Dieses Manuskript skizziert ein Protokoll zur Erstellung einer ATAC-seq-Bibliothek von Neutrophilen aus dem Knochenmark von Mäusen, mit dem Ziel, eine optimale Lebensfähigkeit der Neutrophilen und eine hohe Bibliotheksqualität zu gewährleisten. Es bietet Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur BMC-Vorbereitung, zur immunomagnetischen Sortierung und zum Aufbau von Bibliotheken und dient insbesondere für Neueinsteiger in die Erforschung von Neutrophilen als wertvolle Anleitung.

Der Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierung (ATAC-seq) ist eine leistungsstarke Hochdurchsatztechnik zur Beurteilung der Chromatinzugänglichkeit und zum Verständnis der epigenomischen Regulation. Neutrophile, als wichtiger Leukozytentyp in der Immunantwort, durchlaufen während der Differenzierung und Aktivierung erhebliche Veränderungen der Chromatinarchitektur, die die für ihre Funktionen notwendige Genexpression erheblich beeinflussen. ATAC-seq hat maßgeblich dazu beigetragen, wichtige Transkriptionsfaktoren bei der Reifung von Neutrophilen aufzudecken, erregerspezifische epigenomische Signaturen aufzudecken und therapeutische Ziele für Autoimmunerkrankungen zu identifizieren. Die Empfindlichkeit der Neutrophilen gegenüber dem externen Milieu erschwert jedoch die Produktion qualitativ hochwertiger ATAC-seq-Daten. Hier schlagen wir ein skalierbares Protokoll für die Herstellung von ATAC-seq-Bibliotheken aus Neutrophilen aus dem Knochenmark von Nagetieren vor, das eine verbesserte immunomagnetische Trennung bietet, um eine optimale Zellviabilität und qualitativ hochwertige Bibliotheken zu gewährleisten. Die wesentlichen Elemente, die sich auf die Bibliotheksqualität auswirken, und die Optimierungsprinzipien für die methodische Erweiterung werden ausführlich diskutiert. Dieses Protokoll wird die Forscher unterstützen, die bereit sind, die Chromatinarchitektur und die epigenomische Reprogrammierung von Neutrophilen zu untersuchen und Studien in der grundlegenden und klinischen Immunologie voranzutreiben.

Neutrophile sind einer der am häufigsten vorkommenden und wichtigsten Immunzelltypen bei Wirbeltieren und machen 50 % bis 70 % der menschlichen Leukozyten aus¹. Neutrophile Pflanzen spielen eine zentrale Rolle beim Nachweis und der Eliminierung von Mikroorganismen im Wirt. Bei einer Sepsis gehören reife Neutrophile zu den Ersthelfern². Sie mobilisieren sich schnell über Chemotaxis³ zu den Infektionsherden, wo sie Krankheitserreger bekämpfen, indem sie Mikroorganismen aufnehmen (Phagozytose), NADPH-Oxidase-abhängige reaktive Sauerstoffspezies produzieren (Atemausbrüche), Granulate sezernieren (Degranulation) und neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) bilden, die extrazelluläre Bakterien fangen und abtöten, sobald sie am Entzündungsort ankommen⁴. Auch unreife Neutrophile werden durch Chemokine schnell aus dem Knochenmark in den peripheren Kreislauf mobilisiert ^5,6. Diese Neutrophilen, die von der infektiösen Stelle angezogen werden, setzen auch Zytokine frei, die an mehreren physiologischen Prozessen wie Hämatopoese, Angiogenese und Wundheilung beteiligt sind ^7,8. Patienten, die an angeborenen oder erworbenen Krankheiten leiden, die zu einer verminderten Neutrophilenzahl führen, sind anfälliger für Infektionen ^9,10. Die Aktivierung von Neutrophilen ist jedoch ein zweischneidiges Schwert. Eine übermäßige Aktivierung und Freisetzung von Zytokinen kann Gewebe- und Organschäden verursachen, die zu Funktionsstörungen mehrerer Organe führen, wenn die Infektionen nicht sofort kontrolliert werden^11,12. Darüber hinaus tragen Neutrophile auch zu verschiedenen Entzündungs- und Autoimmunerkrankungen bei und können das Fortschreiten und die Metastasierung von Krebs beeinflussen^13,14. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, die Regulation der Neutrophilenaktivität zu untersuchen, um eine effektive Immunantwort auszugleichen und Schäden am Wirt zu verhindern.

Bei Neutrophilen erfährt die Chromatinarchitektur deutliche und dynamische Veränderungen in ihrer Differenzierung, Migration und Aktivierung und spielt während der gesamten zellulären Lebensdauer eine zentrale regulatorische Rolle. Diese Reise vom großen, runden, euchromatinreichen Kern der Myeloblasten zu einem stärker eingedrückten Kern in Myelozyten und Metamyelozyten und dann zu einer C- oder S-förmigen In-Band-Zelle und einem stark gelappten Chromatin in polymorphkernigen Neutrophilen^15,16, ist ein Beweis für die Komplexität der Biologie der Neutrophilen. Die spezialisierte Chromatinkonfiguration gewährleistet die selektive Expression von Genen, die für die Funktion von Neutrophilen essentiell sind, wie z. B. solche, die an der Granulatproduktion und schnellen Transkriptionsreaktionen beteiligt sind, die für eine effektive Eliminierung von Krankheitserregern erforderlich sind¹⁷. Wenn Neutrophile über Chemotaxis an Entzündungsherde mobilisiert werden, übt die transendotheliale Migration Druck auf den LINC-Komplex (Nucleoskeleton/Cytoskeleton Complex Linker) aus, was zu einem Chromatin-Remodeling und mehr Aktivierungspotenzial führt¹⁸. Bei der Sepsis zeigen aktivierte Neutrophile eine "Kern-Links-Verschiebung" mit abnormaler Chromatinmorphologie, wie z. B. zweilappigen oder nicht gelappten Kernen und einer deutlich lockereren Chromatinkondensation¹⁹. Dies führt zu einer erhöhten Zugänglichkeit innerhalb von Genregionen, die mit einer Entzündungsreaktion assoziiert sind, wodurch eine signifikante Expression dieser Gene induziert wird. Wenn die Infektionen nicht ordnungsgemäß kontrolliert werden, sind eine Histon-Citrullinierung und ein anschließender Chromatinabbau erforderlich, um NETs^{zu bilden 20,21}. Daher ist das Verständnis der Chromatinarchitektur von Neutrophilen von entscheidender Bedeutung für die Weiterentwicklung der Biologie von Neutrophilen und die Entwicklung von Behandlungen für Entzündungs- und Autoimmunerkrankungen, was Hoffnung auf eine zukünftige Krankheitsbehandlung bietet.

Die Zugänglichkeit des Chromatins dient als Metrik für die Chromatinarchitektur auf epigenomischer Ebene. Sie zeigt, wie genomische Regionen physikalisch für Enhancer, Promotoren, Isolatoren und Chromatin-bindende Faktoren zulässig sind und wie diese Elemente die Genexpression beeinflussen²². Der Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierung (ATAC-seq) ist eine weit verbreitete Technik zur Beurteilung der Chromatinzugänglichkeit im gesamten Genom²³. Es erfordert keine Vorkenntnisse über regulatorische Elemente, was es zu einem wirksamen Werkzeug für die epigenetische Forschung macht. Dieses Verfahren umfasst die Isolierung von Probenkernen, die Fragmentierung genomischer DNA durch Transposase Tn5 und die Zugabe von Sequenzierungsprimern für die Bibliotheksvorbereitung, Sequenzierung und Datenanalyse²³. ATAC-seq war maßgeblich an der Untersuchung der Nukleosomenkartierung, der Bindungsanalyse von Transkriptionsfaktoren, der Regulationsmechanismen in verschiedenen Zelltypen oder Krankheiten, der Identifizierung neuartiger Enhancer, der Entdeckung von Biomarkern usw.^{beteiligt 22,23}. Sie wird oft mit anderen Techniken, wie z. B. der RNA-Sequenzierung, kombiniert, um eine umfassende Analyse der Genexpression zu ermöglichen.

ATAC-seq hat unser Wissen über die Biologie von Neutrophilen erweitert, indem es präzise epigenetische Mechanismen bei Gesundheit und Krankheit aufgedeckt hat. Es wurden mehrere wichtige Transkriptionsfaktoren (z. B. RUNX1, KLF6, PU.1 usw.) bei der Reifung von Neutrophilen und Effektorreaktionen aufgedeckt^24,25, pathogenspezifische Signaturen mit Biomarkerpotenzial bei Sepsis^{aufgedeckt 26}, die epigenomischen Mechanismen des angeborenen Immungedächtnisses^{aufgeklärt 12} und therapeutische Ziele bei der pädiatrischen akuten myeloischen Leukämie (AML) ^{identifiziert27}. Als prominente zelluläre Komponente in der Immunüberwachung weisen Neutrophile jedoch eine hohe Sensitivität gegenüber ihrem äußeren Milieu auf und stellen daher eine Herausforderung für die Erstellung hochwertiger ATAC-seq-Daten dar. Unter physiologischen Umständen wird die mediane Halbwertszeit von humanen Neutrophilen mit 3,8 Tagen angegeben, während die durchschnittliche Halbwertszeit von Maus-Neutrophilen 12,5 h beträgt. Bemerkenswert ist, dass ihre Halbwertszeit in vitro deutlich kürzer ist ^28,29. Während des In-vitro-Betriebs isolierter Neutrophilen kann die Exposition gegenüber Mikroorganismen oder pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMPs) sowie redundante experimentelle Verfahren und raue Abläufe zu einer aberranten Aktivierung von Neutrophilen und einer verminderten zellulären Lebensfähigkeit aufgrund von Apoptose oder NETose führen. Die verstorbenen Zellen beherbergen in der Regel erhebliche Mengen an unchromatinisierter DNA, die sehr anfällig für Tn5 sind, wodurch das Hintergrundrauschen von ATAC-seq²³ erhöht wird.

Hier schlagen wir ein skalierbares Protokoll zur Vorbereitung von ATAC-seq-Bibliotheken vor, das für Neutrophile optimiert ist, die aus Knochenmarkproben von Nagetieren stammen. Abbildung 1 zeigt einen grafischen Überblick über das Protokoll, das die immunomagnetische Trennung von Neutrophilen aus dem Knochenmark umfasst, gefolgt von ATAC-seq. Die verbesserte immunomagnetische Sortierung garantiert die optimale Lebensfähigkeit der Neutrophilen vor der Extraktion des Zellkerns für die ATAC-seq-Bibliothek, wodurch die hohe Qualität der Bibliotheken sichergestellt und die Einbeziehung zusätzlicher Neutrophilenbewertungen in das Schema erleichtert wird. Die Implementierung dieses Protokolls wird den Forschern helfen, die Merkmale der Chromatinarchitektur und die epigenomischen Reprogrammierungsmechanismen von Neutrophilen zu verstehen, wenn sie verschiedenen Herausforderungen der Mikroumwelt ausgesetzt sind. Es wird erwartet, dass dies breite Anwendungen in grundlegenden und klinischen immunologischen Studien haben wird.

Alle im Folgenden vorgestellten Tierverfahren entsprachen den nationalen Ethik- und Tierschutzrichtlinien und -vorschriften, die von der Animal Care Research Ethics Commission der Capital Medical University, Peking, China, genehmigt wurden (sjtkl11-1x-2022(060)).

1. Herstellung von Knochenmarkzellsuspensionen (BMC)

1. Wählen Sie männliche C57BL/6J-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen mit einem Gewicht von 19-21 g aus. Euthanasieren Sie die Mäuse mit einer CO₂ -Kammer, gefolgt von einer Gebärmutterhalsluxation, nachdem der tiefe Reflex verschwunden ist. Desinfizieren Sie sie mit 70%igem Ethanolspray auf einer Seziermatte.
2. Trennen Sie den Oberschenkelknochen mit einer kleinen Schere und Pinzette vorsichtig vom Hüftgelenk und dem Schienbein, entfernen Sie die anhaftende Haut und den Skelettmuskel und spülen Sie den Oberschenkelknochen mit kalter, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer 10 cm großen Petrischale.
3. Schneiden Sie die Epiphysen des Oberschenkelknochens ab, führen Sie vorsichtig eine 28-g-Nadel, die an einer 2-ml-Spritze befestigt ist, in die Markhöhle ein und spülen Sie das Knochenmark mit kaltem PBS aus, das 2 % fötales Rinderserum (FBS) enthält.
4. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, bis die dunkelrote Flüssigkeit durchsichtig wird. In der Regel sind drei Spülungen erforderlich.
   HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Nadel zu tief in die Knochenmarkhöhle einzuführen, um eine optimale Zellentnahme zu gewährleisten.
5. Verwenden Sie ein 70-μm-Zellsieb, um die Zellsuspension in ein Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortierröhrchen (FACS) (5 ml) zu filtrieren.
6. Lysieren Sie die Erythrozyten in BMCs mit einem handelsüblichen Erythrozyten-Lysepuffer ohne Polyformaldehyd.
   1. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 500 x g für 5 min bei 25 °C, entfernen Sie vorsichtig den Überstand, lassen Sie ca. 100 μl Flüssigkeit am Boden verbleiben, und klopfen Sie vorsichtig auf das Röhrchen, um das Pellet zu lösen.
   2. Fügen Sie 2 ml Lysepuffer hinzu, verdünnt mit Erythrozyten-Lysepuffer (10x), und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen dreimal auf den Kopf stellen. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen bei 500 x g für 5 Minuten, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet durch leichtes Klopfen.
   3. Waschen Sie die Zellen zweimal mit RPMI 1640 Medium mit 10 % FBS und resuspendieren Sie sie in einem Volumen von 2 ml.
      HINWEIS: Bei unverstreuten Zellklumpen wird empfohlen, eine 200-μl-Pipettenspitze zu verwenden, um sie herauszunehmen, anstatt die Zellsuspensionen durch ein 70-μm-Zellsieb zu filtrieren. Diese Methode kann den Zellverlust reduzieren.
7. Berechnen Sie die zelluläre Lebensfähigkeit und die Gesamtzahl der lebenden Zellen pro Probe mit Trypanblau-Färbung.

2. Immunmagnetische Markierung von Neutrophilen mit anti-Ly6G-Magnetkügelchen

1. Resuspendieren Sie die Knochenmarkzellen (~2 x 10⁷ lebende Zellen pro Maus) in 2 ml RPMI 1640 Medium mit 10 % FBS und zentrifugieren Sie sie bei 500 x g für 5 min bei 25 °C.
   HINWEIS: Angesichts des begrenzten Bedarfs von 1 x 10⁵ Zellen für ATAC-seq können die überschüssigen Neutrophilen für zusätzliche epigenomische Analysen (z. B. ChIP-seq und Hi-C) oder Immunfunktionsbewertungen (z. B. Zytokinproduktion, Phagozytose und NETs) unter Verwendung von Neutrophilen aus derselben Maus zugewiesen werden.
2. Saugen Sie den größten Teil des Überstands an, so dass etwa 100 μl zurückbleiben, und klopfen Sie vorsichtig auf das Rohr, um das Pellet zu lösen.
3. Fügen Sie 30 μl Ly6G-Kügelchen hinzu und mischen Sie sie durch vorsichtiges Klopfen mit den BMCs.
   HINWEIS: Magnetische Kügelchen sollten vor der Verwendung mindestens 10 Sekunden lang vortext werden. Nach der Zugabe der Kügelchen zu BMCs wird empfohlen, auf ein Vortexen zu verzichten.
4. Inkubieren Sie das Röhrchen bei 25 °C für 15 min.
5. Fügen Sie 2 ml PBS hinzu, um die Kügelchen und Zellen zu resuspendieren, und zentrifugieren Sie dann 5 Minuten lang bei 25 °C bei 500 x g .
6. Saugen Sie den größten Teil des Überstands an, so dass etwa 100 μl zurückbleiben, und klopfen Sie vorsichtig auf das Rohr, um das Pellet zu lösen. Fügen Sie zusätzliches PBS hinzu, um ein Endvolumen von 1 ml zu erhalten.
   HINWEIS: Bei unverstreuten Zellklumpen wird empfohlen, eine 200-μl-Pipettenspitze zu verwenden, um sie herauszunehmen, anstatt die Zellsuspensionen durch ein 70-μm-Zellsieb zu filtrieren. Diese Methode kann den Zellverlust reduzieren.

3. Neutrophilentrennung mit immunomagnetischer Zellsortierung

1. Behandeln Sie die MS-Säule mit PBS vor.
   1. Positionieren Sie die MS-Säule innerhalb des Magnetfelds eines kompatiblen MACS-Separators (magnetic-activated cell sorting). Positionieren Sie ein unbesetztes 5-ml-Röhrchen unter der Flüssigkeit, die aus der MS-Säule austritt.
   2. Spülen Sie die Säule mit 500 μl PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt, nachdem PBS vollständig in die MS-Spalte gelangt ist.
      HINWEIS: Das PBS sollte allmählich, Tropfen für Tropfen, über die MS-Säule in das 5-ml-Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierungsröhrchen (FACS) fließen. Stellen Sie sicher, dass keine Luft in die Säule eindringt, da Luftblasen die Säule verstopfen können.
2. Tragen Sie die magnetisch markierte BMC-Suspension auf die MS-Säule auf, indem Sie jeweils 500 μl hinzufügen, und füllen Sie sie sofort wieder auf, sobald das Säulenreservoir leer ist.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspensionen keine Zellmasse enthalten. Positionieren Sie bei Bedarf ein neues 5-ml-FACS-Röhrchen unter der MS-Säule, um die unmarkierten Zellen (z. B. Monozyten und Lymphozyten) vor diesem Stadium zu sammeln.
   HINWEIS: Beachten Sie die Tröpfchendurchflussrate. Ein langsamer Durchfluss könnte darauf hindeuten, dass die Sortierkolonne verstopft ist.
3. Waschen Sie die MS-Säule, indem Sie jedes Mal, wenn das Reservoir leer ist, 500 μl PBS hinzufügen, und wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal.
   HINWEIS: Die vorzeitige Zugabe von PBS kann den Eintritt bestimmter Zellen in die Sortiersäule behindern und möglicherweise die Reinheit der Zellsortierung beeinträchtigen.
4. Sammle die magnetisch markierten Neutrophilen.
   1. Sobald das Säulenreservoir leer ist, nehmen Sie die Säule aus dem Magnetfeld und positionieren Sie sie vorsichtig auf einem 5-ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Stellen Sie vor dem Entfernen der Säule sicher, dass sich keine Restflüssigkeit darin befindet, um den Verlust von Neutrophilen durch Tröpfchenaustritt während des Prozesses zu verhindern. Die Rückstände in der Säule konnten mit einer Pipette entfernt werden.
   2. Geben Sie 2 mL PBS auf die Säule und drücken Sie dann sofort und fest den Kolben in die Säule, um die magnetisch markierten Neutrophilen auszustoßen.
      HINWEIS: Um genügend Neutrophile zu erhalten, stellen Sie ein ausreichendes Elutionsvolumen sicher und bleiben Sie kurz, wenn Sie den Kolben in die Säule schieben.
5. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die isolierten Zellen aufzuzählen. Identifizieren Sie die Reinheit der isolierten Neutrophilen, indem Sie 100 μl der Zellsuspension nach der Sortierung entnehmen und mit Durchflusszytometrie analysieren.

4. Extraktion des Zellkerns

1. Die 50.000 einzelligen Suspensionen, die die Neutrophilen enthalten, werden 5 min lang bei 4 °C in einem 0,2-ml-Röhrchen zentrifugiert, dann wird der Überstand verworfen.
2. Die Neutrophilen werden in 50 μl vorgekühltem Lysepuffer resuspendiert (siehe Tabelle 1), die Lösung vorsichtig mit einer Pipette gemischt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert.
   HINWEIS: Wenn das Probenvolumen weniger als 5 μl beträgt, ist die direkte Zugabe des Lysepuffers zulässig. Die Konzentration der Zellsuspension überschreitet 1 x 10⁷ Zellen/ml nicht.
3. Bei 500 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren, dann den Überstand verwerfen und den Zellkern auffangen. Positionieren Sie das Rohr auf Eis, bevor Sie mit den nachfolgenden Eingriffen beginnen.
   HINWEIS: Um den Probenverlust zu minimieren, bezeichnen Sie die Seite der Rohrwand, an der sich Pellets ansammeln, und saugen Sie die Flüssigkeit vorsichtig von der gegenüberliegenden Seite an, wenn der Überstand entfernt wird.

5. Nukleosomen-gebundene Tagmentierung mit Transposase

1. Bereiten Sie die Tagmentationsreaktionsmischung mit Tn5-Transposase in einem Polymerase-Kettenreaktionsröhrchen (PCR) gemäß den Richtlinien des DNA Library Prep Kit vor (siehe Tabelle 2) und wärmen Sie die gekühlten Amplikon-Reinigungskügelchen mindestens 30 Minuten lang bei 25 °C vor.
2. Resuspendieren Sie den Neutrophilenkern mit 50 μl Tagmentationsreaktionsmischung und rühren Sie vorsichtig mit einer Pipette um, gefolgt von einer Zentrifugation für 5 s mit einer Handzentrifuge (~2600 x g).
3. Inkubieren Sie das Reaktionsgefäß in einem PCR-Instrument bei 37 °C für 30 Minuten.
4. Geben Sie 100 μl vorwirbelnde Amplikon-Reinigungskügelchen in das Lysat und mischen Sie die magnetischen Kügelchen gründlich in der Lösung, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren.
   HINWEIS: Magnetische Kügelchen sind klebrig und können sich leicht an den Pipettenspitzen anheften, stellen Sie daher sicher, dass Sie das richtige Volumen ansaugen und sie beim Übertragen der Kügelchen langsam von den Spitzen abgeben.
5. Inkubieren Sie das Reaktionsröhrchen bei 25 °C für 5 min, dann zentrifugieren Sie es 5 s lang mit einer Handzentrifuge (~2600 × g).
6. Das unterbrochene DNA-Fragment wird gereinigt, indem das Reaktionsröhrchen auf ein Magnetgestell gestellt wird, bis die Lösung klar ist (ca. 5 Minuten). Entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand, ohne die Magnetkügelchen zu stören.
7. Waschen Sie die Magnetkugel jedes Mal mit 200 μl frisch zubereitetem 80%igem Ethanol, während Sie das Reaktionsrohr 30 s lang auf dem Magnetgestell halten. Vermeiden Sie es, die Kügelchen bei der Zugabe von Ethanol zu stören. Wiederholen Sie die in Schritt 5.7 beschriebene Vorgehensweise.
8. Zentrifugieren Sie das Reaktionsröhrchen mit einer Handzentrifuge (ca. 2600 × g), aspirieren Sie das Ethanol mit 10 μL-Pipettenspitzen und trocknen Sie dann die magnetischen Kügelchen 3-5 Minuten lang, während Sie den Deckel öffnen.
   HINWEIS: Die Trocknungsdauer von magnetischen Kügelchen kann aufgrund unterschiedlicher Luftfeuchtigkeit in verschiedenen Regionen variieren. Die Kügelchen sollten so lange getrocknet werden, bis sie ihren Glanz verlieren. Eine übermäßige Trocknung kann den Elutionsprozess erschweren, während eine unzureichende Trocknung zum Vorhandensein von Alkoholrückständen führen kann, die sich auf nachfolgende Experimente auswirken. Darüber hinaus ist die horizontale Positionierung des Magnetgestells förderlicher für die gleichmäßige Trocknung der Magnetkügelchen.
9. Nachdem Sie das Reaktionsgefäß aus dem Magnetgestell genommen haben, fügen Sie 26 μl ddH₂O hinzu, um die Magnetkügelchen zu bedecken, und pipettieren Sie auf und ab, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Dann bei 25 °C 2 Minuten inkubieren.
   HINWEIS: Verlängern Sie die Inkubationsdauer entsprechend, wenn die magnetischen Kügelchen übertrocknet sind.
10. Das Reaktionsgefäß wird kurz mit einer Handzentrifuge (ca. 2600 × g) zentrifugiert und die magnetischen Kügelchen mit einem Magnetgestell getrennt, bis die Lösung klar ist (ca. 5 min).
11. Übertragen Sie den 24-μl-Überstand vorsichtig in das neue PCR-Röhrchen.

6. Bibliotheksaufbau für Next-Generation-Sequencing (NGS)

1. Bereiten Sie die PCR-Reaktionsmischung in einem sterilisierten Röhrchen unter Verwendung von gereinigten DNA-Fragmenten und Primern mit Sequenzieradaptern vor (siehe Tabelle 3).
2. Führen Sie die PCR-Reaktion gemäß den empfohlenen Verfahren (siehe Tabelle 4) durch, die in der Regel etwa 1 h dauert.
   HINWEIS: Das Experiment kann nach diesem Verfahren vorübergehend unterbrochen werden, und die PCR-Produkte können bei -20 °C oder mindestens 2 Wochen gelagert werden.
3. Fügen Sie 27,5 μl vorwirbelnde Amplikon-Reinigungskügelchen zu 50 μl PCR-Produkten hinzu und mischen Sie die magnetischen Kügelchen dann gründlich in der Lösung, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren.
   HINWEIS: Das falsche Verhältnis von magnetischen Beads zu PCR-Produkten kann zu Diskrepanzen in den Längen der sortierten Fragmente führen. Verwenden Sie ddH₂O, um das verdampfte Volumen des PCR-Produkts auf 50 μl aufzufüllen. Stellen Sie sicher, dass das richtige Volumen der magnetischen Kügelchen abgesaugt wird, und geben Sie sie langsam aus den Pipettenspitzen ab, um die Anzahl der Kügelchen, die möglicherweise anhaften, zu minimieren.
4. Das Reaktionsgefäß wird 5 min lang bei 25 °C inkubiert und anschließend mit einer Handzentrifuge (ca. 2600 x g) 5 s lang zentrifugiert.
5. Reinigen Sie die DNA-Bibliothek, indem Sie das Reaktionsröhrchen auf ein Magnetgestell stellen, bis die Lösung klar ist (ca. 5 Minuten). Übertragen Sie dann den Überstand vorsichtig in ein neues sterilisiertes PCR-Röhrchen und entsorgen Sie die magnetischen Kügelchen.
6. Geben Sie 50 μl vorwirbelnde Amplikons-Reinigungskügelchen in den Überstand und mischen Sie die magnetischen Kügelchen gründlich in der Lösung, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren.
7. Das Reaktionsgefäß wird 5 min lang bei 25 °C inkubiert und anschließend mit einer Handzentrifuge (ca. 2600 x g) 5 s lang zentrifugiert.
8. Das Reaktionsgefäß wird auf ein Magnetgestell gestellt, bis die Lösung klar ist (ca. 5 Minuten), und dann den Überstand vorsichtig entfernen, ohne die Magnetkügelchen zu stören.
9. Waschen Sie die Magnetperle jedes Mal zweimal mit 200 μl frisch zubereitetem 80%igem Ethanol und lassen Sie das Reaktionsröhrchen 30 Sekunden lang auf dem Magnetgestell. Vermeiden Sie es, die Kügelchen bei der Zugabe von Ethanol zu stören.
10. Trocknen Sie die Magnetkügelchen 5 Minuten lang, während Sie den Deckel öffnen.
11. Nachdem Sie das Reaktionsröhrchen aus dem Magnetgestell genommen haben, fügen Sie 22 μl ddH₂O hinzu, um die magnetischen Kügelchen zu bedecken, und pipetieren Sie 10 Mal auf und ab, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Anschließend 5 Minuten bei 25 °C inkubieren.
12. Zentrifugieren Sie das Reaktionsgefäß kurz mit einer Handzentrifuge (ca. 2600 × g) und trennen Sie die magnetischen Kügelchen mit einem Magnetgestell, bis die Lösung klar ist (ca. 5 min).
13. Den 20-μl-Überstand vorsichtig in ein neues sterilisiertes PCR-Röhrchen umfüllen und bei -20 °C lagern.
    HINWEIS: Um eine Bibliothek mit einer konzentrierteren Längenverteilung zu erhalten, sollten Sie die Verwendung eines Gel-Rückgewinnungskits in Betracht ziehen, um das amplifizierte Produkt zu sortieren. Wenn es keine spezifischen Anforderungen an den Längenverteilungsbereich gibt, kann das amplifizierte Produkt alternativ direkt mit einem magnetischen Bead- oder Säulenreinigungskit ohne Längensortierung gereinigt werden.

7. Qualitätskontrolle und Sequenzierung von Bibliotheken

1. Nutzen Sie DNA-Fragment-Analyseplattformen, um die Längenverteilung von Bibliotheks-DNA zu bewerten.
2. Nutzen Sie NGS-Plattformen, um eine Hochdurchsatz-Sequenzierung an den Bibliotheken durchzuführen, die die Qualitätsprüfung bestanden haben.

Das skizzierte Protokoll wurde verwendet, um Neutrophile aus dem Knochenmark von C57BL/6-Mäusen zu isolieren und ihre jeweilige Varianz in der Chromatinzugänglichkeit vor und nach der Lipopolysaccharidstimulation (LPS) über ATAC-seq zu vergleichen. Typischerweise können 2 x 10⁷ BMCs aus beiden Femuren einer 6-8 Wochen alten C57BL/6-Maus entnommen werden, und anschließend können 2-5 x 10⁶ Neutrophile isoliert werden. Davon werden 1 x 10⁵ Zellen für ATAC-seq verwendet, während die überschüssigen Zellen für eine umfassende Neutrophilenanalyse zugeordnet werden können.

Die FACS-Immunphänotypisierung wurde eingesetzt, um die Reinheit und Lebensfähigkeit der Neutrophilen nach der immunomagnetischen Sortierung zu bestimmen (Abbildung 2). Obwohl die Verteilung der vorderen Streufläche (FSC-A) und der seitlichen Streufläche (SSC-A) allein eine Abschätzung liefern könnte, wurde hier eine spezifische Neutrophilenmarkerfärbung verwendet, um den Sortiereffekt zu demonstrieren. Nach dem FSC-A- und SSC-A-Gating wurden die Zellen weiter mit FSC-A und Forward Scatter Height (FSC-H) gesteuert, um einzelne Zellen von aggregierten Zellen zu unterscheiden. Rund 99 % der Nachsortierzellen wurden als einzeln identifiziert. Dann wurde 7-Amino-Actinomycin D (7AAD), ein DNA-Farbstoff, der effizient von lebenden Zellen ausgeschieden wird, ausgeschlossen, um Zellen zu markieren und >99 % der Lebensfähigkeit von Einzelzellen nach der Sortierung zu identifizieren. CD11b und CD48 wurden weiter markiert, um myeloische Zellen zu identifizieren bzw. Neutrophile von Monozyten in myeloischen Zellen zu unterscheiden. In BMCs von C57BL/6-Mäusen machten myeloische Zellen 46,7 % der lebensfähigen Zellen aus, wobei Neutrophile 76,4 % der myeloischen Zellpopulation ausmachten. Nach der immunomagnetischen Sortierung wurde die Reinheit der Neutrophilen in lebensfähigen Zellen auf 98,5% überprüft, was den Anforderungen des ATAC-seq-Bibliotheksaufbaus entspricht.

Nach dem Aufbau der ATAC-seq-Bibliothek wurde die gereinigte DNA einer Längenverteilungsanalyse mit dem DNA-Fragmentanalysator unterzogen. Die Ergebnisse zeigten eine Länge zwischen 100 bp und 1000 bp ohne kleine oder große Fragmentkontamination (Abbildung 3A). Die Konzentrationen der ATA-seq-Bibliotheken und die Mengen der Sequenzierungsdaten sind in Tabelle 5 aufgeführt. Nach Erhalt der Sequenzierungsdaten untersuchten wir auch die Längenverteilung von ATAC-seq-Fragmenten (Abbildung 3B). Da die Tagmentierung von Tn5-Transposasen ein Signaturgrößenmuster von Fragmenten erzeugt, die aus den nukleosomenfreien Regionen (NFR, < 100 bp), Mononukleosomen (~200 bp), Dinukleosomen (~400 bp), Trinukleosomen (~600 bp) und längeren Oligonukleosomen aus anderen offenen Chromatinregionen stammen, sollte ein erfolgreiches ATAC-seq-Experiment das typische Fragmentgrößenverteilungsdiagramm mit periodisch abnehmenden Peaks erzeugen, die den ganzzahligen Vielfachen der Nukleosomen entsprechen (Abbildung 3B). Veränderungen der ATAC-seq-Peaks wurden im Allgemeinen identifiziert, um die dynamische Landschaft offener Chromatinregionen zu veranschaulichen. Wie in Abbildung 3C gezeigt, sollten die Regionen mit erhöhten oder verringerten ATAC-seq-Signalen durch übersichtliche Heatmaps dargestellt werden. Anschließend analysierten wir die Chromatinzugänglichkeit von Genen für Entzündungsfaktoren, die hauptsächlich von der LPS-Stimulation beeinflusst werden, wie IL10, Stat1, Il12a, Cxcl1 und Irak1, und wir fanden heraus, dass diese Gene bei LPS-stimulierten Neutrophilen eine höhere Zugänglichkeit aufwiesen (Abbildung 3D). Insgesamt war die Qualitätskontrolle der von uns konstruierten ATAC-seq-Bibliothek zufriedenstellend, und die produzierten Daten waren ausreichend, um die epigenetischen Veränderungen von Maus-Neutrophilen nach LPS-Stimulation zu analysieren.

Abbildung 1: Schematische Übersicht über das Protokoll für die Herstellung von neutrophilen ATAC-seq-Bibliotheken. Der Überblick folgt der Vorbereitung von BMC-Suspensionen, der Markierung von Neutrophilen mit anti-Ly6G-Magnetbeads, der Neutrophilentrennung durch immunomagnetische Sortierung, der Extraktion des Neutrophilenkerns, der Nukleosomen-Tethered-Tagmentation, dem Aufbau von NGS-Bibliotheken und der Sequenzierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Die Bewertung der Reinheit und Viabilität von Neutrophilen mittels FACS vor und nach der immunomagnetischen Sortierung. (A) BMCs und (B) isolierte Neutrophile wurden nach einem standardisierten Protokoll mit anti-CD11b, anti-Ly6G, anti-CD48 und 7AAD gefärbt. Anschließend wurden einzelne Zellen von der Gesamtzellpopulation abgegrenzt, wobei tote Zellen mit 7AAD ausgeschlossen wurden. Myeloische Zellen wurden dann von lebenden Zellen abgegrenzt, und schließlich wurden Neutrophile aus der myeloischen Zellpopulation entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Qualitätsbewertung der ATAC-seq-Bibliothek, die aus murinen Knochenmark-Neutrophilen hergestellt wurde. (A) Die Längenverteilung der mit dem DNA-Fragmentanalysator analysierten Bibliotheks-DNA und (B) des ATAC-seq-Fragments wurde durch Sequenzierungsdaten bestimmt. (C) Pile-up-Heatmap von genomischen Regionen, die bei unbehandelten und LPS-stimulierten Neutrophilen eine Zugänglichkeit (± 10 kb um das Zentrum dieser Peaks erreichen. (D) Integrative Genomics Viewer (IGV) Ansichten von ATAC-seq-Signalen an repräsentativen Genorten, die Entzündungsfaktoren entsprechen, wobei rote und schwarze Signalpeaks unbehandelte bzw. LPS-stimulierte Neutrophile darstellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Lysepufferformulierung für die Zellkernextraktion.

Tabelle 2: Herstellung der Tagmentationsreaktionsmischung.

Tabelle 3: Vorbereitung der PCR-Reaktionsmischung für den Aufbau einer NGS-Bibliothek.

Tabelle 4: Empfohlene Verfahren der PCR-Reaktion für den Aufbau von NGS-Bibliotheken.

Tabelle 5: Übersicht über die Konzentration der ATAC-seq-Bibliothek und die Sequenzierungsdaten.

Dieses Manuskript berichtet über ein experimentelles Protokoll zur Herstellung von ATAC-seq-Bibliotheken, die für Neutrophile optimiert sind, die aus Knochenmarkproben von Nagetieren stammen. Da Neutrophile sehr anfällige und leicht zu aktivierende Immunzellen sind, konzentrierten sich die Optimierungsbemühungen auf die Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit isolierter Neutrophilen. Eine unsachgemäße Behandlung kann zu NETose und anderen Formen des Zelltods führen, was zur Freisetzung erheblicher Mengen unchromatinisierter DNA führt und dadurch zum Hintergrundrauschen beiträgt²³. Wir haben das Verfahren vor der Zellkernextraktion vereinfacht und uns für einen Erythrozyten-Lysepuffer ohne Polyformaldehyd entschieden. Im Gegensatz zu peripheren Blutproben erfordert eine minimale Menge an Erythrozyten eine kurze Inkubationszeit von BMCs mit dem Erythrozyten-Lysepuffer, wodurch der Verlust von Neutrophilen effektiv minimiert und gleichzeitig die gründliche Auflösung der Erythrozyten gewährleistet wird. Um unnötige Reize zu minimieren, ist es zwingend erforderlich, alle Reagenzien vor der Inkubation mit BMCs auf 37 °C vorzuwärmen und mit äußerster Sorgfalt zu behandeln, wobei Aktivitäten wie Vortexen, wiederholtes Filtern mit Zellsieben, längeres Zentrifugieren mit zu hoher Drehzahl usw. vermieden werden. Verbesserungen in den oben genannten Verfahren verbessern die Lebensfähigkeit sortierter Neutrophilen und schaffen dadurch Bedingungen, die für qualitativ hochwertige ATAC-seq-Bibliotheken förderlich sind.

Wir haben drei weit verbreitete Sortiertechniken untersucht, um Neutrophile mit optimaler Lebensfähigkeit zu erhalten: immunomagnetische Trennung, Dichtegradientenzentrifugation und Durchflusszytometrie-Sortierung. Bei der Dichtegradientenzentrifugation können Neutrophile die Trennflüssigkeitsschicht durchqueren, was möglicherweise zu osmotischem Druck und NET-Bildung führt. Bei der durchflusszytometrischen Sortierung erfahren die Neutrophilen, die die Düse passieren, Reize aufgrund mechanischer Scherkräfte. Die Sortierdauer beträgt in der Regel mehr als eine Stunde, und die Zellkonzentration nimmt nach der Sortierung ab, was zu einem größeren Neutrophilenverlust während der Trennung und anschließenden Zentrifugation führt. Im Vergleich zu den beiden oben genannten Ansätzen erreicht die immunomagnetische Trennung eine Reinheit von 95 % und eine Lebensfähigkeit von 99,5 % der Neutrophilen innerhalb von 30 Minuten. Obwohl diese Methodik zu höheren experimentellen Kosten führen kann, halten wir sie für unerlässlich, um zuverlässige Forschungsergebnisse zu erzielen. Mit Ausnahme von ATAC-seq kann die immunomagnetische Trennung auch in andere Experimente integriert werden, die strenge Kriterien für die Lebensfähigkeit von Neutrophilen haben, wie z. B. Bewertungen der Immunfunktion (z. B. Zytokinproduktion, Phagozytose, NETs usw.), "Omics"-Methoden (z. B. ChIP-seq, Hi-C, gezielte Breitband-Metabolomik usw.) und andere molekularbiologische Routineexperimente. Die integrierte Methodik ermöglicht es, die Funktionen von Neutrophilen und die damit verbundenen Mechanismen aus verschiedenen Perspektiven innerhalb einer einzigen Maus zu untersuchen.

Das beschriebene Protokoll ist ein skalierbares Schema, das erweitert werden kann, um Neutrophile aus verschiedenen Spezies und verschiedenen Gewebequellen aufzunehmen. Basierend auf dem Erythrozytenverhältnis in den Proben empfiehlt es sich, die Inkubationszeit mit dem Erythrozyten-Lysepuffer auf ein Minimum zu optimieren und gleichzeitig eine ausreichende Auflösungseffizienz zu gewährleisten. Bei der immunomagnetischen Sortierung hat die Menge der verwendeten magnetischen Kügelchen einen erheblichen Einfluss auf die Reinheit der isolierten Zellen. Die Optimierung sollte auf die Menge der verarbeiteten Zellen der Proben und das Neutrophilenverhältnis zugeschnitten sein. Die Aufrechterhaltung der Reinheit der Neutrophilen steht dabei im Vordergrund. Nach unserer Erfahrung fügen Sie 30 μl Kügelchen für 2 x 10⁷ Zellen aus zwei Oberschenkelknochen und 50 μl für 4 x 10⁷ Zellen aus zwei Oberschenkelknochen und zwei Tibias hinzu. Aufgrund der hervorragenden Reproduzierbarkeit über verschiedene Chargen hinweg und des breiten Bereichs der Antikörperdosierung muss die Optimierung zunächst nur untersucht werden. Darüber hinaus ist die Generierung hochwertiger und stabiler ATAC-seq-Bibliotheken abhängig von dem geeigneten Verhältnis der Tn5-Transposase zum investierten Zellkern³⁰. Der optimale Investitionsbetrag beträgt 50.000 Zellkerne für aus dem murinen Knochenmark gewonnene Neutrophile, wobei für andere Proben geringfügige Anpassungen erforderlich sind.

Zusammenfassend schlagen wir ein integriertes Schema der immunomagnetischen Sortierung von Neutrophilen und der anschließenden ATAC-seq-Bibliotheksvorbereitung vor, das vielversprechend für einen umfassenden Einsatz in der Untersuchung von Neutrophilen ist. Es wird den Forschern helfen, die Merkmale der Chromatinarchitektur von Neutrophilen zu verstehen, ihre regulatorischen Mechanismen der Entzündungsreaktion und der epigenomischen Reprogrammierung in Gegenwart verschiedener Mikroumgebungsherausforderungen aufzudecken und so potenzielle therapeutische Ziele beim Auftreten und Fortschreiten der Krankheit aufzudecken 12,24,25,26,27.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des F&E-Programms der Beijing Municipal Education Commission (KZ202010025041) und der Chinese Institutes for Medical Research, Peking (Grant No. CX24PY29).