Fare İç Kulak Dokusunun Kriyoseksiyon ve İmmün Boyama: Embriyonik Aşamalardan Yetişkin Aşamalarına

Fare iç kulak dokusunun acemi kullanıcıları için tasarlanan bu protokol, kesit immün boyama için farklı gelişim aşamalarında fare iç kulaklarının işlenmesine yönelik adımları kapsamlı bir şekilde detaylandırır.

Bu protokol, embriyonik, yenidoğan ve yetişkin farelerden iç kulak örneklerinin hazırlanması için genel histoloji yöntemlerini detaylandırır. Bu protokolün amacı, fare kokleası ile çalışmakla ilgilenen, muhtemelen bu alanda yeni olan araştırmacılar için iç kulak dokusu işleme için basit ve standartlaştırılmış bir yöntem sağlamaktır. Burada diseksiyon, fiksasyon, gömme, kriyoseksiyon ve immün boyama protokolleri bulunmaktadır. Seksiyon immün boyama, tüm koklea bağlamında tek tek hücreleri incelemek için en iyi yöntemlerden biridir.

Anahtar adımlar arasında iç kulağın kafatasından uzakta diseksiyonu, dokunun% 4 paraformaldehit kullanılarak sabitlenmesi, Optimal Kesme Sıcaklığı bileşiği ile gömülmesi, kriyoseksiyon ve koklea tarafından eksprese edilen spesifik proteinleri hedefleyen antikorlarla immün boyama yer alır.

Yöntemlerimize, koklea için özel olarak dikkat edilmesi gereken hususlar dahildir.
şekil ve yapı. Doku hasarı, immün boyamanın kalitesini ve numuneler arasındaki tutarlılığı etkileyebileceğinden, makul derecede iyi odaklanma ve diseksiyon becerilerine ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, ana hatlarıyla belirttiğimiz prosedürlerle, çoğu kullanıcı güzel hazırlıklar yapmak için birkaç hafta içinde eğitilebilir. Genel olarak, bu protokol, fare modellerinde işitsel gelişimi, işlevi ve hastalığı anlamak için araştırmaları teşvik etmek için değerli bir yol sunar.

İşitsel gelişimi ve işlevi anlamak, farklı işitme kaybı biçimlerini karakterize etmek ve ele almak için çok önemlidir. İşitme kaybı için risk faktörleri çoktur ve diyabet ^1,2, hipertansiyon ^3,4,5, otoimmün hastalıklar ^6,7, bakteriyel menenjit ^8,9 ve çeşitli nörodejeneratif bozuklukları^{içerir 10,11,12,13}. Ek olarak, bazı antibiyotikler ve kemoterapi ilaçları gibi bazı ilaçlar da işitmeyi olumsuz etkileyebilir¹⁴. İşitsel bozukluğun acil zorluklarının ötesinde, işitme kaybı bilişsel işlevi olumsuz etkileyebilir ve kaygı ve stresi artırabilir, bu da bilişsel bozukluk ve zihinsel sağlık düşüşü ile ilişkili olabilir 11,15,16. Bu protokolü yayınlayarak, özellikle koklea ile daha önce çalışma deneyimi olmayanlar için işitsel araştırmaya girişin önündeki tüm engelleri hafifletmeyi amaçlıyoruz. Bu kılavuz, embriyonik, juvenil (yenidoğan) ve yetişkin farelerden iç kulak örneklerinin nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır. Bu protokolün amacı, iç kulak dokusunun işlenmesine basit bir yaklaşım sağlamak, deneyler arasında tekrarlanabilirlik ve tutarlılık sağlamaktır. Seksiyon immün boyama, tüm koklea bağlamında farklı hücre tiplerini incelemek için en iyi yöntemlerden biridir; Diğer durumlarda, tam montajlı immün boyama daha avantajlı olabilir (örneğin, saç hücresi stereosilia morfolojisinin veya protein lokalizasyonunun incelenmesi).

Bunun mantığı, fare kokleası ile çalışmanın zorluklarından kaynaklanmaktadır. Küçük boyutu, benzersiz bobini ve hassas yapısı¹⁷, doğru diseksiyon, fiksasyon, gömme, kriyoseksiyon ve immünoboyama için özel teknikler gerektirir. Kokleanın spiral şekli, gömmenin, kokleanın her dönüşünün korunmasını sağlamak için yönlendirmeye dikkat edilmesi gerektiği anlamına gelir, bu da tutarlı bölümler elde etmek için çok önemlidir. Ek olarak, koklea olgunlaştıkça kemikleşmeye¹⁸ uğrar, yani yavaş yavaş kemiğe dönüşür, bu da doku korumasını zorlaştırabilir ve dekalsifikasyon gerektirebilir. Kriyoseksiyon immün boyama, alternatif preparatlara (tam montajlı immün boyama gibi) göre çeşitli avantajlar sunar. Kriyoseksiyonun temel faydaları, proteinlerin ve nükleik asitlerin genel olarak korunmasıdır ve nispeten ince, ~ 2D bölümler tutarlı ve hassas ölçümlere izin verir. Ek olarak, tüm koklear hücre tiplerinin korunmasına ve görüntülenmesine izin verir ve immün boyama kalitesini artırabilir. Birçok koklear tam montaj preparatının aksine, kriyoseksiyon spiral ligament, stria vaskülaris, Reissner membranı ve tektoryal membran gibi yapıları korur. Embriyonik 19,20,21, neonatal ^22,23,24 ve yetişkin ^25,26 iç kulakların yüksek kaliteli kesit immün boyama örnekleri için aşağıdaki önceki yayınlara bakın.

NOT: Burada açıklanan tüm yöntemler Georgetown Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmadaki tüm fareler, Georgetown Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ne (protokol # 1147) uygun olarak korunmuştur. Doğum sonrası ilk haftada temporal kemik yapıları tam gelişmediği için dekalsifikasyona gerek kalmaz. Bununla birlikte, P6 ve daha yaşlı farelerden elde edilen koklealar, dekalsifikasyon ve farklı bir diseksiyon yöntemi gerektirir. Protokolümüzde erkek ve dişi NCI Cr:NIH(S) (NIH Swiss) fareleri kullanıldı ve E16.5, P0 ve P30'da kullanıldı. Her bölüm için, yeni başlayanlar için her adımın ne kadar sürmesinin beklendiğini parantez içinde not ediyoruz. Adımların çoğu pratikle daha hızlı hale gelecektir.

1. Embriyonik ve juvenil iç kulak örneği toplanması (~75 dk)

1. Onaylanmış bir hayvan çalışma protokolüne uygun olarak farelere ötenazi yapın ve dekapitasyon yapın.
2. İnce diseksiyon makası kullanarak, boyundan başlayıp buruna doğru uzanan, cildi yana doğru iterek (ilk kesim) kafa derisi boyunca dikkatlice orta hat kesisi yapın.
3. Alt makas bıçağını foramen magnumuna ve üst makas bıçağını kafatasına yerleştirin. Kafatasının üst yarısını buruna kadar kesin (ikinci kesim).
4. Makası kısmen kesilmiş kafadan geri çekin, ardından alt makas bıçağını kafatasının altına ve üst makas ucunu foramen magnumuna yerleştirin. Başın alt yarısını buruna kadar kesin (üçüncü kesim).
   NOT: Makas bıçaklarının orta hattı tam olarak kesmesi ve çok az çabayla kolayca kesmesi önemlidir. Bu, makas bıçaklarının sol ve sağ iç kulak arasını kesmesini sağlayacaktır.
5. Bu noktada, fare kafası rostral-kaudal eksen boyunca ikiye bölünür. İnce forseps ve makas kullanarak beyin, kaslar ve bağ dokusu gibi temporal kemiği çevreleyen yumuşak dokuları dikkatlice ayırın. Kemiğe veya çevresindeki yapılara zarar vermekten kaçının.
6. Fare yarım kafalarını, oda sıcaklığında 1x PBS içeren 24 oyuklu bir plakanın kuyularına yerleştirin. Her bir kafa işlendikten sonra, 1x PBS çözeltisini %4 PFA çözeltisi (sabitleme için) ile değiştirin ve oda sıcaklığında (tipik olarak 20 °C) 45 dakika inkübe edin.
   NOT: Fiksasyon süresi, tespit edilmesi gereken proteinlere ve/veya farklı antikorların bağlanma etkinliğine bağlı olarak değişebilir.
7. 45 dakika sonra, dokuyu 1x PBS ile 3 x 5-10 dakika durulayın.
8. Numuneleri 4 °C'de 1x PBS'de saklayın veya bir sonraki adıma geçin ve inceleyin. Uzun süreli depolama için, 4 ° C'de% 0.1 sodyum azid içeren 1x PBS'de saklayın.
9. Kalan fare dokusunu kurumun biyolojik tehlike/doku imhası yönergelerine göre atın.

2. Embriyonik ve juvenil iç kulak örneği diseksiyonu (her örnekte 3-5 dakika)

1. Farenin yarım kafasının içindeki temporal kemik/iç kulak kapsülünü bulun. Dış kulakla aynı pozisyonda bulunur ancak kafatası kemiğinin içinde bulunur. İnce forseps kullanarak, iç kulak kapsülünü çevreleyen yumuşak dokuyu dikkatlice ayırın. İç kulak kapsülü gevşetildikten sonra, iç kulak kapsülünün etrafındaki dokuyu kesmeye başlayın.
2. İç kulak kapsülü kafatası dokusundan büyük ölçüde kurtulduktan sonra, tamamen serbest bırakmak için forseps kullanarak iç kulak kapsülünün çevresine hafifçe baskı uygulayın.
   NOT: İç kulak kapsülünü çevresindeki eklerden gevşetmek için kademeli olarak basınç uygulayın. İç kulak kapsülüne zarar vermekten kaçının. Erken gelişen iç kulak oldukça yumuşak olduğundan, forsepsinizle doğrudan temas kurmaktan kaçının.
3. İç kulak örneklerini adım 1.8'deki gibi saklayın ve sabit kafa dokusunda kalan kalıntıları atın.

3. Erişkin iç kulak örneği alınması ve diseksiyonu (~ 75 dk + 2 - 3 gün EDTA tedavisi)

1. Onaylanmış bir hayvan çalışma protokolüne göre farelere ötenazi yapın ve dekapitasyon yapın.
2. Keskin diseksiyon makası kullanarak, boyundan başlayıp buruna doğru uzanan kafa derisi boyunca dikkatlice orta hat kesisi yapın. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi geriye doğru katlayın (ilk kesim).
3. Alt makas bıçağını foramen magnumuna ve üst makas bıçağını kafatasına yerleştirin. Kafatasının üst yarısını buruna kadar kesin (ikinci kesim).
   NOT: Bu adım sırasında, makas bıçaklarının orta derecede "çatırdadığını" fark edeceksiniz; Bu normal.
4. Makası kısmen kesilmiş kafadan geri çekin, ardından alt makas bıçağını kafatasının altına ve üst makas bıçağını foramen magnumuna yerleştirin. Başın alt yarısını buruna kadar kesin (üçüncü kesim), bıçakların iç kulakları ıskalamasını sağlamak için orta hat boyunca sağa doğru gitmeye dikkat edin.
   NOT: Makası dokudan zorla geçirmeyin; Bu, bıçakların iç kulaklardan birine çarptığını gösterebilir.
5. Her yarım kafa için, forseps ve makas kullanarak, beyin, kaslar ve bağ dokusu gibi temporal kemiği çevreleyen yumuşak dokuları ayırın.
   NOT: Temporal kemiğe veya çevresindeki yapılara zarar vermemek için dikkatli olun.
6. Çevreleyen doku temizlendikten sonra, kafatası dokusunu parmaklarınızla "ters kıvırın" ve temporal kemiğin alt tarafına hafifçe baskı uygulamak için bir başparmak kullanın. Kemiği çevresindeki ataşmanlardan gevşetirken kademeli basınç uygulayın.
   NOT: Basınç uygulandıkça, iç kulak kapsülü kafatasının çevresindeki kemiklerden yavaş yavaş ayrılır. Nazik manipülasyon ile kemik nispeten kolay bir şekilde dışarı çıkmalıdır.
7. İç kulak kapsülü çıkarıldıktan sonra 1x PBS ile durulayın.
8. Bir sylgard kabını %4 PFA ile doldurun ve mikroskobun altına yerleştirin. Sylgard kabına tek bir dışarı çıkmış iç kulak yerleştirin.
9. İç kulakta herhangi bir yapışkan yumuşak doku veya kemik olup olmadığını inceleyin ve nazikçe çıkarın.
10. Oval pencereyi bulun ve stapesleri forseps ile nazikçe çıkarın.
11. Yuvarlak pencereyi bulun ve çevredeki dokunun onu tıkamadığından emin olmak için küçük bir delik açın.
12. İnce forseps ile tepede küçük bir delik açın. Sabitlemek için kokleayı %20 PFA ile doldurulmuş bir P4 pipeti ile yıkayın. Oval pencereden çıkan sıvıyı (seyreltik kan, endolenf / perilenf) görselleştirdiğinizden emin olun.
13. Sabit kokleayı% 4 PFA ile doldurulmuş 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Zamanı işaretleyin. Hafif çalkalama (külbütör veya nutator) ile oda sıcaklığında 30-60 dakika inkübe edin, ardından numuneyi 1x PBS çözeltisi ile 3 x 5-10 dakika durulayın.
14. Son durulamadan sonra, dokuyu 1.25 mM EDTA'ya yerleştirin ve 4 ° C'de 2-3 gün boyunca sallanmasına izin verin.
15. Kalan fare dokusunu kurumun biyolojik tehlike/doku imhası yönergelerine göre uygun şekilde atın.
16. EDTA tedavisinden sonra, dokuyu 1x PBS ile 3 x 5 dakika durulayın.
17. Numuneleri 4 °C'de 1x PBS'de saklayın veya bir sonraki adıma geçin ve inceleyin. Uzun süreli saklama için, numuneleri 4 °C'de %0,1 sodyum azid içeren 1x PBS'de saklayın.

4. Kriyoseksiyon için iç kulak örneği hazırlama (~ 24 saat)

1. Diseke edilmiş iç kulak kapsülünü %10 sükroz (1x PBS'de) içine yerleştirin ve oda sıcaklığında en az 2 saat inkübe etmesine izin verin.
   NOT: Numuneler tamamen dengelendiğinde, tüpün dibine batacaktır.
2. % 10 sükroz çözeltisini atın,% 20 sükrozu 1x PBS'ye ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat daha inkübasyona izin verin.
3. % 20 sükroz çözeltisini atın,% 30 sükrozu 1x PBS'ye ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin (minimum).
   NOT: Bu adım 2 saate düşürülebilir, ancak gece inkübasyonu en iyi sonuçları verir. Doku, uzun bir süre boyunca herhangi bir sükroz yüzdesinde bırakılabilir.
   1. %30'luk sükroz çözeltisinin yarısını çıkarın ve boşluğu Optimum Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiği ile doldurun. En az 30 dakika ve en fazla 2 saat sallanmasına izin verin.
      NOT: Numunelerin uzun süre OCT'de bırakılması dokunun küçülmesine neden olacaktır.
4. Numuneleri OCT ile doldurulmuş etiketli kriyomoldlara aktarın.
5. Gömülü kriyoblokta mikroskop altında koklear oryantasyonu kontrol edin. "Standart" koklear kesitler için, iç kulağın içbükey tarafının kriyomoldun dar taraflarına baktığını doğrulayın.
6. Kuru buzu küçük bir kaba koyun ve 5-10 mL etanol veya dimetilbütan ekleyin. Bloğu hızla dondurmak için kriyokalıpları + OCT + numuneyi köpüren kuru buzun üzerine yerleştirin.
7. Numuneleri -80 °C'de saklayın.

5. İç kulakların kesitlenmesi (numune başına ~ 25 dakika)

1. Kriyoblokları -20 °C'ye kadar önceden soğutulmuş bir kriyostatın odasına aktarın. Numunelerin orada 30-60 dakika dengelenmesine izin verin.
2. Kesit alma için doğru yönlendirmeyi sağlamak için kriyoblokun koklear pozisyona karşılık gelen tarafını bir kalem kullanarak işaretleyin.
3. Mandrene küçük bir OCT havuzu ekleyin ve kriyobloku geniş tarafı (kalem işareti olmadan) aşağı gelecek şekilde üzerine yerleştirin.
4. Mandren + OCT + numuneyi soğutulmuş kriyostat odasına yerleştirin ve OCT'nin tamamen donmasına izin verin. Birkaç dakika sonra, mandren + s'yi yerleştirinampkalem işareti sağa veya sola bakacak şekilde ayna tutucusuna.
5. Doku görünene kadar bloğu kesin (trim ayarı olarak 40 μm kullanın).
6. Doku belirginleştikten sonra, kriyoseksiyon için tasarlanmış slaytlarla 12 μm'lik bir kesit alın ve kesit yerini mikroskop altında kontrol edin.
7. Koklear dönüşlere yaklaşıyorsanız, tüm dönüşleri geçene kadar ara sıra konumu kontrol ederek 12 μm'lik bölümler toplayın.
   NOT: Slayt başına bölüm sayısı değişebilir, ancak genellikle slayt başına 8-10 bölüm ve koklea başına yaklaşık 6 slayt alırız.
8. Slaytları -80 °C'de saklayın.

6. Bölüm immün boyama (~ 1 - 3 gün)

1. Slaytları -80 °C dondurucudan çıkarın ve yaklaşık 10 dakika kurumaya bırakın.
2. Bir kalem kullanarak, slaytları kullanılacak antikorlarla etiketleyin.
3. Hidrofobik bir işaretleyici (örneğin, Hidrofobik Bariyer Peroksidaz-Antiperoksidaz Kalemi (PAP)) kullanarak kenarları izleyin.
4. Örnekleri 1x PBS'de 5 dakika boyunca yeniden sulandırın.
5. 1x PBS'yi slaytlardan atın ve geçirgenleşmesi için 20 dakika boyunca slaytlara 1x PBS + %0.1 Triton X-100 (%0.1 PBSTx) ekleyin.
6. Slayttan% 0.1 PBSTx'i çıkarın ve oda sıcaklığında 1-2 saatlik bir inkübasyon için 200 μL engelleme çözeltisi ekleyin.
   NOT: Blokaj, immünohistokimya ve immünofloresan gibi immünoboyama tekniklerinde çok önemli bir adımdır ve burada antikorların dokulara veya hücrelere spesifik olmayan bağlanmasını önler. Daha fazla bilgi için, Lewis'in kontrol ve engelleme reaktiflerini seçme kılavuzuna^{bakın 27}. Yaygın olarak kullanılan bir engelleme çözeltisi,% 0.5 PBSTx'te% 10 Normal Eşek Serumu 'dur, ancak bu yalnızca eşekten türetilen ikincil antikorlar kullanıldığında geçerlidir.
7. 1x PBS ile hızlı bir durulama yapın,% 0.5 PBSTx'te bulunan 200 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Şekil 1'de gösterilen primer antikorlar için aşağıdaki dilüsyonları kullanın: Plexin-B1 için 1:200, Sox2 için 1:200, Tuj1, Myo6 ve Myo7A için her biri 1:1.000 (ayrıca bkz. Malzeme Listesi).
   NOT: Her primer antikor, epitop bağlanma özelliklerine ve doku örneklerine nüfuz etme yeteneğine bağlı olarak farklı davranır.
8. Primer antikorlarla tedaviyi takiben, PBSTx'te 4 x 30 dakika durulayın,% 0.5 PBSTx'te (Malzeme Listesi) bulunan 200 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
   NOT: Bazen, istenmeyen çökeltileri peletlemek için ikincil antikor çözeltilerini 30 dakika boyunca 4 ° C'de tam hızda döndürmek yardımcı olabilir. İkincil çözeltiler santrifüjlenmişse, pipet ucuyla tüpün altına dokunmaktan kaçının.
9. PBSTx'te 4 x 30 dakika durulayın (veya gece boyunca durulayın), ardından foto ağartmayı önlemeye yardımcı olan bir montaj ortamı (örn. Fluoromount) kullanarak slaytları monte edin.
10. Görüntüleme kurulumu için uygun bir kalınlığa sahip uygun boyutta bir lamel ekleyin (örneğin, kalınlığı 0,13-0,16 mm olan 1 numaralı lameller).

Embriyonik bir gün 16.5 (E16.5) fare kokleasının apeks ve bazal dönüşü ve doğum sonrası 0. gün (P0) ve P30 kokleasından bazal dönüş ile ilgili kendi laboratuvarımızdan örnekler sunuyoruz. Bu örnekler, saç hücreleri (Myo7A ve Myo6), spiral ganglion nöronları (SGN'ler; Tuj1), glia ve destek hücreleri (Sox2) ve koklear kanal ve SGN'lerin etrafındaki bazal membranı etiketleyen Plexin-B1. Kokleanın farklı gelişim aşamalarındaki kesitleri, kokleanın olgunlaşmasını yansıtan morfoloji ve hücresel organizasyonda önemli farklılıklar ortaya koymaktadır.

E16.5'te koklea, Corti organının farklılaşmaya başlamasıyla birlikte gelişimin erken bir aşamasındadır. Bu aşamada, SGN'ler tarafından saç hücresi innervasyonu başlamıştır (Şekil 1C), ancak sinir birkaç hafta daha tam olarak gelişmeyecektir. Saç hücresi öncüleri tanımlanabilir; erken iç ve dış tüy hücreleri görülebilir (Şekil 1D). Yapısal olarak, koklear kanal mevcuttur, ancak tam yetişkin uzunluğuna kadar uzamamış değildir. P0 ile koklea nispeten çok daha olgun hale gelir. Koklear kanal, skala timpani ve vestibuli'nin gözle görülür bir genişlemesi ile daha belirgindir. Koklear innervasyon, tüy hücreleri ve SGN'ler arasında daha yerleşik ve organize bağlantılarla ilerlemeye devam eder (Şekil 1G); iç ve dış tüy hücreleri kolayca ayırt edilebilir (Şekil 1H).

P30 ile koklea, bazı ölçülere²⁸ göre tam olgunluğa ulaşır, koklear kanal artık tamamen uzamıştır ve yapı, tam olarak oluşmuş koklear dönüşler de dahil olmak üzere yetişkin boyutundadır. Nöral innervasyon, spiral ganglion nöronları ve saç hücreleri arasındaki kesin ve olgun bağlantılarla tamamlanmıştır (Şekil 1K). Corti organı da belirgin şekilde ayrılmış ve tamamen işlevsel iç ve dış saç hücreleri (Şekil 1L) ve tamamen farklılaşmış destek hücreleri (Şekil 1J) ile tamamen olgunlaşmıştır.

Şekil 1: E16.5, P0 ve P30 farelerinden alınan immün boyalı koklear kriyokesitler. (AD) E16.5 fare tabanı ve apeks dönüşleri. (E-H) P0 ve (I-L) P30 fare koklear bazal dönüşleri. (A,E,I) Numunelerin üçlü immünofloresan boyamanın birleştirilmiş görüntüleri. (B,F) E16.5 ve P0 koklealardaki pleksin-B1 ekspresyonu, güçlü bazal membran boyaması (ok) ve soluk SGN ve koklear epitel hücre boyaması gösterir. (C,G,K) Tuj1 (beta-III-tubulin), gelişimleri boyunca SGN'lere lokalize olur ve P30'da görünür kalır. (J) Sox2, koklear epitelde SGN'ler ve destekleyici hücreler etrafındaki glia ile eksprese edilir. (D,H) Myo6, P0'da iç ve dış tüy hücreleri ile ifade edilir. (L) Myo7A, P30'da iç ve dış saç hücreleri tarafından eksprese edilir. Oklar, her panel için temsili işaretçileri ifade eden hücrelere işaret eder. Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objektifli bir Zeiss LSM 880 konfokal mikroskop kullanılarak 20x görüntü elde edildi. Alexa Fluor 488, Cy3 ve Cy5'i uyarmak için sırasıyla 488 nm, 561 nm ve 633 nm'deki lazer çizgileri kullanıldı. Görüntüler 1.024 x 1.024 piksel, iki satır ortalaması ve 1 Airy biriminde iğne deliği boyutunda çekildi. 8 bit çözünürlükte 10 optik bölüm yakalayarak Z-stack görüntüleme gerçekleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Sorun Giderme.

Başarılı kriyoseksiyon ve immün boyama için birkaç önemli adım vardır. Koklear dokunun uygun şekilde sabitlenmesi esastır ve antikora bağlı olarak değişebilen sabitleme süresi de önemlidir. Çoğu antikor, PFA'da 45 dakika gibi daha kısa bir fiksasyon süresiyle daha iyi çalışırken, bazı hedef epitoplar gece boyunca fiksasyonu tolere edebilir. Deneyimlerimize dayanarak, 45 dakikalık bir fiksasyon yeterli korumayı sağlar ve koklear preparatlar kullanılarak yapılan araştırmalar için yaygın olarak kullanılan çoğu primer antikorla uyumludur. İmmün boyamada sorun giderirken (bakınız Tablo 1), farklı fiksasyon süreleri dikkate alınmalıdır. Kriyoseksiyon, belirli hücre tiplerini tanımlamak gibi birçok avantaj sunarken ve belirli yapısal ayrıntıların (örneğin, Reissner zarı, stria vascularis, modiols) daha iyi çözülmesine yardımcı olabilirken, tam montajlar, doku içindeki her türlü 3B bağlamı ve uzamsal ilişkileri korumak için avantajlıdır²⁹. Ek olarak, tam montajlı (sabitlenmemiş) preparatlar, hücresel dinamikler³⁰ ve Ca2+ geçici akımları³¹ gibi şeyleri gözlemlemek için kokleayı canlı bir preparat olarak incelemek için fırsatlar sunar.

Fare kokleasının kriyoseksiyonunun en büyük avantajlarından biri, yapılabilecek çok sayıda kantitatif analizdir. Örneğin, kriyoseksiyon, antikor tespitini takiben floresan yoğunluk seviyelerini ölçmek için mükemmeldir (örneğin, bkz. 32,33,34); 12 μm'lik kesitlerin sınırlı doku derinliği, tam montajlı preparatlara kıyasla daha az ışık saçılımı oluşturur. SGN veya diğer hücre yoğunluğunu incelemek için, kesitler tüm bağlara göre tercih edilir (örneğin, bkz.^25,35), çünkü kesitler tipik olarak kokleanın uzunlamasına eksenine ortogonal düzlem boyunca yapılır, bu da hücre çekirdeklerinin belirli doku bölmeleri içinde net bir şekilde görselleştirilmesine izin verir. Benzer şekilde, tektoriyal membran, stria vascularis veya skala timpani/media/vestibuli gibi yapıların morfolojisinin ölçülmesi en kolay şekilde enine kesitler kullanılarak yapılır (örneğin, bkz.^36,37).

Doğru analiz için uygun kesit alma yönteminin seçilmesi çok önemlidir. Parafin gömme, dokuyu kesit almadan önce gömmek için başka bir yaygın yöntemdir. Parafin bölümleri, dokuların mükemmel fiziksel stabilite sağlayan ve doku morfolojisini minimum hasarla koruyan balmumuna gömülmesini içerir. Bununla birlikte, balmumu sızma işlemi, bazı boyama yöntemleriyle uyumluluklarını sınırlayabilir. Buna karşılık, kriyoseksiyonlar belirli analizler için spesifik proteinleri ve hücresel yapıları daha iyi koruyabilir, ancak daha az stabil kesitlere ve potansiyel doku hasarına neden olabilir³⁸. Her tekniğin güçlü yönlerini ve sınırlamalarını anlamak, araştırma soruları için en iyi yaklaşımı seçmek için çok önemlidir.

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

M.A.D. ve T.M.C., NIH hibeleri 5R01DC016595-07 (TMC'ye) ve 5R01DC018040-05 (Michael Deans, Univ. Utah, PI) tarafından desteklendi. Şekil 1A-H'deki örnek mikrograflar Dr. Kaidi Zhang tarafından oluşturulmuştur.