Murin Kemik İliği Kaynaklı Nötrofillerin ATAC-Seq Kütüphanesi Hazırlanması

Bu el yazması, optimal nötrofil canlılığını ve yüksek kütüphane kalitesini garanti etmeyi amaçlayan, murin kemik iliğinden nötrofillerden oluşan bir ATAC-seq kütüphanesi hazırlamak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. BMC hazırlama, immünomanyetik sıralama ve kütüphane yapımı hakkında adım adım talimatlar sunarak, özellikle nötrofilleri incelemeye yeni başlayanlar için değerli bir rehber görevi görür.

Dizileme ile Transpozaz Erişilebilir Kromatin Testi (ATAC-seq), kromatin erişilebilirliğini değerlendirmek ve epigenomik regülasyonu anlamak için güçlü, yüksek verimli bir tekniktir. İmmün yanıtlarda çok önemli bir lökosit türü olan nötrofiller, farklılaşma ve aktivasyon sırasında önemli kromatin mimari değişikliklerine uğrar ve bu da işlevleri için gerekli gen ekspresyonunu önemli ölçüde etkiler. ATAC-seq, nötrofil olgunlaşmasında anahtar transkripsiyon faktörlerini ortaya çıkarmada, patojene özgü epigenomik imzaları ortaya çıkarmada ve otoimmün hastalıklar için terapötik hedefleri belirlemede etkili olmuştur. Bununla birlikte, nötrofillerin dış ortama duyarlılığı, yüksek kaliteli ATAC-seq veri üretimini zorlaştırır. Burada, kemirgen kemik iliği türevi nötrofillerden ATAC-seq kütüphaneleri hazırlamak için, optimum hücre canlılığı ve yüksek kaliteli kütüphaneler sağlamak için geliştirilmiş immünomanyetik ayırma özelliğine sahip ölçeklenebilir bir protokol öneriyoruz. Kütüphane kalitesini etkileyen hayati unsurlar ve metodolojik genişleme için optimizasyon ilkeleri ayrıntılı olarak tartışılmaktadır. Bu protokol, nötrofillerin kromatin mimarisini ve epigenomik yeniden programlamasını incelemek, temel ve klinik immünoloji alanındaki çalışmaları ilerletmek isteyen araştırmacıları destekleyecektir.

Nötrofiller, omurgalılarda en bol bulunan ve en önemli bağışıklık hücresi tiplerinden biridir ve insan lökositlerinin %50-70'ini oluşturur¹. Nötrofiller, konakçılardaki mikroorganizmaların tespit edilmesinde ve ortadan kaldırılmasında merkezi bir rol oynar. Sepsis sırasında, olgun nötrofiller ilk yanıt verenler arasındadır². Kemotaksis³ yoluyla enfeksiyon bölgelerine hızla harekete geçerler, burada mikroorganizmaları yutarak (fagositoz), NADPH oksidaza bağımlı reaktif oksijen türleri üreterek (solunum patlamaları), granüller salgılayarak (degranülasyon) ve iltihap bölgesine vardıklarında hücre dışı bakterileri yakalayan ve öldüren nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) oluştururlar⁴. Olgunlaşmamış nötrofiller ayrıca kemokinler ^5,6 tarafından kemik iliğinden periferik dolaşıma hızla mobilize edilir. Enfeksiyöz bölgeye çekilen bu nötrofiller ayrıca hematopoez, anjiyogenez ve yara iyileşmesi gibi çeşitli fizyolojik süreçlerde yer alan sitokinleri de serbest bırakır ^7,8. Nötrofil sayısının azalmasına neden olan konjenital veya edinsel hastalıklardan muzdarip hastalar enfeksiyonlara daha duyarlıdır ^9,10. Bununla birlikte, nötrofil aktivasyonu iki ucu keskin bir kılıçtır. Aşırı aktivasyon ve sitokin salınımı doku ve organ hasarına neden olabilir ve enfeksiyonlar derhal kontrol edilmezse çoklu organ fonksiyon bozukluğuna yol açabilir ^11,12. Ek olarak, nötrofiller ayrıca çeşitli enflamatuar ve otoimmün hastalıklara katkıda bulunur ve kanserin ilerlemesini ve metastazı etkileyebilir^13,14. Bu, etkili bağışıklık tepkisini dengelemek ve konakçıya zarar gelmesini önlemek için nötrofil aktivitesinin düzenlenmesini inceleme ihtiyacının altını çizmektedir.

Nötrofillerde, kromatin mimarisi, farklılaşmalarında, göçlerinde ve aktivasyonlarında belirgin ve dinamik değişikliklere uğrar ve hücresel yaşam süresi boyunca çok önemli düzenleyici roller oynar. Miyeloblastların büyük, yuvarlak, ökromatin açısından zengin çekirdeğinden, miyelositlerde ve metamiyelositlerde daha girintili bir çekirdeğe ve daha sonra C veya S şeklinde bir bant içi hücrelere ve polimorfonükleer nötrofillerde yoğun şekilde paketlenmiş kromatin ile yüksek oranda lobüle edilmiş^{bu yolculuk 15,16}, nötrofil biyolojisinin karmaşıklığının bir kanıtıdır. Özel kromatin konfigürasyonu, granül üretiminde yer alanlar ve etkili patojen eliminasyonu için gerekli olan hızlı transkripsiyonel yanıtlar gibi nötrofil fonksiyonu için gerekli olan genlerin seçici ekspresyonunu sağlar¹⁷. Nötrofiller kemotaksis yoluyla enflamatuar bölgelere mobilize edildiğinde, transendotelyal göç, nükleoskeleton / hücre iskeleti kompleksi bağlayıcı (LINC) kompleksi üzerinde baskı uygulayarak kromatinin yeniden şekillenmesine ve daha fazla aktivasyon potansiyeline^{neden olur 18}. Sepsiste, aktive edilmiş nötrofiller, iki loblu veya lobsuz çekirdekler ve önemli ölçüde daha gevşek kromatin yoğunlaşması gibi anormal kromatin morfolojisi ile bir "nükleer-sola kayma" sergiler¹⁹. Bu, enflamatuar yanıtla ilişkili gen bölgelerinde erişilebilirliğin artmasına neden olur ve böylece bu genlerin önemli ölçüde ekspresyonunu indükler. Enfeksiyonlar gerektiği gibi kontrol edilmezse, NET'leri oluşturmak için histon sitrülinasyonu ve ardından kromatin dekonstrüksiyonu gereklidir^20,21. Bu nedenle, nötrofil kromatin mimarisini anlamak, nötrofil biyolojisini ilerletmek ve inflamatuar ve otoimmün hastalıklar için tedaviler geliştirmek için çok önemlidir ve gelecekteki hastalık tedavisi için umut verir.

Kromatin erişilebilirliği, epigenomik düzeyde kromatin mimarisi için bir metrik görevi görür. Genomik bölgelerin güçlendiriciler, destekleyiciler, yalıtkanlar ve kromatin bağlayıcı faktörler için fiziksel olarak nasıl izin verildiğini ve bu elementlerin gen ekspresyonunu nasıl etkilediğini gösterir²². Dizileme ile transpozaz erişilebilir kromatin testi (ATAC-seq), genom²³ boyunca kromatin erişilebilirliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Düzenleyici unsurlar hakkında önceden bilgi gerektirmez, bu da onu epigenetik araştırmalar için güçlü bir araç haline getirir. Bu yöntem, numunelerin çekirdeklerinin izole edilmesini, genomik DNA'nın transpozaz Tn5 ile parçalanmasını ve kütüphane hazırlama, dizileme ve veri analizi için dizileme primerlerinin eklenmesini içerir²³. ATAC-seq, nükleozom haritalama, transkripsiyon faktörü bağlanma analizi, çeşitli hücre tiplerinde veya hastalıklarda düzenleyici mekanizmalar, yeni güçlendirici tanımlama, biyobelirteç keşfi vb.^{çalışmalarda etkili olmuştur 22,23}. Gen ekspresyonunun kapsamlı bir analizi için genellikle RNA dizilimi gibi diğer tekniklerle birleştirilir.

ATAC-seq, sağlık ve hastalıkta kesin epigenetik mekanizmaları ortaya çıkararak nötrofil biyolojisi hakkındaki bilgimizi geliştirmiştir. Nötrofil olgunlaşması ve efektör yanıtlarında^24,25 birkaç anahtar transkripsiyon faktörünü (yani RUNX1, KLF6, PU.1, vb.) ortaya çıkarmış, sepsis^26'da biyobelirteç potansiyeline sahip patojene özgü imzaları ortaya çıkarmış, doğuştan gelen bağışıklık hafızasının¹² epigenomik mekanizmalarını aydınlatmış ve pediatrik akut miyeloid lösemide (AML) terapötik hedefleri ^{tanımlamıştır27}. Bununla birlikte, immün sürveyansta önemli bir hücresel bileşen olarak, nötrofiller dış ortamlarına karşı yüksek hassasiyet gösterirler ve bu nedenle yüksek kaliteli ATAC-seq verileri üretmek için bir zorluk oluştururlar. Fizyolojik koşullar altında, insan nötrofillerinin medyan yarılanma ömrünün 3.8 gün olduğu, fare nötrofillerinin ortalama yarılanma ömrünün ise 12.5 saat olduğu bildirilmektedir. İn vitro olarak incelendiğinde yarılanma ömürlerinin önemli ölçüde daha kısa olması dikkat çekicidir ^28,29. İzole nötrofillerin in vitro çalışması sırasında, mikroorganizmalara veya patojenle ilişkili moleküler modellere (PAMP'ler) maruz kalmanın yanı sıra gereksiz deneysel prosedürler ve zorlu işlemler, apoptoz veya NETosis nedeniyle anormal nötrofil aktivasyonuna ve hücresel canlılığın azalmasına neden olabilir. Ölen hücreler genellikle Tn5'e oldukça duyarlı olan önemli miktarda kromatinleşmemiş DNA barındırır ve sonuç olarak ATAC-seq^23'ün arka plan gürültüsünü yükseltir.

Burada, kemirgen kemik iliği örneklerinden türetilen nötrofiller için optimize edilmiş ATAC-seq kütüphanelerini hazırlamak için ölçeklenebilir bir protokol öneriyoruz. Şekil 1 , nötrofillerin kemik iliğinden immünomanyetik olarak ayrılmasını ve ardından ATAC-seq'i kapsayan protokolün grafiksel bir genel bakışını sunmaktadır. Geliştirilmiş immünomanyetik sınıflandırma, ATAC-seq kütüphanesi için çekirdeği çıkarmadan önce nötrofillerin optimal canlılığını garanti eder, böylece kütüphanelerin yüksek kalitesini sağlar ve şemaya ek nötrofil değerlendirmelerinin dahil edilmesini kolaylaştırır. Bu protokolün uygulanması, araştırmacılara çeşitli mikro-çevresel zorluklara maruz kaldıklarında nötrofillerin kromatin mimarisini, özelliklerini ve epigenomik yeniden programlama mekanizmalarını anlamalarında yardımcı olacaktır. Bunun temel ve klinik immünoloji çalışmalarında geniş uygulama alanlarına sahip olması beklenmektedir.

Aşağıda sunulan tüm hayvan prosedürleri, Pekin, Çin'deki Başkent Tıp Üniversitesi Hayvan Bakımı Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanan ulusal etik ve hayvan refahı yönergelerine ve düzenlemelerine uygundur (sjtkl11-1x-2022(060)).

1. Kemik iliği hücresi (BMC) süspansiyonlarının hazırlanması

1. 19-21 g ağırlığında 6-8 haftalık erkek C57BL/6J fareleri seçin. Fareleri bir CO₂ odası kullanarak ötenazi yapın, ardından derin refleks kaybolduktan sonra servikal çıkık yapın. Bir diseksiyon matı üzerinde% 70 etanol spreyi ile dezenfekte edin.
2. Femuru kalça eklemi ve tibiadan dikkatlice ayırmak için küçük makas ve forseps kullanın, bağlı cildi ve iskelet kasını çıkarın ve femuru 10 cm'lik bir Petri kabında soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın.
3. Femurun epifizlerini kesin, 2 mL'lik bir şırıngaya bağlı 28 G'lik bir iğneyi ilik boşluğuna nazikçe sokun ve kemik iliğini% 2 fetal sığır serumu (FBS) içeren soğuk PBS ile yıkayın.
4. Kızarmış koyu kırmızı sıvı yarı saydam hale gelene kadar önceki adımı tekrarlayın. Genellikle üç yıkama gereklidir.
   NOT: Optimum hücre edinimini sağlamak için iğneyi kemik iliği boşluğuna çok derine sokmaktan kaçının.
5. Hücre süspansiyonunu floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tüpüne (5 mL) filtrelemek için 70 μm'lik bir hücre süzgeci kullanın.
6. BMC'lerdeki eritrositleri poliformaldehit içermeyen ticari bir eritrosit lizis tamponu ile parçalayın.
   1. Tüpü 25 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, altta yaklaşık 100 μL sıvı bırakarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti gevşetmek için tüpe hafifçe vurun.
   2. Eritrosit lizis tamponundan (10x) seyreltilmiş 2 mL lizis tamponu ekleyin ve tüpü üç kez ters çevirerek karıştırın. Daha sonra, tüpü 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hafifçe vurarak hücre peletini yeniden süspanse edin.
   3. Hücreleri %10 FBS içeren RPMI 1640 ortamı ile iki kez yıkayın ve 2 mL'lik bir hacimde yeniden süspanse edin.
      NOT: Dağılmamış hücre kümeleriyle uğraşırken, hücre süspansiyonlarını 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirmek yerine bunları ayırmak için 200 μL'lik bir pipet ucu kullanılması önerilir. Bu yöntem hücre kaybını azaltabilir.
7. Tripan mavisi boyama ile numune başına hücresel canlılığı ve toplam canlı hücre sayısını hesaplayın.

2. Nötrofillerin anti-Ly6G manyetik boncuklarla immünomanyetik etiketlenmesi

1. Kemik iliği hücrelerini (fare başına ~ 2 x 10,⁷ canlı hücre)% 10 FBS içeren 2 mL RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin ve 25 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.
   NOT: ATAC-seq için 1 x^{10 5} hücrenin sınırlı gereksinimi göz önüne alındığında, fazla nötrofiller ek epigenomik analizler (örneğin, ChIP-seq ve Hi-C) veya bağışıklık fonksiyonu değerlendirmeleri (örneğin, sitokin üretimi, fagositoz ve NET'ler) için tahsis edilebilir.
2. Süpernatantın çoğunu aspire edin, geride yaklaşık 100 μL bırakın ve peleti gevşetmek için tüpe hafifçe vurun.
3. 30 μL Ly6G boncuk ekleyin ve hafifçe vurarak BMC'lerle karıştırın.
   NOT: Manyetik boncuklar kullanımdan önce en az 10 saniye girdaplanmalıdır. Boncukların BMC'lere eklenmesini takiben, girdaplaşmadan kaçınılması önerilir.
4. Tüpü 25 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
5. Boncukları ve hücreleri yeniden süspanse etmek için 2 mL PBS ekleyin, ardından 25 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.
6. Süpernatantın çoğunu aspire edin, geride yaklaşık 100 μL bırakın ve peleti gevşetmek için tüpe hafifçe vurun. 1 mL'lik son hacim için ek PBS ekleyin.
   NOT: Dağılmamış hücre kümeleriyle uğraşırken, hücre süspansiyonlarını 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirmek yerine bunları ayırmak için 200 μL'lik bir pipet ucu kullanılması önerilir. Bu yöntem hücre kaybını azaltabilir.

3. İmmünomanyetik hücre ayırma ile nötrofil ayırma

1. MS kolonunu PBS ile ön işlemden geçirin.
   1. MS sütununu uyumlu bir manyetik ile etkinleştirilen hücre sıralama (MACS) ayırıcısının manyetik alanı içine yerleştirin. MS kolonundan boşalan sıvının altına boş bir 5 mL tüp yerleştirin.
   2. Kolonu 500 μL PBS ile durulayın. PBS'nin MS sütununa tam akışı sağlandıktan sonra bu adımı tekrarlayın.
      NOT: PBS'nin, MS sütunu aracılığıyla 5 mL floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tüpüne kademeli olarak, damla damla akmasına izin verilmelidir. Hava kabarcıkları sütunu tıkayabileceğinden, sütuna hava girmediğinden emin olun.
2. Manyetik olarak etiketlenmiş BMC süspansiyonunu, bir seferde 500 μL ekleyerek MS kolonuna uygulayın ve kolon rezervuarı boşaldığında hemen yeniden doldurun.
   NOT: Hücre süspansiyonlarının hücre kütlesinden yoksun olduğundan emin olun. Gerekirse, bu aşamadan önce etiketlenmemiş hücreleri (örn. monositler ve lenfositler) toplamak için MS kolonunun altına yeni bir 5 mL FACS tüpü yerleştirin.
   NOT: Damlacık akış hızına dikkat edin. Yavaş bir akış hızı, sıralama sütununun engellendiğini gösterebilir.
3. Rezervuar her boşaldığında 500 μL PBS ekleyerek MS kolonunu yıkayın ve bu işlemi iki kez tekrarlayın.
   NOT: PBS'nin erken eklenmesi, belirli hücrelerin sıralama sütununa girişini engelleyebilir ve potansiyel olarak hücre sıralamasının saflığını tehlikeye atabilir.
4. Manyetik olarak etiketlenmiş nötrofilleri toplayın.
   1. Kolon rezervuarı tükendiğinde, kolonu manyetik alandan çıkarın ve dikkatlice 5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
      NOT: Kolonu çıkarmadan önce, işlem sırasında damlacık deşarjı nedeniyle nötrofil kaybını önlemek için içinde sıvı kalmadığından emin olun. Kolondaki kalıntı bir pipet kullanılarak çıkarılabilir.
   2. Kolona 2 mL PBS dağıtın, ardından manyetik olarak etiketlenmiş nötrofilleri dışarı atmak için pistonu hemen ve sıkıca kolona itin.
      NOT: Yeterli nötrofil elde etmek için yeterli elüsyon hacmini sağlayın ve pistonu kolona iterken kısa kalın.
5. İzole edilmiş hücreleri numaralandırmak için bir hemositometre kullanın. İzole edilen nötrofillerin saflığını, sıralama sonrası hücre süspansiyonunun 100 μL'sini alarak ve akış sitometrisi ile analiz ederek tanımlayın.

4. Çekirdek ekstraksiyonu

1. Nötrofilleri içeren 50.000 tek hücreli süspansiyonu 500 x g'da 5 ° C'de 5 dakika boyunca 0.2 mL'lik bir tüpte santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın.
2. Nötrofilleri 50 μL önceden soğutulmuş Lizis tamponunda yeniden süspanse edin ( Tablo 1'e bakın), çözeltiyi bir pipet kullanarak hafifçe karıştırın ve 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
   NOT: Numune hacmi 5 μL'den azsa, Lysis tamponunun doğrudan eklenmesine izin verilir. Hücre süspansiyon konsantrasyonu 1 x 10⁷ hücre / mL'yi geçmez.
3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın ve çekirdeği toplayın. Sonraki prosedürlere başlamadan önce tüpü buzun üzerine yerleştirin.
   NOT: Numune kaybını en aza indirmek için, tüp duvarının peletlerin biriktiği tarafını belirtin ve süpernatanı çıkarırken sıvıyı karşı taraftan nazikçe aspire edin.

5. Transpozaz ile nükleozoma bağlı etiketleme

1. Tn5 transpozaz içeren Tagmentasyon Reaksiyonu Karışımını bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpünde DNA Kütüphanesi Hazırlık kitinin yönergelerine göre hazırlayın ( Tablo 2'ye bakın) ve soğutulmuş amplikon saflaştırma boncuklarını 25 ° C'de en az 30 dakika önceden ısıtın.
2. Nötrofil çekirdeğini 50 μL etiketleme reaksiyon karışımı ile yeniden süspanse edin ve bir pipetle hafifçe çalkalayın, ardından el tipi bir santrifüj (~ 2600 x g) kullanarak 5 saniye santrifüjleyin.
3. Reaksiyon tüpünü bir PCR cihazında 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
4. Lizata 100 μL önceden girdaplanmış amplikon saflaştırma boncukları ekleyin, ardından manyetik boncukları 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek çözelti içinde iyice karıştırın.
   NOT: Manyetik boncuklar yapışkandır ve pipet uçlarına kolayca takılabilir, bu nedenle boncukları aktarırken doğru hacmi aspire ettiğinizden ve bunları uçlardan yavaşça dağıttığınızdan emin olun.
5. Reaksiyon tüpünü 25 ° C'de 5 dakika inkübe edin, ardından el tipi bir santrifüj (~ 2600 × g) ile 5 saniye santrifüjleyin.
6. Reaksiyon tüpünü çözelti berraklaşana kadar (yaklaşık 5 dakika) manyetik bir rafa yerleştirerek kesintiye uğrayan DNA parçasını saflaştırın. Ardından, manyetik boncukları bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın.
7. Manyetik boncuğu her seferinde 200 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ile yıkayın ve reaksiyon tüpünü manyetik rafta 30 saniye tutun. Etanol eklerken boncukları rahatsız etmekten kaçının. Adım 5.7'de açıklanan prosedürü tekrarlayın.
8. Reaksiyon tüpünü el tipi bir santrifüjle (yaklaşık 2600 × g) santrifüjleyin, etanolü 10 μL pipet uçlarıyla aspire edin, ardından kapağı açarken manyetik boncukları 3-5 dakika kurutun.
   NOT: Manyetik boncuklar için kurutma süreleri, nem seviyelerindeki farklılıklar nedeniyle farklı bölgeler arasında değişebilir. Boncuklar parlaklıklarını kaybedene kadar kurutulmalıdır. Aşırı kurutma, elüsyon sürecini zorlaştırabilirken, yetersiz kurutma, sonraki deneyleri etkileyen alkol kalıntısının varlığına neden olabilir. Ek olarak, manyetik rafın yatay olarak konumlandırılması, manyetik boncukların düzgün bir şekilde kurutulması için daha elverişlidir.
9. Reaksiyon tüpünü manyetik raftan çıkardıktan sonra, manyetik boncukları kaplamak için 26 μL ddH_2Oekleyin, iyice karıştırmayı sağlamak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra 25 °C'de 2 dakika inkübe edin.
   NOT: Manyetik boncuklar aşırı kurutulursa inkübasyon süresini uygun şekilde uzatın.
10. Reaksiyon tüpünü el tipi bir santrifüjle (yaklaşık 2600 × g) kısaca santrifüjleyin ve çözelti berraklaşana kadar (yaklaşık 5 dakika) manyetik bir raf kullanarak manyetik boncukları ayırın.
11. 24 μL süpernatanı dikkatlice yeni PCR tüpüne aktarın.

6. Yeni nesil dizileme (NGS) için kütüphane inşaatı

1. PCR Reaksiyon Karışımını, saflaştırılmış DNA parçaları ve dizileme adaptörleri içeren primerler kullanarak sterilize edilmiş bir tüpte hazırlayın (bkz. Tablo 3).
2. PCR reaksiyonunu önerilen prosedürleri izleyerek gerçekleştirin ( Tablo 4'e bakın), tipik olarak yaklaşık 1 saat gerektirir.
   NOT: Bu prosedürden sonra deney geçici olarak durdurulabilir ve PCR ürünleri -20 °C'de veya en az 2 hafta saklanabilir.
3. 50 μL PCR ürününe 27,5 μL önceden girdaplanmış amplikon saflaştırma boncuğu ekleyin, ardından manyetik boncukları 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek çözelti içinde iyice karıştırın.
   NOT: Manyetik boncukların PCR ürünlerine yanlış oranı, sıralanan parçaların uzunluklarında tutarsızlıklara neden olabilir. PCR ürününün buharlaşan hacmini 50 μL'ye doldurmak için ddH_2Okullanın. Doğru hacimde manyetik boncukları aspire ettiğinizden emin olun ve takılabilecek boncukları en aza indirmek için bunları pipet uçlarından yavaşça dağıtın.
4. Reaksiyon tüpünü 25 °C'de 5 dakika inkübe edin, ardından el tipi bir santrifüj (yaklaşık 2600 x g) ile 5 saniye santrifüjleyin.
5. Çözelti berraklaşana kadar (yaklaşık 5 dakika) reaksiyon tüpünü manyetik bir rafa yerleştirerek kütüphane DNA'sını saflaştırın. Ardından, süpernatanı dikkatlice yeni bir sterilize edilmiş PCR tüpüne aktarın ve manyetik boncukları atın.
6. Süpernatanıma 50 μl önceden girdaplanmış amplikon saflaştırma boncukları ekleyin, ardından manyetik boncukları 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek çözelti içinde iyice karıştırın.
7. Reaksiyon tüpünü 25 °C'de 5 dakika inkübe edin, ardından el tipi bir santrifüj (yaklaşık 2600 x g) ile 5 saniye santrifüjleyin.
8. Reaksiyon tüpünü, çözelti berraklaşana kadar (yaklaşık 5 dakika) manyetik bir rafa yerleştirin, ardından manyetik boncukları bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın.
9. Manyetik boncuğu her seferinde 200 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ile iki kez yıkayın ve reaksiyon tüpünü manyetik rafta 30 saniye tutun. Etanol eklerken boncukları rahatsız etmekten kaçının.
10. Kapağı açarken manyetik boncukları 5 dakika kurutun.
11. Reaksiyon tüpünü manyetik raftan çıkardıktan sonra, manyetik boncukları kaplamak için 22 μL ddH_2Oekleyin, iyice karıştırmayı sağlamak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra 25 °C'de 5 dakika inkübe edin.
12. Reaksiyon tüpünü el tipi bir santrifüjle (yaklaşık 2600 × g) kısaca santrifüjleyin ve çözelti berraklaşana kadar (yaklaşık 5 dakika) manyetik boncukları manyetik bir raf kullanarak ayırın.
13. 20 μL'lik süpernatanı dikkatlice yeni bir sterilize edilmiş PCR tüpüne aktarın ve -20 °C'de saklayın.
    NOT: Daha konsantre bir uzunluk dağılımına sahip bir kitaplık elde etmek için, güçlendirilmiş ürünü sıralamak için bir jel geri kazanım kiti kullanmayı düşünün. Alternatif olarak, uzunluk dağıtım aralığı için özel bir gereklilik yoksa, amplifiye edilmiş ürün, uzunluk sıralaması yapılmadan bir manyetik boncuk veya kolon saflaştırma kiti kullanılarak doğrudan saflaştırılabilir.

7. Kütüphane kalite kontrolü ve sıralaması

1. Kütüphane DNA'sının uzunluk dağılımını değerlendirmek için DNA fragmanı analiz platformlarını kullanın.
2. Kalite denetiminden geçen kütüphanelerde yüksek verimli sıralama yapmak için NGS platformlarını kullanın.

Ana hatlarıyla belirtilen protokol, nötrofilleri C57BL / 6 farelerinin kemik iliğinden izole etmek ve ATAC-seq yoluyla kromatin erişilebilirliği öncesi ve sonrası lipopolisakkarit (LPS) stimülasyonundaki ilgili varyanslarını karşılaştırmak için kullanıldı. Tipik olarak, 6-8 haftalık bir C57BL / 6 farenin her iki uyluk kemiğinden 2 x 10⁷ BMC toplanabilir ve daha sonra 2-5 x 10⁶ nötrofil izole edilebilir. Bunlar arasında, ATAC-seq için 1 x 10⁵ hücre kullanılırken, fazla hücreler kapsamlı nötrofil analizi için tahsis edilebilir.

İmmünomanyetik ayıklama sonrası nötrofil saflığını ve canlılığını belirlemek için FACS immünofenotiplemesi benimsendi (Şekil 2). İleri saçılma alanı (FSC-A) ve yan saçılma alanı (SSC-A) dağılımı tek başına bir tahmin sağlayabilse de, sıralama etkisini göstermek için burada spesifik nötrofil işaretleyici boyama kullanıldı. FSC-A ve SSC-A geçişini takiben, hücreler, tek hücreleri toplanmış hücrelerden ayırt etmek için FSC-A ve ileri saçılma yüksekliği (FSC-H) kullanılarak daha fazla kapılandı. Sıralama sonrası hücrelerin yaklaşık% 99'u tek olarak tanımlandı. Daha sonra, canlı hücreler tarafından verimli bir şekilde salgılanan bir DNA boyası olan 7-amino-aktinomisin D (7AAD), hücreleri etiketlemek ve sıralama sonrası tek hücrelerden canlılığın% >99'unu belirlemek için hariç tutuldu. CD11b ve CD48, sırasıyla miyeloid hücreleri tanımlamak ve nötrofilleri miyeloid hücreler içindeki monositlerden ayırt etmek için ayrıca etiketlendi. C57BL / 6 farelerinin BMC'lerinde, miyeloid hücreler canlı hücrelerin %46.7'sini oluştururken, nötrofiller miyeloid hücre popülasyonunun %76.4'ünü oluşturuyordu. İmmünomanyetik sınıflandırmadan sonra, canlı hücreler içindeki nötrofil saflığının% 98.5 olduğu doğrulandı ve ATAC-seq kütüphane yapısının gereksinimini karşıladı.

ATAC-seq kütüphanesi oluşturulduktan sonra, saflaştırılmış DNA, DNA fragman analizörü kullanılarak uzunluk dağılım analizine tabi tutuldu. Sonuçlar, küçük veya büyük parça kontaminasyonu olmaksızın 100 bp ile 1000 bp arasında bir uzunluk gösterdi (Şekil 3A). ATA-seq kütüphanelerinin konsantrasyonları ve sıralama verilerinin miktarları Tablo 5'te detaylandırılmıştır. Dizileme verilerini aldıktan sonra, ATAC-seq fragmanlarının uzunluk dağılımını da inceledik (Şekil 3B). Tn5 transpozazlarının tagmentasyonu, nükleozom içermeyen bölgelerden (NFR, < 100 bp), mononükleozomdan (~200 bp), dinükleozomdan (~400 bp), trinükleozomdan (~600 bp) türetilen fragmanların imza boyutu modelini ürettiğinden ve diğer açık kromatin bölgelerinden daha uzun oligonükleozom, başarılı bir ATAC-seq deneyi, nükleozomların tamsayı katlarına karşılık gelen periyodik azalan tepe noktaları ile tipik parça boyutu dağılım grafiğini koordineli olarak üretmelidir (Şekil 3B). ATAC-seq piklerindeki değişiklikler genellikle açık kromatin bölgelerinin dinamik manzarasını göstermek için tanımlanmıştır. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, ATAC-seq sinyallerinin arttığı veya azaldığı bölgeler net ısı haritaları ile gösterilmelidir. Daha sonra, IL10, Stat1, Il12a, Cxcl1 ve Irak1 gibi LPS stimülasyonundan birincil olarak etkilenen enflamatuar faktörler için genlerin kromatin erişilebilirliğini analiz ettik ve bu genlerin LPS ile uyarılan nötrofillerde daha yüksek erişilebilirliğe sahip olduğunu bulduk (Şekil 3D). Birlikte ele alındığında, oluşturduğumuz ATAC-seq kütüphanesinin kalite kontrolü tatmin ediciydi ve üretilen veriler, LPS stimülasyonundan sonra fare nötrofillerinin epigenetik değişikliklerini analiz etmek için yeterliydi.

Şekil 1: Nötrofil ATAC-seq kütüphanesinin hazırlanması için protokolün şematik genel bakışı. Genel bakış, BMC'lerin süspansiyonlarının hazırlanmasını, nötrofillerin anti-Ly6G manyetik boncuklarla etiketlenmesini, immünmanyetik sıralama ile nötrofil ayrılmasını, nötrofil çekirdeğinin ekstraksiyonunu, nükleozoma bağlı etiketlemeyi, NGS kütüphane yapımını ve dizilemeyi takip eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İmmünomanyetik ayıklama öncesi ve sonrası FACS kullanılarak nötrofil saflığı ve canlılık değerlendirmesi. (A) BMC'ler ve (B) izole nötrofiller, standart bir protokole göre anti-CD11b, anti-Ly6G, anti-CD48 ve 7AAD ile boyandı. Daha sonra, tek hücreler, 7AAD'li ölü hücreler hariç, toplam hücre popülasyonundan ayrıldı. Miyeloid hücreler daha sonra canlı hücrelerden geçit ile ayrıldı ve son olarak miyeloid hücre popülasyonundan nötrofiller kapılandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Murin kemik iliği nötrofillerinden hazırlanan ATAC-seq kütüphanesinin kalite değerlendirmesi. (A) DNA fragmanı analizörü tarafından analiz edilen kütüphane DNA'sının uzunluk dağılımı ve (B) ATAC-seq fragmanının uzunluk dağılımı dizileme verileri ile belirlendi. (C) Tedavi edilmemiş ve LPS ile uyarılmış nötrofillerde erişilebilirliğe (bu zirvelerin merkezi etrafında 10 kb ±) ulaşan genomik bölgelerin yığılma ısı haritası. (D) Kırmızı ve siyah sinyal tepe noktalarının sırasıyla tedavi edilmemiş ve LPS ile uyarılmış nötrofilleri temsil ettiği enflamatuar faktörlere karşılık gelen temsili gen lokuslarında ATAC-seq sinyallerinin bütünleştirici genomik görüntüleyici (IGV) görünümleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Çekirdek ekstraksiyonu için lizis tamponu formülasyonu.

Tablo 2: Etiketleme Reaksiyon Karışımının Hazırlanması.

Tablo 3: NGS kütüphanesi yapımı için PCR Reaksiyon Karışımının Hazırlanması.

Tablo 4: NGS kütüphane yapımı için önerilen PCR reaksiyonu prosedürleri.

Tablo 5: ATAC-seq Kitaplığı Konsantrasyonu ve Sıralama Verilerine Genel Bakış.

Bu el yazması, kemirgen kemik iliği örneklerinden türetilen nötrofiller için optimize edilmiş ATAC-seq kütüphanelerinin hazırlanması için deneysel bir protokol bildirmektedir. Nötrofillerin oldukça duyarlı ve kolayca aktive edilmiş bağışıklık hücreleri olması nedeniyle, optimizasyon çabaları izole nötrofillerin canlılığını korumaya öncelik verdi. Yanlış tedavi, NETosis ve diğer hücre ölümü biçimlerine yol açarak önemli miktarlarda kromatinize edilmemiş DNA'nın salınmasına neden olabilir ve böylece arka plan gürültüsüne katkıda bulunabilir²³. Çekirdek ekstraksiyonundan önce prosedürü kolaylaştırdık ve poliformaldehit içermeyen bir eritrosit lizis tamponu seçtik. Periferik kan örneklerinin aksine, minimum miktarda eritrosit, eritrosit lizis tamponu ile BMC'lerin kısa bir kuluçka süresi gerektirir, bu da eritrositlerin tamamen çözünmesini sağlarken nötrofil kaybını etkili bir şekilde en aza indirir. Gereksiz uyaranları en aza indirmek için, BMC'lerle inkübe etmeden önce tüm reaktifleri 37 °C'ye önceden ısıtmak ve bunları son derece dikkatli bir şekilde kullanmak, girdaplama, hücre süzgeçleri ile tekrarlanan filtreleme, aşırı dönme hızıyla uzun süreli santrifüjleme vb. faaliyetlerden kaçınmak zorunludur. Yukarıdaki prosedürlerdeki iyileştirmeler, sıralanmış nötrofil canlılığını iyileştirir, böylece yüksek kaliteli ATAC-seq kütüphanelerine elverişli koşullar yaratır.

Optimal canlılığa sahip nötrofiller elde etmek için yaygın olarak kullanılan üç sıralama tekniğini araştırdık: immünomanyetik ayırma, yoğunluk gradyan santrifüjleme ve akış sitometrisi sıralaması. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme yapılırken, nötrofiller ayırma sıvısı tabakasını geçebilir ve potansiyel olarak ozmotik basınca ve NET oluşumuna yol açabilir. Akış sitometrisi sıralaması yapılırken, nozuldan geçen nötrofiller, mekanik kesme kuvveti nedeniyle uyaranlara maruz kalır. Ayırma süresi tipik olarak bir saati aşar ve ayırma sonrası hücresel konsantrasyon azalır, bu da ayırma ve sonraki santrifüjleme sırasında daha fazla nötrofil kaybına neden olur. Yukarıdaki iki yaklaşımla karşılaştırıldığında, immünomanyetik ayırma, 30 dakika içinde nötrofillerin %95 saflığına ve %99,5 canlılığına ulaşır. Bu metodoloji daha yüksek deneysel maliyetlere yol açabilse de, güvenilir araştırma sonuçları elde etmek için gerekli olduğunu düşünüyoruz. ATAC-seq dışında, immünomanyetik ayırma, bağışıklık fonksiyonu değerlendirmeleri (örneğin, sitokin üretimi, fagositoz, NET'ler, vb.), 'omik' metodolojileri (örneğin, ChIP-seq, Hi-C, geniş spektrumlu hedefli metabolomikler, vb.) ve diğer rutin moleküler biyoloji deneyleri gibi nötrofil canlılığı için katı kriterlere sahip diğer deneylerle de entegre edilebilir. Entegre metodoloji, nötrofil fonksiyonlarının ve ilgili mekanizmaların tek bir fare içinde çeşitli perspektiflerden kapsamlı bir şekilde incelenmesine olanak tanır.

Açıklanan protokol, çeşitli türlerden ve çeşitli doku kaynaklarından nötrofilleri barındıracak şekilde genişletilebilen ölçeklenebilir bir şemadır. Numunelerdeki eritrosit oranına bağlı olarak, yeterli çözünme verimliliği sağlarken eritrosit lizis tamponu ile inkübasyon süresinin minimuma optimize edilmesi tavsiye edilir. İmmünomanyetik sıralama sırasında, kullanılan manyetik boncukların miktarı, izole edilen hücrelerin saflığını önemli ölçüde etkiler. Optimizasyon, numunelerin işlenen hücre miktarına ve nötrofil oranına göre uyarlanmalıdır. Nötrofillerin saflığını korumak birincil odak noktasıdır. Deneyimlerimize göre, iki uyluk kemiğinden 2 x 10⁷ hücre için 30 μL boncuk ve iki uyluk kemiği ve iki tibiadan 4 x 10⁷ hücre için 50 μL boncuk ekleyin. Farklı partiler arasında mükemmel tekrarlanabilirlik ve geniş antikor dozajı aralığı nedeniyle, optimizasyonun yalnızca başlangıçta araştırılması gerekir. Ek olarak, yüksek kaliteli ve kararlı ATAC-seq kütüphanelerinin oluşturulması, Tn5 transpozazının yatırılan hücresel çekirdeğe^{uygun oranına bağlıdır 30}. Yatırım yapılacak en uygun miktar, murin kemik iliği türevi nötrofiller için 50.000 çekirdektir ve diğer numuneler için küçük ayarlamalar gereklidir.

Birlikte ele alındığında, nötrofillerin immünomanyetik sınıflandırılması ve nötrofillerin araştırılmasında kapsamlı kullanım için büyük umut vaat eden ATAC-seq kütüphanesi hazırlığının entegre bir şemasını öneriyoruz. Araştırmacıların nötrofillerin kromatin mimari özelliklerini anlamalarına, çeşitli mikroçevresel zorlukların varlığında düzenleyici inflamatuar yanıt ve epigenomik yeniden programlama mekanizmalarını ortaya çıkarmalarına yardımcı olacak ve böylece hastalık oluşumu ve ilerlemesinde potansiyel terapötik hedefleri ortaya çıkaracaktır 12,24,25,26,27.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma, Pekin Belediye Eğitim Komisyonu (KZ202010025041) Ar-Ge Programı ve Pekin Çin Tıbbi Araştırma Enstitüleri'nden (Hibe No. CX24PY29).