Aqui, descrevemos em detalhes métodos para extrair macrófagos da medula óssea, baço e coração infartado e, posteriormente, avaliar o fluxo metabólico em células vivas.

A reprogramação metabólica é uma marca registrada da ativação de monócitos/macrófagos e da polarização entre estados pró e anti-inflamatórios. Por exemplo, monócitos/macrófagos pró-inflamatórios (ou seja, semelhantes a M1) exibem mais dependência da glicólise anaeróbica e menos dependência da fosforilação oxidativa mitocondrial, enquanto macrófagos anti-inflamatórios (semelhantes a M2) exibem mais dependência da glicose e da oxidação de ácidos graxos nas mitocôndrias. Aqui, descrevemos protocolos detalhados para extrair macrófagos dos dois principais reservatórios de monócitos / macrófagos do corpo, o baço e a medula óssea, bem como tecidos lesionados, como o coração, após infarto do miocárdio.

Macrófagos ou monócitos são extraídos por classificação imunomagnética usando microesferas marcadas com anticorpos, que se ligam facilmente às células sem comprometer seus fenótipos. As células extraídas são então cultivadas em placas de 96 poços, seguidas de análise de fluxo extracelular usando um analisador de fluxo metabólico. Tanto a glicólise quanto a fosforilação oxidativa mitocondrial podem ser medidas simultaneamente em um pequeno número de células (apenas 2-3 × 10⁵ células). Este método pode ser facilmente executado em 1 dia e produz resultados confiáveis e repetíveis. Em última análise, esses métodos ajudam a melhorar nossa compreensão das alterações metabólicas durante as respostas imunes e inflamatórias a lesões e doenças, o que pode levar ao desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para vias imunometabólicas.

O imunometabolismo é um campo florescente que estuda o papel da reprogramação metabólica nas células imunes em diferentes doenças patológicas e estados de lesão. Os macrófagos são uma parte fundamental do sistema imunológico inato que desempenha papéis críticos na inflamação, resposta à infecção, apresentação de antígenos e cicatrização de feridas¹. Compreender como os macrófagos se polarizam entre subconjuntos pró e anti-inflamatórios (semelhantes a M1 e semelhantes a M2) em diferentes estados de doença é uma área de investigação contínua e intensa. Estudos recentes identificaram a reprogramação metabólica como um mecanismo-chave subjacente à polarização dos macrófagos. O paradigma atual é que, em termos gerais, os macrófagos do tipo M1 (que são tipicamente semelhantes a monócitos) dependem mais da glicólise para alimentar as funções pró-inflamatórias, enquanto os macrófagos do tipo M2 dependem mais da fosforilação oxidativa mitocondrial para reprimir as funções pró-inflamatórias e alimentar os processos anti-inflamatórios². Compreender como o metabolismo dos macrófagos é alterado em diferentes estados de doença pode fornecer informações sobre possíveis terapias que podem ser usadas para direcionar as vias metabólicas.

Como exemplo, nosso laboratório investigou extensivamente o papel da reprogramação metabólica de macrófagos durante o infarto do miocárdio (IM)^3,4,5. Os macrófagos desempenham um papel fundamental na resposta inflamatória e de cicatrização de feridas durante o infarto do miocárdio e, como tal, sofrem polarização de fenótipos semelhantes a M1 para M2 à medida que o coração infartado sofre remodelação para formar tecido cicatricial de substituição. Usando os métodos aqui descritos, demonstramos que essa polarização é caracterizada por alterações únicas no metabolismo da glicose e da glutamina e na função mitocondrial. Descrevemos métodos para extração de macrófagos cardíacos, bem como macrófagos esplênicos e monócitos da medula óssea, que podem ser combinados com a análise do fluxo extracelular para avaliar o fluxo metabólico ex vivo em um único dia. Esperamos que os métodos descritos ofereçam uma abordagem padronizada para avaliar os fenótipos metabólicos das células imunes para aumentar a reprodutibilidade entre os laboratórios que estudam este importante tópico.

Os métodos abaixo descrevem protocolos para extração de macrófagos e realização de análise ex vivo do fluxo metabólico do coração infartado após IM, baço e medula óssea (Figura 1). Para o coração e baço do miocárdio, o método de extração usado é idêntico. Todos os protocolos envolvendo camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro Médico da Universidade do Mississippi (Protocolo # 1371, Mouton).

1. Extração de macrófagos do coração e baço infartados

NOTA: A extração de macrófagos teciduais usa uma estratégia de seleção negativa para remover primeiro os neutrófilos, que são marcados com microesferas de Ly6G e, em seguida, uma estratégia de seleção positiva para obter macrófagos com microesferas de CD11b 3,4,5,6. Ao realizar este protocolo, trabalhe rapidamente e mantenha as células frias.

1. Eutanasiar o camundongo de acordo com a AALAC e as diretrizes institucionais por overdose de isoflurano seguida de remoção do coração.
2. Remova o coração e o baço rapidamente e pese os tecidos.
3. Antes do ensaio, prepare o tampão PEB dissolvendo EDTA (2 mM) e albumina sérica bovina a 0,5% (p / v) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Mantenha frio.
4. Coloque o coração na solução salina balanceada de Hank (HBSS) fria. Pique com um bisturi estéril em pedaços pequenos.
5. Preparar uma solução de digestão contendo 600 U/ml de colagenase tipo II e 60 U/ml de DNase tipo I. Misturar o tecido em 10 ml da solução de digestão num tubo de dissociação celular MACS.
   NOTA: Faça o suficiente da solução de digestão para usar 10 mL para cada tecido (temperatura ambiente).
6. Incubar os tecidos usando o dissociador celular de acordo com o protocolo do fabricante. Isso incubará o tecido picado a 37 ° C com rotação suave por ~ 1 h para gerar uma suspensão celular.
7. Mover a suspensão para tubos cónicos de 15 ml e centrifugar a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
8. Ressuspenda o pellet em 1 mL de tampão PEB. Para gerar uma suspensão unicelular, aplique a suspensão sobre um filtro de 30 μm.
9. Para lisar os glóbulos vermelhos, adicione 10 mL de 1x solução de lise de glóbulos vermelhos. Incubar durante 5-10 min no escuro a 4 °C.
10. Centrifugar a suspensão durante 300 × g durante 10 min a 4 °C.
11. Ressuspenda o pellet em 1 mL de PEB e conte as células usando um hemacitómetro.
12. Centrifugar a suspensão a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
13. Para remover neutrófilos, prepare microesferas misturando 90 μL de tampão PEB com 10 μL de microesferas anti-Ly6G por 10⁷ células. Misturar o sedimento celular com a suspensão de microesferas e incubar durante 10 minutos no escuro a 4 °C.
14. Para lavar as microesferas não ligadas, adicione 10 ml de tampão PEB e centrifugue a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
15. Prepare colunas magnéticas (MS ou LS) em um suporte magnético. Molhe as colunas adicionando 0,5-1,0 mL de tampão PEB.
    NOTA: Para tecidos com abundância de células imunes (ou seja, baço), a coluna magnética pode facilmente ficar entupida e parar de fluir. Assim, recomendamos o uso de colunas LS para baço.
16. Ressuspenda o pellet celular em 500 μL de tampão PEB. Adicione a suspensão celular à coluna magnética e deixe as células não marcadas (ou seja, não neutrófilos) passarem. Lave a coluna 2x com 500 μL de tampão PEB. Colete as células não marcadas (ou seja, macrófagos e outras células) em um tubo cônico de 15 mL.
17. Centrifugar a suspensão a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
18. Prepare as microesferas misturando 90 μL de tampão PEB com 10 μL de microesferas anti-CD11b por 10⁷ células. Misturar o sedimento celular com a suspensão de microesferas e incubar durante 15 min no escuro a 4 °C.
19. Repita as etapas 1.13-1.15.
20. Os macrófagos marcados serão ligados à coluna magnética. Para coletá-los, retire a coluna magnética do suporte magnético e coloque-a sobre um novo tubo cônico de 15 mL.
21. Adicione 1 mL de meio RPMI suplementado com 0,1% de soro fetal bovino (FBS) à coluna. Use o êmbolo para extrair os macrófagos para o tubo. Contar os macrófagos utilizando um hemacitómetro.
    NOTA: Os macrófagos estão agora no tubo e prontos para uso em ensaios adicionais.

2. Extração de monócitos da medula óssea

NOTA: A extração de monócitos da medula óssea usa uma estratégia de seleção negativa na qual os não monócitos, incluindo linfócitos, células assassinas naturais, células dendríticas, células eritróides e granulócitos (ou seja, neutrófilos), são imunomagneticamente marcados e removidos.

1. Eutanasiar o camundongo de acordo com a AALAC e as diretrizes institucionais por overdose de isoflurano seguida de remoção do coração.
2. Remova as pernas do mouse. No HBSS frio, disseque o músculo da tíbia e do fêmur até que os ossos estejam limpos.
3. Corte cuidadosamente as duas extremidades do osso. Usando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 27 G, lave a medula óssea em um tubo cônico de 15 mL com tampão PEB. Centrifugar a suspensão a 300 × g durante 10 min a 4 °C.
4. Execute as etapas 1.8 a 1.12.
5. Adicione 175 μL de tampão PEB, 25 μL de reagente bloqueador FcR e 50 μL de coquetel de biotina-anticorpo de monócitos por 5 × 10⁷ do total de células. Incubar durante 5 min no escuro a 4 °C.
6. Lave adicionando 10 mL de tampão PEB e centrifugue a 300 × g por 10 min a 4 °C.
7. Colete o pellet e ressuspenda as células em 500 μL de tampão PEB e 100 μL de microesferas anti-biotina. Incubar durante 10 min no escuro a 4 °C.
8. Prepare colunas magnéticas (LS) em um suporte magnético. Molhe as colunas adicionando 1,0 mL de tampão PEB.
9. Aplique imediatamente a suspensão da célula à coluna. Use um tubo de 15 mL para coletar o fluxo, que contém os monócitos. Os não-monócitos estão ligados à coluna magnética.
10. Lave a coluna 2x com 1 mL de tampão PEB. Conte os monócitos usando um hemacitômetro.
11. Para preparar os monócitos para a próxima etapa, centrifugue a 300 × g por 10 min a 4 °C. Para análise de fluxo, ressuspenda o pellet celular em 1 mL de RPMI + 0,1% FBS. Para citometria de fluxo, mantenha as células em PEB frio e prossiga com a coloração.

3. Preparação de células para análise do fluxo metabólico

1. Hidrate o cartucho do sensor (um dia antes do ensaio)
   1. Remova o cartucho do sensor da embalagem. Remova a placa do sensor (verde) dos poços e pipete 200 μL de fluido calibrante em cada poço. Coloque a placa do sensor de volta na parte superior da placa do cartucho para que os sensores fiquem submersos no fluido calibrante.
   2. Coloque o cartucho em uma incubadora umidificada sem CO₂ (37 °C) durante a noite.
2. Revestimento das células
   1. Plaquear as células em uma placa de cultura de 96 poços em 200 μL de meio por pelo menos 1 h. Deixe pelo menos um poço em branco para medições de fundo (use o mesmo volume de mídia para poços em branco).
      NOTA: O número ideal de células deve ser determinado antes da experimentação. Consulte "Dicas de solução de problemas" na discussão para obter mais detalhes.
   2. Quando estiver pronto para realizar o ensaio, prepare o meio de fluxo metabólico (ou seja, RPMI basal ou DMEM sem glicose, glutamina, piruvato, etc.). Para o teste de estresse de glicólise, certifique-se de que o meio basal seja suplementado com 2 mM de glutamina. Para o teste de estresse mitocondrial, certifique-se de que o meio basal seja suplementado com 2 mM de glutamina, 10 mM de glicose e 1 mM de piruvato.
   3. Substitua cuidadosamente a mídia antiga pela nova mídia basal pipetando lentamente (tome cuidado para não desalojar nenhuma célula). Verifique as células ao microscópio para ter certeza de que ainda estão presentes.
   4. Coloque a placa celular em uma incubadora umidificada sem CO₂ (37 °C).
3. Carregando a placa de fluxo
   1. Recupere o cartucho do sensor hidratado/placa de fluxo da incubadora.
   2. Preparar os compostos de ensaio para o ensaio de glicólise ou de stress mitocondrial.
      1. Glicólise: Usando meio basal de glicólise, crie soluções estoque dissolvendo glicose em 3 mL, oligomicina em 270 μL (100 μM) e 2-desoxiglicose em 3 mL. Crie uma solução de oligomicina funcional de 10 μM.
      2. Mitocondrial: Usando meio basal mitocondrial, crie soluções estoque dissolvendo oligomicina em 630 μL (100 μM), cianeto de carbonila-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) em 720 μL (100 μM) e rotenona/antimicina A em 540 μL (50 μM). Crie soluções de trabalho de oligomicina (0,5-2,5 μM), FCCP (0,125-2,0 μM) e rotenona/antimicina A (0,5 μM).
         NOTA: Descobrimos que 1,5 μM de oligomicina e 2,0 μM de FCCP produzem os melhores resultados.
   3. Carregue os compostos de teste nas portas usando os seguintes volumes: porta A-20 μL, porta B-22 μL, porta C-25 μL, porta D-27 μL. Opcional: Carregue o medicamento ou composto de escolha na porta A e teste os compostos nas portas B, C e D para avaliar os efeitos agudos na glicólise ou na respiração mitocondrial. Se não estiver usando medicamento ou composto adicional, deixe a porta D vazia.
4. Executando o ensaio
   1. Abra o software e selecione Teste de estresse mitocondrial.
      NOTA: Este programa também pode ser usado para teste de estresse de glicólise, pois a taxa de acidificação extracelular (ECAR) é medida.
   2. Selecione os poços que serão usados. Para subtrair o fundo, certifique-se de que pelo menos 1 poço não tenha células.
   3. Execute o programa. Carregue a placa de fluxo com a tampa removida para que a placa seja calibrada (~20 min).
   4. Depois que a placa for calibrada, o software fornecerá um prompt para carregar a placa da célula. Retire a placa celular da incubadora, remova a parte inferior da placa de fluxo e coloque a placa celular no suporte. Pressione executar. O ensaio levará ~ 2,5 h para ser concluído.
   5. Analise os resultados usando o software de fluxo metabólico⁷ ou outro software analítico de sua escolha.

O número típico de células obtidas dos diferentes tecidos depende do tamanho, idade e sexo do animal. Para um camundongo macho adulto (ou seja, 16 semanas de idade, ~ 30 g), o baço pode produzir 3,0-4,0 × 10⁶ macrófagos, enquanto a medula óssea (duas tíbias e dois fêmures) normalmente produz 1,0-1,5 × 10⁶ monócitos (Figura 2A). O coração infartado normalmente produz números altos também, dependendo do dia após o IM ^4,5,6. No dia 3, o rendimento é tipicamente ~ 1,5 × 10⁶ células / coração. O coração saudável normalmente tem muito poucos macrófagos (0,1-0,2 × 10⁵/coração)⁶; Assim, se estiver usando macrófagos do coração saudável (não infartado) como controle, pode ser necessário agrupar vários corações. A Figura 2B ilustra gráficos representativos de citometria de fluxo de macrófagos ou monócitos extraídos, mostrando populações altamente positivas para CD11b e negativas para Ly6G. Os macrófagos cardíacos e esplênicos mostram heterogeneidade para o marcador de monócitos Ly6C, enquanto os monócitos da medula óssea são altamente positivos para Ly6C. Gráficos de citometria de fluxo representativos para neutrófilos classificados (coração e baço) e células não classificadas do coração, baço e medula óssea infartados (ou seja, tecido total) são exibidos na Figura Suplementar S1, Figura Suplementar S2 e Figura Suplementar S3.

Os resultados da análise do fluxo extracelular são representados como alterações no ECAR (mPh/min) e na taxa de consumo de oxigênio (OCR, pmol O₂/min). Os resultados são normalmente apresentados em um gráfico de linhas com ECAR ou OCR no eixo y e tempo no eixo x (Figura 3). Medições específicas são exibidas como gráficos de barras.

A partir dos dados brutos, pode-se calcular vários parâmetros metabólicos. Pode-se também calcular a relação OCR/ECAR de cada poço para dar uma ideia da dependência da glicólise versus respiração mitocondrial, que pode mudar em diferentes condições⁴. Por exemplo, jejuamos camundongos (macho adulto C57BL / 6J) durante a noite para avaliar as mudanças no metabolismo dos macrófagos. Um fenótipo em jejum foi confirmado pela diminuição dos níveis de glicose no sangue e aumento das cetonas no sangue (Figura Suplementar S4), que diminuiu os leucócitos e neutrófilos circulantes (Hemavet 950FS Auto Blood Analyzer; Figura Suplementar S5). Isolamos monócitos da medula óssea e macrófagos esplênicos de camundongos alimentados versus em jejum e avaliamos as alterações metabólicas por análise de fluxo extracelular (Figura 4). Nos monócitos da medula óssea, o jejum diminuiu a glicólise e aumentou a relação OCR/ECAR tanto no teste de estresse mitocondrial quanto no teste de estresse de glicólise (Figura 4A). Nos macrófagos do baço, o jejum não afetou significativamente a glicólise, mas aumentou a capacidade de reposição e a respiração ligada ao ATP (Figura 4B). A Figura 4C mostra um exemplo de fluxo metabólico em macrófagos isolados do coração infartado 3 dias após a cirurgia.

Figura 1: Esquema representativo da análise do fluxo metabólico em macrófagos/monócitos extraídos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados representativos de macrófagos cardíacos e esplênicos e monócitos da medula óssea isolados de camundongos. (A) Imagens representativas de macrófagos cardíacos e esplênicos isolados e monócitos da medula óssea (4x); número médio de células por camundongo. Barra de escala = 1 mm. (B) Gráficos de citometria de fluxo representativos de macrófagos cardíacos (infarto do miocárdio dia 3) e baço e monócitos da medula óssea. O CD45 foi usado como marcador panleucocitário e o CD11b foi usado como marcador de células mieloides. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultados representativos dos testes. (A) Glicólise e (B) testes de estresse mitocondrial. N = 3 medidas independentes (macrófagos esplênicos). Média ± MEV. Abreviaturas: ECAR = taxa de acidificação extracelular; OCR = taxa de consumo de oxigênio; FCCP = cianeto de carbonila-p-trifluorometoxifenilhidrazona. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Impacto do jejum noturno no metabolismo celular. (A) Metabolismo dos monócitos da medula óssea e (B) dos macrófagos do baço. (C) Gráficos representativos de fluxo extracelular de macrófagos cardíacos 3 dias após o infarto do miocárdio. N = 3-4 cada grupo. Abreviatura: FCCP = cianeto de carbonila-p-trifluorometoxifenilhidrazona. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar 1: Gráficos representativos de citometria de fluxo e níveis de glicose no sangue e cetona de camundongos alimentados e em jejum. Clique aqui para baixar este arquivo.

Nosso método detalha a extração rápida de macrófagos da medula óssea, baço e coração infartado, que podem ser usados para realizar análises a jusante, como análise de fluxo metabólico extracelular. A combinação desses dois métodos é uma ferramenta poderosa que pode quantificar alterações metabólicas em macrófagos sob diferentes estados de doença ou lesão, ou estados metabólicos, como exercícios. Enquanto nosso método se concentra na medula óssea e nos macrófagos esplênicos, outros reservatórios de macrófagos podem ser usados, como o compartimento peritoneal⁸. Embora não sejamos os primeiros a usar esse método, esperamos que este artigo aumente a exposição e melhore a padronização entre os laboratórios.

Embora os dados obtidos com esses métodos forneçam informações valiosas sobre o estado metabólico de diferentes compartimentos de macrófagos, é altamente recomendável usar outros métodos para complementar os dados de fluxo metabólico para obter uma imagem mais completa do metabolismo. Por exemplo, combinar os dados de fluxo metabólico com metabolômica (ou seja, quantificação de metabólitos intracelulares) e expressão gênica / proteína e / ou atividade de enzimas metabólicas é frequentemente usada para criar uma avaliação completa dos estados metabólicos em macrófagos ^5,9. Em muitos casos, células do mesmo animal podem ser usadas para diferentes ensaios.

Em nossa experiência, a otimização do protocolo pode envolver a solução de problemas em várias etapas diferentes. Uma das coisas mais importantes é trabalhar rapidamente e manter as células frias, o que aumentará o rendimento e a viabilidade celular. Determinar o número ideal de células para o fluxo extracelular é outro ponto-chave, pois poucas células não darão um sinal detectável, enquanto muitas células esgotarão os nutrientes no meio e, portanto, não exibirão uma resposta aos compostos injetados. Para macrófagos, descobrimos que 2,0 × 10⁵ células do coração IM e 3,0 × 10⁵ em uma placa de 96 poços fornecem os resultados mais confiáveis e reprodutíveis. No entanto, isso pode variar entre os laboratórios. Deve-se tomar cuidado extra para garantir que números de células iguais entre amostras e grupos sejam usados. Diferentes números de células têm respostas diferentes aos medicamentos usados no ensaio e podem introduzir variabilidade indesejada.

As concentrações ideais de drogas injetáveis incluídas no ensaio (oligomicina, FCCP) também devem ser otimizadas antes da realização de experimentos. Por exemplo, descobrimos que 1,5 μM de oligomicina e 2,0 μM de FCCP produzem as respostas mais robustas. Outro erro comum é não permitir que as células tenham tempo suficiente após a extração para aderir à placa de cultura, o que resulta na perda de células ao mudar para o meio de fluxo extracelular. Sugerimos pelo menos 1 h e até 2 h para permitir que as células adiram.

A pipetagem de forma muito agressiva também pode resultar em perda de células; Recomenda-se pipetar com muito cuidado e verificar as células com frequência ao microscópio. Um último ponto é trabalhar rapidamente ao preparar a placa de fluxo, principalmente ao realizar o teste de estresse de glicólise. Como essas células estão carentes de glicose antes do ensaio, tempos de incubação mais longos (mais de 1 h no meio basal) podem alterar a resposta inicial à glicose. Sugerimos preparar imediatamente a placa de fluxo após substituir o meio normal pelo meio basal (~30 min) e, em seguida, calibrar a placa (o que leva ~20 min). A variabilidade interensaio deve ser sempre considerada. Ao fazer comparações diretas entre grupos, deve-se sempre fazer um esforço para realizar todos os grupos dentro da mesma placa ou experimento.

Embora tenhamos descrito dois ensaios padrão que são frequentemente usados (estresse de glicólise e testes de estresse mitocondrial), deve-se notar que existem vários outros ensaios padronizados que podem ser usados para avaliar outras vias metabólicas, como o teste flex de combustível mitocondrial¹⁰, oxidação de ácidos graxos/palmitato¹¹ e ensaio de taxa de ATP¹². Novos estudos demonstraram a eficácia do desacoplador BAM15, que é fornecido no Kit de Perfil Metabólico de Células T. O BAM15 parece ser um desacoplador mais confiável do que o FCCP com menos efeitos citotóxicos¹³. Estudos futuros devem explorar o potencial desse desacoplador na avaliação metabólica de macrófagos.

Existem algumas limitações para este método. A primeira é que, devido ao número de etapas, pode ser difícil para uma pessoa executar em tempo hábil. Em particular, ao usar um número maior de amostras (até 8), recomenda-se ter duas pessoas trabalhando juntas para melhorar a qualidade dos resultados. Descobrimos que é difícil processar mais de oito amostras em um dia, mesmo com duas pessoas. Outra limitação é que, como o ensaio é realizado ex vivo, há sempre a possibilidade de o procedimento de extração causar alterações no fenótipo celular⁶. Embora não haja uma maneira óbvia de eliminar essa limitação, técnicas de imagem in vivo , como ressonância magnética hiperpolarizada, têm sido usadas para visualizar a produção de lactato de macrófagos após o MI¹⁴ e, esperançosamente, continuarão a evoluir como um complemento ou substituto para o método ex vivo que descrevemos. Uma limitação do método de fluxo extracelular é que, embora possa capturar mudanças entre glicólise e OXPHOS, ele não reflete totalmente as mudanças na taxa de produção de ATP dentro dessas vias¹⁵. Além disso, as mudanças na acidificação do meio (ECAR) nem sempre refletem a produção de ácido lático pela glicólise, mas também podem ser influenciadas pela geração de CO₂ pelo ciclo do TCA, que é convertido em bicarbonato¹⁵. Assim, pode ser vantajoso para os usuários calcular a taxa de produção de ATP da glicólise e do OXPHOS, que pode avaliar as contribuições dessas vias para a produção geral de ATP.

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Gostaríamos de agradecer o financiamento que apoiou este trabalho: NIH / NHBLI 166737, NIH R00 HL146888, NIH U54HL169191, NIH / NIGMS P20GM104357 e NIH / NIGMS P30GM149404 para este trabalho.