Hier beschreiben wir detailliert Methoden zur Extraktion von Makrophagen aus dem Knochenmark, der Milz und dem infarktierten Herzen und zur anschließenden Bestimmung des metabolischen Flusses in lebenden Zellen.

Die metabolische Reprogrammierung ist ein Kennzeichen der Aktivierung von Monozyten/Makrophagen und der Polarisierung zwischen pro- und antiinflammatorischen Zuständen. Zum Beispiel zeigen proinflammatorische (d.h. M1-ähnliche) Monozyten/Makrophagen eine stärkere Abhängigkeit von anaerober Glykolyse und eine geringere Abhängigkeit von der mitochondrialen oxidativen Phosphorylierung, während entzündungshemmende (M2-ähnliche) Makrophagen eine größere Abhängigkeit von Glukose- und Fettsäureoxidation in den Mitochondrien aufweisen. Im Folgenden beschreiben wir ausführliche Protokolle für die Extraktion von Makrophagen aus den beiden wichtigsten Monozyten-/Makrophagen-Reservoirs im Körper, der Milz und dem Knochenmark, sowie aus verletzten Geweben wie dem Herzen nach einem Myokardinfarkt.

Makrophagen oder Monozyten werden durch immunomagnetische Sortierung unter Verwendung von Antikörper-markierten Mikrokügelchen extrahiert, die leicht an Zellen binden, ohne deren Phänotypen zu beeinträchtigen. Die extrahierten Zellen werden dann in 96-Well-Platten kultiviert, gefolgt von einer extrazellulären Flussanalyse mit einem metabolischen Flussanalysator. Sowohl die Glykolyse als auch die mitochondriale oxidative Phosphorylierung können gleichzeitig in einer kleinen Anzahl von Zellen gemessen werden (nur 2-3 × 10⁵ Zellen). Diese Methode kann problemlos an 1 Tag durchgeführt werden und liefert zuverlässige und wiederholbare Ergebnisse. Letztendlich tragen diese Methoden dazu bei, unser Verständnis von metabolischen Veränderungen während Immun- und Entzündungsreaktionen auf Verletzungen und Krankheiten zu verbessern, was zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Ziele für immunmetabolische Signalwege führen könnte.

Der Immunstoffwechsel ist ein blühendes Gebiet, das die Rolle der metabolischen Reprogrammierung in Immunzellen bei verschiedenen pathologischen Krankheits- und Verletzungszuständen untersucht. Makrophagen sind ein wichtiger Bestandteil des angeborenen Immunsystems, das eine entscheidende Rolle bei Entzündungen, der Reaktion auf Infektionen, der Antigenpräsentation und der Wundheilung spielt¹. Das Verständnis, wie Makrophagen zwischen pro- und antiinflammatorischen (M1-ähnlichen und M2-ähnlichen) Untergruppen über verschiedene Krankheitszustände hinweg polarisieren, ist ein Bereich fortlaufender und intensiver Untersuchungen. Neuere Studien haben die metabolische Reprogrammierung als einen Schlüsselmechanismus identifiziert, der der Polarisierung von Makrophagen zugrunde liegt. Das derzeitige Paradigma ist, dass M1-ähnliche Makrophagen (die typischerweise monozytenähnlich sind) im Großen und Ganzen mehr auf Glykolyse angewiesen sind, um entzündungsfördernde Funktionen zu fördern, während M2-ähnliche Makrophagen mehr auf mitochondriale oxidative Phosphorylierung angewiesen sind, um entzündungsfördernde Funktionen zu unterdrücken und entzündungshemmende Prozesse zu fördern². Das Verständnis, wie der Makrophagenstoffwechsel in verschiedenen Krankheitszuständen verändert ist, kann Aufschluss über potenzielle Therapien geben, die zur gezielten Ausrichtung von Stoffwechselwegen eingesetzt werden könnten.

Als Beispiel hat unser Labor die Rolle der metabolischen Reprogrammierung von Makrophagen während eines Myokardinfarkts (MI) ausführlich ^{untersucht3,4,5}. Makrophagen spielen eine Schlüsselrolle bei der Entzündungs- und Wundheilungsreaktion während des Myokardinfarkts und durchlaufen als solche eine Polarisierung von M1-ähnlichen zu M2-ähnlichen Phänotypen, wenn das infarzierte Herz umgebaut wird, um Ersatznarbengewebe zu bilden. Unter Verwendung der hier beschriebenen Methoden haben wir gezeigt, dass diese Polarisation durch einzigartige Veränderungen im Glukose- und Glutaminstoffwechsel und in der mitochondrialen Funktion gekennzeichnet ist. Wir beschreiben Methoden zur Extraktion von kardialen Makrophagen sowie Milzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten, die mit der extrazellulären Flussanalyse kombiniert werden können, um den ex vivo metabolischen Fluss an einem einzigen Tag zu bestimmen. Wir hoffen, dass die beschriebenen Methoden einen standardisierten Ansatz zur Bewertung von metabolischen Phänotypen von Immunzellen bieten, um die Reproduzierbarkeit in Laboren, die dieses wichtige Thema untersuchen, zu verbessern.

Die folgenden Methoden beschreiben Protokolle für die Extraktion von Makrophagen und die Durchführung einer Ex-vivo-Analyse des metabolischen Flusses aus dem infarktierten Herzen nach MI, der Milz und dem Knochenmark (Abbildung 1). Für den Myokardinfarkt Herz und Milz ist die verwendete Extraktionsmethode identisch. Alle Protokolle, an denen Mäuse beteiligt waren, wurden vom University of Mississippi Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt (Protokoll #1371, Mouton).

1. Extraktion von Makrophagen aus dem infarktierten Herzen und der Milz

HINWEIS: Bei der Extraktion von Gewebemakrophagen wird eine negative Selektionsstrategie verwendet, um zunächst Neutrophile zu entfernen, die mit Ly6G-Mikrokügelchen markiert sind, und dann eine positive Selektionsstrategie, um Makrophagen mit CD11b-Mikrokügelchen 3,4,5,6 zu erhalten. Wenn Sie dieses Protokoll durchführen, arbeiten Sie schnell und halten Sie die Zellen kalt.

1. Euthanasieren Sie die Maus in Übereinstimmung mit AALAC und den institutionellen Richtlinien durch Isofluran-Überdosierung, gefolgt von der Entfernung des Herzens.
2. Entnehmen Sie schnell das Herz und die Milz und wiegen Sie das Taschentuch.
3. Vor dem Assay ist der PEB-Puffer durch Auflösen von EDTA (2 mM) und 0,5 % Rinderserumalbumin (w/v) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) herzustellen. Kalt halten.
4. Legen Sie das Herz in kalte Hank's ausgewogene Salzlösung (HBSS). Mit einem sterilen Skalpell in kleine Stücke hacken.
5. Bereiten Sie eine Aufschlusslösung vor, die 600 U/ml Kollagenase Typ II und 60 U/ml DNase Typ I enthält. Mischen Sie das Gewebe in 10 ml der Aufschlusslösung in einem MACS-Zelldissoziationsröhrchen.
   HINWEIS: Machen Sie genug von der Verdauungslösung, um 10 ml für jedes Gewebe (Raumtemperatur) zu verwenden.
6. Inkubieren Sie das Gewebe mit dem Zelldissoziator gemäß dem Protokoll des Herstellers. Dadurch wird das zerkleinerte Gewebe bei 37 °C unter sanftem Schleudern für ~1 h inkubiert, um eine Zellsuspension zu erzeugen.
7. Die Suspension in konische 15-ml-Röhrchen geben und 10 Minuten lang bei 4 °C bei 300 × g zentrifugieren.
8. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 mL PEB-Puffer. Um eine einzellige Suspension zu erzeugen, tragen Sie die Suspension auf einen 30-μm-Filter auf.
9. Um rote Blutkörperchen zu lysieren, fügen Sie 10 ml 1x Lyselösung für rote Blutkörperchen hinzu. 5-10 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
10. Die Suspension wird 10 min lang 300 × g bei 4 °C zentrifugiert.
11. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml PEB und zählen Sie die Zellen mit einem Hämazytometer.
12. Die Suspension wird bei 300 × g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
13. Um Neutrophile zu entfernen, bereiten Sie Mikrokügelchen vor, indem Sie 90 μl PEB-Puffer mit 10 μl Anti-Ly6G-Mikrokügelchen pro 10⁷ Zellen mischen. Mischen Sie das Zellpellet mit der Mikrokügelchensuspension und inkubieren Sie es 10 min im Dunkeln bei 4 °C.
14. Um ungebundene Mikrokügelchen auszuwaschen, fügen Sie 10 mL PEB-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie sie bei 300 × g für 10 min bei 4 °C.
15. Bereiten Sie magnetische Säulen (MS oder LS) auf einem Magnetständer vor. Befeuchten Sie die Säulen mit 0,5-1,0 mL PEB-Puffer.
    HINWEIS: Bei Geweben mit einer Fülle von Immunzellen (z. B. Milz) kann die magnetische Säule leicht verstopfen und nicht mehr fließen. Daher empfehlen wir die Verwendung von LS-Säulen für die Milz.
16. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 μl PEB-Puffer. Geben Sie die Zellsuspension in die magnetische Säule und lassen Sie die unmarkierten Zellen (d.h. Nicht-Neutrophile) durchlaufen. Waschen Sie die Säule 2x mit 500 μL PEB-Puffer. Sammeln Sie die unmarkierten Zellen (d. h. Makrophagen und andere Zellen) in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
17. Die Suspension wird bei 300 × g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
18. Bereiten Sie Mikrokügelchen vor, indem Sie 90 μl PEB-Puffer mit 10 μl Anti-CD11b-Mikrokügelchen pro 10⁷ Zellen mischen. Mischen Sie das Zellpellet mit der Mikrokügelchensuspension und inkubieren Sie es 15 min im Dunkeln bei 4 °C.
19. Wiederholen Sie die Schritte 1.13-1.15.
20. Die markierten Makrophagen werden an die magnetische Säule gebunden. Um sie zu sammeln, nehmen Sie die Magnetsäule vom Magnetständer ab und legen Sie sie auf ein neues konisches 15-ml-Röhrchen.
21. Geben Sie 1 ml RPMI-Medium, ergänzt mit 0,1 % fötalem Rinderserum (FBS), in die Säule. Verwenden Sie den Kolben, um die Makrophagen in das Röhrchen zu extrahieren. Zählen Sie die Makrophagen mit einem Hämazytometer.
    HINWEIS: Die Makrophagen befinden sich nun im Röhrchen und können für weitere Assays verwendet werden.

2. Extraktion von Monozyten aus dem Knochenmark

HINWEIS: Bei der Extraktion von Monozyten aus dem Knochenmark wird eine negative Selektionsstrategie verwendet, bei der Nicht-Monozyten, einschließlich Lymphozyten, natürliche Killerzellen, dendritische Zellen, erythroide Zellen und Granulozyten (d. h. Neutrophile), immunomagnetisch markiert und entfernt werden.

1. Euthanasieren Sie die Maus in Übereinstimmung mit AALAC und den institutionellen Richtlinien durch Isofluran-Überdosierung, gefolgt von der Entfernung des Herzens.
2. Entfernen Sie die Beine von der Maus. Bei kaltem HBSS präparieren Sie den Muskel von der Tibia und dem Oberschenkelknochen weg, bis die Knochen sauber sind.
3. Schneide vorsichtig beide Enden des Knochens ab. Spülen Sie das Knochenmark mit einer 10-ml-Spritze und einer 27-g-Nadel in ein konisches 15-ml-Röhrchen mit PEB-Puffer aus. Die Suspension wird bei 300 × g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
4. Führen Sie die Schritte 1.8-1.12 aus.
5. 175 μl PEB-Puffer, 25 μl FcR-Blockierungsreagenz und 50 μl Monozyten-Biotin-Antikörper-Cocktail pro 5 × 10⁷ Zellen insgesamt hinzufügen. 5 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
6. Waschen Sie mit 10 ml PEB-Puffer und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 4 °C bei 300 × g .
7. Sammeln Sie das Pellet und suspendieren Sie die Zellen in 500 μl PEB-Puffer und 100 μl Anti-Biotin-Mikrokügelchen. 10 min im Dunkeln bei 4 °C inkubieren.
8. Bereiten Sie magnetische Säulen (LS) auf einem Magnetständer vor. Befeuchten Sie die Säulen mit 1,0 mL PEB-Puffer.
9. Tragen Sie die Zellsuspension sofort auf die Säule auf. Verwenden Sie ein 15-ml-Röhrchen, um den Durchfluss zu sammeln, der die Monozyten enthält. Die Nicht-Monozyten sind an die magnetische Säule gebunden.
10. Waschen Sie die Säule 2x mit 1 mL PEB-Puffer. Zählen Sie die Monozyten mit einem Hämazytometer.
11. Um die Monozyten für den nächsten Schritt vorzubereiten, zentrifugieren Sie bei 300 × g für 10 min bei 4 °C. Für die Flussmittelanalyse resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml RPMI + 0,1 % FBS. Halten Sie die Zellen für die Durchflusszytometrie in kaltem PEB und fahren Sie mit der Färbung fort.

3. Vorbereitung der Zellen für die Analyse des metabolischen Flusses

1. Hydratisieren Sie die Sensorkartusche (am Tag vor dem Assay)
   1. Nehmen Sie die Sensorkassette aus der Verpackung. Entfernen Sie die Sensorplatte (grün) aus den Vertiefungen und pipettieren Sie 200 μl Kalibrierungsflüssigkeit in jede Vertiefung. Setzen Sie die Sensorplatte wieder auf die Oberseite der Patronenplatte, so dass die Sensoren in die Kalibrierflüssigkeit eingetaucht sind.
   2. Stellen Sie die Kartusche über Nacht in einen nicht_{CO 2} -befeuchteten Inkubator (37 °C).
2. Plattieren der Zellen
   1. Plattieren Sie die Zellen in einer 96-Well-Kulturplatte in 200 μl Medium für mindestens 1 h. Lassen Sie mindestens eine Vertiefung für Hintergrundmessungen leer (verwenden Sie das gleiche Medienvolumen für leere Vertiefungen).
      HINWEIS: Die optimale Zellzahl sollte vor dem Experimentieren bestimmt werden. Weitere Informationen finden Sie unter "Tipps zur Fehlerbehebung" in der Diskussion.
   2. Wenn Sie bereit sind, den Assay durchzuführen, bereiten Sie das metabolische Flussmedium vor (d. h. basales RPMI oder DMEM ohne Glukose, Glutamin, Pyruvat usw.). Stellen Sie für den Glykolyse-Stresstest sicher, dass das Basalmedium mit 2 mM Glutamin ergänzt wird. Stellen Sie für den mitochondrialen Stresstest sicher, dass das Basalmedium mit 2 mM Glutamin, 10 mM Glukose und 1 mM Pyruvat ergänzt wird.
   3. Ersetzen Sie das alte Medium vorsichtig durch langsames Pipettieren durch neues Basalmedium (achten Sie darauf, keine Zellen zu entfernen). Überprüfen Sie die Zellen unter einem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie noch vorhanden sind.
   4. Legen Sie die Zellplatte in einen nicht CO₂ -befeuchteten Inkubator (37 °C).
3. Bestückung der Flussmittelplatte
   1. Nehmen Sie die hydratisierte Sensorpatrone/Flussmittelplatte aus dem Inkubator.
   2. Bereiten Sie die Testverbindungen entweder für die Glykolyse oder den mitochondrialen Stresstest vor.
      1. Glykolyse: Stellen Sie unter Verwendung von Glykolyse-Basalmedien Stammlösungen her, indem Sie Glukose in 3 ml, Oligomycin in 270 μl (100 μM) und 2-Desoxyglucose in 3 ml auflösen. Stellen Sie eine funktionierende Oligomycin-Lösung von 10 μM her.
      2. Mitochondrial: Unter Verwendung mitochondrialer Basalmedien stellen Sie Stammlösungen her, indem Sie Oligomycin in 630 μl (100 μM), Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon (FCCP) in 720 μl (100 μM) und Rotenon/Antimycin A in 540 μl (50 μM) auflösen. Erstellen Sie Arbeitslösungen aus Oligomycin (0,5-2,5 μM), FCCP (0,125-2,0 μM) und Rotenon/Antimycin A (0,5 μM).
         HINWEIS: Wir haben festgestellt, dass 1,5 μM Oligomycin und 2,0 μM FCCP die besten Ergebnisse liefern.
   3. Laden Sie Testverbindungen in Ports mit den folgenden Volumina: Port A-20 μL, Port B-22 μL, Port C-25 μL, Port D-27 μL. Optional: Laden Sie das Medikament oder die Verbindung Ihrer Wahl in Port A und testen Sie Verbindungen in Port B, C und D, um akute Auswirkungen auf die Glykolyse oder die mitochondriale Atmung zu beurteilen. Wenn Sie kein zusätzliches Medikament oder Wirkstoff verwenden, lassen Sie Anschluss D leer.
4. Ausführen des Assays
   1. Öffnen Sie die Software und wählen Sie Mitochondrialer Belastungstest.
      HINWEIS: Dieses Programm kann auch für Glykolyse-Stresstests verwendet werden, da die extrazelluläre Ansäuerungsrate (ECAR) gemessen wird.
   2. Wählen Sie die Vertiefungen aus, die verwendet werden sollen. Um den Hintergrund zu subtrahieren, stellen Sie sicher, dass mindestens 1 Vertiefung keine Zellen enthält.
   3. Führen Sie das Programm aus. Laden Sie die Flussmittelplatte mit abgenommenem Deckel, so dass die Platte kalibriert ist (~20 min).
   4. Nachdem die Platte kalibriert wurde, fordert die Software Sie auf, die Zellenplatte zu laden. Nehmen Sie die Zellplatte aus dem Inkubator, entfernen Sie die Unterseite der Flussmittelplatte und setzen Sie die Zellplatte in die Halterung ein. Drücken Sie auf Ausführen. Die Analyse wird ~2,5 Stunden in Anspruch nehmen.
   5. Analysieren Sie die Ergebnisse mit der Stoffwechselfluss-Software⁷ oder einer anderen Analysesoftware Ihrer Wahl.

Typische Zellzahlen, die aus den verschiedenen Geweben gewonnen werden, hängen von der Größe, dem Alter und dem Geschlecht des Tieres ab. Bei einer adulten männlichen Maus (d. h. 16 Wochen alt, ~30 g) kann die Milz 3,0-4,0 × 10⁶ Makrophagen liefern, während das Knochenmark (zwei Tibien und zwei Femure) typischerweise 1,0-1,5 × 10⁶ Monozyten liefert (Abbildung 2A). Das infarzierte Herz liefert in der Regel ebenfalls hohe Zahlen, abhängig vom Tag nach dem MI ^4,5,6. An Tag 3 beträgt die Ausbeute typischerweise ~1,5 × 10⁶ Zellen/Herz. Das gesunde Herz hat in der Regel sehr wenige Makrophagen (0,1-0,2 × 10⁵/Herz)⁶; Wenn also Makrophagen aus dem gesunden (nicht infarktierten) Herzen als Kontrolle verwendet werden, kann das Pooling mehrerer Herzen erforderlich sein. Abbildung 2B zeigt repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme von extrahierten Makrophagen oder Monozyten, die Populationen zeigen, die für CD11b sehr positiv und für Ly6G negativ sind. Kardiale und Milzmakrophagen weisen eine Heterogenität für den Monozytenmarker Ly6C auf, während Knochenmarkmonozyten für Ly6C sehr positiv sind. Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme für sortierte Neutrophile (Herz und Milz) und nicht sortierte Zellen aus dem infarktierten Herzen, der Milz und dem Knochenmark (d. h. ganzes Gewebe) sind in der ergänzenden Abbildung S1, der ergänzenden Abbildung S2 und der ergänzenden Abbildung S3 dargestellt.

Die Ergebnisse der extrazellulären Flussanalyse werden als Änderungen der ECAR (mPh/min) und der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR, pmol O₂/min) dargestellt. Die Ergebnisse werden in der Regel in einem Liniendiagramm mit ECAR oder OCR auf der y-Achse und Zeit auf der x-Achse dargestellt (Abbildung 3). Spezifische Messungen werden als Balkendiagramme angezeigt.

Aus den Rohdaten kann man mehrere Stoffwechselparameter berechnen. Man kann auch das OCR/ECAR-Verhältnis von jedem Well berechnen, um eine Vorstellung davon zu bekommen, wie abhängig von der Glykolyse im Vergleich zur mitochondrialen Atmung die Abhängigkeit von der mitochondrialen Atmung ist, die sich unter verschiedenen Bedingungen ändern kann⁴. Zum Beispiel haben wir Mäuse (adultes Männchen C57BL/6J) über Nacht nüchtern gemacht, um Veränderungen im Makrophagenstoffwechsel zu beurteilen. Ein nüchterner Phänotyp wurde durch verringerte Blutzuckerspiegel und erhöhte Blutketone bestätigt (Ergänzende Abbildung S4), die die zirkulierenden Leukozyten und Neutrophilen verringerten (Hemavet 950FS Auto Blood Analyzer; Ergänzende Abbildung S5). Wir isolierten Knochenmarkmonozyten und Milzmakrophagen von gefütterten und nüchternen Mäusen und bewerteten metabolische Veränderungen durch extrazelluläre Flussanalyse (Abbildung 4). In den Monozyten des Knochenmarks verringerte das Fasten die Glykolyse und erhöhte das OCR/ECAR-Verhältnis sowohl im mitochondrialen Stresstest als auch im Glykolyse-Stresstest (Abbildung 4A). Bei Milzmakrophagen hatte das Fasten keinen signifikanten Einfluss auf die Glykolyse, erhöhte aber die freie Kapazität und die ATP-gebundene Atmung (Abbildung 4B). Abbildung 4C zeigt ein Beispiel für den metabolischen Fluss in Makrophagen, die 3 Tage nach der Operation aus dem infarktierten Herzen isoliert wurden.

Abbildung 1: Repräsentatives Schema der Stoffwechselflussanalyse in extrahierten Makrophagen/Monozyten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse von kardialen und Milzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten, die aus Mäusen isoliert wurden. (A) Repräsentative Bilder von isolierten kardialen und Milzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten (4x); Durchschnittliche Zellenanzahl pro Maus. Maßstabsbalken = 1 mm. (B) Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme von Herz- (Myokardinfarkt Tag 3) und Milzmakrophagen sowie Knochenmarkmonozyten. CD45 wurde als Pan-Leukozyten-Marker und CD11b als myeloischer Zellmarker verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Repräsentative Ergebnisse der Tests. (A) Glykolyse und (B) mitochondriale Stresstests. N = 3 unabhängige Messungen (Milzmakrophagen). Mittlere ± REM. Abkürzungen: ECAR = extrazelluläre Versauerungsrate; OCR = Sauerstoffverbrauchsrate; FCCP = Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Einfluss des Fastens über Nacht auf den Zellstoffwechsel. (A) Knochenmarkmonozyten- und (B) Milzmakrophagenstoffwechsel. (C) Repräsentative extrazelluläre Flussdiagramme von Herzmakrophagen 3 Tage nach dem Myokardinfarkt. N = 3-4 jede Gruppe. Abkürzung: FCCP = Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Datei 1: Repräsentative Durchflusszytometrie-Diagramme und Blutzucker- und Ketonspiegel von gefütterten und nüchternen Mäusen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Unsere Methode beschreibt die schnelle Extraktion von Makrophagen aus Knochenmark, Milz und dem infarktierten Herzen, die dann zur Durchführung nachgelagerter Analysen wie der extrazellulären Stoffwechselflussanalyse verwendet werden können. Die Kombination dieser beiden Methoden ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um metabolische Veränderungen in Makrophagen unter verschiedenen Krankheits- oder Verletzungszuständen oder Stoffwechselzuständen wie Bewegung zu quantifizieren. Während sich unsere Methode auf Knochenmark- und Milzmakrophagen konzentrierte, können auch andere Makrophagen-Reservoire verwendet werden, wie z.B. das Peritonealkompartiment⁸. Obwohl wir nicht die ersten sind, die diese Methode anwenden, hoffen wir, dass dieser Artikel die Bekanntheit erhöht und die Standardisierung in den Labors verbessert.

Während die mit diesen Methoden gewonnenen Daten einen unschätzbaren Einblick in den Stoffwechselzustand verschiedener Makrophagenkompartimente geben, wird dringend empfohlen, andere Methoden zu verwenden, um die Daten des metabolischen Flusses zu ergänzen und ein vollständigeres Bild des Stoffwechsels zu erhalten. Zum Beispiel wird die Kombination der metabolischen Flussdaten mit der Metabolomik (d. h. der Quantifizierung intrazellulärer Metaboliten) und der Gen-/Proteinexpression und/oder -aktivität von Stoffwechselenzymen häufig verwendet, um eine abgerundete Bewertung der Stoffwechselzustände in Makrophagen zu erstellen ^5,9. In vielen Fällen können Zellen desselben Tieres für verschiedene Assays verwendet werden.

Unserer Erfahrung nach kann die Optimierung des Protokolls eine Fehlerbehebung in mehreren verschiedenen Schritten beinhalten. Eines der wichtigsten Dinge ist, schnell zu arbeiten und die Zellen kalt zu halten, was die Zellausbeute und Lebensfähigkeit erhöht. Die Bestimmung der optimalen Zellzahl für den extrazellulären Fluss ist ein weiterer wichtiger Punkt, da zu wenige Zellen kein nachweisbares Signal geben, während zu viele Zellen die Nährstoffe im Medium erschöpfen und daher keine Reaktion auf die injizierten Verbindungen zeigen. Für Makrophagen haben wir festgestellt, dass 2,0 × 10⁵ Zellen aus dem MI-Herzen und 3,0 × 10⁵ in einer 96-Well-Platte die zuverlässigsten und reproduzierbarsten Ergebnisse liefern. Dies kann jedoch von Labor zu Labor unterschiedlich sein. Es sollte besonders darauf geachtet werden, dass die gleiche Zellzahl für Proben und Gruppen verwendet wird. Unterschiedliche Zellzahlen reagieren unterschiedlich auf die im Assay verwendeten Medikamente und können zu unerwünschter Variabilität führen.

Die optimalen Konzentrationen der im Assay enthaltenen injizierten Arzneimittel (Oligomycin, FCCP) sollten ebenfalls vor der Durchführung von Experimenten optimiert werden. Zum Beispiel haben wir herausgefunden, dass 1,5 μM Oligomycin und 2,0 μM FCCP die robustesten Reaktionen hervorrufen. Ein weiterer häufiger Fehler besteht darin, den Zellen nach der Extraktion nicht genügend Zeit zu geben, um an der Kulturschale zu haften, was zum Verlust von Zellen beim Wechsel zu den extrazellulären Flussmedien führt. Wir empfehlen mindestens 1 h und bis zu 2 h, damit die Zellen anhaften können.

Zu aggressives Pipettieren kann auch zum Verlust von Zellen führen. Es wird empfohlen, sehr vorsichtig zu pipettieren und die Zellen häufig unter dem Mikroskop zu überprüfen. Ein letzter Punkt ist ein schnelles Arbeiten bei der Vorbereitung der Flussmittelplatte, insbesondere bei der Durchführung des Glykolyse-Stresstests. Da diese Zellen vor dem Assay nicht mehr mit Glukose versorgt werden, können längere Inkubationszeiten (länger als 1 h im Basalmedium) die anfängliche Reaktion auf Glukose verändern. Wir empfehlen, die Flussmittelplatte sofort vorzubereiten, nachdem Sie das normale Medium durch das Basalmedium ersetzt haben (~30 min) und dann die Platte kalibriert haben (was ~20 min dauert). Die Interassay-Variabilität sollte immer berücksichtigt werden. Bei direkten Vergleichen zwischen Gruppen sollte immer darauf geachtet werden, dass alle Gruppen innerhalb derselben Platte oder desselben Experiments durchgeführt werden.

Während wir zwei Standard-Assays beschrieben haben, die häufig verwendet werden (Glykolyse-Stress- und mitochondriale Stresstests), sollte beachtet werden, dass es mehrere andere standardisierte Assays gibt, die zur Beurteilung anderer Stoffwechselwege verwendet werden können, wie z. B. der mitochondriale Fuel-Flex-Test¹⁰, die Fettsäure-/Palmitat-Oxidation¹¹ und der ATP-Rate-Assay¹². Neue Studien haben die Wirksamkeit des BAM15-Entkopplers gezeigt, der im T cell Metabolic Profiling Kit enthalten ist. BAM15 scheint ein zuverlässigerer Entkoppler als FCCP mit weniger zytotoxischen Effekten zu sein¹³. Zukünftige Studien sollten das Potenzial dieses Entkopplers bei der metabolischen Bewertung von Makrophagen untersuchen.

Es gibt einige Einschränkungen bei dieser Methode. Der erste ist, dass es aufgrund der Anzahl der Schritte für eine Person schwierig sein kann, rechtzeitig zu arbeiten. Insbesondere bei der Verwendung einer höheren Anzahl von Proben (bis zu 8) wird empfohlen, zwei Personen zusammenarbeiten zu lassen, um die Qualität der Ergebnisse zu verbessern. Wir haben festgestellt, dass es schwierig ist, mehr als acht Proben an einem Tag zu verarbeiten, selbst mit zwei Personen. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass bei der Durchführung des Assays ex vivo immer die Möglichkeit besteht, dass das Extraktionsverfahren Veränderungen im zellulären Phänotyp⁶ verursacht. Obwohl es keinen offensichtlichen Weg gibt, diese Einschränkung zu beseitigen, wurden In-vivo-Bildgebungsverfahren wie die hyperpolarisierte Magnetresonanztomographie verwendet, um die Makrophagen-Laktatproduktion nach MI¹⁴ sichtbar zu machen, und werden sich hoffentlich als Ergänzung oder Ersatz für die von uns beschriebene Ex-vivo-Methode weiterentwickeln. Eine Einschränkung der extrazellulären Flussmethode besteht darin, dass sie zwar Verschiebungen zwischen Glykolyse und OXPHOS erfassen kann, aber Änderungen der ATP-Produktionsrate innerhalb dieser Signalwege nicht vollständig widerspiegelt¹⁵. Darüber hinaus spiegeln Änderungen der Ansäuerung des Mediums (ECAR) nicht immer die Milchsäureproduktion durch Glykolyse wider, sondern können auch durch die CO₂ -Bildung durch den TCA-Zyklus beeinflusst werden, der in Bicarbonat¹⁵ umgewandelt wird. Daher kann es für die Anwender von Vorteil sein, die ATP-Produktionsrate aus Glykolyse und OXPHOS zu berechnen, um die Beiträge dieser Wege zur Gesamt-ATP-Produktion bewerten zu können.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte anzugeben.

Wir möchten uns für die Finanzierung bedanken, die diese Arbeit unterstützt hat: NIH/NHBLI 166737, NIH R00 HL146888, NIH U54HL169191, NIH/NIGMS P20GM104357 und NIH/NIGMS P30GM149404 für diese Arbeit.