Анализ метаболического потока ex vivo в селезеночных и сердечных макрофагах и моноцитах костного мозга

Здесь мы подробно описываем методы извлечения макрофагов из костного мозга, селезенки и инфарктного сердца, а также последующей оценки метаболического потока в живых клетках.

Метаболическое перепрограммирование является отличительной чертой активации моноцитов/макрофагов и поляризации между про- и противовоспалительными состояниями. Например, провоспалительные (т.е. М1-подобные) моноциты/макрофаги демонстрируют большую зависимость от анаэробного гликолиза и меньшую зависимость от митохондриального окислительного фосфорилирования, в то время как противовоспалительные (М2-подобные) макрофаги демонстрируют большую зависимость от окисления глюкозы и жирных кислот в митохондриях. В данной статье мы подробно описываем протоколы экстракции макрофагов из двух основных резервуаров моноцитов/макрофагов в организме, селезенки и костного мозга, а также из поврежденных тканей, таких как сердце, после инфаркта миокарда.

Макрофаги или моноциты экстрагируются с помощью иммуномагнитной сортировки с использованием меченых антителами микрогранул, которые легко связываются с клетками без ущерба для их фенотипов. Затем извлеченные клетки культивируют в 96-луночных планшетах с последующим анализом внеклеточного потока с помощью анализатора метаболического потока. Как гликолиз, так и митохондриальное окислительное фосфорилирование могут быть измерены одновременно в небольшом количестве клеток (всего 2-3 × 10-5 клеток). Этот метод может быть легко выполнен за 1 день и дает надежные и воспроизводимые результаты. В конечном счете, эти методы помогают улучшить наше понимание метаболических изменений во время иммунных и воспалительных реакций на травму и заболевание, что может привести к разработке новых терапевтических мишеней для иммунометаболических путей.

Иммунометаболизм — это процветающая область, которая изучает роль метаболического перепрограммирования в иммунных клетках при различных патологических заболеваниях и состояниях повреждения. Макрофаги являются ключевой частью врожденной иммунной системы, которая играет важнейшую роль в воспалении, ответе на инфекцию, презентации антигена и заживлении ран¹. Понимание того, как макрофаги поляризуются между про- и противовоспалительными (М1-подобными и М2-подобными) субпопуляциями при различных болезненных состояниях, является областью продолжающихся и интенсивных исследований. Недавние исследования определили метаболическое перепрограммирование в качестве ключевого механизма, лежащего в основе поляризации макрофагов. Современная парадигма заключается в том, что, вообще говоря, М1-подобные макрофаги (которые, как правило, являются моноцитарными) больше полагаются на гликолиз для стимулирования провоспалительных функций, в то время как М2-подобные макрофаги больше полагаются на митохондриальное окислительное фосфорилирование для подавления провоспалительных функций и стимулирования противовоспалительных процессов^. Понимание того, как метаболизм макрофагов изменяется при различных заболеваниях, может дать представление о потенциальных методах лечения, которые могут быть использованы для нацеливания на метаболические пути.

Например, наша лаборатория широко исследовала роль метаболического перепрограммирования макрофагов во время инфаркта миокарда (ИМ)^3,4,5. Макрофаги играют ключевую роль в воспалительной и ранозаживляющей реакции во время ИМ и, как таковые, претерпевают поляризацию от М1-подобных фенотипов к М2-подобным по мере того, как инфарктированное сердце подвергается ремоделированию с образованием замещающей рубцовой ткани. Используя описанные здесь методы, мы продемонстрировали, что эта поляризация характеризуется уникальными изменениями метаболизма глюкозы и глутамина, а также функции митохондрий. Описаны методы экстракции сердечных макрофагов, а также макрофагов селезенки и моноцитов костного мозга, которые могут быть объединены с анализом внеклеточного потока для оценки метаболического потока ex vivo за один день. Мы надеемся, что описанные методы предложат стандартизированный подход к оценке метаболических фенотипов иммунных клеток для повышения воспроизводимости в лабораториях, изучающих эту важную тему.

Приведенные ниже методы описывают протоколы экстракции макрофагов и проведения ex vivo анализа метаболического потока из инфарктного сердца после инфаркта миокарда, селезенки и костного мозга (рис. 1). Для ИМ сердца и селезенки используемый метод экстракции идентичен. Все протоколы с участием мышей были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского центра Университета Миссисипи (протокол #1371, Мутон).

1. Экстракция макрофагов из инфарктного сердца и селезенки

Примечание: При экстракции тканевых макрофагов используется стратегия отрицательного отбора для сначала удаления нейтрофилов, которые помечены Ly6G-микрогранулами, а затем стратегия положительного отбора для получения макрофагов с CD11b-микрогранулами 3,4,5,6. Выполняя этот протокол, работайте быстро и держите клетки в холоде.

1. Усыпить мышь в соответствии с AALAC и институциональными рекомендациями путем передозировки изофлурана с последующим удалением сердца.
2. Быстро удалите сердце и селезенку и взвесьте ткани.
3. Перед проведением анализа готовят буфер PEB путем растворения ЭДТА (2 мМ) и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (w/v) в фосфатно-солевом буфере (PBS). Хранить в холоде.
4. Поместите сердце в холодный сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS). Пропустите через мясорубку стерильным скальпелем на мелкие кусочки.
5. Приготовьте раствор для разложения, содержащий 600 Ед/мл коллагеназы типа II и 60 Ед/мл ДНКазы типа I. Смешайте ткань с 10 мл раствора для разложения в пробирке для диссоциации клеток MACS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте достаточное количество раствора для пищеварения, чтобы использовать 10 мл на каждую ткань (комнатной температуры).
6. Инкубируйте ткани с помощью клеточного диссоциатора в соответствии с протоколом производителя. При этом измельченная ткань будет инкубирована при 37 °C с мягким вращением в течение ~1 часа для получения клеточной суспензии.
7. Переместите суспензию в конические пробирки объемом 15 мл и центрифугируйте при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C.
8. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл буфера PEB. Чтобы получить одноклеточную суспензию, нанесите суспензию на фильтр 30 мкм.
9. Чтобы лизировать эритроциты, добавьте 10 мл 1x раствора для лизиса эритроцитов. Выдерживать 5-10 минут в темноте при температуре 4 °C.
10. Центрифугировать суспензию в течение 300 × г в течение 10 мин при 4 °С.
11. Суспендируйте гранулу в 1 мл ПЭБ и подсчитайте клетки с помощью гемацитометра.
12. Центрифугируйте суспензию при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C.
13. Для удаления нейтрофилов готовят микрогранулы, смешивая 90 мкл буфера PEB с 10 мкл микрогранул анти-Ly6G на^10-7 клеток. Смешайте клеточную гранулу с микрогранулированной суспензией и инкубируйте в течение 10 минут в темноте при температуре 4 °C.
14. Чтобы вымыть несвязанные микрогранулы, добавьте 10 мл буфера PEB и центрифугируйте при 300 × г в течение 10 минут при 4 °C.
15. Подготовьте магнитные колонки (МС или ЛС) на магнитной подставке. Увлажните колонки, добавив 0,5-1,0 мл буфера PEB.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для тканей с большим количеством иммунных клеток (например, селезенки) магнитный столб может легко закупориться и перестать течь. Таким образом, мы рекомендуем использовать колонки LS для селезенки.
16. Повторно суспендируйте клеточную таблетку в 500 μл буфера PEB. Добавьте клеточную суспензию к магнитной колонке и пропустите через нее немеченые клетки (т.е. ненейтрофилы). Промойте колонку 2 раза 500 мкл буфера PEB. Соберите немеченные клетки (т.е. макрофаги и другие клетки) в коническую пробирку объемом 15 мл.
17. Центрифугируйте суспензию при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C.
18. Приготовьте микрогранулы, смешав 90 мкл буфера PEB с 10 мкл микрогранул анти-CD11b на 10^{7 клеток} . Смешайте клеточную гранулу с микрогранулированной суспензией и инкубируйте в течение 15 минут в темноте при температуре 4 °C.
19. Повторите шаги 1.13-1.15.
20. Помеченные макрофаги будут привязаны к магнитной колонке. Чтобы собрать их, отсоедините магнитную колонку от магнитной стойки и поместите ее над новой конической трубкой объемом 15 мл.
21. Добавьте в колонку 1 мл среды RPMI с добавлением 0,1% фетальной бычьей сыворотки (FBS). С помощью поршня извлеките макрофаги в пробирку. Подсчитайте макрофаги с помощью гемацитометра.
    Примечание: Теперь макрофаги находятся в пробирке и готовы к использованию для дальнейших анализов.

2. Экстракция моноцитов из костного мозга

Примечание: При экстракции моноцитов из костного мозга используется стратегия отрицательного отбора, при которой немоноциты, включая лимфоциты, естественные клетки-киллеры, дендритные клетки, эритроидные клетки и гранулоциты (т.е. нейтрофилы), иммуномагнитно мечаются и удаляются.

1. Усыпить мышь в соответствии с AALAC и институциональными рекомендациями путем передозировки изофлурана с последующим удалением сердца.
2. Снимите ножки с мыши. При холодном HBSS рассеките мышцу в сторону от большеберцовой и бедренной костей, пока кости не станут чистыми.
3. Аккуратно отрежьте оба конца косточки. С помощью шприца объемом 10 мл с иглой 27 G промыть костный мозг в коническую трубку объемом 15 мл с буфером PEB. Центрифугируйте суспензию при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C.
4. Выполните шаги 1.8-1.12.
5. Добавьте 175 мкл буфера PEB, 25 мкл реагента-блокатора FcR и 50 мкл коктейля биотин-антител моноцитов на 5 × 10⁷ от общего количества клеток. Выдерживать 5 минут в темноте при температуре 4 °C.
6. Промойте, добавив 10 мл буфера PEB, и центрифугируйте при 300 × г в течение 10 минут при 4 °C.
7. Соберите гранулу и повторно суспендируйте клетки в 500 мкл буфера PEB и 100 мкл микрогранул антибиотина. Выдерживать 10 минут в темноте при температуре 4 °C.
8. Подготовьте магнитные колонки (ЛС) на магнитной подставке. Увлажните колонки, добавив 1,0 мл буфера PEB.
9. Сразу же нанесите клеточную суспензию на колонку. Используйте пробирку объемом 15 мл для сбора проточного канала, который содержит моноциты. Немоноциты связываются с магнитной колонкой.
10. Промойте колонку 2 раза 1 мл буфера PEB. Подсчитайте моноциты с помощью гемацитометра.
11. Чтобы подготовить моноциты к следующему этапу, центрифугируйте при 300 × г в течение 10 мин при 4 °C. Для анализа потока ресуспендируют клеточную гранулу в 1 мл RPMI + 0,1% FBS. Для проточной цитометрии держите клетки в холодном PEB и приступайте к окрашиванию.

3. Подготовка клеток к анализу метаболических потоков

1. Гидратация сенсорного картриджа (за день до анализа)
   1. Извлеките картридж датчика из упаковки. Снимите сенсорную пластину (зеленого цвета) с лунок и внесите пипеткой 200 мкл калибровочной жидкости в каждую лунку. Поместите пластину датчика обратно на верхнюю часть пластины картриджа так, чтобы датчики были погружены в жидкость калибра.
   2. Поместите картридж в увлажнённый инкубатор без CO₂ (37 °C) на ночь.
2. Покрытие ячеек
   1. Поместите клетки в 96-луночный культуральный планшет в среду с концентрацией 200 мкл в течение не менее 1 ч. Оставьте хотя бы одну лунку пустой для фоновых измерений (используйте тот же объем среды для глухих лунок).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное количество клеток должно быть определено до начала эксперимента. Для получения более подробной информации см. раздел «Советы по устранению неполадок» в обсуждении.
   2. Когда вы будете готовы к проведению анализа, приготовьте метаболические флюсовые среды (т.е. базальные RPMI или DMEM без глюкозы, глутамина, пирувата и т.д.). Для стресс-теста на гликолиз убедитесь, что в базальную среду добавлено 2 мМ глутамина. Для проведения митохондриального стресс-теста убедитесь, что в базальную среду добавлено 2 мМ глутамина, 10 мМ глюкозы и 1 мМ пирувата.
   3. Осторожно замените старую среду новой базальной средой путем медленного пипетирования (будьте осторожны, чтобы не сместить клетки). Проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они все еще присутствуют.
   4. Поместите камеру во влажный инкубатор без содержания_CO2 (37 °C).
3. Загрузка флюсовой пластины
   1. Извлеките из инкубатора картридж с гидратированным датчиком/флюсовую пластину.
   2. Подготовьте исследуемые соединения для гликолиза или митохондриального стресс-теста.
      1. Гликолиз: с помощью гликолиза базальную среду создают исходные растворы путем растворения глюкозы в 3 мл, олигомицина в 270 мкл (100 мкМ) и 2-дезоксиглюкозы в 3 мкл. Создать рабочий раствор олигомицина с концентрацией 10 мкМ.
      2. Митохондриальный: Используя митохондриальную базальную среду, создать исходные растворы путем растворения олигомицина в 630 мкл (100 мкМ), карбонилцианида--трифторметоксифенилгидразона (FCCP) в 720 мкл (100 мкМ) и ротенона/антимицина А в 540 мкл (50 мкМ). Создают рабочие растворы олигомицина (0,5-2,5 мкМ), ФКХП (0,125-2,0 мкМ) и ротенона/антимицина А (0,5 мкМ).
         Примечание: Мы обнаружили, что 1,5 мкМ олигомицин и 2,0 мкМ FCCP дают наилучшие результаты.
   3. Загрузите тестовые соединения в порты с использованием следующих объемов: порт A-20 μL, порт B-22 μL, порт C-25 μL, порт D-27 μL. Дополнительно: загрузите лекарственный препарат или соединение по вашему выбору в порт A, а тестовые соединения в порты B, C и D для оценки острого воздействия на гликолиз или митохондриальное дыхание. Если вы не используете дополнительный препарат или соединение, оставьте порт D пустым.
4. Проведение анализа
   1. Откройте программу и выберите «Митохондриальный стресс-тест».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта программа также может быть использована для стресс-теста гликолиза, так как измеряется скорость внеклеточного закисления (ECAR).
   2. Выберите скважины, которые будут использоваться. Чтобы вычесть фон, следите за тем, чтобы хотя бы в 1 лунке не было ячеек.
   3. Запустите программу. Загрузите флюсовую пластину со снятой крышкой, чтобы пластина была откалибрована (~20 мин).
   4. После калибровки пластины программное обеспечение выдаст запрос на загрузку пластины ячейки. Выньте клеточную пластину из инкубатора, снимите нижнюю часть флюсовой пластины и поместите клеточную пластину в держатель. Нажмите run. Анализ займет ~2,5 часа.
   5. Анализируйте результаты с помощью программного обеспечения для управления метаболическим потоком⁷ или другого аналитического программного обеспечения по вашему выбору.

Типичное количество клеток, полученных из различных тканей, зависит от размера, возраста и пола животного. У взрослого самца мыши (т.е. 16 недель, ~30 г) селезенка может давать 3,0-4,0 × 10⁶ макрофагов, в то время как костный мозг (две большеберцовые кости и две бедренные кости) обычно дает 1,0-1,5 × 10⁶ моноцитов (рис. 2А). Инфаркт сердца обычно также дает высокие показатели, в зависимости от дня после ИМ ^4,5,6. На 3-й день выход обычно составляет ~1,5 × 10⁶ клеток/сердце. Здоровое сердце обычно имеет очень мало макрофагов (0,1-0,2 × 10⁵ на сердце)⁶; Таким образом, при использовании макрофагов из здорового (неинфарктного сердца) в качестве контроля, может потребоваться объединение нескольких сердец. На рисунке 2B показаны репрезентативные графики проточной цитометрии из экстрагированных макрофагов или моноцитов, показывающие популяции, которые высоко положительны на CD11b и отрицательны на Ly6G. Сердечные макрофаги и макрофаги селезенки демонстрируют гетерогенность по моноцитарному маркеру Ly6C, в то время как моноциты костного мозга высоко позитивны к Ly6C. Репрезентативные графики проточной цитометрии для отсортированных нейтрофилов (сердца и селезенки) и несортированных клеток из инфарктированного сердца, селезенки и костного мозга (т.е. целой ткани) показаны на дополнительном рисунке S1, дополнительном рисунке S2 и дополнительном рисунке S3.

Результаты анализа внеклеточного потока представлены в виде изменения ECAR (мPh/мин) и скорости потребления кислорода (OCR, pmol O₂/min). Результаты обычно представляются в виде линейного графика с ECAR или OCR по оси y и временем по оси x (рис. 3). Конкретные измерения отображаются в виде гистограмм.

На основе исходных данных можно рассчитать несколько метаболических параметров. Можно также рассчитать соотношение OCR/ECAR для каждой скважины, чтобы дать представление о зависимости гликолиза от митохондриального дыхания, которое может меняться при различных условиях⁴. Например, мы натощали мышей (взрослого самца C57BL/6J) в течение ночи для оценки изменений в метаболизме макрофагов. Фенотип натощак был подтвержден снижением уровня глюкозы в крови и повышением кетонов в крови (дополнительный рисунок S4), что привело к снижению циркулирующих лейкоцитов и нейтрофилов (Hemavet 950FS Auto Blood Analyzer; Дополнительный рисунок S5). Мы выделили моноциты костного мозга и макрофаги селезенки от мышей, которых кормили и кормили натощак, и оценивали метаболические изменения с помощью анализа внеклеточного потока (рис. 4). В моноцитах костного мозга натощак снижал гликолиз и увеличивал соотношение OCR/ECAR как в митохондриальном стресс-тесте, так и в стресс-тесте гликолиза (рис. 4A). В макрофагах селезенки голодание не оказывало существенного влияния на гликолиз, но увеличивало резервную емкость и АТФ-связанное дыхание (рис. 4B). На рисунке 4C показан пример метаболического потока в макрофагах, выделенных из инфарктированного сердца через 3 дня после операции.

Рисунок 1: Репрезентативная схема анализа метаболических потоков в экстрагированных макрофагах/моноцитах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативные результаты исследований сердечных макрофагов и макрофагов селезенки и моноцитов костного мозга, выделенных у мышей. (A) Репрезентативные изображения изолированных сердечных макрофагов и макрофагов селезенки, а также моноцитов костного мозга (4x); среднее количество ячеек на мышь. Масштабная линейка = 1 мм. (B) Репрезентативные графики проточной цитометрии из сердечных (инфаркт миокарда 3-й день) и макрофагов селезенки и моноцитов костного мозга. CD45 использовали в качестве панлейкоцитарного маркера, а CD11b — в качестве маркера миелоидных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Репрезентативные результаты тестов. (А) гликолиз и (Б) митохондриальные стресс-тесты. N = 3 независимых измерения (макрофагов селезенки). Среднее ± СЕМ. Сокращения: ECAR = скорость внеклеточного закисления; OCR = норма потребления кислорода; FCCP = карбонильцианид--трифторметоксифенилгидразон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Влияние ночного голодания на клеточный метаболизм. (A) метаболизм моноцитов костного мозга и (B) макрофагов селезенки. (C) Репрезентативные графики внеклеточного потока из сердечных макрофагов через 3 дня после инфаркта миокарда. N = 3-4 в каждой группе. Сокращение: FCCP = карбонильцианид--трифторметоксифенилгидразон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный файл 1: Репрезентативные графики проточной цитометрии и уровни глюкозы и кетонов в крови у мышей, которых кормили и голодали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Наш метод подробно описывает быстрое извлечение макрофагов из костного мозга, селезенки и инфарктного сердца, которые затем могут быть использованы для выполнения последующих анализов, таких как анализ внеклеточного метаболического потока. Комбинация этих двух методов является мощным инструментом, который может количественно оценить метаболические изменения в макрофагах при различных заболеваниях или травмах, или метаболических состояниях, таких как физические упражнения. В то время как наш метод был сосредоточен на макрофагах костного мозга и селезеночной селезенке, можно использовать и другие резервуары макрофагов, такие как перитонеальный компартмент⁸. Хотя мы не первые, кто использует этот метод, мы надеемся, что эта статья повысит осведомленность и улучшит стандартизацию в лабораториях.

В то время как данные, полученные с помощью этих методов, дают бесценную информацию о метаболическом состоянии различных компартментов макрофагов, настоятельно рекомендуется использовать другие методы для дополнения данных метаболического потока для получения более полной картины метаболизма. Например, объединение данных метаболического потока с метаболомикой (т.е. количественной оценкой внутриклеточных метаболитов), а также экспрессией генов/белков и/или активностью метаболических ферментов часто используется для создания всесторонней оценки метаболических состояний в макрофагах ^5,9. Во многих случаях клетки одного и того же животного могут быть использованы для разных анализов.

По нашему опыту, оптимизация протокола может включать в себя устранение неполадок на нескольких различных этапах. Одним из самых важных моментов является быстрая работа и поддержание клеток в холоде, что повысит выход и жизнеспособность клеток. Определение оптимального количества клеток для внеклеточного потока является еще одним ключевым моментом, поскольку слишком мало клеток не будет давать обнаруживаемый сигнал, в то время как слишком большое количество клеток будет истощать питательные вещества в среде и, таким образом, не будет проявлять реакцию на вводимые соединения. Для макрофагов мы обнаружили, что 2,0 × 10⁵ клеток из сердца ИМ и 3,0 × 10⁵ в 96-луночном планшете дают наиболее надежные и воспроизводимые результаты. Тем не менее, это может варьироваться в зависимости от лаборатории. Особое внимание следует уделять обеспечению равного количества клеток между образцами и группами. Разные номера клеток по-разному реагируют на препараты, используемые в анализе, и могут вносить нежелательную вариабельность.

Оптимальные концентрации вводимых лекарственных средств, включенных в анализ (олигомицин, ФЦХП), также должны быть оптимизированы до проведения экспериментов. Например, мы обнаружили, что 1,5 мкМ олигомицин и 2,0 мкМ FCCP вызывают наиболее устойчивые ответы. Еще одна распространенная ошибка заключается в том, что клеткам не предоставляется достаточно времени после экстракции, чтобы прилипнуть к чашке для культивирования, что приводит к потере клеток при переходе на внеклеточную среду потока. Мы рекомендуем не менее 1 часа и до 2 часов, чтобы клетки прилипли.

Слишком агрессивное пипетирование также может привести к потере клеток; Рекомендуется проводить пипетку очень осторожно и часто проверять клетки под микроскопом. Последним моментом является быстрая работа при подготовке флюсовой пластины, особенно при проведении стресс-теста на гликолиз. Поскольку эти клетки испытывают недостаток глюкозы до проведения анализа, более длительное время инкубации (более 1 часа в базальной среде) может изменить первоначальную реакцию на глюкозу. Мы предлагаем немедленно подготовить флюсовую пластину после замены обычной среды на базальную (~30 минут) и затем калибровать пластину (что занимает ~20 минут). Вариабельность межанализационного анализа всегда должна учитываться. При проведении прямых сравнений между группами всегда следует прилагать усилия, чтобы выполнить все группы в рамках одной и той же пластины или эксперимента.

Несмотря на то, что мы описали два часто используемых стандартных анализа (стресс-тесты гликолиза и митохондриальные стресс-тесты), следует отметить, что существует несколько других стандартизированных анализов, которые могут быть использованы для оценки других метаболических путей, таких как тест гибкости митохондриального топлива¹⁰, окисление жирных кислот/пальмитата¹¹ и анализ скорости АТФ¹². Новые исследования продемонстрировали эффективность развязки BAM15, которая входит в набор для метаболического профилирования Т-клеток. BAM15, по-видимому, является более надежным разъединителем, чем FCCP, с меньшими цитотоксическими эффектами¹³. В будущих исследованиях следует изучить потенциал этого разъединителя в метаболической оценке макрофагов.

У этого метода есть некоторые ограничения. Первый заключается в том, что из-за количества шагов одному человеку может быть сложно выполнить его своевременно. В частности, при использовании большего количества образцов (до 8) рекомендуется, чтобы два человека работали вместе для улучшения качества результатов. Мы обнаружили, что трудно обработать более восьми образцов за день, даже с двумя людьми. Еще одним ограничением является то, что, поскольку анализ проводится ex vivo, всегда существует вероятность того, что процедура экстракции вызовет изменения в клеточном фенотипе⁶. Несмотря на то, что нет очевидного способа устранить это ограничение, методы визуализации in vivo , такие как гиперполяризованная магнитно-резонансная томография, использовались для визуализации продукции лактата макрофагов после ИМ¹⁴ и, как мы надеемся, продолжат развиваться в качестве дополнения или замены описанного нами метода ex vivo . Ограничением метода внеклеточного потока является то, что, хотя он может улавливать сдвиги между гликолизом и OXPHOS, он не полностью отражает изменения скорости продукции АТФ в^{этих путях}. Кроме того, изменения в подкислении среды (ECAR) не всегда могут отражать продукцию молочной кислоты путем гликолиза, но также могут быть подвержены влиянию образования CO₂ в цикле TCA, который преобразуется в бикарбонат¹⁵. Таким образом, для пользователей может быть полезно рассчитать скорость производства АТФ с помощью гликолиза и OXPHOS, что позволяет оценить вклад этих путей в общую выработку АТФ.

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Мы хотели бы выразить признательность за финансирование, которое поддержало эту работу: NIH/NHBLI 166737, NIH R00 HL146888, NIH U54HL169191, NIH/NIGMS P20GM104357 и NIH/NIGMS P30GM149404 за эту работу.