JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح هذا البروتوكول ، المخصص للمستخدمين المبتدئين لأنسجة الأذن الداخلية للفأر ، بشكل شامل خطوات معالجة الأذنين الداخلية للفأر في مراحل النمو المختلفة للتلوين المناعي للمقطع.

Abstract

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طرق الأنسجة العامة لإعداد عينات الأذن الداخلية من الفئران الجنينية وحديثي الولادة والبالغين. الغرض من هذا البروتوكول هو توفير طريقة مباشرة وموحدة لمعالجة أنسجة الأذن الداخلية للباحثين ، ربما الجدد في هذا المجال ، المهتمين بالعمل مع قوقعة الفأر. تتضمن هنا بروتوكولات التشريح والتثبيت والتضمين والتقطيع بالتبريد والتلوين المناعي. يعد التلوين المناعي للقسم أحد أفضل الطرق لفحص الخلايا الفردية في سياق القوقعة بأكملها.

تشمل الخطوات الرئيسية تشريح الأذن الداخلية بعيدا عن الجمجمة ، وتثبيت الأنسجة باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد ، والتضمين مع مركب درجة حرارة القطع المثلى ، والتقطيع بالتبريد ، والتلوين المناعي بالأجسام المضادة التي تستهدف بروتينات معينة تعبر عنها القوقعة.

تتضمن أساليبنا اعتبارات خاصة تم وضعها للقوقعة بالنظر إلى
الشكل والهيكل. هناك حاجة إلى مهارات تركيز وتشريح جيدة بشكل معقول ، حيث يمكن أن يؤثر تلف الأنسجة على جودة التلوين المناعي والاتساق بين العينات. ومع ذلك ، من خلال الإجراءات التي نحددها ، يمكن تدريب معظم المستخدمين في غضون أسابيع قليلة لإجراء استعدادات جميلة. بشكل عام ، يوفر هذا البروتوكول طريقة قيمة لتعزيز البحث لفهم التطور السمعي والوظيفة والمرض في نماذج الفئران.

Introduction

يعد فهم التطور السمعي ووظيفته أمرا بالغ الأهمية لتوصيف ومعالجة الأشكال المختلفة لفقدان السمع. عوامل خطر فقدان السمع كثيرة وتشمل مرض السكري1،2 ، وارتفاع ضغطالدم 3،4،5 ، وأمراض المناعة الذاتية6،7 ، والتهاب السحايا الجرثومي8،9 ، والعديد من الاضطرابات التنكسية العصبية10،11،12،13. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤثر بعض الأدوية ، مثل بعض المضادات الحيوية وأدوية العلاج الكيميائي ، سلبا على السمع14. بالإضافة إلى التحديات الفورية لضعف السمع ، يمكن أن يؤثر فقدان السمع سلبا على الوظيفة المعرفية ويزيد من القلق والتوتر ، والذي يمكن أن يرتبط بالضعف الإدراكي وتدهور الصحة العقلية11،15،16. من خلال نشر هذا البروتوكول ، نهدف إلى تخفيف أي عوائق تحول دون دخول البحث السمعي ، خاصة لأولئك الذين ليس لديهم خبرة سابقة في العمل مع القوقعة. يشرح هذا الدليل كيفية تحضير عينات الأذن الداخلية من الفئران الجنينية والأحداث (حديثي الولادة) والبالغين. الغرض من هذا البروتوكول هو توفير نهج مباشر لمعالجة أنسجة الأذن الداخلية ، مما يضمن قابلية التكاثر والاتساق عبر التجارب. يعد التلوين المناعي للقسم أحد أفضل الطرق لفحص أنواع الخلايا المختلفة في سياق القوقعة بأكملها. في ظروف أخرى ، قد يكون التلوين المناعي الكامل أكثر فائدة (على سبيل المثال ، فحص مورفولوجيا الأهداب المجسمة لخلايا الشعر أو توطين البروتين).

ينبع الأساس المنطقي لذلك من تحديات العمل مع قوقعة الفأر. يتطلب حجمها الصغير ولفائفها الفريدة وهيكلها الدقيق17 تقنيات متخصصة للتشريح الدقيق والتثبيت والتضمين والتقطيع بالتبريد والتلوين المناعي. يعني الشكل الحلزوني للقوقعة أن التضمين يتطلب اهتماما دقيقا بالتوجيه لضمان الحفاظ على كل منعطف من القوقعة ، وهو أمر بالغ الأهمية للحصول على أقسام متسقة. بالإضافة إلى ذلك ، مع نضوج القوقعة ، تخضع للتعظم18 ، مما يعني أنها تتحول تدريجيا إلى عظم ، مما قد يعقد الحفاظ على الأنسجة ويستلزم إزالة الكلس. يوفر التلوين المناعي للتشريح بالتبريد العديد من المزايا مقارنة بالمستحضرات البديلة (مثل التلوين المناعي بالكامل). تتمثل الفوائد الرئيسية للاستئصال بالتبريد في الحفاظ العام على البروتينات والأحماض النووية ، وتسمح الأقسام الرقيقة نسبيا ~ 2D بقياسات متسقة ودقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يسمح بالحفاظ على جميع أنواع خلايا القوقعة الصناعية وتصورها ، ويمكنه تحسين جودة التلوين المناعي. على عكس العديد من مستحضرات القوقعة الصناعية الكاملة ، يحافظ التقطيع بالتبريد على الهياكل بما في ذلك الرباط الحلزوني ، والأوعية الدموية ، وغشاء ريسنر ، والغشاء التكتوري. انظر المنشورات السابقة التالية للحصول على أمثلة على تلطيخ مناعي القسم عالي الجودة للآذان الداخليةالجنينية 19،20،21 ، وحديثيالولادة 22،23،24 ،والبالغين 25،26 الأذنين الداخلية.

Protocol

ملاحظة: تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) بجامعة جورج تاون. تم الحفاظ على جميع الفئران في هذه الدراسة وفقا للجنة رعاية واستخدام المؤسسية بجامعة جورج تاون (البروتوكول # 1147). في الأسبوع الأول بعد الولادة ، نظرا لأن هياكل العظام الصدغية لم يتم تطويرها بشكل كامل ، فإن إزالة الكلس ليست مطلوبة. ومع ذلك ، فإن القوقعة من الفئران التي تتراوح أعمارها بين P6 وما فوق تتطلب إزالة الكلس وطريقة مختلفة للتشريح. في بروتوكولنا ، تم استخدام الفئران من الذكور والإناث NCI Cr: NIH (S) (NIH السويسرية) ، وفي E16.5 و P0 و P30. لكل قسم ، نلاحظ بين قوسين المدة التي يتوقع أن تستغرقها كل خطوة للمبتدئين. ستصبح العديد من الخطوات أسرع مع الممارسة.

1. جمع عينات الأذن الداخلية الجنينية والأحداث (~ 75 دقيقة)

  1. القتل الرحيم وقطع رأس الفئران وفقا لبروتوكول دراسة المعتمد.
  2. باستخدام مقص تشريح دقيق ، قم بعمل شق خط الوسط بعناية على طول فروة الرأس ، بدءا من الرقبة ويمتد نحو الخطم ، ودفع الجلد جانبا (القطع الأول).
  3. ضع شفرة المقص السفلية في الثقبة ماغنوم وشفرة المقص العلوية في الجمجمة. قطع النصف العلوي من الجمجمة حتى الأنف (القطع الثاني).
  4. أعد المقص من الرأس المقطوع جزئيا ، ثم ضع شفرة المقص السفلية في الجزء السفلي من الجمجمة ونهاية المقص العلوي عند الثقبة العظمى. قطع النصف السفلي من الرأس حتى الأنف (القطع الثالث).
    ملاحظة: من المهم أن تقطع شفرات المقص خط الوسط مباشرة وتقطع بسهولة بجهد ضئيل. سيضمن ذلك قطع شفرات المقص بين الأذن الداخلية اليمنى واليسرى.
  5. في هذه المرحلة ، ينقسم رأس الفأر إلى نصفين على طول المحور الذيلي. باستخدام ملقط ومقص ناعم ، افصل بعناية أي أنسجة رخوة تحيط بالعظم الصدغي ، مثل الدماغ والعضلات والأنسجة الضامة. تجنب إتلاف العظام أو الهياكل المحيطة.
  6. ضع أنصاف رؤوس الماوس في آبار من صفيحة 24 بئرا تحتوي على درجة حرارة الغرفة 1x PBS. بمجرد معالجة كل رأس ، قم باستبدال محلول 1x PBS بمحلول PFA بنسبة 4٪ (للتثبيت) واحتضانه لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (عادة 20 درجة مئوية).
    ملاحظة: قد يختلف وقت التثبيت اعتمادا على البروتينات التي يجب اكتشافها و / أو فعالية الارتباط للأجسام المضادة المختلفة.
  7. بعد 45 دقيقة ، اشطف المنديل لمدة 3 × 5-10 دقائق باستخدام 1x PBS.
  8. قم بتخزين العينات في 1x PBS عند 4 درجات مئوية أو انتقل إلى الخطوة التالية وقم بتشريحها. للتخزين طويل الأجل ، قم بتخزينه في 1x PBS يحتوي على 0.1٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.
  9. تخلص من أي أنسجة فئران متبقية وفقا لإرشادات المؤسسة للتخلص من المخاطر البيولوجية / الأنسجة.

2. تشريح عينة الأذن الداخلية الجنينية واليافعة (3-5 دقائق لكل عينة)

  1. حدد موقع العظم الصدغي / كبسولة الأذن الداخلية داخل نصف رأس الفأر. يحتل نفس موضع الأذن الخارجية ولكنه يقع داخل عظم الجمجمة. باستخدام ملقط ناعم ، افصل بعناية أي أنسجة رخوة تحيط بكبسولة الأذن الداخلية. بمجرد فك كبسولة الأذن الداخلية ، ابدأ في قطع الأنسجة حول كبسولة الأذن الداخلية.
  2. بمجرد تحرير كبسولة الأذن الداخلية في الغالب من أنسجة الجمجمة ، اضغط برفق على المنطقة المحيطة بكبسولة الأذن الداخلية باستخدام ملقط لتحريرها تماما.
    ملاحظة: اضغط تدريجيا لفك كبسولة الأذن الداخلية من الملحقات المحيطة بها. تجنب إتلاف كبسولة الأذن الداخلية. نظرا لأن الأذن الداخلية التي تتطور مبكرا ناعمة جدا ، تجنب الاتصال المباشر بالملقط.
  3. قم بتخزين عينات الأذن الداخلية كما في الخطوة 1.8 وتخلص من أي بقايا متبقية من أنسجة الرأس الثابتة.

3. جمع عينات الأذن الداخلية للبالغين وتشريحها (~ 75 دقيقة + 2-3 أيام من علاج EDTA)

  1. القتل الرحيم وقطع رأس الفئران وفقا لبروتوكول دراسة المعتمد.
  2. باستخدام مقص تشريح حاد ، قم بعمل شق خط الوسط بعناية على طول فروة الرأس ، بدءا من الرقبة ويمتد نحو الخطم. قم بطي الجلد للخلف لكشف الجمجمة (القطع الأول).
  3. ضع شفرة المقص السفلية في الثقبة ماغنوم وشفرة المقص العلوية في الجمجمة. قطع النصف العلوي من الجمجمة حتى الأنف (القطع الثاني).
    ملاحظة: خلال هذه الخطوة ، ستلاحظ "طحن" معتدل لشفرات المقص. هذا طبيعي.
  4. أعد المقص من الرأس المقطوع جزئيا ، ثم ضع شفرة المقص السفلية في الجزء السفلي من الجمجمة وشفرة المقص العلوية عند الثقبة العظمى. اقطع النصف السفلي من الرأس حتى الأنف (القطع الثالث) ، مع الحرص على السير يمينا على طول خط الوسط لضمان أن الشفرات تفقد الأذنين الداخلية.
    ملاحظة: لا تدفع المقص عبر الأنسجة. قد يشير هذا إلى أن الشفرات تصطدم بإحدى الأذنين الداخلية.
  5. لكل نصف رأس ، باستخدام الملقط والمقص ، افصل أي نسيج رخوة يحيط بالعظم الصدغي ، مثل الدماغ والعضلات والأنسجة الضامة.
    ملاحظة: توخي الحذر لتجنب إتلاف العظم الصدغي أو الهياكل المحيطة.
  6. مع تنظيف الأنسجة المحيطة ، قم بعمل "تجعيد عكسي" لأنسجة الجمجمة بالأصابع واستخدم الإبهام للضغط برفق على الجانب السفلي من العظم الصدغي. ضع ضغطا تدريجيا مع فك العظم من المرفقات المحيطة به.
    ملاحظة: عند الضغط ، تنفصل كبسولة الأذن الداخلية تدريجيا عن عظام الجمجمة المحيطة. مع التلاعب اللطيف ، يجب أن يخرج العظم بسهولة نسبيا.
  7. بمجرد إزالة كبسولة الأذن الداخلية ، اشطفها باستخدام 1x PBS.
  8. املأ طبق سيلجارد بنسبة 4٪ PFA وضعه تحت المجهر. ضع أذنا داخلية واحدة منبثقة في طبق سيلجارد.
  9. افحص الأذن الداخلية بحثا عن أي أنسجة أو عظم ناعم ملتصق وقم بإزالة أي منها برفق.
  10. ابحث عن النافذة البيضاوية ، وقم بإزالة الركاب برفق باستخدام الملقط.
  11. ابحث عن النافذة المستديرة واصنع حفرة صغيرة للتأكد من عدم انسداد الأنسجة المحيطة بها.
  12. افتح ثقبا صغيرا في القمة باستخدام ملقط دقيق. اغسل القوقعة بماصة P20 مملوءة بنسبة 4٪ من PFA لإصلاحها. تأكد من تصور السائل (الدم المخفف ، اللمف الباطن / اللمف) يخرج من النافذة البيضاوية.
  13. ضع القوقعة الثابتة في طبق مكون من 24 بئرا مملوءا بنسبة 4٪ من PFA. حدد الوقت. احتضن 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تحريك لطيف (هزاز أو معقد) ، ثم اشطف العينة لمدة 3 × 5-10 دقائق باستخدام محلول 1x PBS.
  14. بعد الشطف النهائي ، ضع الأنسجة في 1.25 ملي EDTA واتركها تهتز لمدة 2-3 أيام عند 4 درجات مئوية.
  15. تخلص من أنسجة الفئران المتبقية بشكل مناسب وفقا لإرشادات المؤسسة للتخلص من المخاطر البيولوجية / الأنسجة.
  16. بعد علاج EDTA ، اشطف المنديل لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام 1x PBS.
  17. قم بتخزين العينات في 1x PBS عند 4 درجات مئوية أو انتقل إلى الخطوة التالية وقم بتشريحها. للتخزين طويل الأجل ، قم بتخزين العينات في 1x PBS تحتوي على 0.1٪ أزيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.

4. تحضير عينة الأذن الداخلية للتقطيع بالتبريد (~ 24 ساعة)

  1. ضع كبسولة الأذن الداخلية التي تم تشريحها في 10٪ سكروز (في 1x PBS) واتركها تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: عندما تتوازن العينات بشكل كامل ، فإنها ستغرق في قاع الأنبوب.
  2. تخلص من محلول السكروز بنسبة 10٪ ، وأضف 20٪ سكروز في 1x PBS ، واترك ساعتين إضافيتين من الحضانة في درجة حرارة الغرفة.
  3. تخلص من محلول السكروز بنسبة 20٪ ، وأضف 30٪ سكروز في 1x PBS ، واحتضنه عند 4 درجات مئوية طوال الليل (كحد أدنى).
    ملاحظة: يمكن تقليل هذه الخطوة إلى 2 ساعة ، لكن الحضانة بين عشية وضحاها تحقق أفضل النتائج. يمكن ترك الأنسجة في أي نسبة مئوية من السكروز لفترة طويلة من الوقت.
    1. أخرج نصف محلول السكروز بنسبة 30٪ واملأ الفراغ بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT). اتركه يتأرجح لمدة 30 دقيقة على الأقل ولمدة 2 ساعة كحد أقصى.
      ملاحظة: سيؤدي ترك العينات في OCT لفترة طويلة إلى تقلص الأنسجة.
  4. انقل العينات إلى قوالب التبريد المسماة والمملوءة ب OCT.
  5. تحقق من اتجاه القوقعة الصناعية تحت المجهر في كتلة التبريد المدمجة. بالنسبة للمقاطع العرضية للقوقعة الصناعية "القياسية"، تأكد من أن الجانب المقعر من الأذن الداخلية يواجه الجوانب الضيقة للقالب بالتبريد.
  6. ضع الثلج الجاف في وعاء صغير وأضف 5-10 مل من الإيثانول أو ثنائي ميثيل البيوتان. ضع القوالب المبردة + OCT + العينة على الثلج الجاف الفقاعي لتجميد الكتلة بسرعة.
  7. قم بتخزين العينات في -80 درجة مئوية.

5. تقسيم الأذنين الداخلية (~ 25 دقيقة لكل عينة)

  1. انقل كتل التبريد إلى حجرة ناظم البرد المبرد مسبقا إلى -20 درجة مئوية. اسمح للعينات بالتوازن هناك لمدة 30-60 دقيقة.
  2. باستخدام قلم رصاص، ضع علامة على جانب الكتلة المبردة الذي يتوافق مع موضع القوقعة الصناعية لضمان الاتجاه المناسب للتقسيم.
  3. أضف مجموعة صغيرة من OCT إلى الظرف وضع الكتلة المبردة عليها ، بحيث يكون الجانب العريض (بدون علامة القلم الرصاص) لأسفل.
  4. ضع عينة الظرف + OCT + في غرفة التبريد المبردة ، مما يسمح ل OCT بالتجميد تماما. بعد بضع دقائق ، ضع الظرف + العينة على حامل الظرف مع علامة القلم الرصاص التي تشير إلى اليمين أو اليسار.
  5. قم بقص الكتلة حتى تظهر الأنسجة (استخدم 40 ميكرومتر كإعداد التشذيب).
  6. بمجرد ظهور الأنسجة ، احصد قسما بحجم 12 ميكرومتر مع شرائح مصممة للاستئصال بالتبريد وتحقق من موقع التقسيم تحت المجهر.
  7. إذا اقتربت من المنعطفات القوقعة الصناعية ، فقم بحصاد أقسام 12 ميكرومتر ، وتحقق من الموضع من حين لآخر ، حتى تجاوز جميع المنعطفات.
    ملاحظة: يمكن أن يختلف عدد الأقسام لكل شريحة ، لكننا نحصل عادة على 8-10 أقسام لكل شريحة ، وحوالي 6 شرائح لكل قوقعة.
  8. قم بتخزين الشرائح عند -80 درجة مئوية.

6. قسم تلطيخ المناعة (~ 1 - 3 أيام)

  1. قم بإزالة الشرائح من الفريزر -80 درجة مئوية واتركها تجف في الهواء لمدة 10 دقائق تقريبا.
  2. باستخدام قلم رصاص ، قم بتسمية الشرائح بالأجسام المضادة التي سيتم استخدامها.
  3. تتبع الحواف باستخدام علامة كارهة للماء (على سبيل المثال ، قلم الحاجز الكارهة للماء بيروكسيداز بيروكسيداز - مضاد للبيروكسيداز (PAP)).
  4. أعد ترطيب العينات في 1x PBS لمدة 5 دقائق.
  5. تخلص من 1x PBS من الشرائح وأضف 1x PBS + 0.1٪ Triton X-100 (0.1٪ PBSTx) إلى الشرائح لمدة 20 دقيقة للنفاذ.
  6. قم بإزالة 0.1٪ PBSTx من الشريحة وأضف 200 ميكرولتر من محلول الحجب لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يعد الحجب خطوة حاسمة في تقنيات التلوين المناعي مثل الكيمياء المناعية والتألق المناعي ، حيث يمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة بالأنسجة أو الخلايا. لمزيد من المعلومات ، راجع دليل لويس لاختيار الكواشف للتحكم والحظر27. محلول الحجب الشائع الاستخدام هو مصل الحمار العادي بنسبة 10٪ في 0.5٪ PBSTx ، ولكن هذا ينطبق فقط عند استخدام الأجسام المضادة الثانوية المشتقة من الحمار.
  7. قم بشطف سريع باستخدام 1x PBS ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية المتكون من 0.5٪ PBSTx ، واحتضن لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بالنسبة للأجسام المضادة الأولية الموضحة في الشكل 1 ، استخدم التخفيفات التالية: 1: 200 ل Plexin-B1 ، 1: 200 ل Sox2 ، 1: 1،000 لكل من Tuj1 و Myo6 و Myo7A (انظر أيضا قائمة المواد).
    ملاحظة: يتصرف كل جسم مضاد أساسي بشكل مختلف اعتمادا على خصائص ربط الحاتمة وقدرته على اختراق عينات الأنسجة.
  8. بعد العلاج بالأجسام المضادة الأولية ، اشطفها لمدة 4 × 30 دقيقة في PBSTx ، وأضف 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية المتكون من 0.5٪ PBSTx (قائمة المواد) ، واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: في بعض الأحيان قد يكون من المفيد تدوير محاليل الأجسام المضادة الثانوية بأقصى سرعة عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لتكسير أي راسب غير مرغوب فيه. إذا تم طرد المحاليل الثانوية ، فتجنب لمس قاع الأنبوب بطرف الماصة.
  9. اشطفها لمدة 4 × 30 دقيقة في PBSTx (أو اشطفها طوال الليل) ، ثم قم بتركيب الشرائح باستخدام وسيط تثبيت يساعد على منع التبييض الضوئي (على سبيل المثال ، Fluoromount).
  10. أضف غطاء بحجم مناسب بسماكة مناسبة لإعداد التصوير (على سبيل المثال ، أغطية رقم 1 ، والتي يبلغ سمكها 0.13-0.16 مم).

النتائج

نقدم أمثلة من مختبرنا الخاص على القمة والدوران القاعدي لقوقعة فأر اليوم الجنيني 16.5 (E16.5) والدوران القاعدي من يوم ما بعد الولادة 0 (P0) و P30 قوقعة. تم تقطيع هذه العينات وتلوينها المناعي باستخدام علامات لخلايا الشعر (Myo7A و Myo6) ، والخلايا العصبية العقدية الحلزونية (SGNs; Tuj1) ، الخلايا الدبقية والخلايا الداعمة (Sox2) ، و Plexin-B1 ، الذي يضع علامة على الغشاء القاعدي حول قناة القوقعة الصناعية و SGNs. تكشف المقاطع العرضية للقوقعة في مراحل النمو المختلفة عن اختلافات كبيرة في التشكل والتنظيم الخلوي ، مما يعكس نضوج القوقعة.

في E16.5 ، تكون القوقعة في مرحلة مبكرة من التطور ، حيث يبدأ عضو كورتي في التمايز. في هذه المرحلة ، بدأ تعصيب خلايا الشعر بواسطة SGNs (الشكل 1C) ، على الرغم من أن العصب لن يتم تطويره بالكامل لعدة أسابيع أخرى. سلائف خلايا الشعر يمكن التعرف عليها. خلايا الشعر الداخلية والخارجية المبكرة مرئية (الشكل 1 د). من الناحية الهيكلية ، تكون قناة القوقعة الصناعية موجودة ولكنها غير ممدودة إلى طولها الكامل للبالغين. بحلول P0 ، تكون القوقعة أكثر نضجا نسبيا. يتم تحديد قناة القوقعة الصناعية بشكل أكثر تحديدا ، مع توسع مرئي للسكالا طبلية والدهليز. يستمر تعصيب القوقعة الصناعية في التقدم ، مع وجود روابط أكثر رسوخا وتنظيما بين خلايا الشعر و SGNs (الشكل 1G) ؛ يمكن تمييز خلايا الشعر الداخلية والخارجية بسهولة (الشكل 1H).

بحلول P30 ، تصل القوقعة إلى مرحلة النضج الكامل ببعض المقاييس28 ، مع قناة القوقعة الصناعية الآن ممدودة بالكامل والهيكل بحجمها البالغ ، بما في ذلك المنعطفات القوقعة الصناعية كاملة التكوين. التعصيب العصبي مكتمل ، مع روابط دقيقة وناضجة بين الخلايا العصبية العقدية الحلزونية وخلايا الشعر (الشكل 1 ك). كما أن عضو كورتي ناضج تماما ، مع خلايا شعر داخلية وخارجية منفصلة بشكل واضح وتعمل بكامل طاقتها (الشكل 1L) وخلايا داعمة متمايزة تماما (الشكل 1J).

figure-results-2096
الشكل 1: عمليات القطع بالتبريد للقوقعة الصناعية الملطخة بالمناعة من الفئران E16.5 و P0 و P30. (A-D) قاعدة الفأر E16.5 ومنعطفات القمة. (E-H) P0 و (I-L) P30 قوقعة صناعية الفأر يتحول القاعدي. (أ ، ه ، أنا) صور مدمجة للتلطيخ المناعي الثلاثي للعينات. (ب ، و) يظهر تعبير Plexin-B1 في E16.5 و P0 cochleae تلطيخا قويا للغشاء القاعدي (السهم) وتلوين الخلايا الظهارية الخافتة SGN والقوقعة. (ج ، ز ، ك) يتم توطين Tuj1 (beta-III-tubulin) إلى SGNs طوال فترة تطورها ويظل مرئيا عند P30. (J) يتم التعبير عن Sox2 بواسطة الخلايا الدبقية حول SGNs والخلايا الداعمة في ظهارة القوقعة. (د ، ح) يتم التعبير عن Myo6 بواسطة خلايا الشعر الداخلية والخارجية عند P0. (L) Myo7A يتم التعبير عنه بواسطة خلايا الشعر الداخلية والخارجية عند P30. تشير الأسهم إلى الخلايا التي تعبر عن العلامات التمثيلية لكل لوحة. تم الحصول على 20x صورة باستخدام مجهر متحد البؤر Zeiss LSM 880 مع هدف Plan-Apochromat 20x / 0.8 M27. تم استخدام خطوط الليزر عند 488 نانومتر و 561 نانومتر و 633 نانومتر لإثارة Alexa Fluor 488 و Cy3 و Cy5 على التوالي. تم التقاط الصور بدقة 1,024 × 1,024 بكسل ، ومتوسط خطين ، وحجم ثقب واحد من وحدة Airy. تم إجراء تصوير Z-stack ، حيث التقط 10 أقسام بصرية بدقة 8 بت. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المشاكل الشائعةالأسباب المحتملة
1. المقاطع العرضية التالفة·         قد تكون الأنسجة قد تضررت أثناء التشريح.
·         يمكن أن يؤدي علاج EDTA غير المكتمل للعينات العظمية القديمة إلى تلف الأنسجة أثناء القطع.
·         يمكن أن يؤدي إزاحة الغطاء أثناء التركيب أو بعده إلى إتلاف الأنسجة.
·         يمكن أن يؤدي استخدام شفرة باهتة إلى إتلاف الأنسجة.
2. أقسام تتدحرج·         قد تنقلب الأقسام إذا تم استخدام تقنيات تجميع غير صحيحة.
·         قد تكون درجة حرارة غرفة التبريد و / أو الرطوبة دون المستوى الأمثل.
·         يمكن أن يؤدي الوضع غير الصحيح للوحة المضادة للانزلاق بالنسبة للشفرة إلى تدحرج الأقسام ، والتي يمكن ضبطها بواسطة مسامير على اللوحة المضادة للانزلاق.
3. تلطيخ غير مرئي·         قد لا يكون التلوين مرئيا إذا كان تركيز الجسم المضاد الأولي أو الثانوي منخفضا جدا.
·         أوقات التثبيت دون المستوى الأمثل لمجموعة معينة من الحاتمة / الأجسام المضادة.
·         خطأ في سحب السراقة.
4. يظهر التلوين الكثير من ضوضاء الخلفية·         يمكن أن يؤدي استخدام تركيز عال من الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية إلى خلفية مفرطة.
·         يمكن أن يؤدي حل الحجب السيئ إلى ربط غير محدد وزيادة الخلفية.
·         قد يؤدي التفاعل المتبادل للأجسام المضادة أيضا إلى خلفية مفرطة.

الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

Discussion

هناك عدة خطوات رئيسية لنجاح التشريح بالتبريد والتلوين المناعي. يعد التثبيت الصحيح لأنسجة القوقعة الصناعية أمرا ضروريا ، كما أن مدة التثبيت مهمة أيضا ، والتي يمكن أن تختلف اعتمادا على الجسم المضاد. في حين أن معظم الأجسام المضادة تعمل بشكل أفضل مع وقت تثبيت أقصر ، مثل 45 دقيقة في PFA ، يمكن لبعض الحلقات المستهدفة أن تتحمل التثبيت بين عشية وضحاها. بناء على تجربتنا ، يضمن التثبيت لمدة 45 دقيقة الحفظ الكافي ومتوافق مع معظم الأجسام المضادة الأولية المستخدمة بشكل شائع للبحث باستخدام مستحضرات القوقعة الصناعية. عند استكشاف أخطاء التلوين المناعي وإصلاحها (انظر الجدول 1) ، يجب مراعاة أوقات تثبيت مختلفة. في حين أن التقطيع بالتبريد يوفر العديد من المزايا ، مثل تحديد أنواع معينة من الخلايا ، ويمكن أن يساعد في حل بعض التفاصيل الهيكلية بشكل أفضل (على سبيل المثال ، غشاء رايسنر ، والأوعية الدموية ، و modiolus) ، فإن الحوامل الكاملة مفيدة للحفاظ على أي نوع من السياق ثلاثي الأبعاد والعلاقات المكانية داخل الأنسجة29. بالإضافة إلى ذلك ، توفر الاستعدادات الكاملة (غير الثابتة) فرصا لدراسة القوقعة كإعداد حي لمراقبة أشياء مثل الديناميكيات الخلوية30 و Ca2 + العابرين31.

واحدة من أكبر مزايا التقطيع بالتبريد لقوقعة الفأر هي العدد الكبير من التحليلات الكمية التي يمكن إجراؤها. على سبيل المثال ، يعد التشريح بالتبريد ممتازا لقياس مستويات شدة التألق بعد اكتشاف الأجسام المضادة (على سبيل المثال ، انظر32،33،34). يولد عمق الأنسجة المحدود البالغ 12 ميكرومتر تشتت أقل للضوء مقارنة بالمستحضرات الكاملة. لفحص SGN أو كثافة الخلايا الأخرى ، يفضل استخدام المقاطع العرضية (على سبيل المثال ، انظر25،35) على الحوامل بأكملها لأن المقاطع تتم عادة على طول المستوى المتعامد مع المحور الطولي للقوقعة ، مما يسمح بالتصور الواضح لنوى الخلية داخل مقصورات أنسجة معينة. وبالمثل ، فإن قياس مورفولوجيا الهياكل مثل الغشاء الصدري أو السطور الوعائي أو scala tympani / media / vestibuli يتم إجراؤه بسهولة باستخدام المقاطع العرضية (على سبيل المثال ، انظر36،37).

يعد اختيار طريقة التقسيم المناسبة أمرا بالغ الأهمية للتحليل الدقيق. يعد تضمين البارافين طريقة شائعة أخرى لتضمين الأنسجة قبل التقسيم. تتضمن أقسام البارافين تضمين الأنسجة في الشمع ، مما يوفر ثباتا بدنيا ممتازا ويحافظ على مورفولوجيا الأنسجة بأقل قدر من الضرر. ومع ذلك ، يمكن أن تحد عملية تسلل الشمع من توافقها مع بعض طرق التلوين. في المقابل ، يمكن أن يحافظ القطع بالتبريد على بروتينات وهياكل خلوية معينة بشكل أفضل لتحليلات معينة ولكنها قد تؤدي إلى أقسام أقل استقرارا وتلف محتمل للأنسجة38. يعد فهم نقاط القوة والقيود في كل تقنية أمرا ضروريا لاختيار أفضل نهج لأسئلة البحث.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

تم دعم M.A.D. و TMC من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة 5R01DC016595-07 (إلى TMC) و 5R01DC018040-05 (مايكل دينز ، جامعة يوتا ، PI). تم إنشاء أمثلة على الصور المجهرية في الشكل 1A-H بواسطة الدكتور كايدي تشانغ.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Triton X-100Thermo Fisher Scientific, Inc.BP151-500
PBSCorning, Inc.46-013-CM
EDTASigma-Aldrich, LLC.60-00-4
Sucrose VWR International, Inc.97061-432
Sodium azide Amresco, Inc.0639-250G
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15714
EthanolDecon labs, Inc.v1001
Dimethylbutane Thermo Fisher Scientific, Inc.19387-AP
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)VWR International, Inc.25608-930
Specific equipment
CryostatThermo Fisher Scientific, Inc.14-071-459
Disection forcepsElectron Microscopy Sciences72700-DZ
Hydrophobic Barrier Peroxidase-Antiperoxidase Pen (PAP) Vector Laboratories, Inc.H-4000
Confocal MicroscopeCarl Zeiss Microscopy, LLC.LSM 880
P20 micropipetteGilson, Inc.F144056M
Dissection scissorsThermo Fisher Scientific, Inc.08-951-20
Sylgard dishElectron Microscopy Sciences24236-10
CentrifugeEppendorf5424R
Mounting Materials
FluoromountElectron Microscopy Sciences17984-25
Superfrost plus slidesThermo Fisher Scientific, Inc.1255015
Immunostaining Reagents
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch, Inc.017-000-121
Anti-mouse FAB fragments Jackson ImmunoResearch, Inc.715-007-003
BlokHenAves labs, Inc.BH-1001
Tuj1 (beta-III-tubulin) mouse monoclonal antibodyBiolegend, Inc.MMS-435P
Sox2 goat polyclonal antibodyR&D Systems, Inc.AF2018
Myo6 rabbit polyclonal antibodyProteus Biosciences25–6791
Myo7A rabbit polyclonal antibodyThermo Fisher Scientific, Inc.PA1-936
Plexin-B1 goat polyclonal antibodyR&D Systems, Inc.AF3749
Secondary antibodies (made in donkey; Alexa-488, Cy3, Cy5)Jackson ImmunoResearch, Inc.see catalog

References

  1. Bainbridge, K. E., Hoffman, H. J., Cowie, C. C. Diabetes and hearing impairment in the United States: Audiometric evidence from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999 to 2004 . Ann Intern Med. 149 (1), 1-10 (1999).
  2. Baiduc, R. R., Helzner, E. P. Epidemiology of diabetes and hearing loss. Semin Hear. 40 (4), 281-291 (2019).
  3. Agarwal, S., Mishra, A., Jagade, M., Kasbekar, V., Nagle, S. K. Effects of hypertension on hearing. Indian J Otolaryngol Head Neck Surg. 65 (Suppl 3), 614-618 (2013).
  4. Przewoźny, T., Gójska-Grymajło, A., Kwarciany, M., Gąsecki, D., Narkiewicz, K. Hypertension and cochlear hearing loss. Blood Press. 24 (4), 199-205 (2015).
  5. Babarinde, J. A., Adeyemo, A. A., Adeoye, A. M. Hearing loss and hypertension: exploring the linkage. The Egyptian Journal of Otolaryngology. 37 (1), 1-6 (2021).
  6. Mijovic, T., Zeitouni, A., Colmegna, I. Autoimmune sensorineural hearing loss: the otology-rheumatology interface. Rheumatology (Oxford). 52 (5), 780-789 (2013).
  7. Mancini, P., et al. Hearing loss in autoimmune disorders: Prevalence and therapeutic options. Autoimmun Rev. 17 (7), 644-652 (2018).
  8. Persson, F., Bjar, N., Hermansson, A., Gisselsson-Solen, M. Hearing loss after bacterial meningitis, a retrospective study. Acta Otolaryngol. 142 (3-4), 298-301 (2022).
  9. Kutz, J. W., Simon, L. M., Chennupati, S. K., Giannoni, C. M., Manolidis, S. Clinical predictors for hearing loss in children with bacterial meningitis. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 132 (9), 941-945 (2006).
  10. Li, S., et al. Hearing loss in neurological disorders. Front Cell Dev Biol. 9, 716300 (2021).
  11. Shen, Y., et al. Cognitive decline, dementia, Alzheimer's disease and presbycusis: Examination of the possible molecular mechanism. Front Neurosci. 12, 12 (2018).
  12. Profant, O., et al. Auditory dysfunction in patients with Huntington's disease. Clin Neurophysiol. 128 (10), 1946-1953 (2017).
  13. Jafari, Z., Kolb, B. E., Mohajerani, M. H. Auditory dysfunction in Parkinson's disease. Mov Disord. 35 (4), 537-550 (2020).
  14. Rybak, L. P., Ramkumar, V. Ototoxicity. Kidney Int. 72 (8), 931-935 (2007).
  15. Demirhan, M. A., Celebisoy, N. Cognitive functions in episodic vestibular disorders: Meniere's disease and vestibular migraine. J Vestib Res. 33 (1), 63-70 (2023).
  16. Shoham, N., Lewis, G., Favarato, G., Cooper, C. Prevalence of anxiety disorders and symptoms in people with hearing impairment: a systematic review. Soc Psychiatry Psychiatr Epidemiol. 54 (6), 649-660 (2019).
  17. Manley, G. A., Manley, G. A., Gummer, A. W., Popper, A. N., Fay, R. R. The cochlea: What it is, where it came from, and what is special about it. Understanding the Cochlea. Springer Handbook of Auditory Research. 62, 17-32 (2017).
  18. Bai, J., et al. Three-dimensionally visualized ossification and mineralization process of the otic capsule in a postnatal developmental mouse. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 8 (4), 1036-1043 (2023).
  19. Dabdoub, A., et al. Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18396-18401 (2008).
  20. Mann, Z. F., Chang, W., Lee, K. Y., King, K. A., Kelley, M. W. Expression and function of scleraxis in the developing auditory system. PLoS One. 8 (9), e75521 (2013).
  21. Wang, Z., et al. The purinergic receptor P2rx3 is required for spiral ganglion neuron branch refinement during development. eNeuro. 7 (4), (2020).
  22. Matern, M., et al. Gfi1Cre mice have early onset progressive hearing loss and induce recombination in numerous inner ear non-hair cells. Sci Rep. 7, 42079 (2017).
  23. Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea. Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).
  24. Zhang, K. D., Coate, T. M. Recent advances in the development and function of type II spiral ganglion neurons in the mammalian inner ear. Semin Cell Dev Biol. 65, 80-87 (2017).
  25. Brooks, P. M., et al. Pou3f4-expressing otic mesenchyme cells promote spiral ganglion neuron survival in the postnatal mouse cochlea. J Comp Neurol. 528 (12), 1967-1985 (2020).
  26. Zhang, Y., et al. Pericytes control vascular stability and auditory spiral ganglion neuron survival. Elife. 12, e83486 (2023).
  27. Lewis, M. . A guide to selecting control and blocking reagents. , (2018).
  28. Song, L., McGee, J., Walsh, E. J. Frequency-and level-dependent changes in auditory brainstem responses (ABRS) in developing mice. J Acoust Soc Am. 119 (4), 2242-2257 (2006).
  29. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole-mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), e53561 (2016).
  30. Driver, E. C., Northrop, A., Kelley, M. W. Cell migration, intercalation and growth regulate mammalian cochlear extension. Development. 144 (20), 3766-3776 (2017).
  31. Babola, T. A., et al. Purinergic signaling controls spontaneous activity in the auditory system throughout early development. J Neurosci. 41 (4), 594-612 (2021).
  32. Donadieu, E., et al. Improved cryosections and specific immunohistochemical methods for detecting hypoxia in mouse and rat cochleae. Acta Histochem. 109 (3), 177-184 (2007).
  33. Rio, C., Dikkes, P., Liberman, M. C., Corfas, G. Glial fibrillary acidic protein expression and promoter activity in the inner ear of developing and adult mice. J Comp Neurol. 442 (2), 156-162 (2002).
  34. Ahmad, S., Chen, S., Sun, J., Lin, X. Connexins 26 and 30 are co-assembled to form gap junctions in the cochlea of mice. Biochem Biophys Res Commun. 307 (2), 362-368 (2003).
  35. Li, X., et al. Spag6 mutant mice have defects in development and function of spiral ganglion neurons, apoptosis, and higher sensitivity to paclitaxel. Sci Rep. 7 (1), 8638 (2017).
  36. Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
  37. Goodyear, R. J., et al. Accelerated age-related degradation of the tectorial membrane in the Ceacam16βgal/βgal null mutant mouse, a model for late-onset human hereditary deafness DFNB113. Front Mol Neurosci. 12, 147 (2019).
  38. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section. Protoplasma. 254 (5), 1931-1939 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 218

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved