Получение первичных культур для визуализации живых клеток кератиноцитов

Этот протокол описывает культуру свежеполученных (пассаж 0) кератиноцитов для использования в визуализации живых клеток.

Отслеживание стволовых клеток и фиксированного поведения предшественников на уровне отдельных клеток в коже человека было сложной задачей как in vivo , так и in vitro. Визуализация живых клеток позволила добиться значительного прогресса в выявлении различий между стволовыми клетками кератиноцитов и поведением предшественников. Визуализация живых клеток является развивающимся и довольно сложным методом изучения поведения кератиноцитов in vitro. Этот протокол был разработан для культивирования кератиноцитов при низкой плотности посева, что позволяет проводить относительно долгосрочную покадровую фотосъемку и мониторинг поведения отдельных клеток. Кератиноциты Passage 0 выращиваются с клональной плотностью, а покадровая съемка позволяет документировать отдельные клеточные деления и время их возникновения. Для максимальной биологической значимости свежевыделенные кератиноциты человека помещаются in vitro. Этот подход ориентирован на распространение. Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован для использования в других приложениях визуализации живых клеток, измеряющих поведение отдельных клеток, таких как измерение миграции клеток, заживления ран и подвижности.

Цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить возможность отслеживания отдельных кератиноцитов в культуре в течение относительно длительного периода времени (несколько недель), что стало возможным благодаря низкой плотности посева и покадровой съемке. Визуализация живых клеток с низкой плотностью дает исследователям возможность визуализировать поведение клеток in vitro на уровне одной клетки. Хотя визуализация живых клеток невозможна в традиционной клеточной культуре, она позволяет создавать деревья линий в режиме реального времени, без использования мечения, из которых можно получить информацию о кинетике деления, такую как продолжительность клеточного цикла и доля делений пролиферации и дифференцировки в колонии. Это также позволяет изучать миграцию и подвижность клеток. Она может быть технически сложной, с аспектами, которые требуют оптимизации в зависимости от типа ячейки и данных, которые должны быть собраны. В других лабораториях использовались неонатальные кератиноциты и/или пассажные кератиноциты, которые легче выращивать¹.

Тем не менее, клеточные линии, которые подвергаются повторному пассионгу, значительно отличаются по поведению и морфологии от своего состояния in vivo ². Для достижения наибольшей биологической значимости с целью получения поведения, наиболее близкого к in vivo , используются клетки пассажа 0. В популяциях кератиноцитов можно провести различие между стволовой клеткой и коммитированным предшественником без сортировки или меток, поскольку существуют явные различия в поведении деления, которые можно наблюдать с^{помощью визуализации} живых клеток.

Мы используем визуализацию живых клеток для изучения кинетики пролиферации кератиноцитов. Аналогичный подход был использован для изучения подвижности клеток меланомы кожи, совместно культивируемых с кератиноцитами⁴, миграции адгезивных клеток в анализах царапин⁵ и того, как ингибиторы ROCK влияют на пролиферацию кератиноцитов⁶. Этот протокол специально разработан для культивирования клеток, чтобы облегчить отслеживание линии с помощью визуализации живых клеток, хотя он может быть адаптирован и для других целей.

В этом протоколе описывается выделение кератиноцитов пассажа 0 с целью визуализации живых клеток, обсуждаются осложнения, которые могут возникнуть, и приводятся соображения, которые могут потребовать внесения изменений в протокол (Рисунок 1).

Для использования человеческих тканей требуется одобрение Комитета по исследованиям на человеке учреждения. Человеческие образцы для исследований часто получают из коммерческих источников (например, ATCC, клеточная технология Lifeline, Zen-Bio). В наших исследованиях используются отбракованные ткани во время операций или образцы биопсии кожи, взятые специально для исследовательских целей. Эти ситуации требуют различных согласований и процедур согласия. Все ткани получают после одобрения Комитета UCSF по исследованиям на людях с использованием письменного информированного согласия и в соответствии с принципами Хельсинкской декларации.

1. Отделение эпидермиса от дермы

1. Убедитесь в получении соответствующих разрешений на использование тканей человека для исследования.
2. Возьмите образец кожи и транспортируйте его в изолированном контейнере с пакетом со льдом. Поместите образец в среду для сбора, содержащую в 5-кратной концентрации пенициллина, стрептомицина и амфотерицина.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимое количество будет зависеть от области применения. По нашему опыту, примерно 1 000 000 кератиноцитов на^см2 получают из взрослой и возрастной кожи. Однако это может значительно варьироваться для каждого образца.
   1. Поместите неонатальную крайнюю плоть в среду для клеточных культур и начните процедуру выделения кератиноцитов не позднее чем через 48 ч после обрезания, чтобы свести к минимуму гибель клеток. Храните салфетку при температуре 4 °C до обработки. Обработка взрослых и старых образцов обычно начинается в течение нескольких часов после сбора.
3. Получите доступ к шкафу биобезопасности с оборудованием уровня BS2, предназначенным для работы с агентами, вызывающими заболевание при проглатывании, слизистой оболочке или чрескожном воздействии⁷. Перед использованием убедитесь, что шкаф для биобезопасности стерилизован ультрафиолетовым излучением в течение не менее 15 минут и что все поверхности опрысканы 70% спиртом.
4. Наденьте перчатки, опрыскайте емкость для сбора 70% спиртом и поместите емкость в вытяжной шкаф. Подложите охлаждающую салфетку под салфетку, чтобы предотвратить ее нагрев до комнатной температуры и сохранить ее целостность. Если ткань очень большая, отрежьте часть для обработки, а остальную часть держите влажной в контейнере для сбора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку многие из старых образцов имеют большую кожу живота или молочной железы после операций, требуется время для разреза и обработки ткани. Салфетку никогда не следует класть непосредственно на прокладку, так как сильный холод может привести к ее замерзанию. Вместо этого его следует разместить на промежуточной поверхности, например, на мраморной плите.
5. Поместите в капюшон две чашки Петри размером 100 мм x 15 мм и стерильный хирургический скальпель #23.
6. Откройте чашки Петри и поставьте их на поверхность шкафа так, чтобы внутренние поверхности каждой чашки были обращены вверх. Добавьте 10 мл 10% глюконата хлоргексидина в одну из чашек Петри. Добавьте 10 мл 5x пенициллина/стрептомицина/амфотерицина/гентамицина в сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS; 5x) в 2 другие половинки чашки Петри (см. Таблицу материалов).
7. Подготовьте 6-луночную пластину для этапа Dispase. Для тканей новорожденных используйте 3 мл Dispase на лунку. Для старых образцов тканей используйте 4 мл. Использование недостаточного количества Dispase для объема ткани может привести к трудностям с отделением эпидермиса от дермы.
8. С помощью скальпеля разрежьте ткань на более мелкие кусочки так, чтобы она лучше проникала Dispase. Диспасе проникает только на расстоянии до 5 мм от краев ткани, поэтому нарезают длинными полосками ткани шириной 0,5-1 см. Если не обрезать достаточно мелко, то отделения эпидермиса от дермы не произойдет.
   1. Более плотную ткань нарежьте на более мелкие кусочки. Разрежьте неонатальную крайнюю плоть на 3 или 4 части (~5 мм x 7 мм). Используйте не более двух полных крайних плотей на лунку Dispase. Поверхностные лоскуты брюшной полости, как правило, намного тоньше, с минимальным количеством подкожной клетчатки или без нее, разрежьте их на более длинные полоски (~5 мм x 15 мм).
   2. Положите максимум четыре полоски на лунку Dispase. Если к полученной ткани прикреплено много подкожного жира, обрежьте подкожную клетчатку, чтобы помочь Dispase полностью проникнуть в ткань. Если ткань разрезана слишком мелко, может потребоваться препарирующий микроскоп, чтобы определить, какая сторона является эпидермальной, а какая — дермальной, при отслаивании эпидермиса. Вытягивание неправильной стороны кожи может привести к дополнительной травме тканей.
9. Поместите тканевую эпидермальную сторону вниз в первую чашку Петри, приготовленную на шаге 1.6, содержащую 10% глюконата хлоргексидина, на 10-20 с. Затем перенесите тканевую эпидермальную сторону вниз во вторую чашку Петри, содержащую 5x пенициллин/стрептомицин/амфотерицин (ПСА) с HBSS, и перемешивайте в течение 10-20 с. Перенесите тканевую эпидермальную сторону вниз в третью чашку Петри, снова содержащую 5x ПСА с HBSS, и перемешивайте еще 10 секунд. Допустима обработка нескольких образцов одним и тем же раствором.
10. Перенесите эпидермальную сторону ткани вниз на 6-луночный планшет Dispase, приготовленный на шаге 1.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем использовать эпидермальную сторону вниз в соответствии с нашей конвенцией. Другие протоколы рекомендуют дерму вниз⁸. Не все рассуждения одинаково эффективны. Отшелушивание эпидермиса с возрастной кожи оказалось сложной задачей при использовании некоторых продуктов, даже в концентрациях, в 4 раза превышающих рекомендованный производителем. Это привело к потере времени и образцов. Компании используют нестандартизированные единицы измерения для Dispase, что затрудняет определение различий концентраций между брендами. В связи с этими проблемами настоятельно рекомендуется использовать один из брендов Dispase, перечисленных в Таблице материалов .
11. Пометьте 6-луночный планшет, содержащий раствор и образцы, и переведите при температуре 4 °C. Инкубируйте неонатальные образцы в течение 16-18 ч в Dispase и взрослые/старые образцы в течение 24 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует альтернативный протокол 2 часов, который можно использовать для образцов, когда образец помещается в диспазу при 37 °C на 2 часа, а затем эпидермис отшелушивается. К сожалению, это не всегда работает, и целостность ткани может быть нарушена после инкубации, что приведет к потере образца. По возможности предпочтительна ночная инкубация.

2. Выделение кератиноцитов

1. Поместите 0,05% Trypsin-EDTA (или TrypLE), нейтрализующий раствор Trypsin и кератиноцитарные среды в водяную баню при температуре 37 °C за 20 минут до начала следующего набора шагов
2. Снимите 6-луночный планшет с температурой 4 °C, распылите на него 70% этанола и поместите в подготовленный шкаф биобезопасности (см. шаг 1.3).
3. Поместите стерильные зубчатые щипцы и незубчатые щипцы в коническую трубку объемом 50 мл, содержащую 20 мл 70% этанола. Если капюшон изначально находится вне колпака, распылите щипцы с 70% этанолом, прежде чем положить его в капот.
4. С помощью химически стерилизованных щипцов захватите кусочек ткани и положите его на стерильную поверхность эпидермальной стороной вверх (используйте чашку Петри или внутреннюю часть верхней половины 6-луночной пластины). Удерживайте дермальную часть ткани зубчатыми щипцами с помощью недоминантной руки и одновременно крепко захватывайте эпидермис незубчатыми щипцами и оттягивайте его от края к краю. Он должен гладко сойти как единое целое.
5. Поместите эпидермис на внутреннюю сторону губы конической трубки объемом 15 мл. Каждая коническая трубка объемом 15 мл должна иметь эпидермис максимум из двух крайних плоттей.
   1. Работать эффективно; Если ткань высохнет, урожайность будет поставлена под угрозу. Если диспаза не проникла должным образом в ткани, могут возникнуть трудности с отшелушиванием эпидермиса. В таком случае оттяните/соскребите эпидермис с подлежащей дермы. Это также приводит к гораздо более низкой урожайности и не рекомендуется.
6. Добавьте 4 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в коническую пробирку объемом 15 мл, затем закройте и переверните пробирку, следя за тем, чтобы весь эпидермис был взвешенным в трипсине и не застрял на боковой стороне пробирки/крышки. Поставьте на водяную баню при температуре 37 °C на 10 минут. Перемешивайте клетки каждые 2 минуты вручную.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Трипсинизация в течение более 10 минут может привести к снижению выхода клеток. Кроме того, если целостность белков клеточной поверхности вызывает беспокойство, используйте TrypLE, поскольку он более специфичен для места его расщепления, что приводит к меньшему повреждению клеток и, как было показано, не приводит к значительному снижению экспрессии поверхностного антигена по сравнению с Trypsin-EDTA⁹. Кроме того, водяная баня является распространенным источником загрязнения, поэтому регулярно очищайте ее. Регулярно меняйте воду с деионизированной водой, содержащей раствор аквагард-2.
7. Поместите коническую пробирку объемом 50 мл в шкаф для биобезопасности. Открутите крышку и поместите сетчатый фильтр 100 μм на отверстие конической трубки.
8. Извлеките коническую пробирку объемом 15 мл с переваренным образцом из водяной бани, тщательно высушите и распылите на нее 70% спирт, прежде чем поместить ее обратно в шкаф для биобезопасности. Постучите конической трубкой 3 раза по поверхности вытяжного шкафа, затем переверните 6 раз. Повторите цикл постукивания и инверсии 3 раза.
9. Добавьте в коническую пробирку 6 мл нейтрализующего трипсин раствора. Налейте фильтр через ячейки в коническую пробирку объемом 50 мл с шага 2.7.
10. Промойте коническую пробирку объемом 15 мл с образцом 5 мл растворов, нейтрализующих трипсин (TNS). Налейте через клеточное ситечко в коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин.
11. Немедленно снимите с центрифуги и пипеткой надосадочную жидкость, чтобы предотвратить потерю клеток в среду. Должна остаться только гранула с небольшим скоплением жидкости. Может быть трудно увидеть гранулу из небольших образцов ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В надосадочной жидкости присутствует трипсин, поэтому лучше удалить его как можно больше, не теряя гранулы.
12. Ресуспендируйте кератиноцитарную гранулу в 2 мл кератиноцитарной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь есть два соображения. Во-первых, какие носители использовать. Для этого рекомендуется использовать бессывороточные среды без коллагена. Исторически сложилось так, что стандартом для культивирования кератиноцитарных клеток была модифицированная среда Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) +10% фетальная сыворотка крупного рогатого скота (FBS) + F-12 Ham's на слое фидера фибробластов (3t3-J2s)¹⁰. Тем не менее, с появлением бессывороточных сред и доступностью коллагена, многие другие возможности остаются жизнеспособными (см. обсуждение)¹¹. Второе соображение заключается в том, является ли использование антибиотиков в культуральной среде подходящим для визуализации живых клеток. Это будет зависеть от времени визуализации, продолжительности и опыта работы с системой визуализации. Колонии визуализируются в течение нескольких недель с использованием общей системы визуализации, что делает использование антибиотиков предпочтительным подходом, несмотря на потенциальное воздействие на культуры (см. обсуждение). Пенициллин, стрептомицин, амфотерицин В и гентамицинсодержащая кератиноцитарная среда используют во время ресуспензии с последующим переходом на пенициллин/стрептомицинсодержащую среду после первоначальной смены среды. Этот метод эффективно предотвращает загрязнение во время расширенной визуализации живых клеток.
13. Подсчитайте ячейки и засейте планшет (см. обсуждение для комментариев по выбору плотности посева). Чтобы обеспечить равномерное распределение посева, перед нанесением покрытия проводят ресуспендию клеток кератиноцитов в общем количестве плоской среды. После легкого перемешивания путем инверсии, слегка перемешать в течение 1-2 с, и надавить на тарелку. Затем переместите микропланшет крестообразно (вверх-вниз, влево-вправо) 3 раза в инкубаторе.
14. Через 24 ч поместите планшет в инкубатор системы визуализации живых клеток. Выполняйте визуализацию живых клеток с 10-кратной скоростью каждые 20 минут. Поместите образцы при температуре 37 °C и 5%_CO2 в инкубатор, прикрепленный к микроскопу.

Учитывая множество переменных, которыми можно манипулировать в этом методе, что в конечном итоге приводит к различным результатам, здесь мы описываем распространенные ошибки и их результирующие результаты, а также приводим примеры результатов и обстоятельства, стоящие за ними.

Как и при любом методе культивирования клеток, контаминация возможна (Дополнительное видео 1). Наряду с тщательными методами стерилизации, рассмотрите возможность использования антибиотиков в средах, особенно при культивировании в течение длительных периодов времени. Частое загрязнение наблюдалось при транспортировке культивируемых клеток в систему визуализации в другом месте без использования антибиотиков. Пожалуйста, ознакомьтесь с разделом обсуждения для получения информации о негативных последствиях использования антибиотиков.

Как сказано в протоколе, выбор СМИ имеет решающее значение. Первоначально использовался DMEM с 10% FBS и F-12 Хэма на слое питателя фибробластов. Однако с этим выбором возникли проблемы (Дополнительное видео 2). Первоначальная плотность посева используемых фибробластов была слишком высокой, и со временем фибробласты, казалось, расширялись, закрывая обзор кератиноцитов. Снижение плотности посева фибробластов решило проблему затенения фибробластов. Однако, кроме того, кератиноциты, по-видимому, дифференцировались быстрее, чем при использовании бессывороточной среды, что приводило к образованию неоднородных участков кератиноцитов, которые было трудно отследить для отслеживания линии (Дополнительное видео 3). В ходе обсуждения были затронуты и другие вопросы, связанные со средами на основе DMEM.

После того, как возникли проблемы с традиционным F-12 от DMEM/FBS/Ham, в качестве альтернативы был выбран носитель без сыворотки. При использовании питательных сред с добавлением HKGS и кератиноцитов с клональной плотностью образовывались однородные колонии, которые можно было отслеживать (Дополнительное видео 4, Дополнительное видео 5). При использовании свободных сывороточных сред дифференцировка происходит медленнее (возможно, из-за более низкого уровня кальция), и многие адгезивные клетки никогда не делятся, но и не отделяются (как это происходит в других средах; Дополнительное видео 4, Дополнительное видео 3).

Плотность посева может повлиять на способность отслеживать клетки. Слишком большое количество клеток может привести к невозможности точного отслеживания клеток, а слишком малое количество клеток, наоборот, приводит к недостаточному росту. Многие производители бессывороточных сред рекомендуют сочетать определенную среду с коллагеном, что позволяет снизить плотность посева (Рисунок 2). Смотрите обсуждение для получения дополнительной информации по этой теме.

Дифференцировка кератиноцитов морфологически проявляется в виде крупных, уплощенных клеток и уложенной морфологии. Смотрите дополнительное видео 2. Оценкой терминальной дифференциации является отсутствие деления за 48 ч ^3,12,13.

Рисунок 1: Этапы выделения кератиноцитов. На этой схеме показаны этапы выделения кератиноцитов, описанные в данном протоколе. Создано в BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Адгезия клеток и образование колоний. Разница в адгезии клеток и образовании колоний через 2 дня 23 ч с коллагеном и без него. Коллаген значительно улучшает первоначальную адгезию кератиноцитов. Создано в BioRender.com Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительное видео 1: Загрязнение колонии кератиноцитов. Изображения, получаемые каждые 20 минут с помощью визуализации живых клеток, сопоставляются в видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео 2: Быстрый рост кератиноцитов с использованием традиционных питательных средств и сред на основе DMEM. Изображения, получаемые каждые 20 минут с помощью визуализации живых клеток, сопоставляются в видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео 3: Повышенная дифференцировка кератиноцитов с использованием традиционного фидера и сред на основе DMEM. Изображения, получаемые каждые 20 минут с помощью визуализации живых клеток, сопоставляются в видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео 4: Отслеживаемая колония кератиноцитов. Изображения, получаемые каждые 20 минут с помощью визуализации живых клеток, сопоставляются в видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительное видео 5: Отслеживаемая колония кератиноцитов. Изображения, получаемые каждые 20 минут с помощью визуализации живых клеток, сопоставляются в видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Здесь мы подробно описали метод первичного культивирования кератиноцитов человека с целью визуализации живых клеток. Этот метод адаптирует существующие методы культивирования клеток с использованием низкоплотного осаждения и долговременного культивирования, чтобы обеспечить успешные исследования визуализации живых клеток. Предпочтительным методом диссоциации этого типа клеток является двухступенчатое ферментативное расщепление, которое, как было показано, приводит к образованию кератиноцитов, из которых 3-4% способны стать колониеобразующими^{единицами}. Рост взрослых и старых кератиноцитов in vitro является сложной задачей, так как многие образцы просто не растут.

Несколько шагов имеют решающее значение для достижения цели максимизации урожайности для улучшения роста. Эти клетки следует изолировать как можно скорее после забора ткани. Поддерживается прямая линия связи с хирургами, а образцы собираются сразу после получения от пациента. Было сделано еще несколько рекомендаций о способах сохранения целостности тканей с помощью этого метода. Сохраняйте ткани в прохладе, храните их в фильтрующих средах и эффективно обрабатывайте ткани. Рассмотрите возможность объединения образцов, если они небольшие, чтобы максимизировать рост in vitro. Всегда нагревайте реагенты не менее 20 мин. Используйте диспазы с доказанной эффективностью и рассмотрите возможность разрезания более мелких полосок ткани или продления инкубационного периода, если есть проблемы с отслаиванием эпидермиса. Используйте минимально возможное количество времени для пищеварения с помощью ферментативной обработки по выбору и нейтрализуйте сразу после инкубации. Повторно суспендируйте гранулу как можно скорее после центрифугирования. Даже после того, как все это будет сделано, следует ожидать, что время от времени будут появляться взрослые и пожилые человеческие образцы, которые не растут даже при самых идеальных обстоятельствах.

Цель состоит в том, чтобы наложить кератиноциты на клональную плотность или близкую к ней и отслеживать их с помощью визуализации живых клеток; Этот метод хорошо согласуется с этими целями. Если цель состоит в том, чтобы изолировать кератиноциты и наблюдать за их подвижностью в различных условиях или для функционального анализа, такого как анализ царапин, альтернативным методом является метод эксплантации кожи. Этот безферментный подход к выделению кератиноцитов может привести к более высокому выходу клеток 14,15,16.

Изменения в используемой среде могут иметь важное значение для визуализации живых клеток. Среда, выбранная для стимулирования роста кератиноцитов, будет влиять на все фазы эксперимента. DMEM, 10% FBS и F-12 Хэма с питающими ячейками 3T3-J2 позволили снизить плотность посева, но привели к ряду проблем. Фидерные клетки, если они не использовались при низкой плотности, закрывали визуальную плоскость, на которой находились кератиноциты, что затрудняло отслеживание. При использовании DMEM фибробласты оставались в течение всей визуализации живых клеток (~2 недели). Кроме того, существуют и другие важные проблемы, связанные с сывороткой крови, в том числе стимулирование дифференцировки (что препятствует использованию программного обеспечения IncuCyte для визуализации живых клеток из-за отсутствия однородного внешнего вида клеток) и риск возможного загрязнения из сыворотки¹⁷. В средах, не содержащих сыворотку, требуется более высокая плотность посева, чем при использовании DMEM, так как меньше клеток прилипают. Комбинации 154 CF + HKGS, Epilife + HKGS и Epilife + S7 оказались эффективными. Напоминаем, что всегда используйте свежую среду при использовании добавок для роста, так как со временем они разрушаются. При запуске нового протокола всегда тестируйте среду не менее чем с тремя образцами, чтобы убедиться, что она может поддерживать культивируемые клетки. Производители бессывороточных сред часто рекомендуют использовать коллаген из крысиного хвоста (тип 1)¹⁸. Коллаген способствует первоначальному прикреплению (что позволяет снизить плотность посева) и пролиферации¹⁹.

Наряду с типом среды, еще одним фактором, который может повлиять на результаты, является плотность посева и распределение клеток. Культуре кератиноцитов способствует межклеточное взаимодействие для пролиферации, и, таким образом, более высокая плотность посева приводит к более продуктивному росту²⁰. Различные среды и возраст клеток требуют разной плотности затравки для достижения клонального роста. Эксперименты обычно проводятся с несколькими плотностями посева для получения соответствующих скоростей роста/размеров колоний для желаемого приложения визуализации живых клеток. Плотности для клонального роста и отслеживания линии могут отличаться от тех, которые необходимы для других применений. Убедитесь, что распределение посева равномерно, прежде чем позволить клеткам прилипнуть.

Использование антибиотиков во время изоляции и роста является спорным. Ранее было показано, что обычно используемые антибиотики могут оказывать ингибирующее действие на пролиферацию кератиноцитов²¹. Учитывая это, многие предпочитают не использовать антибиотики после очищения кожи перед обработкой. Это приложение для визуализации живых клеток включает в себя несколько недель роста колонии, что увеличивает риск заражения. Риск потери нескольких недель времени/ценных образцов из-за загрязнения необходимо взвешивать с риском возможного снижения пролиферации кератиноцитов. При более коротких применениях антибиотики могут не потребоваться, в то время как при длительной визуализации живых клеток они необходимы.

Ограничением культивирования клеток для визуализации живых клеток, как и для других методов in vitro, является неизвестная актуальность in vivo . Кроме того, использование свежеполученных и пассаженных клеток может привести к различным результатам, поскольку характеристики клеток развиваются по мере увеличения числа пассажей²⁰. Кроме того, на результаты может влиять однородная внешняя среда. Эта однородная среда может представлять собой как преимущество, так и ограничение, в зависимости от целей исследования, особенно при разграничении внутренних и внешних изменений в поведении клеток.

Существует множество факторов, которые необходимо учитывать при культивировании кератиноцитов с целью визуализации живых клеток. Представленный способ может помочь упростить процесс. Возможность успешного выполнения визуализации живых клеток кератиноцитов в будущих исследованиях позволит более детально понять пролиферативное и дифференцированное поведение кератиноцитов и механизмы поддержания эпидермиса.

Авторам нечего раскрывать.

Особая благодарность Т. Ричарду Паренто, доктору медицинских наук, и Александре Шарруйер, доктору фармацевтических наук, за то, что научили меня культивировать кератиноциты. Спасибо доктору медицины Мерисе Пайпер за предоставленные образцы для выделения кератиноцитов. В заключение благодарим доктора медицины Майкла Розенблюма за предоставленный нам доступ к его системе визуализации живых клеток для завершения экспериментов.