Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Metabolik yeniden programlama, monosit / makrofaj aktivasyonunun ve pro- ve anti-inflamatuar durumlar arasındaki polarizasyonun ayırt edici bir özelliğidir. Örneğin, pro-enflamatuar (yani M1 benzeri) monositler / makrofajlar, anaerobik glikolize daha fazla ve mitokondriyal oksidatif fosforilasyona daha az bağımlı olurken, anti-enflamatuar (M2 benzeri) makrofajlar, mitokondrideki glikoz ve yağ asidi oksidasyonuna daha fazla bağımlı olduğunu gösterir. Burada, vücuttaki iki ana monosit / makrofaj rezervuarı olan dalak ve kemik iliğinden ve ayrıca miyokard enfarktüsünü takiben kalp gibi yaralı dokulardan makrofajların çıkarılması için derinlemesine protokolleri açıklıyoruz.

Makrofajlar veya monositler, fenotiplerinden ödün vermeden hücrelere kolayca bağlanan antikor etiketli mikro boncuklar kullanılarak immünomanyetik sıralama ile ekstrakte edilir. Ekstrakte edilen hücreler daha sonra 96 oyuklu plakalarda kültürlenir, ardından bir metabolik akı analizörü kullanılarak hücre dışı akı analizi yapılır. Hem glikoliz hem de mitokondriyal oksidatif fosforilasyon, az sayıda hücrede (2-3 × 10⁵ hücre kadar az) aynı anda ölçülebilir. Bu yöntem 1 günde kolayca uygulanabilir ve güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar verir. Sonuç olarak, bu yöntemler, yaralanma ve hastalığa karşı bağışıklık ve inflamatuar yanıtlar sırasında metabolik değişiklikler hakkındaki anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olur ve bu da immünometabolik yollar için yeni terapötik hedeflerin geliştirilmesine yol açabilir.

İmmünometabolizma, farklı patolojik hastalık ve yaralanma durumlarında bağışıklık hücrelerinde metabolik yeniden programlamanın rolünü inceleyen çiçek açan bir alandır. Makrofajlar, inflamasyon, enfeksiyona yanıt, antijen sunumu ve yara iyileşmesinde kritik rol oynayan doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir parçasıdır¹. Makrofajların farklı hastalık durumlarında pro- ve anti-enflamatuar (M1 benzeri ve M2 benzeri) alt kümeler arasında nasıl polarize olduğunu anlamak, devam eden ve yoğun bir araştırma alanıdır. Son çalışmalar, metabolik yeniden programlamayı makrofaj polarizasyonunun altında yatan anahtar bir mekanizma olarak tanımlamıştır. Mevcut paradigma, genel olarak konuşursak, M1 benzeri makrofajların (tipik olarak monosit benzeri olan) pro-inflamatuar fonksiyonları beslemek için glikolize daha fazla dayandığı, M2 benzeri makrofajların ise pro-inflamatuar fonksiyonları bastırmak ve anti-inflamatuar süreçleri beslemek için mitokondriyal oksidatif fosforilasyona daha fazla güvendiğidir². Makrofaj metabolizmasının farklı hastalık durumlarında nasıl değiştiğini anlamak, metabolik yolları hedeflemek için kullanılabilecek potansiyel tedaviler hakkında fikir verebilir.

Örnek olarak, laboratuvarımız miyokard enfarktüsü (MI) sırasında makrofaj metabolik yeniden programlamasının rolünü kapsamlı bir şekilde araştırmıştır3,4,5. Makrofajlar, MI sırasında enflamatuar ve yara iyileşme yanıtında önemli bir rol oynar ve bu nedenle, enfarktüslü kalp, replasman skar dokusu oluşturmak üzere yeniden şekillenirken, M1 benzerinden M2 benzeri fenotiplere doğru polarizasyona uğrar. Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, bu polarizasyonun glikoz ve glutamin metabolizmasında ve mitokondriyal fonksiyonda benzersiz değişiklikler ile karakterize olduğunu gösterdik. Kardiyak makrofajların yanı sıra splenik makrofajlar ve kemik iliği monositlerinin çıkarılması için kullanılan yöntemleri açıklıyoruz, bunlar tek bir günde ex vivo metabolik akıyı değerlendirmek için hücre dışı akı analizi ile birleştirilebilir. Açıklanan yöntemlerin, bu önemli konuyu inceleyen laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği artırmak için bağışıklık hücresi metabolik fenotiplerini değerlendirmek için standart bir yaklaşım sunmasını umuyoruz.

Aşağıdaki yöntemler, makrofajların çıkarılması ve MI, dalak ve kemik iliğini takiben enfarktüslü kalpten metabolik akının ex vivo analizini yapmak için protokolleri açıklamaktadır (Şekil 1). MI kalp ve dalak için kullanılan ekstraksiyon yöntemi aynıdır. Fareleri içeren tüm protokoller, Mississippi Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokol # 1371, Mouton) tarafından onaylandı.

1. Enfarktüslü kalp ve dalaktan makrofajların çıkarılması

NOT: Doku makrofajlarının ekstraksiyonu, önce Ly6G-mikroboncukları ile işaretlenmiş nötrofilleri çıkarmak için negatif bir seçim stratejisi ve daha sonra CD11b-mikroboncukları 3,4,5,6 ile makrofajları elde etmek için pozitif bir seçim stratejisi kullanır. Bu protokolü uygularken hızlı çalışın ve hücreleri soğuk tutun.

1. Fareyi AALAC ve kurumsal yönergelere uygun olarak izofluran doz aşımı ile ötenazi yapın ve ardından kalbin çıkarılması ile değiştirin.
2. Kalbi ve dalağı hızlı bir şekilde çıkarın ve dokuları tartın.
3. Testten önce, EDTA (2 mM) ve% 0.5 sığır serum albüminini (a/h) fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözerek PEB tamponunu hazırlayın. Soğuk tutun.
4. Kalbi soğuk Hank'in dengeli tuz çözeltisine (HBSS) yerleştirin. Steril bir neşter ile küçük parçalar halinde kıyın.
5. 600 U / mL kollajenaz tip II ve 60 U / mL DNaz tip I içeren bir sindirim çözeltisi hazırlayın. Dokuyu bir MACS hücre ayrışma tüpünde 10 mL sindirim çözeltisinde karıştırın.
   NOT: Her doku için (oda sıcaklığı) 10 mL kullanacak kadar sindirim solüsyonu yapın.
6. Üreticinin protokolüne göre hücre ayrıştırıcısını kullanarak dokuları inkübe edin. Bu, kıyılmış dokuyu 37 °C'de ~ 1 saat boyunca hafifçe eğirerek inkübe edecek ve bir hücre süspansiyonu oluşturacaktır.
7. Süspansiyonu 15 mL konik tüplere taşıyın ve 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
8. Peleti 1 mL PEB tamponunda yeniden süspanse edin. Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için, süspansiyonu 30 μm'lik bir filtreye uygulayın.
9. Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için 10 mL 1x kırmızı kan hücresi lizis çözeltisi ekleyin. Karanlıkta 4 °C'de 5-10 dakika inkübe edin.
10. Süspansiyonu 300 × g boyunca 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
11. Peleti 1 mL PEB içinde yeniden süspanse edin ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın.
12. Süspansiyonu 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
13. Nötrofilleri çıkarmak için, 10⁷ hücre başına 90 μL PEB tamponunu 10 μL anti-Ly6G mikro boncuklarla karıştırarak mikroboncuklar hazırlayın. Hücre peletini mikro boncuk süspansiyonu ile karıştırın ve karanlıkta 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
14. Bağlanmamış mikro boncukları yıkamak için 10 mL PEB tamponu ekleyin ve 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
15. Manyetik bir stand üzerinde manyetik sütunlar (MS veya LS) hazırlayın. 0.5-1.0 mL PEB tamponu ekleyerek sütunları ıslatın.
    NOT: Bol miktarda bağışıklık hücresi (yani dalak) olan dokular için, manyetik kolon kolayca tıkanabilir ve akışı durdurabilir. Bu nedenle, dalak için LS sütunlarını kullanmanızı öneririz.
16. Hücre peletini 500 μL PEB tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu manyetik kolona ekleyin ve etiketlenmemiş hücrelerin (yani nötrofil olmayanların) geçmesine izin verin. Kolonu 2x 500 μL PEB tamponu ile yıkayın. Etiketlenmemiş hücreleri (yani makrofajlar ve diğer hücreler) 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
17. Süspansiyonu 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
18. 10⁷ hücre başına 90 μL PEB tamponunu 10 μL anti-CD11b mikro boncuk ile karıştırarak mikro boncuklar hazırlayın. Hücre peletini mikro boncuk süspansiyonu ile karıştırın ve karanlıkta 4 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
19. 1.13-1.15 arasındaki adımları tekrarlayın.
20. Etiketli makrofajlar manyetik kolona bağlanacaktır. Bunları toplamak için manyetik sütunu manyetik standdan ayırın ve 15 mL'lik yeni bir konik tüpün üzerine yerleştirin.
21. Kolona% 0.1 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 1 mL RPMI ortamı ekleyin. Makrofajları tüpe çıkarmak için pistonu kullanın. Bir hematitometre kullanarak makrofajları sayın.
    NOT: Makrofajlar artık tüpün içindedir ve daha sonraki tahliller için kullanıma hazırdır.

2. Kemik iliğinden monositlerin ekstraksiyonu

NOT: Monositlerin kemik iliğinden ekstraksiyonu, lenfositler, doğal öldürücü hücreler, dendritik hücreler, eritroid hücreler ve granülositler (yani nötrofiller) dahil olmak üzere monosit olmayanların immünomanyetik olarak etiketlendiği ve çıkarıldığı negatif bir seçim stratejisi kullanır.

1. Fareyi AALAC ve kurumsal yönergelere uygun olarak izofluran doz aşımı ile ötenazi yapın ve ardından kalbin çıkarılması ile değiştirin.
2. Bacakları fareden çıkarın. Soğuk HBSS'de, kemikler temiz olana kadar kası tibia ve femurdan uzaklaştırın.
3. Kemiğin her iki ucunu da dikkatlice kesin. 27 G iğneli 10 mL'lik bir şırınga kullanarak, kemik iliğini PEB tamponlu 15 mL'lik konik bir tüpe boşaltın. Süspansiyonu 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
4. 1.8-1.12 adımlarını gerçekleştirin.
5. Toplam^{hücrelerin 5} ila 10 7'×si başına 175 μL PEB tamponu, 25 μL FcR bloke edici reaktif ve 50 μL monosit biyotin-antikor kokteyli ekleyin. Karanlıkta 4 °C'de 5 dakika inkübe edin.
6. 10 mL PEB tamponu ekleyerek yıkayın ve 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.
7. Peletleri toplayın ve hücreleri 500 μL PEB tamponu ve 100 μL anti-Biotin mikro boncuklar içinde yeniden süspanse edin. Karanlıkta 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.
8. Manyetik bir stand üzerinde manyetik sütunlar (LS) hazırlayın. 1.0 mL PEB tamponu ekleyerek sütunları ıslatın.
9. Hücre süspansiyonunu hemen sütuna uygulayın. Monositleri içeren akışı toplamak için 15 mL'lik bir tüp kullanın. Monosit olmayanlar manyetik kolona bağlanır.
10. Sütunu 2x 1 mL PEB tamponu ile yıkayın. Bir hemasitometre kullanarak monositleri sayın.
11. Monositleri bir sonraki adıma hazırlamak için 300 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Akı analizi için, hücre peletini 1 mL RPMI +% 0.1 FBS'de yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi için hücreleri soğuk PEB'de tutun ve boyamaya devam edin.

3. Metabolik akı analizi için hücrelerin hazırlanması

1. Sensör kartuşunu nemlendirin (testten bir gün önce)
   1. Sensör kartuşunu paketinden çıkarın. Sensör plakasını (yeşil) kuyulardan çıkarın ve her bir kuyucuğa 200 μL kalibrant sıvısı pipetleyin. Sensörler kalibant sıvısına daldırılacak şekilde sensör plakasını kartuş plakasının üstüne geri yerleştirin.
   2. Kartuşu gece boyunca CO₂ olmayan nemlendirilmiş bir inkübatöre (37 °C) yerleştirin.
2. Hücrelerin kaplanması
   1. Hücreleri en az 1 saat boyunca 200 μL ortamda 96 oyuklu bir kültür plakasında kaplayın. Arka plan ölçümleri için en az bir kuyuyu boş bırakın (boş kuyular için aynı hacimde ortam kullanın).
      NOT: En uygun hücre sayısı deneyden önce belirlenmelidir. Daha fazla ayrıntı için tartışmadaki "Sorun Giderme İpuçları" bölümüne bakın.
   2. Testi gerçekleştirmeye hazır olduğunuzda, metabolik akı ortamını hazırlayın (yani, glikoz, glutamin, piruvat vb. içermeyen bazal RPMI veya DMEM). Glikoliz stres testi için bazal ortamın 2 mM glutamin ile desteklendiğinden emin olun. Mitokondriyal stres testi için bazal ortamın 2 mM glutamin, 10 mM glikoz ve 1 mM piruvat ile desteklendiğinden emin olun.
   3. Yavaşça pipetleyerek eski ortamı dikkatlice yeni bazal ortamla değiştirin (herhangi bir hücreyi yerinden çıkarmamaya dikkat edin). Hala mevcut olduklarından emin olmak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin.
   4. Hücre plakasını CO₂ olmayan nemlendirilmiş bir inkübatöre (37 ° C) yerleştirin.
3. Akı plakasının yüklenmesi
   1. Hidratlı sensör kartuşunu/akı plakasını inkübatörden alın.
   2. Test bileşiklerini glikoliz veya mitokondriyal stres testi için hazırlayın.
      1. Glikoliz: Glikoliz bazal ortamını kullanarak, glikozu 3 mL'de, oligomisin'i 270 μL'de (100 μM) ve 2-deoksiglukozu 3 mL'de çözerek stok çözeltileri oluşturun. 10 μM'lik çalışan bir oligomisin çözeltisi oluşturun.
      2. Mitokondriyal: Mitokondriyal bazal ortam kullanarak, oligomisin 630 μL'de (100 μM), karbonil siyanür-p-triflometoksifenilhidrazonu (FCCP) 720 μL'de (100 μM) ve rotenon/antimisin A'yı 540 μL'de (50 μM) çözerek stok çözeltileri oluşturun. Oligomisin (0.5-2.5 μM), FCCP (0.125-2.0 μM) ve rotenon / antimisin A (0.5 μM) için çalışma solüsyonları oluşturun.
         NOT: 1.5 μM oligomisin ve 2.0 μM FCCP'nin en iyi sonuçları verdiğini bulduk.
   3. Aşağıdaki hacimleri kullanarak test bileşiklerini bağlantı noktalarına yükleyin: bağlantı noktası A-20 μL, bağlantı noktası B-22 μL, bağlantı noktası C-25 μL, bağlantı noktası D-27 μL. İsteğe bağlı: Glikoliz veya mitokondriyal solunum üzerindeki akut etkileri değerlendirmek için ilacı veya tercih edilen bileşiği port A'ya yükleyin ve bileşikleri port B, C ve D'ye test edin. Ek ilaç veya bileşik kullanmıyorsanız, D portunu boş bırakın.
4. Tahlili çalıştırma
   1. Yazılımı açın ve Mitokondriyal Stres Testi'ni seçin.
      NOT: Bu program, hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) ölçüldüğü için glikoliz stres testi için de kullanılabilir.
   2. Kullanılacak kuyuları seçin. Arka planı çıkarmak için en az 1 kuyuda hücre olmadığından emin olun.
   3. Programı çalıştırın. Plakanın kalibre edilmesi için akı plakasını kapak çıkarılmış olarak yükleyin (~20 dk).
   4. Plaka kalibre edildikten sonra, yazılım hücre plakasını yüklemek için bir istem verecektir. Hücre plakasını inkübatörden çıkarın, akı plakasının altını çıkarın ve hücre plakasını tutucuya yerleştirin. Çalıştır'a basın. Testin tamamlanması ~ 2.5 saat sürecektir.
   5. Metabolik akı yazılımı⁷ veya tercih edilen diğer analitik yazılımları kullanarak sonuçları analiz edin.

Farklı dokulardan elde edilen tipik hücre sayıları, hayvanın büyüklüğüne, yaşına ve cinsiyetine bağlıdır. Yetişkin bir erkek fare için (ör., 16 haftalık, ~ 30 g), dalak 3.0-4.0 × 10⁶ makrofaj verebilirken, kemik iliği (iki tibia ve iki uyluk kemiği) tipik olarak 1.0-1.5 × 10⁶ monosit verir (Şekil 2A). Enfarktüslü kalp, MI ^4,5,6 sonrası güne bağlı olarak tipik olarak yüksek sayılar verir. 3. günde, verim tipik olarak ~ 1.5 × 10⁶ hücre / kalptir. Sağlıklı kalpte tipik olarak çok az makrofaj bulunur (0.1-0.2 × 10⁵/kalp)⁶; Bu nedenle, sağlıklı (enfarktüslü olmayan kalpten) alınan makrofajlar kontrol olarak kullanılıyorsa, birden fazla kalbin bir araya getirilmesi gerekebilir. Şekil 2B, ekstrakte edilmiş makrofajlardan veya monositlerden elde edilen temsili akış sitometrisi grafiklerini göstermektedir ve CD11b için oldukça pozitif ve Ly6G için negatif olan popülasyonları göstermektedir. Kardiyak ve splenik makrofajlar, monosit belirteci Ly6C için heterojenlik gösterirken, kemik iliği monositleri Ly6C için oldukça pozitiftir. Sıralanmış nötrofiller (kalp ve dalak) ve enfarktüslü kalp, dalak ve kemik iliğinden (yani tüm doku) sıralanmamış hücreler için temsili akış sitometrisi grafikleri Ek Şekil S1, Ek Şekil S2 ve Ek Şekil S3'te gösterilmektedir.

Hücre dışı akı analizinin sonuçları, ECAR (mPh/dk) ve oksijen tüketim oranındaki (OCR, pmol O₂/dk) değişiklikler olarak temsil edilir. Sonuçlar tipik olarak y ekseninde ECAR veya OCR ve x ekseninde zaman ile bir çizgi grafiğinde sunulur (Şekil 3). Belirli ölçümler çubuk grafikler olarak görüntülenir.

Ham verilerden, birkaç metabolik parametre hesaplanabilir. Farklı koşullar altında değişebilen mitokondriyal solunuma karşı glikolize olan bağımlılık hakkında bir fikir vermek için her bir kuyucuktan OCR/ECAR oranı da hesaplanabilir⁴. Örneğin, makrofaj metabolizmasındaki değişiklikleri değerlendirmek için fareleri (yetişkin erkek C57BL / 6J) gece boyunca oruç tuttuk. Açlık fenotipi, kan şekeri seviyelerinin düşmesi ve dolaşımdaki lökositleri ve nötrofilleri azaltan kan ketonlarının artması (Ek Şekil S4) ile doğrulandı (Hemavet 950FS Otomatik Kan Analiz Cihazı; Ek Şekil S5). Beslenen ve aç tutulan farelerden kemik iliği monositlerini ve splenik makrofajları izole ettik ve ekstraselüler akı analizi ile metabolik değişiklikleri değerlendirdik (Şekil 4). Kemik iliği monositlerinde açlık, hem mitokondriyal stres testinde hem de glikoliz stres testinde glikolizi azaltmış ve OCR/ECAR oranını arttırmıştır (Şekil 4A). Dalak makrofajlarında, açlık glikolizi önemli ölçüde etkilemedi, ancak yedek kapasiteyi ve ATP'ye bağlı solunumu artırdı (Şekil 4B). Şekil 4C , ameliyattan 3 gün sonra enfarktüslü kalpten izole edilen makrofajlardaki metabolik akının bir örneğini göstermektedir.

Şekil 1: Ekstrakte edilen makrofajlarda/monositlerde metabolik akı analizinin temsili şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Farelerden izole edilen kardiyak ve splenik makrofajların ve kemik iliği monositlerinin temsili sonuçları. (A) İzole edilmiş kardiyak ve splenik makrofajların ve kemik iliği monositlerinin temsili görüntüleri (4x); fare başına ortalama hücre sayısı. Ölçek çubuğu = 1 mm. (B) Kardiyak (miyokard enfarktüsü Gün 3) ve dalak makrofajlarından ve kemik iliği monositlerinden temsili akış sitometrisi grafikleri. Pan-lökosit markörü olarak CD45, miyeloid hücre markörü olarak CD11b kullanıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Testlerin temsili sonuçları. (A) Glikoliz ve (B) mitokondriyal stres testleri. N = 3 bağımsız ölçüm (splenik makrofajlar). Ortalama ± SEM. Kısaltmalar: ECAR = hücre dışı asitleşme hızı; OCR = oksijen tüketim oranı; FCCP = karbonil siyanür-p-triflometoksifenilhidrazon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Gece boyunca oruç tutmanın hücre metabolizması üzerindeki etkisi. (A) Kemik iliği monosit ve (B) dalak makrofaj metabolizması. (C) Miyokard enfarktüsünden 3 gün sonra kardiyak makrofajlardan temsili hücre dışı akı grafikleri. N = 3-4 her grup. Kısaltma: FCCP = karbonil siyanür-p-triflometoksifenilhidrazon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Beslenen ve aç tutulan farelerden temsili akış sitometrisi grafikleri ve kan şekeri ve keton seviyeleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yöntemimiz, makrofajların kemik iliğinden, dalaktan ve enfarktüslü kalpten hızlı bir şekilde çıkarılmasını detaylandırır ve daha sonra hücre dışı metabolik akı analizi gibi aşağı akış analizlerini gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu iki yöntemin kombinasyonu, farklı hastalık veya yaralanma durumları veya egzersiz gibi metabolik durumlar altında makrofajlardaki metabolik değişiklikleri ölçebilen güçlü bir araçtır. Yöntemimiz kemik iliği ve dalak makrofajlarına odaklanırken, periton kompartmanı⁸ gibi diğer makrofaj rezervuarları da kullanılabilir. Bu yöntemi ilk kullanan biz olmasak da, bu makalenin laboratuvarlarda maruziyeti artıracağını ve standardizasyonu iyileştireceğini umuyoruz.

Bu yöntemlerden elde edilen veriler, farklı makrofaj bölmelerinin metabolik durumu hakkında paha biçilmez bir fikir verirken, metabolizmanın daha eksiksiz bir resmini elde etmek için metabolik akı verilerini tamamlamak için başka yöntemlerin kullanılması şiddetle tavsiye edilir. Örneğin, metabolik akı verilerinin metabolomiklerle (yani hücre içi metabolitlerin nicelleştirilmesi) ve gen/protein ekspresyonu ve/veya metabolik enzimlerin aktivitesiyle birleştirilmesi, makrofajlardaki metabolik durumların çok yönlü bir değerlendirmesini oluşturmak için sıklıkla kullanılır ^5,9. Çoğu durumda, aynı hayvandan alınan hücreler farklı tahliller için kullanılabilir.

Deneyimlerimize göre, protokolün optimizasyonu birkaç farklı adımda sorun gidermeyi içerebilir. En önemli şeylerden biri hızlı çalışmak ve hücreleri soğuk tutmaktır, bu da hücre verimini ve canlılığını artıracaktır. Hücre dışı akı için en uygun hücre sayısının belirlenmesi bir başka önemli noktadır, çünkü çok az hücre tespit edilebilir bir sinyal vermeyecek, çok fazla hücre ortamdaki besinleri tüketecek ve böylece enjekte edilen bileşiklere bir yanıt göstermeyecektir. Makrofajlar için, MI kalbinden 2.0 × 10⁵ hücresinin ve 96 oyuklu bir plakada 3.0 × 10^5'in en güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçları verdiğini bulduk. Ancak, bu laboratuvarlar arasında farklılık gösterebilir. Numuneler ve gruplar arasında eşit hücre sayılarının kullanılmasını sağlamak için ekstra özen gösterilmelidir. Farklı hücre sayıları, tahlilde kullanılan ilaçlara farklı tepkiler verir ve istenmeyen değişkenliğe neden olabilir.

Teste dahil edilen enjekte edilen ilaçların optimal konsantrasyonları (oligomisin, FCCP) da deneyler yapılmadan önce optimize edilmelidir. Örneğin, 1.5 μM oligomisin ve 2.0 μM FCCP'nin en sağlam yanıtları ürettiğini bulduk. Diğer bir yaygın hata, ekstraksiyondan sonra hücrelerin kültür kabına yapışması için yeterli zamana izin vermemektir, bu da hücre dışı akı ortamına geçerken hücre kaybına neden olur. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için en az 1 saat ve en fazla 2 saat öneririz.

Çok agresif pipetleme de hücre kaybına neden olabilir; Çok dikkatli bir şekilde pipetleme yapılması ve hücrelerin mikroskop altında sık sık kontrol edilmesi önerilir. Son bir nokta, akı plakasını hazırlarken, özellikle glikoliz stres testini gerçekleştirirken hızlı bir şekilde çalışmaktır. Bu hücreler tahlilden önce glikozdan yoksun bırakıldığından, daha uzun inkübasyon süreleri (bazal ortamda 1 saatten uzun) glikoza ilk yanıtı değiştirebilir. Normal ortamı bazal ortamla değiştirdikten (~ 30 dakika) ve ardından plakayı kalibre ettikten (~ 20 dakika sürer) hemen akı plakasını hazırlamanızı öneririz. Testler arası değişkenlik her zaman göz önünde bulundurulmalıdır. Gruplar arasında doğrudan karşılaştırmalar yapılırken, her zaman tüm grupları aynı plaka veya deney içinde gerçekleştirmek için çaba gösterilmelidir.

Sıklıkla kullanılan iki standart testi (glikoliz stresi ve mitokondriyal stres testleri) tanımlamış olsak da, mitokondriyal yakıt esnek testi¹⁰, yağ asidi / palmitat oksidasyonu¹¹ ve ATP oranı testi¹² gibi diğer metabolik yolları değerlendirmek için kullanılabilecek birkaç başka standart test olduğuna dikkat edilmelidir. Yeni çalışmalar, T hücresi Metabolik Profil Oluşturma Kitinde sağlanan BAM15 birleştiricinin etkinliğini göstermiştir. BAM15, daha az sitotoksik etkiye sahip FCCP'den daha güvenilir bir birleştirici gibi görünmektedir¹³. Gelecekteki çalışmalar, makrofajların metabolik değerlendirmesinde bu birleştiricinin potansiyelini araştırmalıdır.

Bu yöntemin bazı sınırlamaları vardır. Birincisi, adım sayısı nedeniyle, bir kişinin zamanında gerçekleştirmesi zor olabilir. Özellikle, daha fazla sayıda numune (8'e kadar) kullanıldığında, sonuçların kalitesini artırmak için iki kişinin birlikte çalışması önerilir. İki kişiyle bile bir günde sekizden fazla numuneyi işlemenin zor olduğunu gördük. Diğer bir sınırlama, tahlil ex vivo olarak gerçekleştirildiğinden, ekstraksiyon prosedürünün hücresel fenotip^6'da değişikliklere neden olma olasılığının her zaman olmasıdır. Bu sınırlamayı ortadan kaldırmanın açık bir yolu olmasa da, hiperpolarize manyetik rezonans görüntüleme gibi in vivo görüntüleme teknikleri, MI^14'ten sonra makrofaj laktat üretimini görselleştirmek için kullanılmıştır ve umarız tanımladığımız ex vivo yöntemin bir tamamlayıcısı veya ikamesi olarak gelişmeye devam edecektir. Hücre dışı akı yönteminin bir sınırlaması, glikoliz ve OXPHOS arasındaki kaymaları yakalayabilmesine rağmen, bu yollar¹⁵ içindeki ATP üretim hızındaki değişiklikleri tam olarak yansıtmamasıdır. Ayrıca, ortamın asitleşmesindeki değişiklikler (ECAR) her zaman glikoliz yoluyla laktik asit üretimini yansıtmayabilir, ancak bikarbonat^15'e dönüştürülen TCA döngüsü tarafından CO₂ oluşumundan da etkilenebilir. Bu nedenle, kullanıcıların glikoliz ve OXPHOS'tan ATP üretim oranını hesaplaması avantajlı olabilir, bu da bu yollardan genel ATP üretimine katkıları değerlendirebilir.

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışmayı destekleyen finansmana teşekkür etmek isteriz: NIH/NHBLI 166737, NIH R00 HL146888, NIH U54HL169191, NIH/NIGMS P20GM104357 ve NIH/NIGMS bu çalışma için P30GM149404.