إعداد مكتبة ATAC-Seq للعدلات المشتقة من نخاع عظم الفئران

تحدد هذه المخطوطة بروتوكولا لإعداد مكتبة ATAC-seq للعدلات من نخاع عظم الفئران ، بهدف ضمان بقاء العدلات المثلى وجودة المكتبة العالية. يقدم إرشادات خطوة بخطوة حول إعداد BMC ، والفرز المناعي المغناطيسي ، وبناء المكتبة ، ويعمل كدليل قيم ، خاصة للوافدين الجدد لدراسة العدلات.

مقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه من Transposasse مع التسلسل (ATAC-seq) هي تقنية قوية وعالية الإنتاجية لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين وفهم التنظيم الجيني. تخضع العدلات ، كنوع حاسم من الكريات البيض في الاستجابات المناعية ، لتغييرات معمارية كبيرة في الكروماتين أثناء التمايز والتنشيط ، مما يؤثر بشكل كبير على التعبير الجيني الضروري لوظائفها. كان ATAC-seq مفيدا في الكشف عن عوامل النسخ الرئيسية في نضوج العدلات ، والكشف عن التوقيعات اللاجينية الخاصة بمسببات الأمراض ، وتحديد الأهداف العلاجية لأمراض المناعة الذاتية. ومع ذلك ، فإن حساسية العدلات للوسط الخارجي تعقد إنتاج بيانات ATAC-seq عالية الجودة. هنا ، نقترح بروتوكولا قابلا للتطوير لإعداد مكتبات ATAC-seq من العدلات المشتقة من نخاع عظام القوارض ، والتي تتميز بالفصل المغناطيسي المناعي المحسن لضمان بقاء الخلايا المثلى والمكتبات عالية الجودة. تتم مناقشة العناصر الحيوية التي تؤثر على جودة المكتبة ومبادئ التحسين للتوسع المنهجي بالتفصيل. سيدعم هذا البروتوكول الباحثين الراغبين في دراسة بنية الكروماتين وإعادة البرمجة اللاجينية للعدلات ، وتطوير الدراسات في علم المناعة الأساسي والسريري.

تعد العدلات واحدة من أكثر أنواع الخلايا المناعية وفرة وأهمية في الفقاريات ، حيث تشكل 50٪ -70٪ من الكريات البيض البشرية¹. تلعب العدلات دورا مركزيا في اكتشاف الكائنات الحية الدقيقة والقضاء عليها في العوائف. أثناء تعفن الدم ، تكون العدلات الناضجة من بين المستجيبين الأوائل². يتحركون بسرعة إلى مواقع العدوى عبر الانجذاب الكيميائي³ ، حيث يكافحون مسببات الأمراض عن طريق تناول الكائنات الحية الدقيقة (البلعمة) ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المعتمدة على NADPH أوكسيديز (رشقات نارية في الجهاز التنفسي) ، وإفراز الحبيبات (التحلل) ، وتشكيل مصائد خارج الخلية (NETs) التي تلتقط وتقتل البكتيريا خارج الخلية بمجرد وصولها إلى موقع الالتهاب⁴. يتم أيضا تعبئة العدلات غير الناضجة بسرعة من نخاع العظم إلى الدورة الدموية المحيطية بواسطة الكيموكينات^5،6. تطلق هذه العدلات التي تنجذب إلى الموقع المعدي أيضا السيتوكينات ، والتي تشارك في العديد من العمليات الفسيولوجية ، مثل تكون الدم ، وتكوين الأوعية الدموية ، والتئام الجروح^7،8. المرضى الذين يعانون من أمراض خلقية أو مكتسبة تؤدي إلى انخفاض عدد العدلات هم أكثر عرضة للعدوى^9،10. ومع ذلك ، فإن تنشيط العدلات هو سيف ذو حدين. يمكن أن يتسبب التنشيط المفرط وإفراز السيتوكين في تلف الأنسجة والأعضاء ، مما يؤدي إلى خلل وظيفي متعدد في الأعضاء إذا لم يتم السيطرة على العدوى على الفور^11،12. بالإضافة إلى ذلك ، تساهم العدلات أيضا في العديد من الأمراض الالتهابية وأمراض المناعة الذاتية ويمكن أن تؤثر على تطور السرطان والورم الخبيث^13،14. هذا يؤكد الحاجة إلى دراسة تنظيم نشاط العدلات لتحقيق التوازن بين الاستجابة المناعية الفعالة ومنع تلف المضيف.

في العدلات ، تخضع بنية الكروماتين لتغييرات مميزة وديناميكية في تمايزها وهجرتها وتنشيطها ، مما يؤدي إلى ممارسة أدوار تنظيمية محورية طوال عمر الخلية. هذه الرحلة ، من النواة الكبيرة المستديرة والغنية بالكروماتين للأرومات النخاعية إلى نواة أكثر مسافة بادئة في الخلايا النخاعية والخلايا النخاعية ، ثم إلى خلايا داخل النطاق على شكل C أو S وفصيصية للغاية مع الكروماتين المعبأ بكثافة في العدلات متعددة الأشكال^15،16 ، هي شهادة على تعقيد بيولوجيا العدلات. يضمن تكوين الكروماتين المتخصص التعبير الانتقائي للجينات الضرورية لوظيفة العدلات ، مثل تلك المشاركة في إنتاج الحبيبات واستجابات النسخ السريعة اللازمة للتخلص الفعال من مسببات^{الأمراض 17}. عندما يتم تعبئة العدلات إلى المواقع الالتهابية عبر الانجذاب الكيميائي ، فإن الهجرة عبر البطانة تضغط على مركب الرابط المركب للهيكل النووي / الهيكل الخلوي (LINC) ، مما يؤدي إلى إعادة تشكيل الكروماتين والمزيد من إمكانات^{التنشيط 18}. في الإنتان ، تظهر العدلات المنشطة "تحولا نوويا يسارا" ، مع مورفولوجيا غير طبيعية للكروماتين ، مثل النوى ثنائية أو غير المفصصة وتكثيف الكروماتين الأكثر مرونة¹⁹. ينتج عن هذا زيادة إمكانية الوصول داخل مناطق الجينات المرتبطة بالاستجابة الالتهابية ، مما يؤدي إلى تعبير كبير عن هذه الجينات. إذا لم يتم السيطرة على العدوى على النحو الواجب ، فإن الهيستون سيترولين وتفكيك الكروماتين اللاحق ضروريان لتكوين NETs^20،21. لذلك ، فإن فهم بنية كروماتين العدلات أمر بالغ الأهمية لتطوير بيولوجيا العدلات وتطوير علاجات للأمراض الالتهابية وأمراض المناعة الذاتية ، مما يوفر الأمل في علاج الأمراض في المستقبل.

تعمل إمكانية الوصول إلى الكروماتين كمقياس لبنية الكروماتين على المستوى الجينومي. يشير إلى كيف يسمح بالمناطق الجينومية جسديا للمعززات والمحفزات والعوازل وعوامل ربط الكروماتين وكيف تؤثر هذه العناصر على التعبير الجيني²². مقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه عبر الترانسبوزاز مع التسلسل (ATAC-seq) هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين عبر الجينوم²³. لا يتطلب معرفة مسبقة بالعناصر التنظيمية ، مما يجعله أداة قوية للبحوث اللاجينية تتضمن هذه الطريقة عزل نوى العينات ، وتجزئة الحمض النووي الجيني بواسطة الترانسبوزاز Tn5 ، وإضافة بادئات التسلسل لإعداد المكتبة ، والتسلسل ، وتحليل البيانات²³. كان ATAC-seq مفيدا في دراسة رسم خرائط النيوكليوسوم ، وتحليل ربط عامل النسخ ، والآليات التنظيمية في أنواع الخلايا المختلفة أو الأمراض ، وتحديد المحسن الجديد ، واكتشاف المؤشرات الحيوية ، وما إلى ذلك^22،23. غالبا ما يتم دمجه مع تقنيات أخرى ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، لإجراء تحليل شامل للتعبير الجيني.

طورت ATAC-seq معرفتنا ببيولوجيا العدلات من خلال الكشف عن آليات جينية دقيقة في الصحة والمرض. لقد كشفت عن العديد من عوامل النسخ الرئيسية (مثل RUNX1 ، KLF6 ، PU.1 ، إلخ) في نضوج العدلات واستجابات المستجيب^24،25 ، واكتشفت تواقيع خاصة بمسببات الأمراض مع إمكانات المؤشرات الحيوية في الإنتان²⁶ ، وأوضح الآليات اللاجينية للذاكرة المناعية الفطرية¹² ، وحدد الأهداف العلاجية في ابيضاض الدم النخاعي الحاد لدى الأطفال (AML) ²⁷. ومع ذلك ، كمكون خلوي بارز في المراقبة المناعية ، تظهر العدلات حساسية عالية لبيئتها الخارجية وبالتالي تشكل تحديا لإنتاج بيانات ATAC-seq عالية الجودة. في ظل الظروف الفسيولوجية ، تم الإبلاغ عن متوسط عمر النصف للعدلات البشرية 3.8 يوما ، في حين أن متوسط عمر النصف لعدلات الفئران هو 12.5 ساعة. من الجدير بالذكر أن نصف عمرها أقصر بكثير عند دراستها في المختبر^28،29. أثناء التشغيل المختبري للعدلات المعزولة ، يمكن أن يؤدي التعرض للكائنات الحية الدقيقة أو الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) ، بالإضافة إلى الإجراءات التجريبية الزائدة عن الحاجة والعمليات القاسية ، إلى تنشيط العدلات الشاذ وتقليل قابلية الخلايا للبقاء الخلوي بسبب موت الخلايا المبرمج أو NETosis. تحتوي الخلايا الميتة عادة على كميات كبيرة من الحمض النووي غير الكروماتيني الشديد التأثر ب Tn5 ، مما يؤدي إلى رفع ضوضاء الخلفية ل ATAC-seq²³.

هنا ، نقترح بروتوكولا قابلا للتطوير لإعداد مكتبات ATAC-seq المحسنة للعدلات المشتقة من عينات نخاع عظم القوارض. يقدم الشكل 1 نظرة عامة رسومية على البروتوكول ، والذي يشمل الفصل المناعي المغناطيسي للعدلات عن نخاع العظام ، متبوعا ب ATAC-seq. يضمن الفرز المناعي المغناطيسي المحسن الجدوى المثلى للعدلات قبل استخراج النواة لمكتبة ATAC-seq ، وبالتالي ضمان الجودة العالية للمكتبات وتسهيل دمج تقييمات العدلات الإضافية في المخطط. سيساعد تنفيذ هذا البروتوكول الباحثين في فهم ميزات بنية الكروماتين وآليات إعادة البرمجة اللاجينية للعدلات عند تعرضها لتحديات بيئية جزئية مختلفة. من المتوقع أن يكون لهذا تطبيقات واسعة في دراسات المناعة الأساسية والسريرية.

امتثلت جميع الإجراءات الحيوانية المعروضة أدناه مع المبادئ التوجيهية واللوائح الوطنية للأخلاقيات ورعاية ، والتي تمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات أبحاث رعاية التابعة لجامعة العاصمة الطبية ، بكين ، الصين (sjtkl11-1x-2022 (060)).

1. تحضير معلقات خلايا نخاع العظم (BMC)

1. اختر ذكور الفئران C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ووزنهم 19-21 جم. قتل الفئران الرحيم باستخدام حجرة ثاني أكسيد الكربون₂ ، متبوعا بخلع عنق الرحم بعد اختفاء المنعكس العميق. تطهيرها برذاذ الإيثانول بنسبة 70٪ على حصيرة التشريح.
2. استخدم مقصا صغيرا وملقطا لفصل عظم الفخذ بعناية عن مفصل الورك والساق ، وإزالة الجلد المتصل والعضلات الهيكلية ، وشطف عظم الفخذ بمحلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات (PBS) في طبق بتري مقاس 10 سم.
3. اقطع مشاشية عظم الفخذ ، وأدخل برفق إبرة 28 جم متصلة بحقنة سعة 2 مل في تجويف النخاع ، وقم بإخراج نخاع العظم باستخدام PBS البارد الذي يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني (FBS).
4. كرر الخطوة السابقة حتى يصبح السائل الأحمر الداكن الشفاف. عادة ما تكون هناك حاجة إلى ثلاث تدفقات.
   ملاحظة: تجنب إدخال الإبرة بعمق شديد في تجويف نخاع العظم لضمان اكتساب الخلايا الأمثل.
5. استخدم مصفاة خلية 70 ميكرومتر لتصفية معلق الخلية في أنبوب فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) (5 مل).
6. قم بتحلل كريات الدم الحمراء في BMCs باستخدام مخزن مؤقت تجاري لتحلل كريات الدم الحمراء بدون بولي فورمالدهايد.
   1. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية ، وترك ما يقرب من 100 ميكرولتر من السائل في الأسفل ، واضغط برفق على الأنبوب لفك الحبيبات.
   2. أضف 2 مل من محلول التحلل المخفف من محلول تحلل كريات الدم الحمراء (10x) ، واخلطه عن طريق قلب الأنبوب رأسا على عقب ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق النقر اللطيف.
   3. اغسل الخلايا مرتين باستخدام وسيط RPMI 1640 الذي يحتوي على 10٪ FBS وأعد تعليقها بحجم 2 مل.
      ملاحظة: عند التعامل مع كتل الخلايا غير المتناثرة، يوصى باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لإخراجها بدلا من تصفية معلقات الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. يمكن أن تقلل هذه الطريقة من فقدان الخلايا.
7. احسب الجدوى الخلوية والعدد الإجمالي للخلايا الحية لكل عينة باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق.

2. وضع العلامات المغناطيسية المناعية للعدلات بالخرز المغناطيسي المضاد ل Ly6G

1. أعد تعليق خلايا نخاع العظم (~ 2 × 10⁷ خلايا حية لكل فأر) في 2 مل من وسط RPMI 1640 الذي يحتوي على 10٪ FBS وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية.
   ملاحظة: نظرا للمتطلبات المحدودة المتمثلة في 1 × 10⁵ خلايا ل ATAC-seq ، يمكن تخصيص العدلات الفائضة لتحليلات جينومية إضافية (على سبيل المثال ، ChIP-seq و Hi-C) أو تقييمات وظيفة المناعة (على سبيل المثال ، إنتاج السيتوكين ، البلعمة ، و NETs) باستخدام العدلات التي تم الحصول عليها من نفس الفأر.
2. استنشق معظم المادة الطافية ، تاركا وراءه ما يقرب من 100 ميكرولتر ، واضغط برفق على الأنبوب لفك الحبيبات.
3. أضف 30 ميكرولتر من حبات Ly6G واخلطها مع BMCs عن طريق النقر اللطيف.
   ملاحظة: يجب أن تكون الخرزات المغناطيسية دوامة لمدة لا تقل عن 10 ثوان قبل الاستخدام. بعد إضافة الخرزات إلى BMCs ، يوصى بالامتناع عن الدوامة.
4. احتضان الأنبوب عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
5. أضف 2 مل من PBS لإعادة تعليق الخرز والخلايا ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية.
6. استنشق معظم المادة الطافية ، تاركا وراءه ما يقرب من 100 ميكرولتر ، واضغط برفق على الأنبوب لفك الحبيبات. أضف PBS إضافيا لحجم نهائي قدره 1 مل.
   ملاحظة: عند التعامل مع كتل الخلايا غير المتناثرة، يوصى باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لإخراجها بدلا من تصفية معلقات الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. يمكن أن تقلل هذه الطريقة من فقدان الخلايا.

3. فصل العدلات مع فرز الخلايا المغناطيسية المناعية

1. عالج عمود MS مسبقا باستخدام PBS.
   1. ضع عمود MS داخل المجال المغناطيسي لفاصل فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) المتوافق. ضع أنبوبا غير مأهول سعة 5 مل أسفل تصريف السائل من عمود MS.
   2. اشطف العمود ب 500 ميكرولتر من PBS. كرر هذه الخطوة بعد التدفق الكامل لبرنامج تلفزيوني إلى عمود MS.
      ملاحظة: يجب السماح ل PBS بالتدفق تدريجيا ، قطرة قطرة ، في أنبوب فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) سعة 5 مل عبر عمود MS. تأكد من عدم دخول الهواء إلى العمود ، لأن فقاعات الهواء قد تعيق العمود.
2. قم بتطبيق تعليق BMC المسمى مغناطيسيا على عمود MS عن طريق إضافة 500 ميكرولتر في المرة الواحدة ، وإعادة تعبئته على الفور بمجرد إفراغ خزان العمود.
   ملاحظة: تأكد من خلو معلقات الخلية من كتلة الخلية. إذا لزم الأمر ، ضع أنبوب FACS جديد سعة 5 مل أسفل عمود MS لجمع الخلايا غير المسماة (على سبيل المثال ، الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية) قبل هذه المرحلة.
   ملاحظة: لاحظ معدل تدفق القطرات. قد يشير معدل التدفق البطيء إلى أن عمود الفرز معوق.
3. اغسل عمود MS بإضافة 500 ميكرولتر من PBS في كل مرة يكون فيها الخزان فارغا ، وكرر هذه العملية مرتين.
   ملاحظة: قد تؤدي الإضافة المبكرة ل PBS إلى إعاقة دخول خلايا معينة إلى عمود الفرز ، مما قد يضر بنقاء فرز الخلايا.
4. اجمع العدلات المصنفة مغناطيسيا.
   1. بمجرد نفاد خزان العمود ، قم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي وضعه بعناية على أنبوب سعة 5 مل.
      ملاحظة: قبل إزالة العمود ، تأكد من عدم وجود سائل متبقي بداخله لمنع فقدان العدلات بسبب تصريف القطرات أثناء العملية. يمكن إزالة البقايا الموجودة في العمود باستخدام ماصة.
   2. قم بتوزيع 2 مل من PBS على العمود ، ثم ادفع المكبس على الفور وبقوة إلى العمود لطرد العدلات المسماة مغناطيسيا.
      ملاحظة: للحصول على عدلات كافية ، تأكد من حجم الشطف الكافي والبقاء قصيرا عند دفع المكبس في العمود.
5. استخدم مقياس كثافة الدم لتعداد الخلايا المعزولة. تحديد نقاء العدلات المعزولة عن طريق أخذ 100 ميكرولتر من معلق الخلية بعد الفرز وتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي.

4. استخراج النواة

1. جهاز الطرد المركزي ل 50.000 معلق أحادي الخلية يحتوي على العدلات عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية في أنبوب 0.2 مل ، ثم تخلص من المادة الطافية.
2. أعد تعليق العدلات في 50 ميكرولتر من محلول التحلل المبرد مسبقا (راجع الجدول 1) ، واخلط المحلول برفق باستخدام ماصة ، واحتضنه على الجليد لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: إذا كان حجم العينة أقل من 5 ميكرولتر ، فإن إضافة المخزن المؤقت للتحلل مسموح به. لا يتجاوز تركيز تعليق الخلية 1 × 10⁷ خلايا / مل.
3. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من المادة الطافية واجمع النواة. ضع الأنبوب على الجليد قبل البدء في الإجراءات اللاحقة.
   ملاحظة: لتقليل فقد العينة ، قم بالإشارة إلى جانب جدار الأنبوب حيث تتراكم الكريات وتستنشق السائل برفق من الجانب الآخر عند إزالة المادة الطافية.

5. علامات النيوكليوسوم المربوطة بالينقولاز

1. قم بإعداد مزيج تفاعل العلامات الذي يحتوي على Tn5 transposase في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وفقا لإرشادات مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي (راجع الجدول 2) وقم بتسخين حبات تنقية الأمبليكون المبردة مسبقا عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
2. أعد تعليق نواة العدلات ب 50 ميكرولتر من مزيج تفاعل الوسم وحركه برفق باستخدام ماصة ، متبوعا بالطرد المركزي لمدة 5 ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (~ 2600 × جم).
3. احتضان أنبوب التفاعل في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. أضف 100 ميكرولتر من حبات تنقية الأمبليكون الدوامة مسبقا إلى المحللة ، ثم امزج الخرزات المغناطيسية جيدا في المحلول عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات.
   ملاحظة: الخرزات المغناطيسية لزجة ويمكن تثبيتها بسهولة بأطراف الماصة، وبالتالي، تأكد من شفط الحجم الصحيح وتوزيعها ببطء من الأطراف عند نقل الخرز.
5. احتضان أنبوب التفاعل عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم قم بطرده لمدة 5 ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (~ 2600 × جم).
6. قم بتنقية جزء الحمض النووي المتقطع عن طريق وضع أنبوب التفاعل على رف مغناطيسي حتى يصبح المحلول صافيا (حوالي 5 دقائق). ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الخرز المغناطيسي.
7. اغسل الخرزة المغناطيسية ب 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ في كل مرة ، مع الاحتفاظ بأنبوب التفاعل على الرف المغناطيسي لمدة 30 ثانية. تجنب إزعاج الخرز عند إضافة الإيثانول. كرر الإجراء الموضح في الخطوة 5.7.
8. قم بالطرد المركزي لأنبوب التفاعل باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (حوالي 2600 × جم) ، وشفط الإيثانول بأطراف ماصة 10 ميكرولتر ، ثم جفف الخرزات المغناطيسية لمدة 3-5 دقائق أثناء فتح الغطاء.
   ملاحظة: قد تختلف فترات تجفيف الخرز المغناطيسي باختلاف المناطق بسبب الاختلافات في مستويات الرطوبة. يجب تجفيف الخرزات حتى تفقد لمعانها. يمكن أن يؤدي الإفراط في التجفيف إلى تعقيد عملية الشطف، في حين أن التجفيف غير الكافي قد يؤدي إلى وجود بقايا الكحول، مما يؤثر على التجارب اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن وضع الرف المغناطيسي أفقيا أكثر ملاءمة للتجفيف المنتظم للخرز المغناطيسي.
9. بعد إزالة أنبوب التفاعل من الرف المغناطيسي ، أضف 26 ميكرولتر من ddH₂O لتغطية الخرز المغناطيسي ، مع سحب العينة لأعلى ولأسفل لضمان الخلط الشامل. ثم احتضن عند 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
   ملاحظة: قم بتمديد مدة الحضانة بشكل مناسب إذا كانت الخرزات المغناطيسية جافة بشكل مفرط.
10. قم بالطرد المركزي لأنبوب التفاعل لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (حوالي 2600 × جم) وافصل الخرزات المغناطيسية باستخدام رف مغناطيسي حتى يصبح المحلول واضحا (حوالي 5 دقائق).
11. انقل المادة الطافية سعة 24 ميكرولتر بعناية إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد.

6. بناء المكتبة لتسلسل الجيل التالي (NGS)

1. قم بإعداد مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنبوب معقم باستخدام شظايا الحمض النووي المنقى والبادئات التي تحتوي على محولات التسلسل (راجع الجدول 3).
2. إجراء تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باتباع الإجراءات الموصى بها (راجع الجدول 4) ، وعادة ما يتطلب حوالي 1 ساعة.
   ملاحظة: قد يتم إيقاف التجربة مؤقتا بعد هذا الإجراء ، ويمكن تخزين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عند -20 درجة مئوية أو أسبوعين على الأقل.
3. أضف 27.5 ميكرولتر من حبات تنقية الأمبليكون الدوامة مسبقا إلى 50 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ثم امزج الخرزات المغناطيسية جيدا في المحلول عن طريق سحب الخرز لأعلى ولأسفل 10 مرات.
   ملاحظة: يمكن أن تؤدي النسبة غير الصحيحة للخرز المغناطيسي إلى منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى تناقضات في أطوال الأجزاء التي تم فرزها. استخدم ddH₂O لملء الحجم المتبخر لمنتج PCR إلى 50 ميكرولتر. تأكد من شفط الحجم المناسب من الخرز المغناطيسي وتوزيعها ببطء من أطراف الماصة لتقليل الخرزات التي قد تكون متصلة.
4. احتضان أنبوب التفاعل عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 5 ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (حوالي 2600 × جم).
5. قم بتنقية الحمض النووي للمكتبة عن طريق وضع أنبوب التفاعل على رف مغناطيسي حتى يصبح المحلول واضحا (حوالي 5 دقائق). بعد ذلك ، انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب PCR معقم جديد وتخلص من الخرزات المغناطيسية.
6. أضف 50 ميكرولتر من حبات تنقية الأمبليكونات الدوامة مسبقا إلى المادة الطافية ، ثم اخلطي الخرزات المغناطيسية جيدا في المحلول عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات.
7. احتضان أنبوب التفاعل عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 5 ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (حوالي 2600 × جم).
8. ضع أنبوب التفاعل على رف مغناطيسي حتى يصبح المحلول صافيا (حوالي 5 دقائق) ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الخرز المغناطيسي.
9. اغسل الخرزة المغناطيسية مرتين ب 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ في كل مرة ، مع الاحتفاظ بأنبوب التفاعل على الرف المغناطيسي لمدة 30 ثانية. تجنب إزعاج الخرز عند إضافة الإيثانول.
10. جفف الخرزات المغناطيسية لمدة 5 دقائق أثناء فتح الغطاء.
11. بعد إزالة أنبوب التفاعل من الرف المغناطيسي ، أضف 22 ميكرولتر من ddH₂O لتغطية الخرز المغناطيسي ، مع سحب العينة لأعلى ولأسفل لمدة 10 مرات لضمان الخلط الشامل. ثم احتضن عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
12. قم بالطرد المركزي لأنبوب التفاعل لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (حوالي 2600 × جم) وافصل الخرزات المغناطيسية باستخدام رف مغناطيسي حتى يصبح المحلول واضحا (حوالي 5 دقائق).
13. انقل المادة الطافية سعة 20 ميكرولتر بعناية إلى أنبوب PCR معقم جديد وقم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: للحصول على مكتبة ذات توزيع طول أكثر تركيزا ، ضع في اعتبارك استخدام مجموعة استرداد الهلام لفرز المنتج المضخم. بدلا من ذلك ، إذا لم تكن هناك متطلبات محددة لنطاق توزيع الطول ، فيمكن تنقية المنتج المضخم مباشرة باستخدام حبة مغناطيسية أو مجموعة تنقية عمود بدون فرز الطول.

7. مراقبة جودة المكتبة وتسلسلها

1. استخدم منصات محلل أجزاء الحمض النووي لتقييم توزيع طول الحمض النووي للمكتبة.
2. استخدم منصات NGS لإجراء تسلسل عالي الإنتاجية على المكتبات التي اجتازت فحص الجودة.

تم استخدام البروتوكول الموضح لعزل العدلات من نخاع العظام للفئران C57BL / 6 ومقارنة تباينها في إمكانية الوصول إلى الكروماتين قبل وبعد تحفيز عديدات السكاريد الدهنية (LPS) عبر ATAC-seq. عادة ، يمكن حصاد 2 × 10⁷ BMCs من كل من عظم الفخذ لفأر C57BL / 6 البالغ من العمر 6-8 أسابيع ، وبالتالي ، يمكن عزل 2-5 × 10⁶ عدلات. من بينها ، يتم استخدام 1 × 10⁵ خلايا ل ATAC-seq ، بينما يمكن تخصيص الخلايا الفائضة لتحليل العدلات الشامل.

تم اعتماد التنميط المناعي FACS لتحديد نقاء العدلات وقابليتها للبقاء بعد الفرز المناعي المغناطيسي (الشكل 2). على الرغم من أن توزيع منطقة التشتت الأمامية (FSC-A) ومنطقة التشتت الجانبي (SSC-A) وحدها يمكن أن يوفر تقديرا ، فقد تم استخدام تلطيخ محدد لعلامة العدلات هنا لإثبات تأثير الفرز. بعد بوابة FSC-A و SSC-A ، تم بوابات الخلايا باستخدام FSC-A وارتفاع التشتت الأمامي (FSC-H) لتمييز الخلايا المفردة عن الخلايا المجمعة. تم تحديد حوالي 99٪ من خلايا ما بعد الفرز على أنها مفردة. بعد ذلك ، تم استبعاد 7-أمينو أكتينومايسين D (7AAD) ، وهي صبغة حمض نووي تفرز الخلايا الحية بكفاءة ، لتسمية الخلايا وتحديد >99٪ من الجدوى من الخلايا المفردة بعد الفرز. تم تصنيف CD11b و CD48 أيضا لتحديد الخلايا النخاعية وتمييز العدلات عن الخلايا الوحيدة داخل الخلايا النخاعية ، على التوالي. في BMCs للفئران C57BL / 6 ، شكلت الخلايا النخاعية 46.7٪ من الخلايا القابلة للحياة ، حيث تمثل العدلات 76.4٪ من مجموعة الخلايا النخاعية. بعد الفرز المناعي المغناطيسي ، تم التحقق من نقاء العدلات داخل الخلايا القابلة للحياة بنسبة 98.5٪ ، مما يلبي متطلبات بناء مكتبة ATAC-seq.

بعد إنشاء مكتبة ATAC-seq ، خضع الحمض النووي المنقى لتحليل توزيع الطول باستخدام محلل شظايا الحمض النووي. أظهرت النتائج طولا يتراوح بين 100 نقطة أساس و 1000 نقطة أساس مع عدم وجود تلوث صغير أو كبير بشظايا (الشكل 3 أ). يتم تفصيل تركيزات مكتبات ATA-seq وكميات بيانات التسلسل في الجدول 5. بعد تلقي بيانات التسلسل ، قمنا أيضا بفحص توزيع الطول لأجزاء ATAC-seq (الشكل 3 ب). نظرا لأن وضع علامات على الينقولات Tn5 ينتج نمط حجم توقيع للشظايا المشتقة من المناطق الخالية من النوكليوسوم (NFR ، < 100 نقطة أساس) ، أحادي النوكليوسوم (~ 200 نقطة أساس) ، ثنائي النوكليوسوم (~ 400 نقطة أساس) ، ثلاثي النوكليوسوم (~ 600 نقطة أساس) وقليل النوكليوسوم الأطول من مناطق الكروماتين المفتوحة الأخرى ، يجب أن تولد تجربة ATAC-seq الناجحة بشكل منسق مخطط توزيع حجم الشظية النموذجي مع قمم متناقصة دورية تتوافق مع مضاعفات الأعداد الصحيحة للنيوكليوسومات (الشكل 3 ب). تم تحديد التعديلات في قمم ATAC-seq بشكل عام لتوضيح المشهد الديناميكي لمناطق الكروماتين المفتوحة. كما هو موضح في الشكل 3C ، يجب تصوير المناطق التي تحتوي على إشارات ATAC-seq متزايدة أو منخفضة بواسطة خرائط حرارية واضحة. ثم قمنا بتحليل إمكانية الوصول إلى الجينات للكروماتين بحثا عن العوامل الالتهابية التي تتأثر بشكل أساسي بتحفيز LPS ، مثل IL10 و Stat1 و Il12a و Cxcl1 و Irak1 ، ووجدنا أن هذه الجينات لديها إمكانية وصول أعلى في العدلات المحفزة ل LPS (الشكل 3 د). مجتمعة ، كانت مراقبة الجودة لمكتبة ATAC-seq التي أنشأناها مرضية ، وكانت البيانات المنتجة كافية لتحليل التغيرات اللاجينية لعدلات الفئران بعد تحفيز LPS.

الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على بروتوكول إعداد مكتبة ATAC-seq للعدلات. تتبع النظرة العامة إعداد معلقات BMCs ، ووضع العلامات على العدلات بالخرز المغناطيسي المضاد ل Ly6G ، وفصل العدلات عن طريق الفرز المناعي المغناطيسي ، واستخراج نواة العدلات ، ووضع العلامات المربوطة بالنيوكليوسوم ، وبناء مكتبة NGS ، والتسلسل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تقييم نقاء العدلات وقابليتها للبقاء باستخدام FACS قبل وبعد الفرز المغناطيسي المناعي. (أ) خضعت BMCs و (B) العدلات المعزولة للتلطيخ بمضادات CD11b و anti-Ly6G و anti-CD48 و 7AAD وفقا لبروتوكول موحد. بعد ذلك ، تم فصل الخلايا المفردة من إجمالي عدد الخلايا ، باستثناء الخلايا الميتة التي تحتوي على 7AAD. ثم تم بوابات الخلايا النخاعية من الخلايا الحية ، وأخيرا ، تم فصل العدلات من مجموعة الخلايا النخاعية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تقييم جودة مكتبة ATAC-seq المحضرة من عدلات نخاع عظم الفئران. (أ) تم تحديد توزيع طول الحمض النووي للمكتبة الذي تم تحليله بواسطة محلل شظايا الحمض النووي ، و (ب) لجزء ATAC-seq من خلال بيانات التسلسل. (ج) خريطة حرارية مكدسة للمناطق الجينومية التي تحقق إمكانية الوصول (± 10 كيلو بايت حول مركز تلك القمم) في العدلات غير المعالجة والمحفزة ب LPS. (د) وجهات نظر عارض الجينوم التكاملي (IGV) لإشارات ATAC-seq في مواقع الجينات التمثيلية المقابلة للعوامل الالتهابية ، حيث تمثل قمم الإشارة الحمراء والسوداء العدلات غير المعالجة والمحفزة ل LPS ، على التوالي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: صياغة عازلة التحلل لاستخراج النواة.

الجدول 2: تحضير مزيج تفاعل الوسم.

الجدول 3: تحضير مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لبناء مكتبة NGS.

الجدول 4: الإجراءات الموصى بها لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لبناء مكتبة NGS.

الجدول 5: نظرة عامة على بيانات تركيز مكتبة ATAC-seq وتسلسلها.

تشير هذه المخطوطة إلى بروتوكول تجريبي لإعداد مكتبات ATAC-seq المحسنة للعدلات المشتقة من عينات نخاع عظم القوارض. نظرا لكون العدلات شديدة الحساسية والخلايا المناعية التي يتم تنشيطها بسهولة ، أعطت جهود التحسين الأولوية للحفاظ على صلاحية العدلات المعزولة. قد يؤدي العلاج غير السليم إلى NETosis وأشكال أخرى من موت الخلايا ، مما يؤدي إلى إطلاق كميات كبيرة من الحمض النووي غير الكروماتيني وبالتالي المساهمة في ضوضاء الخلفية²³. قمنا بتبسيط الإجراء قبل استخراج النواة واخترنا عازلة تحلل كريات الدم الحمراء بدون بولي فورمالديهايد. على عكس عينات الدم المحيطية ، فإن الحد الأدنى من كريات الدم الحمراء يتطلب فترة حضانة قصيرة من BMCs مع محلول تحلل كريات الدم الحمراء ، مما يقلل بشكل فعال من فقدان العدلات مع ضمان الذوبان الشامل لكريات الدم الحمراء. لتقليل المحفزات غير الضرورية ، من الضروري تسخين جميع الكواشف مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل احتضانها باستخدام BMCs والتعامل معها بعناية فائقة ، وتجنب أنشطة مثل الدوامة ، والترشيح المتكرر باستخدام مصافي الخلايا ، والطرد المركزي المطول مع سرعة الدوران المفرطة ، إلخ. تعمل التحسينات في الإجراءات المذكورة أعلاه على تحسين قابلية بقاء العدلات المصنفة ، وبالتالي تهيئة الظروف المؤاتية لمكتبات ATAC-seq عالية الجودة.

لقد استكشفنا ثلاث تقنيات فرز مستخدمة على نطاق واسع للحصول على العدلات ذات الجدوى المثلى: الفصل المغناطيسي المناعي ، والطرد المركزي المتدرج للكثافة ، وفرز قياس التدفق الخلوي. عند إجراء الطرد المركزي المتدرج للكثافة ، يمكن للعدلات عبور طبقة سائل الفصل ، مما قد يؤدي إلى الضغط التناضحي وتكوين NET. عند إجراء فرز قياس التدفق الخلوي ، تواجه العدلات التي تمر عبر الفوهة محفزات بسبب قوة القص الميكانيكية. عادة ما تتجاوز مدة الفرز ساعة واحدة ، ويتناقص التركيز الخلوي بعد الفرز ، مما يؤدي إلى فقدان أكبر للعدلات أثناء الفصل والطرد المركزي اللاحق. بالمقارنة مع النهجين أعلاه ، يحقق الفصل المغناطيسي المناعي نقاء 95٪ و 99.5٪ من صلاحية العدلات في غضون 30 دقيقة. في حين أن هذه المنهجية قد تؤدي إلى ارتفاع النفقات التجريبية ، إلا أننا نعتبرها ضرورية للحصول على نتائج بحثية يمكن الاعتماد عليها. باستثناء ATAC-seq ، يمكن أيضا دمج الفصل المغناطيسي المناعي مع التجارب الأخرى التي لها معايير صارمة لصلاحية العدلات ، مثل تقييمات وظائف المناعة (على سبيل المثال ، إنتاج السيتوكين ، البلعمة ، NETs ، إلخ) ، منهجيات "omics" (على سبيل المثال ، ChIP-seq ، Hi-C ، الأيض المستهدف واسع الطيف ، إلخ) ، وتجارب البيولوجيا الجزيئية الروتينية الأخرى. تسمح المنهجية المتكاملة بإجراء دراسات شاملة لوظائف العدلات والآليات ذات الصلة من وجهات نظر مختلفة داخل فأر واحد.

البروتوكول الموصوف هو مخطط قابل للتطوير يمكن توسيعه لاستيعاب العدلات من أنواع متنوعة ومصادر الأنسجة المختلفة. بناء على نسبة كريات الدم الحمراء في العينات ، ينصح بتحسين فترة الحضانة باستخدام المخزن المؤقت لتحلل كريات الدم الحمراء إلى الحد الأدنى مع ضمان كفاءة الذوبان الكافية. أثناء الفرز المناعي المغناطيسي ، تؤثر كمية الخرز المغناطيسي المستخدم بشكل كبير على نقاء الخلايا المعزولة. يجب أن يكون التحسين مصمما وفقا لكمية العينات من الخلايا المعالجة ونسبة العدلات. الحفاظ على نقاء العدلات هو التركيز الأساسي. وفقا لتجربتنا ، أضف 30 ميكرولتر من الخرز ل 2 × 10⁷ خلايا من عظم الفخذ و 50 ميكرولتر ل 4 × 10⁷ خلايا من عظم الفخذ واثنين من الظنبوب. نظرا لقابلية التكاثر الممتازة عبر دفعات مختلفة والنطاق الواسع لجرعة الأجسام المضادة ، لا يحتاج التحسين إلا إلى استكشاف في البداية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إنشاء مكتبات ATAC-seq عالية الجودة ومستقرة يتوقف على النسبة المناسبة من Tn5 transposase إلى النواة الخلوية المستثمرة³⁰. المبلغ الأمثل للاستثمار هو 50,000 نواة للعدلات المشتقة من نخاع عظم الفئران ، مع إجراء تعديلات طفيفة مطلوبة لعينات أخرى.

مجتمعة ، نقترح مخططا متكاملا للفرز المناعي المغناطيسي للعدلات واتباع إعداد مكتبة ATAC-seq ، والذي يبشر بالاستخدام المكثف في التحقيق في العدلات. سيساعد الباحثين في فهم ميزات بنية الكروماتين للعدلات ، والكشف عن آلياتهم التنظيمية للاستجابة الالتهابية وإعادة البرمجة اللاجينية في وجود تحديات بيئية دقيقة مختلفة ، وبالتالي الكشف عن الأهداف العلاجية المحتملة في حدوث المرض وتطوره^{12،24،25،26،27}.

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

تم دعم هذا العمل من خلال منح من برنامج البحث والتطوير التابع للجنة التعليم في بلدية بكين (KZ202010025041) والمعاهد الصينية للبحوث الطبية في بكين (المنحة رقم 10). CX24PY29).