Generierung von Primärkulturen für die Bildgebung lebender Keratinozyten

Dieses Protokoll beschreibt die Kultivierung von frisch gewonnenen (Passage 0) Keratinozyten für die Verwendung in der Lebendzellbildgebung.

Die Verfolgung von Stammzellen und dem Verhalten von Vorläufern auf Einzelzellebene in der menschlichen Haut war sowohl in vivo als auch in vitro eine Herausforderung. Die Bildgebung von lebenden Zellen hat zu erheblichen Fortschritten bei der Identifizierung von Unterschieden zwischen Keratinozyten-Stammzellen und dem Verhalten von Vorläufern geführt. Die Bildgebung lebender Zellen ist eine sich entwickelnde und etwas herausfordernde Methode, um das Verhalten von Keratinozyten in vitro zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Keratinozyten bei niedriger Seeding-Dichte zu kultivieren, was eine relativ langfristige Zeitrafferfotografie und die Überwachung des Verhaltens einzelner Zellen ermöglicht. Passage 0 Keratinozyten werden mit klonaler Dichte gezüchtet, und die Zeitrafferfotografie ermöglicht die Dokumentation einzelner Zellteilungen und des Zeitpunkts ihres Auftretens. Für eine maximale biologische Relevanz werden frisch isolierte humane Keratinozyten in vitro platziert. Dieser Ansatz konzentriert sich auf die Proliferation. Dieses Protokoll kann jedoch für den Einsatz in anderen Anwendungen zur Bildgebung lebender Zellen angepasst werden, um das Verhalten einzelner Zellen zu messen, wie z. B. die Messung von Zellmigration, Wundheilung und Motilität.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Möglichkeit zu bieten, einzelne Keratinozyten in Kultur über einen relativ langen Zeitraum (mehrere Wochen) zu verfolgen, was durch niedrige Seeding-Dichten und Zeitrafferfotografie ermöglicht wird. Die Bildgebung lebender Zellen mit geringer Dichte bietet Forschern die Möglichkeit, das Zellverhalten in vitro auf Einzelzellebene zu visualisieren. Obwohl dies in herkömmlichen Zellkulturen nicht möglich ist, ermöglicht die Bildgebung lebender Zellen die Entwicklung von Stammbäumen in Echtzeit ohne den Einsatz von Markierung, aus denen Informationen über die Teilungskinetik ermittelt werden können, wie z. B. die Dauer des Zellzyklus und den Anteil der Proliferations- und Differenzierungsteilungen in einer Kolonie. Es ermöglicht auch die Untersuchung der Zellmigration und -motilität. Es kann eine technische Herausforderung sein, mit Aspekten, die je nach Zelltyp und den zu erfassenden Daten optimiert werden müssen. Andere Labore haben neonatale Keratinozyten und/oder passageierte Keratinozyten verwendet, die leichter zu züchten sind¹.

Zelllinien, die wiederholt passagiert werden, unterscheiden sich jedoch in Verhalten und Morphologie signifikant von ihrem in vivo-Zustand ². Für die größte biologische Relevanz, um das Verhalten in vivo am nächsten zu bringen, werden Passage-0-Zellen verwendet. In Keratinozytenpopulationen ist es möglich, zwischen der Stammzelle und dem verbindlichen Vorläufer ohne Sortierung oder Markierung zu unterscheiden, da es deutliche Unterschiede im Teilungsverhalten gibt, die mit Hilfe der Lebendzellbildgebung beobachtet werden^{können 3}.

Wir verwenden Live-Cell-Imaging, um die Kinetik der Keratinozytenproliferation zu untersuchen. Ein ähnlicher Ansatz wurde verwendet, um die Motilität von kutanen Melanomzellen zu untersuchen, die mit Keratinozyten kokultiviert wurden⁴, die adhärente Zellmigration von Scratch-Assays⁵ und wie ROCK-Inhibitoren die Keratinozytenproliferation beeinflussen⁶. Dieses Protokoll wurde speziell für die Kultivierung von Zellen entwickelt, um die Abstammungsverfolgung durch Lebendzell-Bildgebung zu erleichtern, obwohl es für andere Zwecke angepasst werden kann.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Keratinozyten der Passage 0 zum Zwecke der Lebendzellbildgebung, erörtert Komplikationen, die auftreten können, und enthält Überlegungen, die Änderungen am Protokoll erfordern können (Abbildung 1).

Für die Verwendung von menschlichem Gewebe ist die Genehmigung des Ausschusses für Humanforschung der Institution erforderlich. Humanproben für die Forschung werden oft aus kommerziellen Quellen gewonnen (z. B. ATCC, Lifeline-Zelltechnologie und Zen-Bio). In unseren Studien werden zum Zeitpunkt der Operation verworfenes Gewebe oder Hautbiopsieproben verwendet, die speziell für Studienzwecke entnommen wurden. Diese Situationen erfordern unterschiedliche Genehmigungen und Zustimmungsverfahren. Alle Gewebe werden nach Genehmigung durch das UCSF-Komitee für Humanforschung unter Verwendung einer schriftlichen Einverständniserklärung und gemäß den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki gewonnen.

1. Trennung der Epidermis von der Dermis

1. Stellen Sie sicher, dass die entsprechenden Genehmigungen für die Verwendung von menschlichem Gewebe für die Studie eingeholt werden.
2. Entnehmen Sie eine Hautprobe und transportieren Sie sie in einem isolierten Behälter mit einem Eisbeutel. Legen Sie die Probe in ein Sammelmedium, das die 5-fache Konzentration von Penicillin, Streptomycin und Amphotericin enthält.
   HINWEIS: Die erforderliche Menge hängt von der Anwendung ab. Nach unserer Erfahrung werden ca. 1.000.000 Keratinozyten pro^cm2 aus erwachsener und gealterter Haut gewonnen. Dies kann jedoch bei jeder Probe erheblich variieren.
   1. Legen Sie die Vorhaut von Neugeborenen in Zellkulturmedien und beginnen Sie die Keratinozytenisolierung nicht länger als 48 Stunden nach der Beschneidung, um den Zelltod zu minimieren. Lagern Sie das Gewebe bis zur Verarbeitung bei 4 °C. Die Verarbeitung von erwachsenen und gealterten Proben beginnt in der Regel innerhalb weniger Stunden nach der Entnahme.
3. Erhalten Sie Zugang zu einer Biosicherheitswerkbank mit BS2-Level-Ausrüstung, die für die Arbeit mit Erregern entwickelt wurde, die durch Verschlucken, Schleimhaut oder perkutane Exposition Krankheiten verursachen⁷. Stellen Sie sicher, dass die Biosicherheitswerkbank mindestens 15 Minuten lang UV-sterilisiert ist und dass alle Oberflächen vor der Verwendung mit 70% Alkohol besprüht werden.
4. Ziehen Sie Handschuhe an, besprühen Sie den Auffangbehälter mit 70% Alkohol und stellen Sie den Behälter in den Abzug. Legen Sie ein Kühlkissen unter das Gewebe, um zu verhindern, dass es sich auf Raumtemperatur erwärmt, und um seine Integrität zu erhalten. Wenn das Taschentuch extrem groß ist, schneiden Sie einen Teil für die Verarbeitung ab und halten Sie den Rest im Auffangbehälter feucht.
   HINWEIS: Da es sich bei vielen der gealterten Proben um große Bauch- oder Brusthaut von Operationen handelt, dauert es einige Zeit, bis das Gewebe geschnitten und verarbeitet ist. Das Taschentuch sollte niemals direkt auf das Polster gelegt werden, da es durch die extreme Kälte einfrieren kann. Stattdessen sollte es auf eine Zwischenfläche, wie z.B. eine Marmorplatte, gelegt werden.
5. Platzieren Sie zwei 100 mm x 15 mm Petrischalen und ein steriles chirurgisches Skalpell #23 in der Haube.
6. Öffnen Sie die Petrischalen und stellen Sie sie so auf die Oberfläche des Schranks, dass die Innenflächen jeder Schale nach oben zeigen. Geben Sie 10 ml 10% Chlorhexidingluconat in eine der Petrischale. Geben Sie 10 ml 5x Penicillin/Streptomycin/Amphotericin/Gentamycin in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; 5x) zu 2 anderen Petrischale-Hälften (siehe Materialtabelle).
7. Bereiten Sie eine 6-Well-Platte für den Dispase-Schritt vor. Verwenden Sie für Neugeborenengewebe 3 ml Dispase pro Vertiefung. Für gealterte Gewebeproben verwenden Sie 4 ml. Die Verwendung unzureichender Mengen an Dispase für das Gewebevolumen kann zu Schwierigkeiten bei der Trennung von Epidermis und Dermis führen.
8. Schneiden Sie das Gewebe mit einem Skalpell in kleinere Stücke, damit es besser von Dispase durchdrungen werden kann. Die Dispase dringt nur bis zu 5 mm von den Rändern des Gewebes ein, schneiden Sie also lange Gewebestreifen mit einer Breite von 0,5 bis 1 cm ab. Wenn der Schnitt nicht klein genug ist, kommt es nicht zu einer Trennung der Epidermis von der Haut.
   1. Schneiden Sie dickeres Gewebe in kleinere Stücke. Schneiden Sie die Vorhaut von Neugeborenen in 3 oder 4 Stücke (~5 mm x 7 mm). Verwenden Sie maximal zwei ganze Vorhäute pro Vertiefung Dispase. Oberflächliche Bauchlappen neigen dazu, viel dünner zu sein, mit minimalem bis keinem Unterhautgewebe, schneiden Sie diese in längere Streifen (~5 mm x 15 mm).
   2. Platzieren Sie maximal vier Streifen pro Vertiefung Dispase. Wenn das gewonnene Gewebe viel Unterhautfett enthält, schneiden Sie das Unterhautgewebe ab, damit Dispase vollständig in das Gewebe eindringen kann. Wenn das Gewebe zu klein geschnitten wird, kann ein Präpariermikroskop erforderlich sein, um beim Abziehen der Epidermis festzustellen, welche Seite epidermal und welche dermal ist. Das Ziehen an der falschen Seite der Haut kann zu einem zusätzlichen Gewebetrauma führen.
9. Legen Sie die epidermale Seite des Gewebes nach unten für 10-20 s in die erste Petrischale, die in Schritt 1.6 vorbereitet wurde und 10 % Chlorhexidingluconat enthält. Übertragen Sie dann die epidermale Seite des Gewebes nach unten in die zweite Petrischale, die 5x Penicillin/Streptomycin/Amphotericin (PSA) mit HBSS enthält, und rühren Sie 10-20 s lang. Übertragen Sie die epidermale Seite des Gewebes nach unten in die dritte Petrischale, die wiederum 5x PSA mit HBSS enthält, und rühren Sie weitere 10 s lang. Die Verarbeitung mehrerer Proben mit derselben Lösung ist akzeptabel.
10. Übertragen Sie das Gewebe mit der Epidermisseite nach unten auf die in Schritt 1.7 vorbereitete 6-Well-Dispase-Platte.
    HINWEIS: Wir empfehlen die epidermale Seite nach unten, wie in unserer Konvention beschrieben. Andere Protokolle empfehlen Dermis nach unten⁸. Nicht alle Dispase ist gleich wirksam. Das Abschälen der Epidermis von gealterter Haut erwies sich bei bestimmten Produkten als schwierig, selbst bei Konzentrationen bis zum 4-fachen des vom Hersteller empfohlenen Wertes. Dies führte zum Verlust von Zeit und Proben. Unternehmen verwenden nicht standardisierte Einheiten für die Dispase, was es schwierig macht, zu erkennen, wie sich die Konzentrationen zwischen den Marken unterscheiden. Aufgrund dieser Herausforderungen wird die Verwendung einer der in der Materialtabelle aufgeführten Dispase-Marken dringend empfohlen.
11. Die 6-Well-Platte mit der Dispase und den Proben beschriften und auf 4 °C erhitzen. Inkubieren Sie Neugeborenenproben für 16-18 Stunden in Dispase und Proben für Erwachsene/gealterte Proben für 24 Stunden.
    HINWEIS: Es gibt ein alternatives 2-Stunden-Protokoll, das für Proben verwendet werden kann, bei dem die Probe 2 Stunden lang bei 37 °C in Dispase gelegt und dann die Epidermis geschält wird. Leider funktioniert dies nicht immer, und die Integrität des Gewebes kann nach der Inkubation beeinträchtigt werden, was zu einem Verlust der Probe führt. Wann immer möglich, wird eine Inkubation über Nacht bevorzugt.

2. Isolierung von Keratinozyten

1. Legen Sie 0,05 % Trypsin-EDTA (oder TrypLE), Trypsin-Neutralisationslösung und Keratinozytenmedien 20 Minuten vor Beginn der nächsten Schritte in ein 37 °C heißes Wasserbad.
2. Nehmen Sie eine 6-Well-Platte aus 4 °C, besprühen Sie sie mit 70 % Ethanol und legen Sie sie in eine vorbereitete Biosicherheitswerkbank (siehe Schritt 1.3).
3. Legen Sie die sterile Zahnzange und die ungezahnte Pinzette in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 20 ml 70%igem Ethanol. Wenn Sie sich zunächst außerhalb der Haube befinden, sprühen Sie die Pinzette mit 70 % Ethanol ein, bevor Sie sie in die Haube einsetzen.
4. Fassen Sie mit einer chemisch sterilisierten Pinzette ein Stück Gewebe und legen Sie es mit der Epidermisseite nach oben auf eine sterile Oberfläche (verwenden Sie eine Petrischale oder die Innenseite der oberen Hälfte der 6-Well-Platte). Halten Sie den dermalen Teil des Gewebes mit einer Zahnzange mit der nicht dominanten Hand fest und fassen Sie gleichzeitig die Epidermis mit der nicht gezahnten Pinzette fest und ziehen Sie sie von Kante zu Kante ab. Es sollte sich in einem Stück glatt ablösen.
5. Legen Sie die Epidermis auf die Innenseite der Lippe eines konischen 15-ml-Röhrchens. Jedes konische 15-ml-Röhrchen sollte eine Epidermis von maximal zwei Vorhäuten haben.
   1. Effizient arbeiten; Trocknet das Gewebe aus, wird die Ausbeute beeinträchtigt. Wenn die Dispase nicht richtig in das Gewebe eingedrungen ist, kann es zu Schwierigkeiten beim Ablösen der Epidermis kommen. Ziehen/kratzen Sie in einem solchen Fall die Epidermis von der darunter liegenden Dermis ab. Dies führt auch zu einem deutlich geringeren Ertrag und ist nicht zu empfehlen.
6. Geben Sie 4 ml 0,05 % Trypsin-EDTA in das konische 15-ml-Röhrchen, verschließen Sie das Röhrchen und drehen Sie es um, wobei Sie darauf achten, dass die gesamte Epidermis im Trypsin suspendiert ist und nicht an der Seite des Röhrchens/des Deckels kleben bleibt. 10 min in ein 37 °C warmes Wasserbad stellen. Rühren Sie die Zellen alle 2 Minuten von Hand.
   HINWEIS: Eine Trypsinisierung für mehr als 10 Minuten kann zu einer geringeren Zellausbeute führen. Wenn die Integrität von Zelloberflächenproteinen ein Problem darstellt, verwenden Sie TrypLE, da es spezifischer für seine Spaltstelle ist, was zu einer geringeren Schädigung der Zellen führt und nachweislich die Expression von Oberflächenantigenen im Vergleich zu Trypsin-EDTA⁹ nicht signifikant verringert. Darüber hinaus ist das Wasserbad eine häufige Kontaminationsquelle, also stellen Sie sicher, dass es regelmäßig gereinigt wird. Wechseln Sie das Wasser regelmäßig durch entionisiertes Wasser, das Aquaguard-2-Lösung enthält.
7. Legen Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen in die Biosicherheitswerkbank. Schrauben Sie den Deckel ab und setzen Sie ein 100 μm Zellsieb auf die Öffnung des konischen Röhrchens.
8. Nehmen Sie das konische 15-ml-Röhrchen mit der aufgeschlossenen Probe aus dem Wasserbad, trocknen Sie es gründlich ab und sprühen Sie es mit 70 % Alkohol ein, bevor Sie es wieder in die Biosicherheitswerkbank legen. Klopfen Sie das konische Rohr 3x gegen die Oberfläche des Abzugs und drehen Sie es dann 6x um. Wiederholen Sie den Klopf-Inversionszyklus 3x.
9. Geben Sie 6 ml Trypsin-neutralisierende Lösung in das konische Röhrchen. Durch das Zellsieb in das konische 50-ml-Röhrchen aus Schritt 2.7 gießen.
10. Spülen Sie das konische 15-ml-Röhrchen, das die Probe enthält, mit 5 mL Trypsin-neutralisierenden Lösungen (TNS). Durch ein Zellsieb in das konische 50-ml-Röhrchen gießen. Bei 300 x g 5 min zentrifugieren.
11. Nehmen Sie den Überstand sofort aus der Zentrifuge und pipettieren Sie ihn, um einen Zellverlust in das Medium zu verhindern. Es sollte nur das Pellet mit einer kleinen Flüssigkeitsansammlung übrig bleiben. Es kann schwierig sein, das Pellet von kleineren Gewebeproben zu erkennen.
    HINWEIS: Im Überstand ist Trypsin enthalten, daher ist es am besten, so viel wie möglich zu entfernen, ohne das Pellet zu verlieren.
12. Resuspendieren Sie das Keratinozyten-Pellet in 2 ml Keratinozytenmedium.
    HINWEIS: Hier gibt es zwei Überlegungen. Erstens, welche Medien verwendet werden sollen. Zu diesem Zweck empfiehlt sich serumfreie Medien ohne Kollagen. In der Vergangenheit war der Standard für Keratinozyten-Zellkulturen Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) +10 % fötales Rinderserum (FBS) +Ham's F-12 auf einer Fibroblasten-Feeder-Schicht (3t3-J2s)¹⁰. Mit dem Aufkommen serumfreier Medien und der Verfügbarkeit von Kollagen bleiben jedoch mehrere andere Möglichkeiten praktikabel (siehe Diskussion)¹¹. Die zweite Überlegung ist, ob die Verwendung von Antibiotika im Kulturmedium für die Anwendung der Lebendzellbildgebung geeignet ist. Dies hängt von der Bildgebungszeit, der Dauer und der Erfahrung mit dem Bildgebungssystem ab. Die Kolonien werden über mehrere Wochen mit einem gemeinsamen Bildgebungssystem abgebildet, so dass der Einsatz von Antibiotika trotz der möglichen Auswirkungen auf die Kulturen ein bevorzugter Ansatz ist (siehe Diskussion). Penicillin, Streptomycin, Amphotericin B und Gentamicin-haltiges Keratinozytenmedium werden während der Resuspension verwendet, gefolgt von einem Wechsel zu Penicillin/Streptomycin-haltigen Medien nach dem anfänglichen Medienwechsel. Diese Methode hat eine Kontamination während der erweiterten Bildgebung von lebenden Zellen effektiv verhindert.
13. Zählen Sie die Zellen und säen Sie die Platte (siehe Diskussion für Kommentare zur Auswahl der Setzdichte). Um eine gleichmäßige Verteilung der Aussaat zu gewährleisten, resuspendieren Sie die Keratinozytenzellen vor dem Plattieren in der Gesamtmenge des zu plattierenden Mediums. Nach sanftem Rühren durch Inversion 1-2 s leicht wirbeln und aufschlagen. Bewegen Sie dann die Mikroplatte in einem kreuzförmigen Muster (oben-unten, links-rechts) 3x im Inkubator.
14. Legen Sie die Platte nach 24 Stunden in den Inkubator des Lebendzell-Imaging-Systems. Führen Sie eine 10-fache Bildgebung von lebenden Zellen durch, wobei alle 20 Minuten Bilder aufgenommen werden. Legen Sie die Proben bei 37 °C und 5 % CO_{2 in} den am Mikroskop angebrachten Inkubator.

Angesichts der zahlreichen Variablen, die in dieser Methode manipuliert werden können und letztendlich zu einer Vielzahl von Ergebnissen führen, skizzieren wir hier häufige Fehltritte und die daraus resultierenden Ergebnisse sowie beispielhafte Ergebnisse und die dahinter stehenden Umstände.

Wie bei jeder Zellkulturtechnik ist eine Kontamination möglich (Ergänzendes Video 1). Neben sorgfältigen sterilen Techniken sollten Sie die Verwendung von Antibiotika in Medien in Betracht ziehen, insbesondere wenn Sie über einen längeren Zeitraum kultivieren. Eine häufige Kontamination wurde beobachtet, wenn kultivierte Zellen ohne den Einsatz von Antibiotika zu einem bildgebenden System an einem anderen Ort transportiert wurden. Bitte lesen Sie den Diskussionsbereich für die negativen Auswirkungen des Antibiotikaeinsatzes.

Wie im Protokoll angegeben, ist die Auswahl der Medien von entscheidender Bedeutung. Zunächst wurde DMEM mit 10% FBS und Ham's F-12 auf einer Fibroblasten-Feeder-Schicht verwendet. Bei dieser Auswahl gab es jedoch Probleme (Ergänzendes Video 2). Die anfängliche Aussaatdichte der verwendeten Fibroblasten war zu hoch, und im Laufe der Zeit schienen sich die Fibroblasten auszudehnen, was die Sicht auf die Keratinozyten verdeckte. Die Verringerung der Aussaatdichte von Fibroblasten löste das Problem der Verschleierung von Fibroblasten. Darüber hinaus schienen sich die Keratinozyten jedoch schneller zu differenzieren als bei serumfreiem Medium, was zu uneinheitlichen Bereichen von Keratinozyten führte, die für die Abstammungsverfolgung schwer zu verfolgen waren (Ergänzendes Video 3). Weitere Fragestellungen zu DMEM-basierten Medien werden in der Diskussion vertieft.

Nach Problemen mit dem herkömmlichen F-12 von DMEM/FBS/Ham wurde als Alternative serumfreie Medien gewählt. Mit Kulturmedien, die mit HKGS und Keratinozyten bei klonaler Dichte ergänzt wurden, gab es einheitliche Kolonien, die verfolgbar waren (Ergänzendes Video 4, Ergänzendes Video 5). Bei serumfreien Medien erfolgt die Differenzierung langsamer (möglicherweise aufgrund von niedrigerem Kalzium), und viele adhärente Zellen teilen sich nie, lösen sich aber nicht ab (wie sie es in anderen Medien tun; Ergänzendes Video 4, Ergänzendes Video 3).

Die Seeding-Dichte kann die Fähigkeit beeinträchtigen, Zellen zu verfolgen. Zu viele Zellen können dazu führen, dass Zellen nicht genau verfolgt werden können, und zu wenige Zellen führen umgekehrt zu unzureichendem Wachstum. Viele Hersteller von serumfreien Medien empfehlen, ihr definiertes Medium mit Kollagen zu kombinieren, um niedrigere Aussaatdichten zu ermöglichen (Abbildung 2). Weitere Informationen zu diesem Thema finden Sie in der Diskussion.

Die Differenzierung der Keratinozyten ist morphologisch durch große, abgeflachte Zellen und gestapelte Morphologie erkennbar. Siehe ergänzendes Video 2. Die Beurteilung der terminalen Differenzierung ist eine fehlende Teilung über 48 h ^3,12,13.

Abbildung 1: Schritte zur Isolierung von Keratinozyten. Dieses Diagramm veranschaulicht die Schritte der Keratinozytenisolierung, wie in diesem Protokoll beschrieben. Erstellt im BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Zelladhärenz und Koloniebildung. Der Unterschied in der Zelladhärenz und Koloniebildung nach 2 Tagen 23 h mit und ohne Kollagen. Kollagen verbessert die anfängliche Adhärenz der Keratinozyten erheblich. Erstellt im BioRender.com Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzendes Video 1: Kontamination der Keratinozytenkolonie. Bilder, die alle 20 Minuten durch Live-Zell-Imaging aufgenommen und in Video zusammengefasst werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 2: Schnelles Wachstum von Keratinozyten mit herkömmlichen Feeder- und DMEM-basierten Medien. Bilder, die alle 20 Minuten durch Live-Zell-Imaging aufgenommen und in Video zusammengefasst werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 3: Erhöhte Keratinozytendifferenzierung mit herkömmlichen Feeder- und DMEM-basierten Medien. Bilder, die alle 20 Minuten durch Live-Zell-Imaging aufgenommen und in Video zusammengefasst werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 4: Verfolgbare Keratinozytenkolonie. Bilder, die alle 20 Minuten durch Live-Zell-Imaging aufgenommen und in Video zusammengefasst werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzendes Video 5: Verfolgbare Keratinozytenkolonie. Bilder, die alle 20 Minuten durch Live-Zell-Imaging aufgenommen und in Video zusammengefasst werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Hier haben wir eine Methode für die Primärkultur von humanen Keratinozyten zum Zwecke der Bildgebung lebender Zellen detailliert beschrieben. Diese Methode passt bestehende Zellkulturtechniken mit Low-Density-Plattierung und Langzeitkultur an, um erfolgreiche Lebendzell-Imaging-Studien zu ermöglichen. Die bevorzugte Methode zur Dissoziation dieses Zelltyps beinhaltet einen zweistufigen enzymatischen Verdau, der nachweislich zu Keratinozyten führt, von denen 3 % bis 4 % in der Lage sind, zu koloniebildenden Einheiten zu werden¹⁴. Das Wachstum von adulten und gealterten Keratinozyten in vitro ist eine Herausforderung, da viele Proben einfach nicht wachsen.

Mehrere Schritte sind entscheidend für das Ziel, die Erträge zu maximieren und das Wachstum zu verbessern. Man sollte diese Zellen so schnell wie möglich nach der Gewebeentnahme isolieren. Es besteht eine direkte Kommunikation mit den Chirurgen, und die Proben werden sofort nach der Entnahme vom Patienten entnommen. Es wurden mehrere weitere Empfehlungen gegeben, wie die Gewebeintegrität mit dieser Methode erhalten werden kann. Halten Sie das Gewebe kühl, bewahren Sie das Gewebe in Sammelmedien auf und verarbeiten Sie das Gewebe effizient. Erwägen Sie die Zusammenlegung von Proben, wenn diese klein sind, um das Wachstum in vitro zu maximieren. Reagenzien immer mindestens 20 Minuten lang erwärmen. Verwenden Sie Dispase mit nachgewiesener Wirksamkeit und erwägen Sie, kleinere Gewebestreifen zu schneiden oder die Inkubationszeit zu verlängern, wenn es Probleme beim Ablösen der Epidermis gibt. Nutzen Sie die minimal mögliche Zeit für die Verdauung mit einer enzymatischen Behandlung Ihrer Wahl und neutralisieren Sie sofort nach der Inkubation. Suspendieren Sie das Pellet so schnell wie möglich nach dem Zentrifugieren. Selbst nachdem Sie all dies getan haben, müssen Sie damit rechnen, dass es gelegentlich erwachsene und alte menschliche Proben geben wird, die nicht wachsen, selbst unter den scheinbar idealsten Umständen.

Ziel ist es, Keratinozyten mit klonaler Dichte oder nahe der klonalen Dichte zu plattieren und sie mit Hilfe von Lebendzell-Imaging zu verfolgen. Diese Methode passt gut zu diesen Zielen. Wenn das Ziel darin besteht, Keratinozyten zu isolieren und die Motilität unter verschiedenen Bedingungen zu beobachten, oder für einen funktionellen Assay wie einen Scratch-Assay, ist die Hautexplantattechnik eine alternative Methode, die in Betracht gezogen werden sollte. Dieser enzymfreie Ansatz zur Isolierung von Keratinozyten kann zu höheren Zellausbeuten führen 14,15,16.

Modifikationen in den verwendeten Medien können für die Bildgebung lebender Zellen wichtig sein. Das Medium, das zur Förderung des Keratinozytenwachstums ausgewählt wird, wirkt sich auf alle Phasen des Experiments aus. DMEM, 10 % FBS und Hams F-12 mit 3T3-J2-Feederzellen ermöglichten niedrigere Aussaatdichten, führten jedoch zu mehreren Problemen. Feeder-Zellen verdunkelten, sofern sie nicht mit geringer Dichte verwendet wurden, die visuelle Ebene, auf der sich die Keratinozyten befanden, was die Nachverfolgung erschwerte. Unter Verwendung von DMEM blieben die Fibroblasten für die Dauer der Lebendzellbildgebung (~2 Wochen) erhalten. Darüber hinaus gibt es andere Probleme mit serumbasierten Medien, die wichtig sind, einschließlich der Förderung der Differenzierung (die die Verwendung der IncuCyte-Software für die Bildgebung lebender Zellen aufgrund des Mangels an einheitlichem Erscheinungsbild der Zellen verhindert) und des Risikos einer möglichen Kontamination durch das Serum¹⁷. Bei serumfreien Medien wird eine höhere Aussaatdichte benötigt als bei DMEM, da weniger Zellen anhaften. Die Kombinationen von 154 CF + HKGS, Epilife + HKGS und Epilife + S7 haben sich alle als wirksam erwiesen. Zur Erinnerung: Verwenden Sie bei der Verwendung von Nahrungsergänzungsmitteln immer frisches Medium, da diese sich mit der Zeit abbauen. Testen Sie das Medium immer mit mindestens drei Proben, wenn Sie ein neues Protokoll beginnen, um sicherzustellen, dass es die zu kultivierenden Zellen unterstützen kann. Hersteller von serumfreien Medien empfehlen häufig die Verwendung von Rattenschwanzkollagen (Typ 1)¹⁸. Kollagen hilft bei der anfänglichen Anheftung (was eine geringere Aussaatdichte ermöglicht) und der Proliferation¹⁹.

Neben der Art des Mediums ist ein weiterer Faktor, der die Ergebnisse beeinflussen kann, die Aussaatdichte und die Zellverteilung. Die Keratinozytenkultur wird durch die Zell-Zell-Interaktion für die Proliferation unterstützt, und daher führen höhere Aussaatdichten zu einem produktiveren Wachstum²⁰. Unterschiedliche Medien und Zellalter erfordern unterschiedliche Aussaatdichten, um ein klonales Wachstum zu erreichen. Experimente werden in der Regel mit mehreren Aussaatdichten durchgeführt, um geeignete Wachstumsraten/Koloniegrößen für die gewünschte Lebendzell-Bildgebungsanwendung zu erhalten. Die Dichten für das klonale Wachstum und die Abstammungsverfolgung können sich von denen unterscheiden, die für andere Anwendungen erforderlich sind. Stellen Sie sicher, dass die Aussaatverteilung gleichmäßig ist, bevor Sie die Zellen anhaften lassen.

Der Einsatz von Antibiotika während der Isolierung und des Wachstums ist umstritten. Es wurde bereits gezeigt, dass häufig verwendete Antibiotika eine hemmende Wirkung auf die Keratinozytenproliferation haben können²¹. Vor diesem Hintergrund entscheiden sich viele dafür, keine Antibiotika zu verwenden, nachdem sie die Haut vor der Verarbeitung gereinigt haben. Diese Anwendung zur Bildgebung lebender Zellen erfordert ein mehrwöchiges Koloniewachstum, was das Risiko einer Kontamination erhöht. Das Risiko, Wochen an Zeit/wertvollen Proben aufgrund von Kontamination zu verlieren, muss gegen das Risiko einer möglichen verminderten Keratinozytenproliferation abgewogen werden. Kürzere Anwendungen benötigen möglicherweise keine Antibiotika, während längere Zeiträume der Bildgebung lebender Zellen dies tun.

Eine Einschränkung der Kultivierung von Zellen für die Bildgebung lebender Zellen, wie bei anderen in vitro Techniken, ist die unbekannte in vivo Relevanz. Darüber hinaus kann die Verwendung von frisch gewonnenen und passageierten Zellen zu unterschiedlichen Ergebnissen führen, da sich die Zelleigenschaften mit zunehmender Passagenzahl^{von 20} weiterentwickeln. Darüber hinaus können die Ergebnisse durch die einheitliche extrinsische Umgebung beeinflusst werden. Diese einheitliche Umgebung kann je nach den Zielen der Studie entweder eine Stärke oder eine Einschränkung darstellen, insbesondere bei der Unterscheidung zwischen intrinsischen und extrinsischen Veränderungen im Zellverhalten.

Es gibt eine Vielzahl von Faktoren, die bei der Kultivierung von Keratinozyten zum Zwecke der Bildgebung lebender Zellen berücksichtigt werden müssen. Die vorgestellte Methode kann helfen, den Prozess zu vereinfachen. Die Möglichkeit, in zukünftigen Studien erfolgreich Keratinozyten-Lebendzell-Imaging durchzuführen, wird ein detaillierteres Verständnis des proliferativen und differenzierenden Verhaltens von Keratinozyten und der Mechanismen der epidermalen Aufrechterhaltung ermöglichen.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Besonderer Dank geht an T. Richard Parenteau, MD/PhD, und Alexandra Charruyer, PharmD/PhD, die mir beigebracht haben, wie man Keratinozyten kultiviert. Vielen Dank an Merisa Piper, MD, für die Bereitstellung von Proben, aus denen wir Keratinozyten isolieren konnten. Abschließender Dank an Dr. Michael Rosenblum, der uns Zugang zu seinem Lebendzell-Bildgebungssystem gewährt hat, um die Experimente durchzuführen.