Криосекция и иммуноокрашивание тканей внутреннего уха мыши: от эмбриональной до взрослой стадии

Этот протокол, предназначенный для начинающих пользователей тканей внутреннего уха мышей, всесторонне детализирует этапы обработки внутренних ушей мышей на разных стадиях развития для иммуноокрашивания.

В этом протоколе подробно описаны методы общей гистологии для подготовки образцов внутреннего уха эмбриональных, неонатальных и взрослых мышей. Цель этого протокола состоит в том, чтобы предоставить простой и стандартизированный метод обработки тканей внутреннего уха для исследователей, возможно, новичков в этой области, заинтересованных в работе с улиткой мыши. Сюда включены протоколы диссекции, фиксации, встраивания, криосекции и иммуноокрашивания. Секционное иммуноокрашивание является одним из лучших методов исследования отдельных клеток в контексте всей улитки.

Ключевые этапы включают в себя рассечение внутреннего уха в стороне от черепа, фиксацию ткани с помощью 4% параформальдегида, встраивание с помощью компаунда оптимальной температуры резки, криосекцию и иммуноокрашивание антителами, нацеленными на специфические белки, экспрессируемые улиткой.

В наши методы включены особые соображения, сделанные для улитки, учитывая ее
форма и структура. Необходимы достаточно хорошие навыки фокусировки и препарирования, так как повреждение тканей может повлиять на качество иммуноокрашивания и однородность образцов. Тем не менее, с помощью описанных нами процедур большинство пользователей могут быть обучены за несколько недель делать прекрасные приготовления. В целом, этот протокол предлагает ценный способ продвижения исследований для понимания слухового развития, функций и заболеваний на мышиных моделях.

Понимание слухового развития и функций имеет решающее значение для характеристики и лечения различных форм тугоухости. Факторы риска потери слуха многочисленны и включают диабет ^1,2, гипертонию ^3,4,5, аутоиммунные заболевания ^6,7, бактериальный менингит ^8,9 и некоторые нейродегенеративные расстройства 10,11,12,13. Кроме того, некоторые лекарства, такие как некоторые антибиотики и химиотерапевтические препараты, также могут негативно влиять на слух¹⁴. Помимо непосредственных проблем со слуховыми нарушениями, потеря слуха может негативно влиять на когнитивные функции и усиливать тревогу и стресс, что может коррелировать с когнитивными нарушениями и ухудшением психического здоровья 11,15,16. Публикуя этот протокол, мы стремимся устранить любые барьеры для входа в слуховые исследования, особенно для тех, кто не имеет предварительного опыта работы с улиткой. В этом руководстве объясняется, как подготовить образцы внутреннего уха эмбриональных, ювенильных (неонатальных) и взрослых мышей. Цель этого протокола — обеспечить простой подход к обработке тканей внутреннего уха, обеспечивая воспроизводимость и согласованность между экспериментами. Секционное иммуноокрашивание является одним из лучших методов исследования различных типов клеток в контексте всей улитки; В других обстоятельствах иммуноокрашивание в целую монтировку может быть более предпочтительным (например, изучение морфологии стереоцилий волосковых клеток или локализации белка).

Обоснование этого связано с трудностями при работе с улиткой мыши. Его небольшой размер, уникальная спираль и нежная структура¹⁷ требуют специализированных методов точной диссекции, фиксации, встраивания, криосекции и иммуноокрашивания. Спиралевидная форма улитки означает, что встраивание требует тщательного внимания к ориентации, чтобы гарантировать сохранение каждого поворота улитки, что имеет решающее значение для получения однородных секций. Кроме того, по мере созревания улитки она подвергается оссификации¹⁸, что означает, что она постепенно трансформируется в кость, что может затруднить сохранение тканей и потребовать декальцинации. Криосекционное иммуноокрашивание имеет ряд преимуществ по сравнению с альтернативными препаратами (например, иммуноокрашивание целиком). Ключевыми преимуществами криосекции являются общая сохранность белков и нуклеиновых кислот, а относительно тонкие, ~2D-срезы позволяют проводить последовательные и точные измерения. Кроме того, это позволяет сохранять и визуализировать все типы кохлеарных клеток, а также может улучшить качество иммуноокрашивания. В отличие от многих препаратов кохлеарного аппаратного крепления, криосекция сохраняет структуры, включая спиральную связку, сосудистую полоску, мембрану Рейсснера и текториальную мембрану. В следующих предыдущих публикациях приведены примеры высококачественного секционного иммуноокрашивания эмбрионального 19,20,21, неонатального ^22,23,24 и взрослого ^25,26 внутреннего уха.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все описанные здесь методы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Джорджтаунского университета. Все мыши в этом исследовании содержались в соответствии с требованиями Комитета по уходу за животными и их использованию Джорджтаунского университета (протокол #1147). В первую послеродовую неделю, поскольку височные костные структуры не полностью развиты, декальцинация не требуется. Тем не менее, улитки от мышей в возрасте P6 и старше требуют декальцификации и другого метода диссекции. В нашем протоколе использовались самцы и самки мышей NCI Cr:NIH(S) (NIH Swiss), а также E16.5, P0 и P30. Для каждого раздела мы отмечаем в скобках, сколько времени займет каждый шаг для новичков. Многие шаги станут быстрее с практикой.

1. Забор образцов эмбрионального и ювенильного внутреннего уха (~75 мин)

1. Усыпляйте и обезглавливайте мышей в соответствии с утвержденным протоколом исследования на животных.
2. С помощью тонких ножниц для рассечения осторожно сделайте разрез по средней линии вдоль волосистой части головы, начиная от шеи и продолжая по направлению к рыле, отодвигая кожу в стороны (первый разрез).
3. Поместите нижнее лезвие ножниц в большое затылочное отверстие, а верхнее лезвие ножниц - в череп. Разрежьте верхнюю половину черепной коробки до носа (второй надрез).
4. Вытащите ножницы из частично надрезанной головки, затем поместите нижнее лезвие ножниц в нижнюю часть черепа, а верхние ножницы заканчиваются в большом затылочном отверстии. Разрежьте нижнюю половину головы до носа (третий надрез).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы лезвия ножниц прорезали прямо через среднюю линию и легко резались без особых усилий. Это гарантирует, что лезвия ножниц будут резать прямо между левым и правым внутренним ухом.
5. В этом месте голова мыши делится пополам по рострально-каудальной оси. С помощью тонких щипцов и ножниц осторожно отделите все мягкие ткани, окружающие височную кость, такие как мозг, мышцы и соединительная ткань. Избегайте повреждения кости или окружающих структур.
6. Поместите полуголовки мыши в лунки 24-луночного планшета с комнатной температурой 1x PBS. После обработки каждой головки замените 1x PBS раствор на 4% раствор PFA (для фиксации) и инкубируйте в течение 45 минут при комнатной температуре (обычно 20 °C).
   Примечание: Время фиксации может варьироваться в зависимости от белков, которые необходимо обнаружить, и/или эффективности связывания различных антител.
7. Через 45 минут прополощите салфетку в течение 3 x 5-10 минут 1x PBS.
8. Храните образцы в 1x PBS при температуре 4 °C или перейдите к следующему шагу и препарируйте их. Для длительного хранения хранить в 1x PBS, содержащем 0,1% азида натрия при температуре 4 °C.
9. Утилизируйте все оставшиеся ткани мыши в соответствии с рекомендациями учреждения по биологической опасности/утилизации тканей.

2. Вскрытие образца эмбрионального и ювенильного внутреннего уха (3 - 5 мин каждый образец)

1. Найдите капсулу височной кости/внутреннего уха в полуголове мыши. Он занимает то же положение, что и наружное ухо, но расположен внутри кости черепа. С помощью тонких щипцов осторожно отсоедините все мягкие ткани, окружающие капсулу внутреннего уха. Как только капсула внутреннего уха будет ослаблена, начните разрезать ткань вокруг капсулы внутреннего уха.
2. После того, как капсула внутреннего уха будет в значительной степени освобождена от тканей черепа, осторожно надавите на окружающую область капсулы внутреннего уха с помощью щипцов, чтобы полностью освободить ее.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Надавливайте постепенно, чтобы освободить капсулу внутреннего уха от окружающих ее насадок. Не повреждайте капсулу внутреннего уха. Поскольку раннее внутреннее ухо довольно мягкое, избегайте прямого контакта с щипцами.
3. Храните образцы внутреннего уха, как описано в шаге 1.8, и выбросьте остатки мусора из неподвижной ткани головы.

3. Забор и вскрытие образцов внутреннего уха у взрослых (~75 мин + 2 - 3 дня лечения ЭДТА)

1. Усыпляйте и обезглавливайте мышей в соответствии с утвержденным протоколом исследования на животных.
2. С помощью острых ножниц для рассечения осторожно сделайте разрез по средней линии вдоль волосистой части головы, начиная от шеи и продолжая по направлению к рыле. Отогните кожу, чтобы обнажить череп (первый разрез).
3. Поместите нижнее лезвие ножниц в большое затылочное отверстие, а верхнее лезвие ножниц - в череп. Разрежьте верхнюю половину черепной коробки до носа (второй надрез).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого шага вы заметите умеренное «хрустение» лезвий ножниц; Это нормально.
4. Вытащите ножницы из частично надрезанной головки, затем поместите нижнее лезвие ножниц в нижнюю часть черепа, а верхнее лезвие ножниц в большое затылочное отверстие. Разрежьте нижнюю половину головы до носа (третий разрез), стараясь осторожно идти прямо по средней линии, чтобы лезвия не попали во внутренние уши.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не проталкивайте ножницы через ткань; Это может указывать на попадание лезвий в одно из внутренних ушей.
5. Для каждой половины головы с помощью щипцов и ножниц отделите все мягкие ткани, окружающие височную кость, такие как мозг, мышцы и соединительная ткань.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы не повредить височную кость или окружающие структуры.
6. Очистив окружающую ткань, «согните» ткань черепа пальцами и большим пальцем мягко надавите на нижнюю часть височной кости. Надавливайте постепенно, освобождая кость от окружающих ее прикреплений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При надавливании капсула внутреннего уха постепенно отделяется от окружающих костей черепа. При аккуратных манипуляциях кость должна относительно легко выскочить наружу.
7. После того, как капсула внутреннего уха будет удалена, промойте ее 1x PBS.
8. Наполните чашку для силгарда 4% PFA и поместите ее под микроскоп. Поместите одно выпуклое внутреннее ухо в форму для сильгарда.
9. Осмотрите внутреннее ухо на наличие прикрепленных мягких тканей или костей и аккуратно удалите их.
10. Найдите овальное окно, и аккуратно снимите стремечко щипцами.
11. Найдите круглое окно и проделайте небольшое отверстие, чтобы убедиться, что окружающие ткани не засоряют его.
12. Откройте небольшое отверстие в верхушке тонкими щипцами. Промойте улитку пипеткой P20, наполненной 4% PFA для фиксации. Обязательно визуализируйте жидкость (разбавленную кровь, эндолимфу/перилимфу), выходящую из овального окна.
13. Поместите неподвижную улитку в 24-луночный планшет, заполненный 4% PFA. Отметьте время. Инкубируйте 30-60 минут при комнатной температуре с легким перемешиванием (коромысло или нутатор), затем промойте образец в течение 3 x 5-10 минут 1x раствором PBS.
14. После окончательного полоскания поместите салфетку в 1,25 мМ ЭДТА и дайте ей покачаться в течение 2-3 дней при температуре 4 °C.
15. Утилизируйте оставшуюся мышиную ткань надлежащим образом в соответствии с рекомендациями учреждения по биологической опасности/утилизации тканей.
16. После процедуры ЭДТА прополощите салфетку в течение 3 x 5 минут 1x PBS.
17. Храните образцы в 1x PBS при температуре 4 °C или перейдите к следующему шагу и препарируйте их. Для длительного хранения образцы следует хранить в 1x PBS, содержащем 0,1% азида натрия, при температуре 4 °C.

4. Подготовка образца внутреннего уха для криосекции (~24 ч)

1. Поместите рассеченную капсулу внутреннего уха в 10% сахарозу (в 1x PBS) и дайте ей инкубироваться при комнатной температуре в течение минимум 2 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда образцы полностью уравновесятся, они опустятся на дно пробирки.
2. Выбросьте 10% раствор сахарозы, добавьте 20% сахарозы в 1x PBS и дайте еще 2 часа инкубации при комнатной температуре.
3. Выбросьте 20% раствор сахарозы, добавьте 30% сахарозы в 1x PBS и инкубируйте при 4 °C в течение ночи (минимум).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап можно сократить до 2 часов, но ночная инкубация дает наилучшие результаты. Ткань можно оставлять в любом процентном соотношении сахарозы на длительное время.
   1. Выньте половину 30% раствора сахарозы и заполните пространство составом для оптимальной температуры резки (OCT). Дайте ему покачаться минимум 30 минут и максимум 2 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если оставить образцы в ОКТ на длительное время, это приведет к уменьшению ткани.
4. Перенесите образцы в помеченные криоформы, заполненные ОКТ.
5. Проверьте ориентацию улитки под микроскопом во встроенном криоблоке. Для «стандартных» поперечных сечений улитки убедитесь, что вогнутая сторона внутреннего уха обращена к узким сторонам криоформы.
6. Поместите сухой лед в небольшую емкость и добавьте 5-10 мл этанола или диметилбутана. Поместите криоформы + ОКТ + образец на бурлящий сухой лед, чтобы быстро заморозить блок.
7. Храните образцы при температуре -80 °C.

5. Секция внутреннего уха (~25 мин на образец)

1. Перенесите криоблоки в камеру криостата, предварительно охлажденную до -20 °C. Дайте образцам сбалансироваться в течение 30-60 минут.
2. С помощью карандаша отметьте сторону криоблока, которая соответствует положению улитки, чтобы обеспечить правильную ориентацию для секционирования.
3. Добавьте небольшую лужу ОКТ в патрон и поместите на нее криоблок широкой стороной (без карандашной пометки) вниз.
4. Поместите патрон + ОКТ + образец в охлажденную криостатную камеру, дав ОКТ полностью замерзнуть. Через несколько минут поместите патрон + образец на держатель патрона так, чтобы отметка карандашом указывала вправо или влево.
5. Обрежьте блок до тех пор, пока ткань не станет очевидной (используйте 40 μм в качестве настройки обрезки).
6. Как только ткань станет очевидной, соберите срез размером 12 мкм со предметными стеклами, предназначенными для криосекции, и проверьте место среза под микроскопом.
7. При приближении к поворотам улитки собирайте срезы 12 мкм, время от времени проверяя положение, до тех пор, пока не пройдут все обороты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество секций на слайде может варьироваться, но обычно мы получаем 8-10 секций на слайде и около 6 слайдов на улитку.
8. Хранить предметные стекла при температуре -80 °C.

6. Иммуноокрашивание срезов (~1 - 3 дня)

1. Выньте предметные стекла из морозильной камеры при температуре -80 °C и дайте им высохнуть на воздухе в течение примерно 10 минут.
2. С помощью карандаша подпишите на предметных стеклах антитела, которые будут использоваться.
3. Обведите края с помощью гидрофобного маркера (например, Hydrophobic Barrier Peroxidaza-Antiperoxidase Pen (PAP)).
4. Регидратируйте образцы в 1x PBS в течение 5 минут.
5. Выбросьте 1x PBS со слайдов и добавьте 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (0,1% PBSTx) на слайды на 20 минут для проникновения.
6. Удалите 0,1% PBSTx со стекла и добавьте 200 μл блокирующего раствора для инкубации в течение 1-2 часов при комнатной температуре.
   Блокирование является важным этапом в методах иммуноокрашивания, таких как иммуногистохимия и иммунофлуоресценция, где оно предотвращает неспецифическое связывание антител с тканями или клетками. Для получения дополнительной информации см. руководство Льюиса по выбору реагентов для контроля и блокировки²⁷. Обычно используемым блокирующим раствором является 10% Normal Donkey Serum в 0,5% PBSTx, но это применимо только в том случае, если используются вторичные антитела, полученные из осла.
7. Проведите быстрое полоскание с помощью 1x PBS, добавьте 200 μL раствора первичного антитела, состоящего из 0,5% PBSTx, и инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C. Для первичных антител, показанных на рисунке 1, используйте следующие разведения: 1:200 для Plexin-B1, 1:200 для Sox2, 1:1000 для Tuj1, Myo6 и Myo7A (см. также Список материалов).
   Примечание: Каждое первичное антитело ведет себя по-разному в зависимости от характеристик связывания эпитопов и способности проникать в образцы тканей.
8. После обработки первичными антителами промыть в PBSTx в течение 4 x 30 минут, добавить 200 мкл раствора вторичного антитела, состоящего из 0,5% PBSTx (Список материалов), и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда может быть полезно вращать растворы вторичных антител на полной скорости при 4 °C в течение 30 минут, чтобы гранулировать любой нежелательный осадок. Если вторичные растворы были центрифугированы, не прикасайтесь наконечником пипетки к дну пробирки.
9. Промойте в течение 4 x 30 минут в PBSTx (или промойте на ночь), затем установите слайды с помощью монтажного материала, который помогает предотвратить фотообесцвечивание (например, Fluoromount).
10. Добавьте покровное стекло подходящего размера с толщиной, подходящей для установки изображения (например, покровное стекло No 1 толщиной 0,13-0,16 мм).

Мы представляем примеры из нашей собственной лаборатории вершины и базального поворота улитки эмбриона на 16,5-й день (E16.5) и базального поворота на постнатальный день 0 (P0) и улитки P30. Эти образцы были срезаны и иммуноокрашены с использованием маркеров для волосковых клеток (Myo7A и Myo6), спиральных ганглиозных нейронов (SGN; Tuj1), глия и опорные клетки (Sox2) и Plexin-B1, которым маркируется базальная мембрана вокруг улиткового протока и SGN. Поперечные срезы улитки на разных стадиях развития показывают значительные различия в морфологии и клеточной организации, отражающие созревание улитки.

В точке E16.5 улитка находится на ранней стадии развития, при этом орган корти начинает дифференцироваться. На этой стадии начинается иннервация волосковых клеток SGN (рисунок 1C), хотя нерв не будет полностью развит в течение еще нескольких недель. Предшественники волосковых клеток идентифицируемы; видны ранние внутренние и наружные волосковые клетки (Рисунок 1D). Структурно улитковый проток присутствует, но не удлинен до полной длины взрослого человека. К P0 улитка сравнительно более зрелая. Кохлеарный проток более выражен, с видимым расширением скала тимпани и вестибули. Кохлеарная иннервация продолжает прогрессировать, с более установленными и организованными связями между волосковыми клетками и SGN (рис. 1G); внутренние и наружные волосковые клетки легко различимы (рисунок 1H).

К P30 улитка достигает полной зрелости по некоторым показателям²⁸, при этом кохлеарный проток теперь полностью удлинен, а структура соответствует взрослому размеру, включая полностью сформированные повороты улитки. Нейронная иннервация является полной, с четкими и зрелыми связями между нейронами спирального ганглия и волосковыми клетками (рис. 1K). Кортиевый орган также является полностью зрелым, с четко разделенными и полностью функциональными внутренними и внешними волосковыми клетками (Рисунок 1L) и полностью дифференцированными поддерживающими клетками (Рисунок 1J).

Рисунок 1: Иммуноокрашенные криосекции улитки у мышей E16.5, P0 и P30. (A-D) E16.5 основания и верхушки мыши. (Э-Х) P0 и (I-L) P30 базальные повороты улитки мыши. (А,Е,И) Объединенные изображения тройного иммунофлуоресцентного окрашивания образцов. (В,Ж) Экспрессия плексина-B1 в улитках E16.5 и P0 характеризуется сильным окрашиванием базальной мембраны (стрелка) и слабым окрашиванием SGN и эпителиальных клеток улитки. (К,Г,К) Tuj1 (бета-III-тубулин) локализуется в SGN на протяжении всего их развития и остается видимым на уровне P30. (J) Sox2 экспрессируется глией вокруг SGN и опорных клеток в эпителии улитки. (Д,Н) Myo6 экспрессируется внутренними и наружными волосковыми клетками на уровне P0. (L) Myo7A экспрессируется внутренними и наружными волосковыми клетками в точке P30. Стрелки указывают на ячейки, выражающие репрезентативные маркеры для каждой панели. 20-кратные изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM 880 с объективом Plan-Apochromat 20x/0.8 M27. Лазерные линии на длинах волн 488 нм, 561 нм и 633 нм использовались для возбуждения Alexa Fluor 488, Cy3 и Cy5 соответственно. Изображения были сняты с разрешением 1024 x 1024 пикселей, двумя средними линиями и размером отверстия 1 единица Эйри. Была выполнена визуализация Z-стека, захватившая 10 оптических участков с 8-битным разрешением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Устранение неполадок.

Существует несколько ключевых этапов для успешной криосекции и иммуноокрашивания. Правильная фиксация ткани улитки имеет важное значение, а также важна продолжительность фиксации, которая может варьироваться в зависимости от антител. В то время как большинство антител работают лучше при более коротком времени фиксации, например, 45 минут в PFA, некоторые эпитопы-мишени могут переносить ночную фиксацию. Исходя из нашего опыта, 45-минутная фиксация обеспечивает адекватную сохранность и совместима с большинством первичных антител, обычно используемых для исследований с использованием кохлеарных препаратов. При устранении неполадок иммуноокрашивания (см. Таблицу 1) следует учитывать разное время фиксации. В то время как криосекция имеет много преимуществ, таких как идентификация конкретных типов клеток, и может помочь лучше разглядеть определенные структурные детали (например, мембрану Рейсснера, сосудистые полосы, модиолус), целые крепления предпочтительны для сохранения любого вида трехмерного контекста и пространственных отношений внутри ткани^. Кроме того, цельные (нефиксированные) препараты дают возможность изучать улитку в качестве живой подготовки к наблюдению за такими вещами, как клеточная динамика³⁰ и переходные процессы Ca2+³¹.

Одним из самых больших преимуществ криосекции улитки мыши является большое количество количественных анализов, которые могут быть выполнены. Например, криосекция отлично подходит для количественной оценки уровней интенсивности флуоресценции после обнаружения антител (например, см. 32,33,34); Ограниченная глубина тканей срезов 12 мкм обеспечивает меньшее рассеяние света по сравнению с препаратами цельного монтажа. Для изучения SGN или другой плотности клеток поперечные срезы предпочтительнее (например, см.^25,35), чем целые монтирования, поскольку срезы обычно выполняются вдоль плоскости, ортогональной продольной оси улитки, что позволяет четко визуализировать ядра клеток в определенных тканевых компартментах. Аналогичным образом, измерение морфологии таких структур, как текториальная мембрана, сосудистая полоса или ударная палочка Scala tympani/media/вестибули, проще всего выполнить с помощью поперечных сечений (например, см.^36,37).

Выбор подходящего метода секционирования имеет решающее значение для точного анализа. Заделка парафина является еще одним распространенным методом заделки ткани перед срезом. Парафиновые срезы предполагают встраивание тканей в воск, что обеспечивает отличную физическую стабильность и сохраняет морфологию тканей с минимальными повреждениями. Однако процесс инфильтрации воска может ограничить их совместимость с некоторыми методами окрашивания. Напротив, криоссекции могут лучше сохранять определенные белки и клеточные структуры для определенных анализов^{, но} могут привести к менее стабильным срезам и потенциальному повреждению тканей. Понимание сильных и слабых сторон каждого метода имеет важное значение для выбора наилучшего подхода к исследовательским вопросам.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

M.A.D. и T.M.C. были поддержаны грантами NIH 5R01DC016595-07 (для T.M.C.) и 5R01DC018040-05 (Майкл Динс, Университет штата Юта, PI). Примеры микрофотографий на рисунке 1A-H были созданы доктором Кайди Чжаном.