken alternatif bir yöntem deri eksplant tekniğidir. Keratinositleri izole etmek için bu enzim içermeyen yaklaşım, daha yüksek hücre verimlerine neden olabilir 14,15,16.

Kullanılan besiyerlerindeki değişiklikler canlı hücre görüntüleme için önemli olabilir. Keratinosit büyümesini teşvik etmek için seçilen besiyeri, deneyin tüm aşamalarını etkileyecektir. DMEM, %10 FBS ve Ham'ın 3T3-J2 besleyici hücrelere sahip F-12'si, daha düşük tohumlama yoğunluklarına izin verdi, ancak çeşitli sorunlara neden oldu. Besleyici hücreler, düşük yoğunlukta kullanılmadıkça, keratinositlerin üzerinde bulunduğu görsel düzlemi gizledi ve izlemeyi daha zor hale getirdi. DMEM kullanarak, fibroblastlar canlı hücre görüntüleme süresi boyunca (~ 2 hafta) kaldı. Ayrıca, farklılaşmanın teşviki (hücrelerin tek tip görünümünün olmaması nedeniyle canlı hücre görüntüleme için IncuCyte yazılımının kullanılmasını engelleyen) ve serumdan olası kontaminasyon riski de dahil olmak üzere serum bazlı ortamlarla ilgili önemli olan başka sorunlar da vardır¹⁷. Serumsuz ortamda, daha az hücre yapıştığı için DMEM'den daha yüksek bir tohumlama yoğunluğuna ihtiyaç vardır. 154 CF + HKGS, Epilife + HKGS ve Epilife + S7 kombinasyonlarının tümü etkili olmuştur. Bir hatırlatma olarak, zamanla bozuldukları için büyüme takviyeleri kullanırken daima taze ortam kullanın. Kültürlenmekte olan hücreleri destekleyebileceğini doğrulamak için yeni bir protokole başlarken ortamı her zaman en az üç örnekle test edin. Serumsuz ortam üreticileri genellikle sıçan kuyruğu kollajen (tip ^{1) kullanılmasını} önermektedir18. Kolajen, ilk bağlanmaya (daha düşük tohumlama yoğunluklarına izin verir) ve çoğalmaya^{yardımcı olur 19}.

Ortam türü ile birlikte, sonuçları etkileyebilecek bir diğer faktör de tohumlama yoğunluğu ve hücre dağılımıdır. Keratinosit kültürüne, proliferasyon için hücre-hücre etkileşimi yardımcı olur ve bu nedenle, daha yüksek tohumlama yoğunlukları daha verimli büyüme ile sonuçlanır²⁰. Farklı ortam ve hücre yaşları, klonal büyüme elde etmek için değişen tohumlama yoğunlukları gerektirir. Deneyler, istenen canlı hücre görüntüleme uygulaması için uygun büyüme oranları/koloni boyutları elde etmek için genellikle birden fazla tohumlama yoğunluğu ile çalıştırılır. Klonal büyüme ve soy izleme yoğunlukları, diğer uygulamalar için gerekli olanlardan farklı olabilir. Hücrelerin yapışmasına izin vermeden önce tohumlama dağılımının tek tip olduğundan emin olun.

İzolasyon ve büyüme sırasında antibiyotik kullanımı tartışmalıdır. Yaygın olarak kullanılan antibiyotiklerin keratinosit proliferasyonu üzerinde inhibe edici bir etkiye sahip olabileceği daha önce gösterilmiştir²¹. Bu göz önüne alındığında, birçok kişi, işlemden önce cildi temizledikten sonra antibiyotik kullanmamayı tercih eder. Bu canlı hücre görüntüleme uygulaması, kontaminasyon riskini artıran birkaç haftalık koloni büyümesini içerir. Kontaminasyon nedeniyle haftalarca zaman/değerli numune kaybetme riski, olası azalmış keratinosit proliferasyonu riski ile tartılmalıdır. Daha kısa uygulamalar antibiyotiğe ihtiyaç duymayabilirken, uzun süreli canlı hücre görüntülemesi yapar.

Diğer in vitro tekniklerde olduğu gibi, canlı hücre görüntüleme için hücrelerin kültürlenmesinin bir sınırlaması, in vivo alaka düzeyi bilinmemektedir. Ek olarak, yeni elde edilen ve pasajlı hücrelerin kullanılması, pasaj sayısı²⁰ arttıkça hücre özellikleri geliştikçe farklı sonuçlar verebilir. Ayrıca, sonuçlar tek tip dış ortamdan etkilenebilir. Bu tekdüze ortam, özellikle hücre davranışındaki içsel ve dışsal değişiklikleri ayırt ederken, çalışmanın amaçlarına bağlı olarak bir gücü veya sınırlamayı temsil edebilir.

Canlı hücre görüntüleme amacıyla keratinositlerin kültürlenmesi sırasında göz önünde bulundurulması gereken çok sayıda faktör vardır. Sunulan yöntem, süreci basitleştirmeye yardımcı olabilir. Gelecekteki çalışmalarda keratinosit canlı hücre görüntülemenin başarılı bir şekilde yapılabilmesi, keratinositlerin proliferatif ve diferansiyel davranışlarının ve epidermal bakım mekanizmalarının daha ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bana keratinositleri nasıl kültürleyeceğimi öğrettikleri için T. Richard Parenteau, MD / PhD ve Alexandra Charruyer, PharmD / PhD'ye özel teşekkürler. Keratinositleri izole etmek için bize örnekler sağladığı için Merisa Piper MD'ye teşekkür ederiz. Son olarak, deneyleri tamamlamak için canlı hücre görüntüleme sistemine erişmemize izin verdiği için Michael Rosenblum'a teşekkür ederiz.