生成用于角质形成细胞活细胞成像的原代培养物

该方案概述了用于活细胞成像的新鲜获得（第 0 代）角质形成细胞的培养物。

在人类皮肤的单细胞水平上追踪干细胞和承诺的祖细胞行为在 体内 和 体外都具有挑战性。活细胞成像在识别角质形成细胞干细胞和定型祖细胞行为之间差异的能力方面取得了重大进展。活细胞成像是一种不断发展且具有一定挑战性的方法，用于研究 体外角质形成细胞的行为。该方案已被开发用于以低接种密度培养角质形成细胞，从而能够对单个细胞行为进行相对长期的延时摄影和监测。第 0 代角质形成细胞以克隆密度生长，延时摄影可以记录单个细胞分裂及其发生时间。为了获得最大的生物学相关性，将新鲜分离的人角质形成细胞置于 体外。这种方法侧重于增殖。然而，该协议可以适用于其他测量单个细胞行为的活细胞成像应用，例如测量细胞迁移、伤口愈合和运动。

该协议的目标是提供在相对较长的时间（几周）内跟踪培养物中单个角质形成细胞的能力，这是通过低接种密度和延时摄影实现的。低密度活细胞成像为研究人员提供了在单个细胞水平上可视化 体外 细胞行为的机会。虽然在传统细胞培养中是不可能的，但活细胞成像可以在不使用标记的情况下实时开发谱系树，从中可以确定有关分裂动力学的信息，例如细胞周期持续时间以及菌落中增殖和分化分裂的比例。它还允许研究细胞迁移和运动。这在技术上可能具有挑战性，需要优化的各个方面，具体取决于细胞类型和要捕获的数据。其他实验室利用了更容易生长的新生角质形成细胞和/或传代角质形成细胞¹。

然而，经历重复传代的细胞系在行为和形态上与其 体内 状态² 显著不同。为了获得最接近 体内 行为的最大生物学相关性，使用传代 0 细胞。在角质形成细胞群中，无需分类或标记即可区分干细胞和定型祖细胞，因为可以通过活细胞成像观察到分裂行为的明显差异³。

我们利用活细胞成像来研究角质形成细胞增殖动力学。类似的方法已被用于研究与角质形成细胞共培养的皮肤黑色素瘤细胞的运动⁴、划痕测定⁵ 的贴壁细胞迁移以及 ROCK 抑制剂如何影响角质形成细胞增殖⁶。该方案专为培养细胞而设计，以促进通过活细胞成像进行谱系追踪，尽管它可能适用于其他目的。

该方案概述了用于活细胞成像目的的第 0 代角质形成细胞的分离，讨论了可能出现的并发症，并提供了可能需要更改方案的注意事项（图 1）。

使用人体组织需要获得该机构人类研究委员会的批准。用于研究的人类样本通常从商业来源（例如 ATCC、Lifeline cell technology 和 Zen-Bio）获得。我们的研究使用手术时丢弃的组织或专门为研究目的采集的皮肤活检样本。这些情况需要不同的批准和同意程序。所有组织均在获得 UCSF 人类研究委员会的批准后获得，使用书面知情同意并遵循赫尔辛基宣言的原则。

1. 表皮与真皮分离

1. 确保获得适当的批准以使用人体组织进行研究。
2. 获取皮肤样本并将其放入带有冰袋的绝缘容器中运输。将样品置于含有 5 倍浓度青霉素、链霉素和两性霉素的收集培养基中。
   注意： 所需数量将取决于应用程序。根据我们的经验，每厘米² 大约有 1,000,000 个角质形成细胞来自成人和老年皮肤。但是，每个样品的阈值可能会有很大差异。
   1. 将新生儿包皮置于细胞培养基中，并在包皮环切术后不超过 48 小时开始角质形成细胞分离程序，以尽量减少细胞死亡。将组织储存在 4 °C 直至处理。成人和老年样本的处理通常在采集后几个小时内开始。
3. 使用带有 BS2 级设备的生物安全柜，该设备设计用于处理通过摄入、粘膜或经皮暴露引起疾病的试剂⁷。确保生物安全柜经过紫外线消毒至少 15 分钟，并且在使用前所有表面都喷洒了 70% 的酒精。
4. 戴上手套，用 70% 酒精喷洒收集容器，然后将容器放入通风橱中。在纸巾下方放置一个冷却垫，以防止其升温至室温并保持其完整性。如果组织非常大，请切下一部分进行处理，并在收集容器中保持其余部分湿润。
   注意：由于许多老化标本是手术留下的大腹部或乳房皮肤，因此切割和处理组织需要时间。切勿将纸巾直接放在垫子上，因为极冷会导致它结冰。相反，它应该放置在中间表面上，例如大理石板。
5. 将两个 100 mm x 15 mm 培养皿和一把无菌 #23 手术刀放入罩中。
6. 打开培养皿并将其放在橱柜表面，使每个培养皿的内表面朝上。将 10 mL 10% 葡萄糖酸氯己定添加到其中一个培养皿中。将 10 mL 5x 青霉素/链霉素/两性霉素/庆大霉素在 Hank 平衡盐溶液 （HBSS;5x） 中加入到其他 2 个培养皿中（参见 材料表）。
7. 为 Dispase 步骤准备一个 6 孔板。对于新生儿组织，每孔使用 3 mL 分散酶。对于老化的组织样品，使用 4 mL。使用与组织体积相称的 Dispase 量不足会导致难以将表皮与真皮分离。
8. 使用手术刀将组织切成更小的碎片，以便更好地被 Dispase 渗透。分散酶只能从组织边缘穿透最多 5 毫米，因此请切割 0.5-1 厘米宽的长条组织。如果切割得不够小，则不会发生表皮与真皮的分离。
   1. 将较厚的组织切成小块。将新生儿包皮切成 3 或 4 块 （~5 mm x 7 mm）。每孔 Dispase 最多使用两个完整的包皮。浅表腹皮瓣往往更薄，皮下组织很少或没有，将它们切成更长的（~5 mm x 15 mm 条带）。
   2. 每个 Dispase 孔最多放置 4 个试纸条。如果获得的组织附着了大量皮下脂肪，请修剪皮下组织以帮助 Dispase 完全渗透组织。如果组织切得太小，可能需要解剖显微镜来确定哪一侧是表皮，哪一侧是真皮，同时剥落表皮。拉扯皮肤的另一侧会导致额外的组织创伤。
9. 将组织表皮面朝下放入步骤 1.6 中制备的第一个培养皿中，含有 10% 葡萄糖酸洗必泰，放置 10-20 秒，然后将组织表皮面向下转移到第二个培养皿中，含有 5x 青霉素/链霉素/两性霉素 （PSA） 和 HBSS，搅拌 10-20 秒。将组织表皮面向下转移到第三个培养皿中，再次含有 5x PSA 和 HBSS，再搅拌 10 秒。使用相同的溶液处理多个样品是可以接受的。
10. 将组织表皮面向下转移到步骤 1.7 中制备的 6 孔 Dispase 板中。
    注意：按照我们的惯例，我们建议表皮面朝下。其他协议建议真皮层下降⁸。所有 Dispase 的效果并不相同。事实证明，使用某些产品很难从老化的皮肤上剥离表皮，即使浓度高达制造商推荐水平的 4 倍。这导致了时间和样本的损失。公司使用 Dispase 的非标准化单位，因此很难确定品牌之间的浓度差异。由于这些挑战，强烈建议使用 材料表 中列出的 Dispase 品牌之一。
11. 标记含有分散酶和样品的 6 孔板，并转移至 4 °C。 将新生儿样品在 Dispase 中孵育 16-18 小时，将成人/老年样品孵育 24 小时。
    注意：有一种替代的 2 小时方案可用于样品，其中将样品置于 37 °C 的 Dispase 中 2 小时，然后剥去表皮。不幸的是，这并不总是有效，并且孵育后组织的完整性可能会受到影响，从而导致标本丢失。尽可能选择过夜孵育。

2. 角质形成细胞的分离

1. 在开始下一组步骤前20分钟，将0.05%胰蛋白酶-EDTA（或TrypLE）、胰蛋白酶中和溶液和角质形成细胞培养基置于37°C水浴中
2. 从4°C中取出6孔板，用70%乙醇喷洒，并将其放入准备好的生物安全柜中（参见步骤1.3）。
3. 将无菌齿形镊子和无齿镊子放入含有 20 mL 70% 乙醇的 50 mL 锥形管中。如果最初在通风橱外，请先用 70% 乙醇将镊子喷洒下来，然后再将其放入通风橱中。
4. 使用化学灭菌的镊子，抓住一块组织并将其放在无菌表面，表皮面朝上（使用培养皿或 6 孔板上半部分的内侧）。用非惯用手用齿形镊子握住组织的真皮部分，同时用无齿镊子牢牢抓住表皮，并将其从边缘拉到另一边。它应该作为一个整体顺利地脱落。
5. 将表皮放在 15 mL 锥形管的边缘内侧。每个 15 mL 锥形管的表皮最多应为两个包皮。
   1. 高效工作;如果组织变干，产量就会受到影响。如果分散酶没有适当地穿透组织，则可能难以剥离表皮。在这种情况下，从下面的真皮上拉/刮掉表皮。这也会导致产量低得多，因此不建议这样做。
6. 在 15 mL 锥形管中加入 4 mL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，然后关闭并倒置试管，确保所有表皮都悬浮在胰蛋白酶中，而不是卡在试管/盖子的侧面。置于 37 °C 水浴中 10 分钟。每 2 分钟手动搅拌一次细胞。
   注：胰蛋白酶消化超过 10 分钟可能会导致细胞产量降低。此外，如果担心细胞表面蛋白的完整性，请使用 TrypLE，因为它对其切割位点更具特异性，对细胞的损伤较小，并且与胰蛋白酶-EDTA⁹ 相比，已被证明不会显著降低表面抗原表达。此外，水浴是常见的污染源，因此请确保定期清洁。定期用含有 aquaguard-2 溶液的去离子水换水。
7. 将 50 mL 锥形管放入生物安全柜中。拧开盖子，将 100 μm 细胞过滤器放在锥形管的开口处。
8. 从水浴中取出装有消解样品的 15 mL 锥形管，彻底干燥，并喷洒 70% 酒精，然后将其放回生物安全柜中。将锥形管轻敲通风橱表面 3 次，然后倒置 6 次。重复敲击-倒置循环 3 次。
9. 将 6 mL 胰蛋白酶中和溶液加入锥形管中。通过细胞过滤器倒入步骤 2.7 中的 50 mL 锥形管中。
10. 用 5 mL 胰蛋白酶中和溶液 （TNS） 冲洗含有样品的 15 mL 锥形管。通过细胞过滤器倒入 50 mL 锥形管中。以 300 x g 离心 5 分钟。
11. 立即从离心机中取出并移液上清液，以防止细胞流失到培养基中。应该只剩下沉淀和少量液体。可能很难从较小的组织样本中看到沉淀。
    注：上清液中存在胰蛋白酶，因此最好在不丢失沉淀的情况下尽可能多地去除。
12. 将角质形成细胞沉淀重悬于 2 mL 角质形成细胞培养基中。
    注意：这里有两个注意事项。首先，使用哪种媒体。为此，建议使用不含胶原蛋白的无血清培养基。从历史上看，角质形成细胞培养的标准是 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） +10% 胎牛血清 （FBS） + 成纤维细胞饲养层上的 Ham F-12 （3t3-J2s）¹⁰。然而，随着无血清培养基的出现和胶原蛋白的出现，多种其他可能性仍然可行（见讨论）¹¹。第二个考虑因素是在培养基中使用抗生素是否适合活细胞成像应用。这将取决于成像持续时间和成像系统的经验。使用共享成像系统对菌落进行数周成像，尽管对培养物有潜在影响，但使用抗生素是首选方法（见讨论）。在重悬过程中使用青霉素、链霉素、两性霉素 B 和含庆大霉素的角质形成细胞培养基，然后在初始培养基更换后改用含青霉素/链霉素的培养基。这种方法有效地防止了长时间活细胞成像过程中的污染。
13. 计数细胞并接种板（有关选择接种密度的评论，请参阅讨论）。为确保接种均匀分布，在铺板前，将角质形成细胞重悬于待铺板培养基的总量中。倒置轻轻搅拌后，轻轻涡旋 1-2 秒，然后板。然后，在培养箱中以十字状模式（上-下、左-右）移动微孔板 3 次。
14. 24 小时后，将板放入活细胞成像系统的培养箱中。以 10 倍的速度进行活细胞成像，每 20 分钟拍摄一次图像。将样品置于 37 °C 和 5% CO₂ 中，放入连接到显微镜的培养箱中。

鉴于这种方法中可能纵的多个变量最终导致各种结果，我们在这里概述了常见的错误及其结果，并提供了示例结果及其背后的情况。

与任何细胞培养技术一样，可能存在污染（补充视频 1）。除了谨慎的无菌技术外，还应考虑在培养基中使用抗生素，尤其是在长时间培养的情况下。当培养的细胞在不使用抗生素的情况下被运送到另一个位置的成像系统时，观察到频繁的污染。请参阅讨论部分，了解抗生素使用的负面影响。

如实验方案所述，培养基选择至关重要。最初使用在成纤维细胞饲养层上含有 10% FBS 和 Ham's F-12 的 DMEM。但是，这种选择存在问题（补充视频 2）。所用成纤维细胞的初始接种密度太高，随着时间的推移，成纤维细胞似乎膨胀，模糊了角质形成细胞的视野。降低成纤维细胞的接种密度解决了成纤维细胞遮挡的问题。然而，此外，角质形成细胞似乎比无血清培养基分化得更快，这导致角质形成细胞的区域不均匀，难以追踪谱系追踪（补充视频 3）。讨论中扩展了基于 DMEM 的媒体的其他问题。

在遇到传统 DMEM/FBS/Ham 的 F-12 问题后，选择无血清培养基作为替代方案。在培养基中补充有克隆密度的 HKGS 和角质形成细胞，存在可追踪的均匀菌落（补充视频 4、补充视频 5）。使用无血清培养基时，分化速度较慢（可能是由于钙含量较低），并且许多贴壁细胞从不分裂但不分离（就像在其他培养基中一样; 补充视频 4，补充视频 3）。

接种密度会影响追踪细胞的能力。细胞过多会导致无法准确追踪细胞，而细胞过少则会导致生长不足。许多无血清培养基制造商建议将他们确定的培养基与胶原蛋白配对，以实现较低的接种密度（图 2）。有关此主题的更多信息，请参阅讨论。

角质形成细胞分化在形态上通过大而扁平的细胞和堆叠的形态很明显。见补充视频 2。终末分化的评估是在 48 小时内缺乏分裂 ^3,12,13。

图 1：角质形成细胞分离步骤。 该图说明了本协议中描述的角质形成细胞分离的步骤。创建于 BioRender.com 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：细胞粘附和集落形成。 2 天 23 小时时细胞粘附和集落形成的差异，有和没有胶原蛋白。胶原蛋白显着改善初始角质形成细胞粘附。创建于 BioRender.com 请单击此处查看此图的较大版本。

补充视频 1：角质形成细胞集落的污染。 通过活细胞成像每 20 分钟拍摄一次图像，并整理成视频。 请点击此处下载此文件。

补充视频 2：使用传统饲养层和基于 DMEM 的培养基快速生长角质形成细胞。 通过活细胞成像每 20 分钟拍摄一次图像，并整理成视频。 请点击此处下载此文件。

补充视频 3：使用传统饲养层和基于 DMEM 的培养基增加角质形成细胞分化。 通过活细胞成像每 20 分钟拍摄一次图像，并整理成视频。 请点击此处下载此文件。

补充视频 4：可追踪的角质形成细胞集落。 通过活细胞成像每 20 分钟拍摄一次图像，并整理成视频。 请点击此处下载此文件。

补充视频 5：可追踪的角质形成细胞集落。 通过活细胞成像每 20 分钟拍摄一次图像，并整理成视频。 请点击此处下载此文件。

在这里，我们详细介绍了一种用于活细胞成像的人角质形成细胞原代培养方法。该方法使用低密度铺板和长期培养来调整现有的细胞培养技术，以实现成功的活细胞成像研究。这种细胞类型解离的首选方法涉及两步酶消化，这已被证明会产生角质形成细胞，其中 3%-4% 能够成为集落形成单位¹⁴。成人和老年角质形成细胞 在体外 生长具有挑战性，因为许多样品根本无法生长。

多个步骤对于实现产量最大化以提高生长的目标至关重要。组织收集后应尽快分离这些细胞。与外科医生保持直接沟通，并从患者那里获得标本后立即收集标本。关于使用这种方法保持组织完整性的方法，已经提出了其他几项建议。保持组织凉爽，将组织保存在采集介质中，并高效处理组织。如果样本小，请考虑合并样本，以最大限度地提高 体外生长。始终将试剂加热至少 20 分钟。利用已证明有效的 Dispase，如果表皮剥落有问题，请考虑切割较小的组织条或延长孵育期。使用尽可能短的时间进行消化，并选择酶处理，并在孵育后立即中和。离心后尽快重悬沉淀。即使在做了所有这些之后，预计偶尔会有成年和老年人类样本不会生长，即使在似乎最理想的情况下也是如此。

目标是以克隆密度或接近克隆密度接种角质形成细胞，并使用活细胞成像对其进行跟踪;这种方法与这些目标非常一致。如果目标是分离角质形成细胞并观察不同条件下的运动，或者进行像划痕测定这样的功能测定，那么可以考虑的另一种方法是皮肤外植体技术。这种用于分离角质形成细胞的无酶方法可能会导致更高的细胞产量 14,15,16。

所用培养基的修改对于活细胞成像可能很重要。选择用于促进角质形成细胞生长的培养基将影响实验的所有阶段。DMEM、10% FBS 和带有 3T3-J2 饲养层细胞的 Ham's F-12 允许较低的接种密度，但会导致几个问题。除非以低密度使用，否则饲养细胞会遮挡角质形成细胞所在的视觉平面，使追踪更加困难。使用 DMEM，成纤维细胞在活细胞成像期间 （~2 周） 保持。此外，基于血清的培养基还有其他重要的问题，包括促进分化（由于细胞外观不均匀，因此无法使用 IncuCyte 软件进行活细胞成像）和血清可能污染的风险¹⁷。在无血清培养基中，由于粘附的细胞更少，因此需要比 DMEM 更高的接种密度。154 CF + HKGS、Epilife + HKGS 和 Epilife + S7 的组合都取得了效果。提醒一下，使用生长补充剂时，请始终使用新鲜培养基，因为它们会随着时间的推移而降解。在开始新方案时，请始终使用至少三个样品测试培养基，以验证其是否能够支持正在培养的细胞。无血清培养基的制造商通常建议使用大鼠尾胶原（1 型）¹⁸。胶原蛋白有助于初始附着（允许较低的播种密度）和增殖¹⁹。

除了培养基类型外，另一个可能影响结果的因素是接种密度和细胞分布。角质形成细胞培养受细胞间相互作用的增殖帮助，因此，较高的接种密度导致更多产的生长²⁰。不同的培养基和细胞年龄需要不同的接种密度才能实现克隆生长。实验通常以多种接种密度进行，以获得适合所需活细胞成像应用的生长速率/菌落大小。克隆生长和谱系追踪的密度可能与其他应用所需的密度不同。在让细胞粘附之前，确保接种分布均匀。

分离和生长期间抗生素的使用存在争议。先前已经表明，常用的抗生素可以对角质形成细胞增殖产生抑制作用²¹。鉴于此，许多人在处理前最初清洁皮肤后选择不使用抗生素。这种活细胞成像应用涉及数周的集落生长，增加了污染风险。需要权衡因污染而损失数周时间/宝贵样品的风险与角质形成细胞增殖可能减少的风险。较短的应用可能不需要抗生素，而长时间的活细胞成像则需要。

与其他体外技术一样，用于活细胞成像的培养细胞的一个局限性是未知的 体内 相关性。此外，随着传代次数的增加，细胞特性的变化，使用新鲜获得的细胞与传代的细胞会产生不同的结果²⁰。此外，结果可能会受到均匀的外部环境的影响。这种统一的环境可能代表一种优势或局限性，具体取决于研究的目标，特别是在区分细胞行为的内在和外在变化时。

在为活细胞成像目的培养角质形成细胞时，需要考虑许多因素。所提出的方法可以帮助简化该过程。能够在未来的研究中成功进行角质形成细胞活细胞成像，将有助于更精细地了解角质形成细胞的增殖和分化行为以及表皮维持的机制。

作者没有什么可披露的。

特别感谢 T. Richard Parenteau（医学博士/博士）和 Alexandra Charruyer（药学博士/博士）教我如何培养角质形成细胞。感谢 Merisa Piper 医学博士为我们提供样品以分离角质形成细胞。最后，感谢医学博士 Michael Rosenblum 允许我们使用他的活细胞成像系统来完成实验。