小鼠内耳组织的冷冻切片和免疫染色：从胚胎阶段到成人阶段

该协议面向小鼠内耳组织的新手用户，全面详细说明了在不同发育阶段处理小鼠内耳以进行切片免疫染色的步骤。

该协议详细介绍了从胚胎、新生儿和成年小鼠制备内耳样本的一般组织学方法。该协议的目的是为对小鼠耳蜗感兴趣的研究人员提供一种简单且标准化的内耳组织处理方法，这些研究人员可能是该领域的新手。此处包括用于解剖、固定、包埋、冷冻切片和免疫染色的方案。切片免疫染色是在整个耳蜗范围内检查单个细胞的最佳方法之一。

关键步骤包括从颅骨上解剖内耳，使用 4% 多聚甲醛固定组织，用最佳切割温度化合物包埋，冷冻切片，以及使用靶向耳蜗表达的特定蛋白质的抗体进行免疫染色。

我们的方法中包括对耳蜗的特殊考虑，因为它
形状和结构。需要相当好的聚焦和解剖技能，因为组织损伤会影响免疫染色的质量和样品之间的一致性。但是，根据我们概述的程序，大多数用户可以在几周内接受培训，以做好漂亮的准备。总体而言，该协议提供了一种有价值的方法来促进研究以了解小鼠模型中的听觉发育、功能和疾病。

了解听觉发育和功能对于表征和解决不同形式的听力损失至关重要。听力损失的危险因素很多，包括糖尿病 ^1,2、高血压^3、4、5、自身免疫性疾病^6、7、细菌性脑膜炎^8、9 和几种神经退行性疾病^{10、11、12、13}.此外，某些药物，例如某些抗生素和化疗药物，也会对听力产生负面影响¹⁴。除了听觉障碍的直接挑战外，听力损失还会对认知功能产生负面影响，增加焦虑和压力，这可能与认知障碍和心理健康下降有关 11,15,16。通过发布该协议，我们旨在减轻进入听觉研究的任何障碍，特别是对于那些之前没有耳蜗工作经验的人。本指南介绍了如何制备胚胎、幼年（新生儿）和成年小鼠的内耳样本。该协议的目的是提供一种简单的内耳组织处理方法，确保实验之间的可重复性和一致性。切片免疫染色是在整个耳蜗背景下检查不同细胞类型的最佳方法之一;在其他情况下，整体免疫染色可能更有利（例如，检查毛细胞立体纤毛形态或蛋白质定位）。

这样做的基本原理源于使用小鼠耳蜗的挑战。其体积小、线圈独特、结构精细¹⁷ 需要专门的技术进行精确解剖、固定、包埋、冷冻切片和免疫染色。耳蜗的螺旋形状意味着包埋需要仔细注意方向，以确保保留耳蜗的每一次转动，这对于获得一致的切片至关重要。此外，随着耳蜗的成熟，它会发生骨化¹⁸，这意味着它会逐渐转化为骨骼，这会使组织保存复杂化并需要脱钙。与其他制备方法（如整体免疫染色）相比，冷冻切片免疫染色具有多项优势。冷冻切片的主要优点是蛋白质和核酸的一般保存，并且相对较薄的 ~2D 切片可实现一致和精确的测量。此外，它可以保存和可视化所有耳蜗细胞类型，并且可以提高免疫染色质量。与许多人工耳蜗整体安装制剂不同，冷冻切片保留了包括螺旋韧带、血管纹、Reissner 膜和盖膜在内的结构。有关胚胎 19,20,21、新生儿²²、^23、24 和成人^25,26 内耳的高质量切片免疫染色的示例，请参阅以下先前的出版物。

注意：此处描述的所有方法均已获得乔治城大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。本研究中的所有小鼠均按照乔治城大学机构动物护理和使用委员会 （协议 #1147） 进行维护。在出生后第一周，由于颞骨结构未完全发育，因此不需要脱钙。然而，来自 P6 岁及以上小鼠的耳蜗需要脱钙和不同的解剖方法。在我们的方案中，使用了雄性和雌性 NCI Cr：NIH（S） （NIH SWISS） 小鼠，以及 E16.5、P0 和 P30。对于每个部分，我们在括号中注明初学者每个步骤预计需要多长时间。许多步骤会随着练习而变得更快。

1. 胚胎和幼年内耳样本采集 （~75 min）

1. 根据批准的动物研究方案对小鼠实施安乐死和斩首。
2. 使用精细解剖剪刀，小心地沿着头皮做一个中线切口，从颈部开始，向鼻子延伸，将皮肤推向侧面（第一次切割）。
3. 将底部剪刀刀片放在枕骨大孔，将顶部剪刀刀片放在颅骨上。将颅骨的上半部分切到鼻子（第二次切割）。
4. 将剪刀从部分切开的头部中伸出，然后将底部剪刀刀片放在颅骨底部，顶部剪刀末端位于枕骨大孔。将头部的下半部分向上切到鼻子（第三次切）。
   注意： 重要的是，剪刀刀片必须直接穿过中线，并且不费吹灰之力就可以轻松切割。这将确保剪刀刀片正好切在左右内耳之间。
5. 此时，小鼠头部沿喙尾轴一分为二。使用细镊子和剪刀小心地分离颞骨周围的任何软组织，例如大脑、肌肉和结缔组织。避免损坏骨骼或周围结构。
6. 将小鼠半头放入含有室温 1x PBS 的 24 孔板的孔中。处理完每个头后，将 1x PBS 溶液与 4% PFA 溶液（用于固定）交换，并在室温（通常为 20 °C）下孵育 45 分钟。
   注：固定时间可能因需要检测的蛋白质和/或不同抗体的结合功效而异。
7. 45 分钟后，用 1x PBS 冲洗组织 3 x 5-10 分钟。
8. 将样品储存在4°C的1x PBS中，或进行下一步并解剖它们。如需长期储存，请在 4 °C 下储存在含有 0.1% 叠氮化钠的 1x PBS 中。
9. 根据机构的生物危害/组织处理指南处理任何剩余的小鼠组织。

2. 胚胎和幼年内耳样本解剖（每个样本 3 - 5 分钟）

1. 在小鼠半头内找到颞骨/内耳囊。它占据与外耳相同的位置，但位于颅骨内。使用细镊子小心地分离内耳囊周围的任何软组织。一旦内耳囊松动，就开始切割内耳囊周围的组织。
2. 一旦内耳囊大部分从颅组织中释放出来，用镊子轻轻地对内耳囊的周围区域施加压力，使其完全释放。
   注意： 逐渐按压以将内耳囊从其周围的附件中松开。避免损坏内耳囊。因为早期发育的内耳非常柔软，所以请避免直接接触镊子。
3. 按照步骤 1.8 储存内耳样品，并丢弃固定头部组织中的任何剩余碎屑。

3. 成人内耳样本采集和解剖（~75 分钟 + EDTA 治疗 2 - 3 天）

1. 根据批准的动物研究方案对小鼠实施安乐死和斩首。
2. 使用锋利的解剖剪刀，小心地沿着头皮做一个中线切口，从颈部开始，一直延伸到鼻子。将皮肤向后折叠，露出头骨（第一次切割）。
3. 将底部剪刀刀片放在枕骨大孔，将顶部剪刀刀片放在颅骨上。将颅骨的上半部分切到鼻子（第二次切割）。
   注意： 在此步骤中，您会注意到剪刀刀片有适度的“嘎吱嘎吱”声;这是正常的。
4. 将剪刀从部分切开的头部中伸出，然后将底部剪刀刀片放在颅骨底部，将顶部剪刀刀片放在枕骨大孔。将头部的下半部分向上切到鼻子（第三次切割），小心地沿着中线向右移动，以确保刀片错过内耳。
   注意：不要用力将剪刀穿过纸巾;这可能表明刀片击中了其中一个内耳。
5. 对于每个半头，使用镊子和剪刀分离颞骨周围的任何软组织，例如大脑、肌肉和结缔组织。
   注意：小心避免损坏颞骨或周围结构。
6. 清除周围组织后，用手指“反向卷曲”颅骨组织，并用拇指轻轻地对颞骨下侧施加压力。逐渐施加压力，同时从周围的附着物中松开骨骼。
   注意：随着压力的施加，内耳囊逐渐与颅骨周围的骨骼分离。通过轻柔的作，骨头应该相对容易弹出。
7. 取出内耳胶囊后，用 1x PBS 冲洗。
8. 用 4% PFA 填充 sylgard 培养皿，并将其置于显微镜下。将一个弹出的内耳放入 sylgard 培养皿中。
9. 检查内耳是否有任何附着的软组织或骨骼，然后轻轻去除。
10. 找到椭圆形窗口，然后用镊子轻轻去除镫骨。
11. 找到圆窗并戳一个小洞，以确保周围没有组织堵塞它。
12. 用细镊子在顶端开一个小孔。用填充有 4% PFA 的 P20 移液器冲洗耳蜗以固定。确保看到从椭圆形窗口流出的液体（稀释血液、内淋巴/外淋巴液）。
13. 将固定的耳蜗放入填充有 4% PFA 的 24 孔板中。标记时间。在室温下轻轻搅拌（摇杆或章动器）孵育 30-60 分钟，然后用 1x PBS 溶液冲洗样品 3 x 5-10 分钟。
14. 最后一次冲洗后，将组织置于 1.25 mM EDTA 中，并在 4 °C 下摇动 2-3 天。
15. 根据机构的生物危害/组织处理指南适当处理剩余的小鼠组织。
16. EDTA 处理后，用 1x PBS 冲洗组织 3 x 5 分钟。
17. 将样品储存在4°C的1x PBS中，或进行下一步并解剖它们。如需长期储存，将样品储存在4°C下含有0.1%叠氮化钠的1x PBS中。

4. 用于冷冻切片的内耳样品制备 （~24 h）

1. 将解剖的内耳胶囊放入 10% 蔗糖（在 1x PBS 中）中，并在室温下孵育至少 2 小时。
   注：当样品完全平衡后，它们会沉到试管底部。
2. 弃去 10% 蔗糖溶液，在 1x PBS 中加入 20% 蔗糖，并在室温下再孵育 2 小时。
3. 弃去 20% 蔗糖溶液，在 1x PBS 中加入 30% 蔗糖，并在 4 °C 下孵育过夜（最少）。
   注意：此步骤可以减少到 2 小时，但过夜孵育可产生最佳结果。组织可以在任何百分比的蔗糖中长时间放置。
   1. 取出一半的 30% 蔗糖溶液，用最佳切割温度 （OCT） 化合物填充空间。让它摇晃最少 30 分钟，最多最多 2 小时。
      注意：将样品长时间置于 OCT 中会导致组织收缩。
4. 将样品转移到填充有 OCT 的标记冷冻模具中。
5. 在嵌入式冷冻块的显微镜下检查耳蜗的方向。对于“标准”耳蜗横截面，请确认内耳的凹面正对着低温模具的窄边。
6. 将干冰放入一个小容器中，加入 5-10 mL 乙醇或二甲基丁烷。将低温模具 + OCT + 样品放在冒泡的干冰上，以快速冷冻块。
7. 将样品储存在 -80 °C。

5. 内耳切片（每个样品 ~25 分钟）

1. 将冻存模块转移到预冷至 -20 °C 的低温恒温器的腔室中。 让样品在那里平衡 30-60 分钟。
2. 使用铅笔标记与人工耳蜗位置相对应的冷冻块侧面，以确保切片的正确方向。
3. 在卡盘中加入一小池 OCT，然后将冷冻块放在上面，宽边（没有铅笔标记）朝下。
4. 将卡盘 + OCT + 样品放入冷藏低温恒温器室中，让 OCT 完全冻结。几分钟后，将卡盘 + 样品放在卡盘支架上，铅笔标记指向右侧或左侧。
5. 修剪块直到组织明显（使用 40 μm 作为修剪设置）。
6. 一旦组织明显，用设计用于冷冻切片的载玻片收获 12 μm 切片，并在显微镜下检查切片位置。
7. 如果接近耳蜗转弯，收获 12 μm 切片，偶尔检查位置，直到通过所有转弯。
   注意：每张载玻片的切片数量可能会有所不同，但我们通常每张载玻片有 8-10 个切片，每个耳蜗大约有 6 张载玻片。
8. 将载玻片储存在 -80 °C。

6. 切片免疫染色（~1 - 3 天）

1. 从 -80 °C 冰箱中取出载玻片，让它们风干约 10 分钟。
2. 使用铅笔，用将使用的抗体标记载玻片。
3. 使用疏水标记物（例如，疏水屏障过氧化物酶-抗过氧化物酶笔 （PAP））描摹边缘。
4. 将样品在 1x PBS 中再水化 5 分钟。
5. 丢弃载玻片中的 1x PBS，并向载玻片中加入 1x PBS + 0.1% Triton X-100 （0.1% PBSTx） 20 分钟以透化。
6. 从载玻片中取出 0.1% PBSTx，加入 200 μL 封闭溶液，在室温下孵育 1-2 小时。
   注：封闭是免疫组化和免疫荧光等免疫染色技术中的关键步骤，它可以防止抗体与组织或细胞的非特异性结合。有关更多信息，请参阅 Lewis 的对照和封闭试剂选择指南²⁷。常用的封闭溶液是 10% 正常驴血清的 0.5% PBSTx 溶液，但这仅适用于使用驴来源的二抗的情况。
7. 用 1x PBS 快速冲洗，加入 200 μL 由 0.5% PBSTx 组成的一抗溶液，并在室温下孵育 1 小时或在 4 °C 下过夜。 对于 图 1 所示的一抗，使用以下稀释度：Plexin-B1 为 1：200，Sox2 为 1：200，Tuj1、Myo6 和 Myo7A 各为 1：1,000（另见 材料列表）。
   注：每种一抗的行为都不同，具体取决于其表位结合特性和穿透组织样品的能力。
8. 用一抗处理后，在 PBSTx 中冲洗 4 x 30 分钟，加入 200 μL 由 0.5% PBSTx 组成的二抗溶液（材料列表），并在室温下孵育 1 小时。
   注：有时，在 4 °C 下全速旋转二抗溶液 30 分钟以沉淀任何不需要的沉淀物可能会有所帮助。如果二级溶液已被离心，请避免用移液器吸头接触试管底部。
9. 在 PBSTx 中冲洗 4 x 30 分钟（或冲洗过夜），然后使用有助于防止光漂白的封固剂（例如 Fluoromount）封片。
10. 添加适当大小的盖玻片，其厚度适合成像设置（例如，1 号盖玻片，其厚度为 0.13-0.16 mm）。

我们展示了来自我们自己实验室的胚胎第 16.5 天 （E16.5） 小鼠耳蜗的顶端和基部转折以及出生后第 0 天 （P0） 和 P30 耳蜗的基底转折。这些样品已使用毛细胞 （Myo7A 和 Myo6）、螺旋神经节神经元 （SGN;Tuj1）、神经胶质细胞和支持细胞 （Sox2） 以及 Plexin-B1，它标记耳蜗管和 SGN 周围的基底膜。不同发育阶段的耳蜗横截面揭示了形态和细胞组织的显着差异，反映了耳蜗的成熟。

在 E16.5 时，耳蜗处于发育的早期阶段，Corti 器官开始分化。在这个阶段，SGN 的毛细胞神经支配已经开始（图 1C），尽管神经还需要几周才能完全发育。毛细胞前体是可识别的;早期的内毛细胞和外毛细胞可见（图 1D）。在结构上，耳蜗管存在，但未拉长至其成人全长。到 P0 时，耳蜗相对成熟得多。耳蜗管更加清晰，鼓膜和前庭可见扩张。耳蜗神经支配继续进展，毛细胞和 SGN 之间的连接更加成熟和有序（图 1G）;内部和外部毛细胞很容易区分（图 1H）。

到 P30，耳蜗通过一些措施达到完全成熟²⁸，耳蜗管现在完全拉长，结构达到成年大小，包括完全形成的耳蜗转弯。神经神经支配是完整的，螺旋神经节神经元和毛细胞之间具有精确而成熟的连接（图 1K）。Corti 的器官也完全成熟，具有明显分离且功能齐全的内毛细胞和外毛细胞（图 1L）和完全分化的支持细胞（图 1J）。

图 1：来自 E16.5、P0 和 P30 小鼠的免疫染色耳蜗冷冻切片。 （A-D） E16.5 小鼠基部和顶端转角。（E-H）P0 和 （I-L） P30 小鼠耳蜗基底转。（A，E，I）样品三重免疫荧光染色的合并图像。（早、女）E16.5 和 P0 耳蜗中的 Plexin-B1 表达显示强基底膜染色（箭头）和微弱的 SGN 和耳蜗上皮细胞染色。（C、G、K）Tuj1 （beta-III-tubulin） 在其整个发育过程中定位于 SGN，并在 P30 处保持可见。（J） Sox2 由 SGN 周围的神经胶质细胞和耳蜗上皮中的支持细胞表达。（D，H）Myo6 由 P0 的内毛细胞和外毛细胞表达。（L） Myo7A 由 P30 位点的内毛细胞和外毛细胞表达。箭头指向表示每个面板的代表性标记的单元格。使用带有 Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 物镜的 Zeiss LSM 880 共聚焦显微镜采集 20 倍图像。488 nm、561 nm 和 633 nm 的激光线分别用于激发 Alexa Fluor 488、Cy3 和 Cy5。图像以 1,024 x 1,024 像素、两行平均值和 1 个 Airy 单位的针孔大小捕获。进行 Z 堆栈成像，以 8 位分辨率捕获 10 个光学切片。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：故障排除。

成功的冷冻切片和免疫染色有几个关键步骤。正确固定耳蜗组织是必不可少的，固定的持续时间也很重要，这可能因抗体而异。虽然大多数抗体在较短的固定时间（例如在 PFA 中为 45 分钟）效果更好，但一些靶表位可以耐受过夜固定。根据我们的经验，45 分钟的固定可确保充分保存，并且与大多数常用的人工耳蜗制剂研究一抗兼容。在排除免疫染色故障时（见 表 1），应考虑不同的固定时间。虽然冷冻切片具有许多优点，例如识别特定细胞类型，并且可以帮助更好地解析某些结构细节（例如，Reissner 膜、血管纹、modiolus），但整体安装有利于保留组织内任何类型的 3D 背景和空间关系²⁹。此外，整装（未固定）制剂提供了研究耳蜗的机会，作为观察细胞动力学³⁰ 和 Ca2+ 瞬变³¹ 等物质的活体制剂。

冷冻切片小鼠耳蜗的最大优点之一是可以进行大量的定量分析。例如，冷冻切片非常适合在抗体检测后定量荧光强度水平（例如，参见 32,33,34）;与整体安装制备相比，12 μm 切片的有限组织深度产生的光散射更少。为了检查 SGN 或其他细胞密度，横截面比整个安装更受欢迎（例如，参见 ^25,35），因为切片通常沿着与耳蜗纵轴正交的平面进行，这允许清晰地可视化特定组织隔室内的细胞核。同样，使用横截面最容易测量盖膜、血管纹或鼓膜/中层/前庭等结构的形态（例如，参见^36,37）。

选择合适的切片方法对于准确分析至关重要。石蜡包埋是在切片前包埋组织的另一种常用方法。石蜡切片涉及将组织包埋在蜡中，这提供了出色的物理稳定性，并以最小的损伤保持了组织形态。然而，蜡浸润过程会限制它们与某些染色方法的兼容性。相比之下，冷冻切片可以更好地保留特定蛋白质和细胞结构以进行某些分析，但可能导致切片稳定性降低和潜在的组织损伤³⁸。了解每种技术的优点和局限性对于为研究问题选择最佳方法至关重要。

作者没有需要披露的利益冲突。

M.A.D. 和 T.M.C. 得到了 NIH 赠款 5R01DC016595-07（给 T.M.C.）和 5R01DC018040-05（Michael Deans，犹他大学，PI）的支持。 图 1A-H 中的示例显微照片由 Kaidi Zhang 博士生成。