マウス骨髄由来好中球のATAC-Seqライブラリー調製

この原稿では、マウスの骨髄から好中球のATAC-seqライブラリーを調製するためのプロトコルを概説し、最適な好中球の生存率と高いライブラリー品質を保証することを目的としています。BMCの調製、免疫磁気ソーティング、およびライブラリ構築に関するステップバイステップの説明を提供し、特に好中球の研究に新規参入する人にとって貴重なガイドとして機能します。

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with sequencing (ATAC-seq) は、クロマチンアクセシビリティを評価し、エピゲノム制御を理解するための強力でハイスループットな手法です。好中球は、免疫応答において重要な白血球タイプとして、分化および活性化中にクロマチン構造に大きな変化を生じ、その機能に必要な遺伝子発現に大きな影響を与えます。ATAC-seqは、好中球の成熟における主要な転写因子の発見、病原体特異的なエピゲノムシグネチャーの解明、自己免疫疾患の治療標的の同定に役立ってきました。しかし、好中球は外部環境に対する感度が高いため、高品質なATAC-seqデータの作成が難しくなっています。ここでは、げっ歯類の骨髄由来好中球からATAC-seqライブラリを調製するためのスケーラブルなプロトコルを提案し、最適な細胞生存率と高品質のライブラリを確保するための免疫磁気分離の改善を特徴としています。方法論の拡張のためのライブラリの品質と最適化の原則に影響を与える重要な要素について詳しく説明します。このプロトコルは、好中球のクロマチン構造とエピゲノムリプログラミングを研究する意欲のある研究者をサポートし、基礎免疫学および臨床免疫学の研究を前進させます。

好中球は、脊椎動物において最も豊富で重要な免疫細胞型の1つであり、ヒト白血球の50%〜70%を占めています¹。好中球は、宿主内の微生物を検出し、排除する上で中心的な役割を果たします。敗血症では、成熟した好中球がファーストレスポンダーの1つです²。彼らは走化性³を介して感染部位に迅速に動員し、微生物を摂取(食作用)、NADPHオキシダーゼ依存性活性酸素種の生成(呼吸バースト)、顆粒の分泌(脱顆粒)、および^{炎症部位に到着し}た細胞外細菌を捕まえて殺す好中球細胞外トラップ(NET)を形成することにより、病原体と戦う4.未熟な好中球も、ケモカインによって骨髄から末梢循環に迅速に動員されます^5,6。感染部位に引き寄せられたこれらの好中球は、造血、血管新生、創傷治癒などのいくつかの生理学的プロセスに関与するサイトカインも放出します^7,8。好中球数の減少をもたらす先天性疾患または後天性疾患に罹患している患者は、感染症にかかりやすくなります^9,10。しかし、好中球の活性化は諸刃の剣です。過剰な活性化とサイトカインの放出は、組織や臓器の損傷を引き起こし、感染が迅速に制御されない場合、多臓器機能障害につながる可能性があります^11,12。さらに、好中球はさまざまな炎症性疾患や自己免疫疾患にも寄与し、がんの進行や転移に影響を与える可能性があります^13,14。このことは、効果的な免疫応答と宿主への損傷を防ぐために、好中球活性の調節を研究する必要性を強調しています。

好中球では、クロマチンの構造は、分化、移動、活性化において明確かつダイナミックな変化を遂げ、細胞の寿命を通じて極めて重要な調節的役割を果たします。骨髄芽球の大きくて丸いユークロマチンに富む核から、骨髄球やメタミエロサイトのよりへこんだ核、そして多形核好中球^15,16のC字型またはS字型のインバンド細胞と、クロマチンが密集した高度にローブされた細胞へのこの旅は、好中球生物学の複雑さを証明しています。特殊なクロマチン配置は、顆粒の生成に関与する遺伝子や効果的な病原体排除に必要な迅速な転写応答など、好中球の機能に不可欠な遺伝子の選択的発現を保証します¹⁷。好中球が走化性を介して炎症部位に動員されると、経内皮移動は核骨格/細胞骨格複合体リンカー(LINC)複合体に圧力をかけ、クロマチンリモデリングとより多くの活性化の可能性を促します¹⁸。敗血症では、活性化された好中球は「核左シフト」を示し、二葉または非葉の核などの異常なクロマチン形態と著しく緩いクロマチン凝縮を示します¹⁹。これにより、炎症反応に関連する遺伝子領域内のアクセシビリティが高まり、これらの遺伝子の有意な発現が誘導されます。感染が適切に制御されていない場合、NETを形成するためには、ヒストンのシトルリン化とそれに続くクロマチンの分解が必要である^20,21。したがって、好中球クロマチンの構造を理解することは、好中球生物学を進歩させ、炎症性疾患や自己免疫疾患の治療法を開発するために重要であり、将来の疾患治療に希望を与えることができます。

クロマチンアクセシビリティは、エピゲノムレベルでのクロマチン構造の指標として機能します。これは、ゲノム領域がエンハンサー、プロモーター、絶縁体、およびクロマチン結合因子に対して物理的にどのように許容されるか、およびこれらの要素が遺伝子発現にどのように影響するかを示しています²²。トランスポゼーゼアクセス可能なクロマチンシーケンシングアッセイ(ATAC-seq)は、ゲノム全体のクロマチンアクセシビリティを評価するために広く使用されている手法です²³。規制要素に関する予備知識を必要としないため、エピジェネティック研究の強力なツールとなっています。この方法は、サンプルの核を単離し、トランスポゼースTn5によってゲノムDNAを断片化し、ライブラリ調製、シーケンシング、およびデータ解析のためのシーケンシングプライマーを添加することを含む²³。ATAC-seqは、ヌクレオソームマッピング、転写因子結合解析、さまざまな細胞タイプや疾患における制御メカニズム、新規エンハンサーの同定、バイオマーカーの発見などの研究に役立ってきました^22,23。多くの場合、RNAシーケンシングなどの他の技術と組み合わせて、遺伝子発現を包括的に解析します。

ATAC-seqは、健康と疾患における正確なエピジェネティックなメカニズムを明らかにすることにより、好中球生物学の知識を進歩させました。好中球の成熟とエフェクター応答におけるいくつかの重要な転写因子(すなわち、RUNX1、KLF6、PU.1など)を明らかにし^24,25、敗血症²⁶におけるバイオマーカー電位を持つ病原体特異的な特徴を明らかにし、自然免疫記憶のエピゲノムメカニズムを解明し¹²、小児急性骨髄性白血病(AML)²⁷における治療標的を特定しました.しかし、好中球は免疫監視における顕著な細胞成分として、外部環境に対して高い感度を示すため、高品質のATAC-seqデータを生成することが課題となっています。生理学的状況下では、ヒト好中球の半減期の中央値は3.8日と報告されていますが、マウス好中球の平均半減期は12.5時間です。in vitroで研究すると、それらの半減期がかなり短いことは注目に値します^28,29。単離された好中球のin vitro操作中、微生物や病原体関連分子パターン(PAMP)への曝露、および冗長な実験手順や過酷な操作は、アポトーシスまたはNETosisによる好中球の異常な活性化と細胞生存率の低下をもたらす可能性があります。死亡した細胞は、通常、Tn5に非常に感受性の高い大量のクロマチン化されていないDNAを収容しており、その結果、ATAC-seq²³のバックグラウンドノイズが上昇します。

ここでは、げっ歯類の骨髄サンプルに由来する好中球に最適化されたATAC-seqライブラリを調製するためのスケーラブルなプロトコルを提案します。 図1 は、骨髄からの好中球の免疫磁気分離とそれに続くATAC-seqを含むプロトコルのグラフィカルな概要を示しています。改良された免疫磁気ソーティングにより、ATAC-seqライブラリの核を抽出する前に好中球の最適な生存率が保証され、ライブラリの高品質が確保され、追加の好中球評価をスキームに組み込むことが容易になります。このプロトコルの実装は、研究者がさまざまな微小環境の課題にさらされたときの好中球のクロマチン構造の特徴とエピゲノムリプログラミングメカニズムを理解するのに役立ちます。これは、基礎および臨床免疫学研究において幅広い応用が期待されています。

以下に示すすべての動物処置は、中国・北京の首都医科大学の動物ケア研究倫理委員会(sjtkl11-1x-2022(060))によって承認された、国家倫理および動物福祉のガイドラインおよび規制に準拠しています。

1. 骨髄細胞(BMC)懸濁液の調製

1. 体重19〜21gの6〜8週齢の雄C57BL / 6Jマウスを選択します。CO₂ チャンバーを使用してマウスを安楽死させ、続いて深部反射が消失した後に頸部脱臼を行います。解剖マットの上で70%エタノールスプレーで消毒します。
2. 小さなハサミと鉗子を使用して、大腿骨を股関節と脛骨から慎重に分離し、付着した皮膚と骨格筋を取り除き、10cmのペトリ皿で大腿骨を冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすいでください。
3. 大腿骨骨端を切り取り、2mLシリンジに取り付けた28Gの針を骨髄腔に静かに挿入し、2%ウシ胎児血清(FBS)を含む冷たいPBSで骨髄を洗い流します。
4. フラッシュされた暗赤色の流体が半透明になるまで、前の手順を繰り返します。通常、3回のフラッシュが必要です。
   注:最適な細胞獲得を確保するために、針を骨髄腔に深く挿入しすぎないでください。
5. 70 μmのセルストレーナーを使用して、細胞懸濁液を蛍光活性化セルソーティング(FACS)チューブ(5 mL)にろ過します。
6. BMC中の赤血球を、ポリホルムアルデヒドを含まない市販の赤血球溶解バッファーで溶解します。
   1. チューブを500 x g で25°Cで5分間遠心分離し、上清を慎重に取り除き、底に約100 μLの液体を残し、チューブを軽くたたいてペレットを緩めます。
   2. 赤血球溶解バッファー(10倍)から希釈した溶解バッファー2mLを加え、チューブを3回逆さまにして混合します。その後、チューブを500 x g で5分間遠心分離し、上清を捨て、穏やかに軽くたたいて細胞ペレットを再懸濁します。
   3. 10% FBSを含むRPMI 1640培地で細胞を2回洗浄し、2 mLの容量に再懸濁します。
      注:未散乱の細胞塊を扱う場合は、70 μmの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をろ過する代わりに、200 μLのピペットチップを使用して細胞塊を拾い出すことをお勧めします。この方法により、細胞の損失を減らすことができます。
7. トリパンブルー染色により、サンプルあたりの細胞生存率と生細胞の総数を計算します。

2. 抗Ly6G磁気ビーズによる好中球の免疫磁気標識

1. 骨髄細胞(~2 x 10⁷ 個の生細胞/マウス)を 10% FBS を含む RPMI 1640 培地 2 mL に再懸濁し、500 x g で 25 °C で 5 分間遠心分離します。
   注:ATAC-seqに必要な細胞数が1 x 10⁵ であることを考えると、余剰の好中球は、同じマウスから得られた好中球を使用して、追加のエピゲノム解析(ChIP-seqやHi-Cなど)や免疫機能評価(サイトカイン産生、食作用、NETなど)に割り当てることができます。
2. 上清の大部分を吸引し、約100μLを残し、チューブを軽くたたいてペレットを緩めます。
3. 30 μLのLy6Gビーズを加え、軽くたたいてBMCと混合します。
   注意: 磁気ビーズは、使用前に最低10秒間ボルテックスする必要があります。BMCにビーズを添加した後は、ボルテックスを控えることをお勧めします。
4. チューブを25°Cで15分間インキュベートします。
5. 2 mLのPBSを添加してビーズと細胞を再懸濁し、500 x g で25°Cで5分間遠心分離します。
6. 上清の大部分を吸引し、約100μLを残し、チューブを軽くたたいてペレットを緩めます。PBSを追加して、最終容量を1 mLにします。
   注:未散乱の細胞塊を扱う場合は、70 μmの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をろ過する代わりに、200 μLのピペットチップを使用して細胞塊を拾い出すことをお勧めします。この方法により、細胞の損失を減らすことができます。

3. 免疫磁性細胞選別による好中球分離

1. MSカラムをPBSで前処理します。
   1. MSカラムを、互換性のある磁気活性化セルソーティング(MACS)セパレーターの磁場内に配置します。MS カラムから排出される液体の下に、空いている 5 mL チューブを配置します。
   2. カラムを 500 μL の PBS ですすいでください。PBSがMSカラムに完全に流れ込んだ後、この手順を繰り返します。
      注:PBSは、MSカラムを介して5 mLの蛍光活性化セルソーティング(FACS)チューブに、一滴ずつ徐々に流入させる必要があります。気泡がカラムを塞ぐ可能性があるため、カラムに空気が入らないようにしてください。
2. 磁気標識されたBMC懸濁液を一度に500 μLずつ加えてMSカラムに適用し、カラムリザーバーが空になったらすぐに補充します。
   注:細胞懸濁液に細胞塊がないことを確認してください。必要に応じて、新しい5 mL FACSチューブをMSカラムの下に置き、この段階の前に非標識細胞(単球やリンパ球など)を回収します。
   注意: 液滴の流量に注意してください。流量が遅い場合は、ソーティングカラムが詰まっている可能性があります。
3. リザーバーが空になるたびに 500 μL の PBS を加えて MS カラムを洗浄し、このプロセスを 2 回繰り返します。
   注:PBSの早期添加は、特定の細胞のソーティングカラムへの侵入を妨げ、細胞ソーティングの純度を損なう可能性があります。
4. 磁気標識された好中球を収集します。
   1. カラムリザーバーがなくなったら、カラムを磁場から取り出し、5 mLチューブに慎重に配置します。
      注:カラムを取り外す前に、プロセス中の液滴排出による好中球の損失を防ぐために、カラム内に液体が残っていないことを確認してください。カラム内の残留物は、ピペットを使用して除去できます。
   2. 2 mLのPBSをカラムに分注し、すぐにプランジャーをカラムにしっかりと押し込んで、磁気的に標識された好中球を排出します。
      注:十分な好中球を獲得するには、十分な溶出量を確保し、プランジャーをカラムに押し込むときは短くしてください。
5. 血球計算盤を使用して、単離された細胞を列挙します。単離された好中球の純度を特定するには、ソーティング後の細胞懸濁液100 μLを採取し、フローサイトメトリーで分析します。

4. 核の抽出

1. 好中球を含む50,000個の単一細胞懸濁液を500 x g で4°C、0.2 mLチューブ内で5分間遠心分離し、上清を捨てます。
2. 好中球を50 μLの予冷済み溶解バッファー( 表1を参照)に再懸濁し、ピペットを使用して溶液を穏やかに混合し、氷上で10分間インキュベートします。
   注:サンプル量が5 μL未満の場合は、Lysisバッファーを直接添加してもかまいません。細胞懸濁液濃度が1 x 10⁷ 細胞/mLを超えない。
3. 500 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清を捨てて核を回収します。その後の手順を開始する前に、チューブを氷の上に置きます。
   注:サンプルの損失を最小限に抑えるために、ペレットが蓄積するチューブ壁の側を示し、上清を除去するときは反対側から液体を穏やかに吸引します。

5. トランスポゼースによるヌクレオソームテザードタグメンテーション

1. DNA Library Prepキット( 表2参照)のガイドラインに従って、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブにTn5トランスポザーゼを含むTagmentation Reaction Mixを調製し、冷蔵アンプリコン精製ビーズを25°Cで少なくとも30分間予温します。
2. 好中球核を50 μLのタグメンテーション反応混合物で再懸濁し、ピペットで穏やかに撹拌した後、ハンドヘルド遠心分離機(~2600 x g)を使用して5秒間遠心分離します。
3. 反応チューブをPCR装置で37°Cで30分間インキュベートします。
4. 100 μLのボルテックス済みアンプリコン精製ビーズをライセートに加え、ピペッティングで10回上下して、磁気ビーズを溶液中で完全に混合します。
   注:磁気ビーズは粘着性があり、ピペットチップに簡単に付着するため、ビーズを移すときは、適切な量を吸引し、チップからゆっくりと分注してください。
5. 反応チューブを25°Cで5分間インキュベートした後、ハンドヘルド遠心分離機(~2600 × g)で5秒間遠心分離します。
6. 溶液が透明になるまで(約5分間)、反応チューブを磁気ラックに置いて、中断されたDNA断片を精製します。次に、磁気ビーズを乱さないように上澄みを慎重に取り除きます。
7. 反応チューブを磁気ラックに30秒間置いたまま、毎回200μLの新しく調製した80%エタノールで磁気ビーズを洗浄します。エタノールを添加する際にビーズを乱さないでください。手順 5.7 で説明した手順を繰り返します。
8. ハンドヘルド遠心分離機(約2600 × g)で反応チューブを遠心分離し、10 μLピペットチップでエタノールを吸引し、蓋を開けながら磁気ビーズを3〜5分間乾燥させます。
   注:磁気ビーズの乾燥時間は、湿度レベルの違いにより、地域によって異なる場合があります。ビーズは、輝きが失われるまで乾燥させる必要があります。乾燥しすぎると溶出プロセスが複雑になり、乾燥が不十分な場合、アルコール残留物が存在し、その後の実験に影響を与える可能性があります。さらに、磁気ラックを水平に配置すると、磁気ビーズの均一な乾燥が容易になります。
9. マグネティックラックから反応チューブを取り出した後、マグネティックビーズを覆うように26 μLのddH₂Oを加え、ピペッティングで上下に動かして完全に混合します。その後、25°Cで2分間インキュベートします。
   注:磁気ビーズが過度に乾燥している場合は、インキュベーション期間を適切に延長してください。
10. ハンドヘルド遠心分離機(約2600 × g)で反応チューブを短時間遠心分離し、溶液が透明になるまで磁気ラックを使用して磁気ビーズを分離します(約5分)。
11. 24 μLの上清を新しいPCRチューブに慎重に移します。

6. 次世代シーケンシング(NGS)のためのライブラリ構築

1. 精製されたDNAフラグメントとシーケンシングアダプターを含むプライマーを使用して、滅菌したチューブでPCR反応ミックスを調製します( 表3を参照)。
2. 推奨される手順( 表4を参照)に従ってPCR反応を行います(通常は約1時間かかります)。
   注:この手順の後、実験は一時的に停止することがあり、PCR産物は-20°Cまたは少なくとも2週間保存することができます。
3. 50 μL の PCR 産物に 27.5 μL のボルテックス済みアンプリコン精製ビーズを添加し、10 回ピペッティングして溶液中で磁気ビーズを十分に混合します。
   注:PCR産物に対する磁気ビーズの比率が正しくないと、ソーティングされたフラグメントの長さに不一致が生じる可能性があります。ddH₂Oを使用して、PCR産物の蒸発量を50 μLまで満たし、適切な量の磁気ビーズを吸引し、ピペットチップからゆっくりと分注して、付着する可能性のあるビーズを最小限に抑えます。
4. 反応チューブを25°Cで5分間インキュベートした後、ハンドヘルド遠心分離機(約2600 x g)で5秒間遠心分離します。
5. 溶液が透明になるまで(約5分間)、反応チューブを磁気ラックに置いて、ライブラリーDNAを精製します。次に、上清を新しい滅菌済みPCRチューブに慎重に移し、磁気ビーズを廃棄します。
6. 上清に50 μlのボルテックス済みアンプリコン精製ビーズを加え、ピペッティングを10回上下して、マグネティックビーズを溶液中で完全に混合します。
7. 反応チューブを25°Cで5分間インキュベートした後、ハンドヘルド遠心分離機(約2600 x g)で5秒間遠心分離します。
8. 溶液が透明になるまで(約5分間)、反応チューブを磁気ラックに置き、磁気ビーズを乱さないように上清を慎重に取り除きます。
9. マグネティックビーズを200μLの新しく調製した80%エタノールで毎回2回洗浄し、反応チューブをマグネティックラックに30秒間保持します。エタノールを添加する際にビーズを乱さないでください。
10. 蓋を開けながら磁気ビーズを5分間乾かします。
11. マグネティックラックから反応チューブを取り出した後、マグネティックビーズを覆うように22μLのddH₂Oを加え、ピペッティングを10回上下させて完全に混合します。その後、25°Cで5分間インキュベートします。
12. ハンド遠心分離機(約2600 × g)で反応チューブを短時間遠心分離し、溶液が透明になるまで磁気ラックを使用して磁気ビーズを分離します(約5分)。
13. 20 μLの上清を新しい滅菌済みPCRチューブに慎重に移し、-20°Cで保存します。
    注:より濃縮された長さ分布のライブラリを実現するには、ゲルリカバリーキットを使用して増幅された製品を選別することを検討してください。あるいは、長さ分布範囲に特定の要件がない場合は、増幅された生成物を磁気ビーズまたはカラム精製キットを使用して、長さの選別なしで直接精製することができます。

7. 図書館の品質管理とシーケンシング

1. DNAフラグメントアナライザープラットフォームを利用して、ライブラリDNAの長さ分布を評価します。
2. NGSプラットフォームを利用して、品質検査に合格したライブラリでハイスループットシーケンシングを実行します。

概説されたプロトコルは、C57BL/6マウスの骨髄から好中球を単離し、ATAC-seqを介してリポ多糖(LPS)刺激前と後カマチンアクセシビリティのそれぞれの分散を比較するために採用されました。通常、生後6-8週齢のC57BL/6マウスの両大腿骨から2 x 10⁷ BMCを採取し、その後、2-5 x 10⁶ 好中球を単離することができます。その中で、1 x 10⁵ 細胞をATAC-seqに使用し、余剰細胞を包括的な好中球解析に割り当てることができます。

FACSイムノフェノタイピングを採用して、免疫磁気選別後の好中球の純度と生存率を決定しました(図2)。前方散乱面積(FSC-A)と側方散乱面積(SSC-A)の分布だけで推定できるが、ここでは特定の好中球マーカー染色を用いてソーティング効果を実証した。FSC-AおよびSSC-Aゲーティングに続いて、FSC-Aおよび前方散乱高さ(FSC-H)を使用してセルをさらにゲーティングし、単一セルと凝集セルを区別しました。ソーティング後の細胞の約99%が単一細胞として同定されました。次に、生細胞によって効率的に排泄されるDNA色素である7-アミノアクチノマイシンD(7AAD)を除外して細胞を標識し、選別後の単一細胞からの生存率の>99%を特定しました。CD11bおよびCD48をさらに標識して、骨髄細胞を同定し、骨髄細胞内の単球から好中球をそれぞれ区別した。C57BL/6マウスのBMCでは、骨髄系細胞が生存細胞の46.7%を占め、好中球が骨髄系細胞集団の76.4%を占めていました。免疫磁気ソーティング後、生細胞内の好中球純度が98.5%であることが確認され、ATAC-seqライブラリ構築の要件を満たしました。

ATAC-seqライブラリーを構築した後、精製したDNAをDNAフラグメントアナライザーを用いて長さ分布解析を行いました。その結果、長さは 100 bp から 1000 bp で、小さいフラグメントも大きいフラグメントの汚染もありませんでした(図 3A)。ATA-seqライブラリの濃度とシーケンシングデータの量を 表5に示します。シーケンシングデータを受け取った後、ATAC-seqフラグメントの長さ分布も調べました(図3B)。Tn5トランスポゼースのタグメンテーションにより、ヌクレオソームフリー領域(NFR、< 100 bp)、モノヌクレオソーム(~200 bp)、ジヌクレオソーム(~400 bp)、トリヌクレオソーム(~600 bp)、および他のオープンクロマチン領域からのより長いオリゴヌクレオソームに由来するフラグメントのシグネチャーサイズパターンが生成されるため、ATAC-seq実験が成功すると、ヌクレオソームの整数倍に対応する周期的に減少するピークを持つ典型的なフラグメントサイズ分布プロットが協調的に生成されるはずです(図3B)。).ATAC-seqピークの変化は、一般に、オープンクロマチン領域のダイナミックなランドスケープを示すために同定されました。 図3Cに示すように、ATAC-seq信号が増加または減少した領域は、明確なヒートマップで表す必要があります。次に、IL10、Stat1、Il12a、Cxcl1、Irak1など、LPS刺激によって主に影響を受ける炎症性因子の遺伝子のクロマチンアクセシビリティを解析し、これらの遺伝子がLPS刺激好中球でより高いアクセシビリティを持つことを発見しました(図3D)。以上を総合すると、構築したATAC-seqライブラリーの品質管理は満足のいくものであり、LPS刺激後のマウス好中球のエピジェネティックな変化を解析するのに十分なデータが得られました。

図1:好中球ATAC-seqライブラリ調製のプロトコールの概略図。 概要は、BMC懸濁液の調製、抗Ly6G磁気ビーズによる好中球の標識、免疫磁気選別による好中球分離、好中球核の抽出、ヌクレオソームテザリングタグメンテーション、NGSライブラリの構築、およびシーケンシングに続きます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:免疫磁気選別前後のFACSを用いた好中球の純度と生存率の評価。 (A)BMCおよび(B)単離された好中球は、標準化されたプロトコルに従って、抗CD11b、抗Ly6G、抗CD48、および7AADによる染色を受けました。続いて、7AADの死細胞を除く全細胞集団から単一細胞をゲートした。次に、骨髄系細胞を生細胞からゲート化し、最後に好中球を骨髄系細胞集団からゲート化しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:マウス骨髄好中球から調製したATAC-seqライブラリーの品質評価 (A)DNAフラグメントアナライザーで解析したライブラリーDNAの長さ分布、(B)ATAC-seqフラグメントの長さ分布をシーケンシングデータにより決定した。(C)未処理およびLPS刺激好中球におけるアクセシビリティ(ピークの中心付近±10kb)を達成したゲノム領域のパイルアップヒートマップ。(D)炎症性因子に対応する代表的な遺伝子座でのATAC-seqシグナルの統合ゲノミクスビューア(IGV)ビュー(赤と黒のシグナルピークは、それぞれ未処理とLPS刺激好中球を表します)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:核抽出用の溶解バッファーの組成。

表2:タグメンテーション反応ミックスの調製。

表3:NGSライブラリ構築のためのPCR反応ミックスの調製。

表4:NGSライブラリー構築のためのPCR反応の推奨手順。

表5:ATAC-seqライブラリの濃度とシーケンシングデータの概要。

この原稿では、げっ歯類の骨髄サンプルに由来する好中球に最適化されたATAC-seqライブラリを調製するための実験プロトコルを報告しています。好中球は非常に感受性が高く、容易に活性化される免疫細胞であるため、最適化の取り組みでは、単離された好中球の生存率を維持することが優先されました。不適切な治療は、NETosisおよび他の形態の細胞死を引き起こし、大量の非クロマチン化DNAの放出を促し、それによってバックグラウンドノイズ²³の一因となる可能性がある。核抽出前の手順を合理化し、ポリホルムアルデヒドを含まない赤血球溶解バッファーを選択しました。末梢血サンプルとは対照的に、赤血球の量が最小限であるため、赤血球溶解バッファーとのBMCの短いインキュベーション期間が必要であり、好中球の損失を効果的に最小限に抑えながら、赤血球の徹底的な溶解を確保します。不必要な刺激を最小限に抑えるためには、BMCとインキュベートする前にすべての試薬を37°Cに予熱し、ボルテックス、細胞ストレーナーによる繰り返しのろ過、過度の回転速度での長時間の遠心分離などの活動を避けて、細心の注意を払って取り扱うことが不可欠です。上記の手順の強化により、選別された好中球の生存率が向上し、高品質のATAC-seqライブラリに適した条件が整います。

私たちは、最適な生存率を持つ好中球を得るために広く使用されている3つのソーティング技術、すなわち免疫磁気分離、密度勾配遠心分離、フローサイトメトリーソーティングを検討してきました。密度勾配遠心分離を行うと、好中球が分離流体層を横切る可能性があり、浸透圧とNET形成につながる可能性があります。フローサイトメトリーのソーティングを行うと、ノズルを通過する好中球は機械的なせん断力による刺激を受けます。選別時間は通常1時間を超え、選別後には細胞濃度が低下するため、分離およびその後の遠心分離中に好中球の損失が大きくなります。上記の2つのアプローチと比較して、免疫磁気分離は30分以内に好中球の純度95%と生存率99.5%を達成します。この方法論は実験費用の増加につながる可能性がありますが、信頼できる研究成果を得るためには不可欠であると考えています。ATAC-seqを除き、免疫磁気分離は、免疫機能評価(サイトカイン産生、食作用、NETsなど)、「オミクス」方法論(ChIP-seq、Hi-C、広域スペクトル標的メタボロミクスなど)、その他の日常的な分子生物学実験など、好中球の生存率に厳しい基準を持つ他の実験と統合することもできます。この統合的な方法論により、好中球の機能と関連メカニズムを1匹のマウスでさまざまな視点から包括的に研究することができます。

記載されているプロトコルは、多様な種およびさまざまな組織源からの好中球に対応するために拡張できるスケーラブルなスキームです。サンプル中の赤血球比に基づいて、赤血球溶解バッファーとのインキュベーション期間を最小限に抑えながら、十分な溶解効率を確保することをお勧めします。免疫磁気選別では、使用される磁気ビーズの量が単離された細胞の純度に大きく影響します。最適化は、サンプルの処理された細胞の量と好中球比に合わせて調整する必要があります。好中球の純度を維持することが主な焦点です。私たちの経験によると、2つの大腿骨からの2 x 10⁷ 細胞には30 μLのビーズを、2つの大腿骨と2つの脛骨からの4 x 10⁷ 細胞には50 μLのビーズを追加します。異なるバッチ間での優れた再現性と幅広い抗体投与量により、最適化を最初に検討するだけで済みます。さらに、高品質で安定したATAC-seqライブラリーの作製は、Tn5トランスポゼースの細胞核に対する適切な比率に左右されます³⁰。最適な投資額は、マウスの骨髄由来好中球の場合は50,000核で、他のサンプルには微調整が必要です。

これらを総合すると、好中球の免疫磁気選別とそれに続くATAC-seqライブラリー調製の統合スキームを提案し、好中球の研究に広く利用されることが期待されます。これは、研究者が好中球のクロマチン構造の特徴を理解し、さまざまな微小環境課題の存在下での炎症反応とエピゲノムリプログラミングの調節メカニズムを明らかにするのに役立ち、それによって疾患の発生と進行における潜在的な治療標的を明らかにする12,24,25,26,27。

著者は何も開示していません。

この研究は、北京市教育委員会(KZ202010025041)および北京の中国医学研究所の研究開発プログラム(助成金番号)からの助成金によって支援されました。CX24PY29)。