Kolektif davranışlarını incelemek için nematodların büyük ölçekli ekimi

Burada, nematodların toplu davranışlarını, köpek maması agar ortamı kullanılarak toplu olarak kültürlenerek incelemek için bir sistem rapor edilmiştir. Bu sistem, araştırmacıların çok sayıda dauer solucanını çoğaltmasına izin verir ve Caenorhabditis elegans ve diğer ilgili türlere uygulanabilir.

Hayvanlar, kuş sürülerinde, balık sürülerinde ve insan kalabalığında gözlemlendiği gibi dinamik kolektif davranışlar sergilerler. Hayvanların kolektif davranışları hem biyoloji hem de fizik alanlarında araştırılmıştır. Laboratuvarda, araştırmacılar yaklaşık bir yüzyıl boyunca meyve sineği ve zebra balığı gibi çeşitli model hayvanları kullandılar, ancak bu genetik olarak izlenebilir model hayvanlar tarafından düzenlenen büyük ölçekli karmaşık kolektif davranışları incelemek büyük bir zorluk olmaya devam etti. Bu makale, Caenorhabditis elegans'ta deneysel bir kolektif davranış sistemi oluşturmak için bir protokol sunmaktadır. Yayılan solucanlar Petri plakasının kapağına tırmanır ve toplu sürü davranışı gösterir. Sistem ayrıca nemi ve ışık stimülasyonunu değiştirerek solucan etkileşimlerini ve davranışlarını kontrol eder. Bu sistem, çevresel koşulları değiştirerek kolektif davranışların altında yatan mekanizmaları incelememizi ve mutantları kullanarak bireysel düzeydeki hareketin kolektif davranışlar üzerindeki etkilerini incelememizi sağlar. Bu nedenle, sistem hem fizik hem de biyolojide gelecekteki araştırmalar için yararlıdır.

Hem bilim adamı olmayanlar hem de bilim adamları, kuş sürülerinde ve balık sürülerinde olduğu gibi hayvanların kolektif davranışlarından etkilenirler. Kolektif davranışlar fizik, biyoloji, matematik ve robotik dahil olmak üzere çok çeşitli alanlarda analiz edilmiştir. Özellikle, aktif madde fiziği, kendinden tahrikli elemanlardan oluşan sistemlere, yani kuş sürüleri, balık sürüleri, hareketli bakterilerin biyofilmleri, aktif moleküllerden oluşan hücre iskeletleri ve kendinden tahrikli kolloid grupları gibi enerji tüketen sistemlere odaklanan büyüyen bir araştırma alanıdır. Aktif madde fiziği teorisi, bireylerin davranışları ne kadar karmaşık olursa olsun, çok sayıda canlının kolektif hareketlerinin az sayıda basit kural tarafından yönetildiğini savunur. Örneğin, kendinden tahrikli parçacıkların kolektif hareketinin birleşik bir tanımı için bir aday olan Vicsek modeli, hayvan sürülerinde olduğu gibi, 2B'de eksantrik dalgalanma ile uzun menzilli sıralı bir faz oluşturmak için hareketli nesnelerin kısa menzilli hizalama etkileşiminin gerekli olduğunu öngörmektedir¹. Aktif madde fiziği ile ilgili yukarıdan aşağıya deneysel yaklaşımlar hızla gelişmektedir. Önceki deneyler, Escherichia coli^2'de uzun menzilli sıralı bir fazın oluşumunu doğruladı. Diğer son çalışmalarda hücreler ^3,4, bakteriler⁵, hareketli kolloidler⁶ veya hareketli proteinler ^7,8 kullanılmıştır. Vicsek modeli gibi basit minimal modeller bu gerçek fenomenleri başarıyla tanımladı. Bu tek hücreli deney sistemlerinin aksine, hiç kimse 10.000 gerçek kuş veya balıkla kontrollü deneyler yapmayı umamayacağından, hayvanların kolektif davranışları genellikle vahşi doğada gözlemlenir.

Biyologlar fizikçilerle aynı ilgiyi paylaşırlar: bireylerin birbirleriyle nasıl etkileşime girdikleri ve işlevsel olarak bir grup olarak nasıl davrandıkları. Bireysel davranışı analiz etmek için kullanılan geleneksel araştırma alanlarından biri, davranışın altında yatan mekanizmaların nöronal ve moleküler düzeyde incelendiği sinirbilimdir. Şimdiye kadar birçok nörobilimsel aşağıdan yukarıya yaklaşım geliştirilmiştir. Fizikte yukarıdan aşağıya yaklaşımlar ve biyolojide aşağıdan yukarıya yaklaşımlar, meyve sineği, solucan Caenorhabditis elegans ve fare gibi model hayvanlar kullanılarak kolaylaştırılabilir⁹. Bununla birlikte, bu model hayvanların laboratuvardaki büyük ölçekli kolektif davranışları hakkında çok az bulgu vardır¹⁰; Genetik olarak izlenebilir model hayvanları laboratuvarda büyük ölçekte hazırlamak hala zordur. Bu nedenle, biyoloji ve fizikteki kolektif davranışlar üzerine yapılan güncel araştırmalarda, genellikle laboratuvarda araştırma yapan bilim adamlarının hayvanların kolektif davranışlarını incelemesi zor olmuştur.

Bu çalışmada, nematodların kolektif davranışlarını incelemek için büyük ölçekli yetiştiriciliği için bir yöntem oluşturduk. Bu sistem, çevresel koşulları değiştirmemize ve mutantları kullanarak bireysel düzeydeki hareketin kolektif davranışlar üzerindeki etkisini incelememize^{olanak tanır 10}. Aktif madde fiziğinde, matematiksel modelin parametreleri hem deneylerde hem de simülasyonlarda kontrol edilebilir, bu da birleşik açıklamaları tanımlamak için bu modelin doğrulanmasını sağlar. Genetik, kolektif davranışın altında yatan nöral devre mekanizmasını anlamak için kullanılır¹¹.

1. Solucanların hazırlanması

NOT: Vahşi tip N2 Bristol suşu¹² ve ZX899 suşunu hazırlayın (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]⁾¹³ sırasıyla kolektif davranışların ve optogenetik deneylerin gözlemlenmesi için. ZX899 gerginliğini karanlık koşullarda koruyun.

1. Agar ile 14 mL nematod büyüme ortamı (NGM) içeren ve E. coli OP50¹² ile tohumlanmış 60 mm'lik bir plaka üzerine dört iyi beslenmiş yetişkin solucan biriktirin.
2. F1 solucanlarını NGM plakasında 7 gün boyunca 23 °C'de açlıktan ölün. F1 solucanlarının verimi bu noktada yaklaşık 100 solucan/plakadır. Solucanların aşamaları, karışık bir dauer ve aç L1 larvası popülasyonu içerir.

2. Köpek maması agar (DFA) orta boy plakalarının hazırlanması

1. 2 g toz köpek maması ve 5 mL %1 agar ortamı içeren bir cam şişeyi otoklavlayın ve oda sıcaklığına soğutun (Şekil 1A).
   NOT: Bu deneyde farklı üreticilerin diğer köpek mamaları kullanılabilir.

3. Solucanların DFA orta plakalarına aşılanması

1. E. coli OP50 ile tohumlanmış bir NGM plakasının merkezine küçük miktarlarda (yaklaşık 0.5 g) DFA ortamı aktarın (Şekil 1B). Optogenetik deneyler için, solucanların aşılanmasından önce kanal rodopsin 2'nin kofaktörü olan 40 μL 50 μM all-trans-retinal dökün.
2. Açlıktan ölen solucanları otoklavlanmış su kullanarak dört NGM plakasından toplayın.
3. DFA ortamına, tabağın kapağından yaklaşık 0.5 mm uzağa küçük bir köpek maması parçası (yaklaşık 2 g) yerleştirin.
4. Kontaminasyonu önlemek için NGM plakasını temiz bir tezgah içinde 15 dakika boyunca ultraviyole ışıkla aydınlatın.
5. Toplanan solucanları (yaklaşık 400 solucan) NGM plakaları üzerindeki DFA ortamına aşılayın. Petri plakasının içindeki nemin artmasını ve solucanları bir kapakta hapseden su damlacıkları oluşturmasını önlemek için plakayı parafilm ile kapatmayın.
6. Solucanları 23 °C'de çoğaltın ve yaklaşık 10-14 gün boyunca plakanın kapağına kadar tırmanmalarına izin verin.
   NOT: Kapaklardaki solucanların sayısı 10-14 gün sonra neredeyse hiç artmadığından, solucanların muhtemelen yiyeceklerinin bittiği varsayılmıştır.

4. Kolektif davranışın gözlemlenmesi

1. Deney gününde, E. coli ve köpek maması agar ortamı içermeyen yeni bir NGM plakasını, bir makro zoom mikroskobu sahnesinde bir alüminyum plaka üzerine yerleştirin (Şekil 2A). Bu yeni NGM plakasının altını bir Peltier sıcaklık kontrol ünitesi kullanarak en az 23 dakika boyunca 5 °C'de tutun (Şekil 2B). Ardından, bu yeni NGM plakasının kapağını, solucanların tırmandığı plakanın kapağıyla değiştirin. Düşük büyütmeli objektif olarak objektif lensi (x2, NA = 0.5) kullanın (Şekil 2A).
2. Petri plakasının içindeki nemi değiştirmek için Petri plakasının tabanının sıcaklığını 23 °C'den 26 °C'ye yükseltin (Şekil 2).
3. Kamera ile plaka kapağının iç yüzeyinin görüntülerini 20 kare s^−1'de alın (Ek Video S1).
4. Alınan görüntüleri Etiketli Görüntü Dosyası biçiminde kaydedin.

5. Optogenetik deney

1. Mavi ışık vermek için bir filtre seti ile filtrelenmiş 100 W cıvalı bir lamba kullanın. Elektromanyetik bir deklanşör sistemi kullanarak aydınlatma süresini hassas bir şekilde kontrol edin (Şekil 2B).
2. ZX899'u bu koşullar altında DFA'da mavi ışık aydınlatmasından önce 5 dakika koruyun.
3. 23 °C'de tutulan mikroskop aşamasında bir Petri plakasının kapağına takılan ZX899 solucanlarını aydınlatın.
4. 20 kare s^−1'de bir kamera ile plaka kapağının iç yüzeyinin görüntülerini alın (Ek Video S2).

Burada, kolektif davranış gözlemleri için vahşi tip dauer solucanları kullanılmıştır. Solucanlar yaklaşık 10-14 gün boyunca 23 ° C'de yetiştirildi ve bir DFA orta plakasının kapağının iç yüzeyine tırmandı. Deney gününde, sadece kapak E. coli ve DFA besiyeri olmayan yeni bir NGM plakasına aktarıldı. Bu Petri plakasının tabanı başlangıçta Peltier sistemi kullanılarak 23 °C'de tutuldu ve daha sonra sıcaklığı 26 °C'ye çıkarıldı. Mikroskop altında bir film çekildi. Şekil 3'te filmin anlık görüntüleri gösterilmektedir. Solucanlar, nem değişimi sırasında ağ modellerini dinamik olarak yeniden şekillendirdi. Nem arttıkça, ağın bölme boyutları da büyür. Son olarak, ağlar çöktü ve kapağın iç yüzeyinde uyuyan solucan kümeleri kaldı.

Şekil 1: Çok sayıda solucan yetiştirmek için DFA ortamının fotoğrafları. (A) Bir cam şişede hazırlanmış DFA ortamının fotoğrafı. (B) Toplanan solucanlar aşılandıktan hemen sonra DFA besiyeri olan NGM plakasının fotoğrafı. Kısaltmalar: DFA = köpek maması agar; NGM = nematod büyüme ortamı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kolektif davranışın gözlemlenmesi için deneysel sistem. (A) Kolektif davranışın gözlemlenmesi için mikroskopi. (B) Peltier sistemini kullanan mekanik deklanşör kontrolörü ve sıcaklık kontrol sistemi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Toplu ağ modelinin neme bağımlılığının temsili verileri. C. elegans ağının ortam nemine bağımlılığı. Kamera kare hızı 1 fps'dir. Ölçek çubuğu = 4 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S1: Toplu ağ oluşumları. Yabani tip dauer solucanları, bir Petri plakasında NGM üzerinde DFA kullanılarak çoğaltıldı. Solucanlar kapağın içinde kendi kendine organize oldular. Nem, bir Peltier cihazı kullanılarak değiştirildi. Görüntüler kapağın üstünden çekildi. Film, gerçek zamanlı kayıt hızından 80 kat daha hızlı oynatılır. Kısaltmalar: DFA = köpek maması agar; NGM = nematod büyüme ortamı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S2: Solucan kollektiflerinin optogenetik manipülasyonu. Optogenetik 1, 2, 4, 8, 32 ve 128 sn mavi ışık aydınlatmaları ile gerçekleştirildi. Bu aktivasyon başlangıçta demetlerin kesilmesine ve çökmesine neden oldu. Son olarak, ilk yapıdan farklı bir ağ oluşturuldu. Film, gerçek zamanlı kayıt hızından 20 kat daha hızlı oynatılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışmada, C. elegans'ın laboratuvardaki büyük ölçekli kolektif davranışı için bir sistem hazırlamak için bir protokol gösteriyoruz. DFA tabanlı yöntem ilk olarak, her ikisi de model olmayan hayvanlar olan Caenorhabditis japonica¹⁴ ve Neoaplectana carpocapsae Weiser¹⁵ ile kurulmuştur. Ancak bu yöntem kolektif davranışların araştırılmasında uygulanmamıştır. C. elegans, genetik olarak izlenebilir bir model hayvandır^11,12. C. elegans kullanılarak yapılan davranışsal genetik çalışmalar, bireysel düzeyde davranışsal araştırmaların incelenmesine katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, C. elegans araştırmasının uzun tarihinde, basit bir kümelenme paterni^{gözlenmesine rağmen} 16,17,18,19, ^C. elegans'ın grup düzeyindeki davranışı yoluyla dinamik patern oluşumunu gösteren hiçbir rapor yoktur. Bu çalışmanın ana fikri, bir Petri plakasında çok sayıda solucanın uzun süre bakımını kolaylaştırmak için DFA ortamını kullanmaktır. DFA ortamını kullanarak, C. elegans tarafından dinamik kolektif davranışın gözlemlenmesini sunuyoruz ve böylece yeni bir davranış paradigması sunuyoruz.

Daha önce, birkaç seri solucan üretim yöntemi bildirilmiştir. Bu yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntemin avantajı, dauer solucanlarının izolasyonu için bir işlem yapılmadan bir kapak üzerinde kolektif davranışın araştırılmasını sağlamaktır. Son zamanlarda, kapak²⁰ ile elektrostatik etkileşimler kullanarak bir kapak ve DFA ortamı arasındaki bir boşluk boyunca güzel dauer solucanlarının transferini bildiren bir makale yayınladık. Bu solucan transferi, solucanlar yaklaşık 100 solucandan oluşan bir nictation sütunu oluşturduğunda meydana gelir. Bu çalışma, DFA'da çok fazla kalabalıklaşma nedeniyle dauer oluşumları indüklendiğinde yalnızca dauer solucanlarının transfer olabileceğini göstermektedir. Bu yöntemle üretilen solucan sayısı, yumurta sarısı bazlı yöntemler gibi diğer yöntemlerden muhtemelen daha azdır. Bununla birlikte, bir kapak üzerinde davranışsal bir tahlil yapmak için, aç bırakılmış L1 larvaları gibi diğer aşama solucanlarını neredeyse hiç içermeyen dauer solucanlarının popülasyonunu kullanabiliriz, oysa önceki yöntemler dauer solucanlarının izolasyonu için bir işlem gerektirir. Böylece, bu yöntem dauer solucanları kullanılarak daha kesin bir kolektif davranışsal incelemeye izin verir. Ek olarak, deneyci aşağıdaki prosedürde solucanların yoğunluğunu da kontrol edebilir. İlk olarak, kapağa taşınan solucanları toplamak ve yıkamak için otoklavlanmış su kullanıldı. Daha sonra, sudaki solucanların konsantrasyonu, solucan süspansiyonunun bir alikotunda solucanlar sayılarak belirlendi ve solucan süspansiyonu bir substrat üzerine düşürüldü. Birlikte ele alındığında, sistemimiz davranışsal deneyler için solucan aşaması ve yoğunluğu açısından daha kontrol edilebilir.

Kolektif davranış, canlı ve cansız kendinden tahrikli parçacıkların kolektif hareketlerinin birleşik tanımlarını tanımlamayı amaçlayan aktif madde fiziği perspektifinden analiz edilmiştir. Bu amaca yönelik olarak, cansız kendinden tahrikli parçacıklar ve hücreler için birçok deneysel sistem geliştirilmiştir, ancak nöral devreye dayalı çok daha karmaşık davranışlar sergileyen çok hücreli organizmalar için daha az sistem geliştirilmiştir. Bu nedenle, sistemimiz kolektif hareketlerin birleşik tanımının var olma olasılığını genişletir. Nem manipülasyonu ile ilgili olarak, bir modele dayanan önceki sayısal simülasyonumuz, muhtemelen deneydeki nemin neden olduğu solucanlar arasındaki çekim kuvvetlerinin, nemin neden olduğu desen değişiklikleri ile niteliksel olarak tutarlı olan desen değişikliklerini indüklediğini öne sürdü¹⁰. Bununla birlikte, desen değişikliklerinin sıcaklıktan ziyade nemden kaynaklandığını gösteren deterministik deneysel kanıt olmadığını düşünüyoruz. Bu nedenle, deneyci, kolektif davranış değişikliklerinin sıcaklık değişiminden ziyade yalnızca nem değişimine atfedilip atfedilemeyeceği konusunda dikkatli olmalıdır.

Hayvanlarda kolektif davranışların altında yatan sinirsel mekanizmayı anlamak, biyoloji alanında yeni bir zorluktur. Kolektif davranışlar, bireysel düzeyde görünmeyen yeni bir işlevin ortaya çıkmasına neden olur. Hayvanlar bir sinir sistemine sahip olduklarından, hafıza ve öğrenme yeteneklerine sahiptirler ve bu sinirsel işlevlerdeki farklılıkları birey ve popülasyon düzeylerinde incelemek ilgi çekicidir. Kolektif davranışların yabancı organizmalar ve avlar için algılama duyarlılığını geliştirdiği ve doğru karar verme yeteneğini geliştirdiği kaydedilmiştir 21,22,23. C. elegans ayrıca 302 nörondan oluşan bir sinir sistemine sahiptir ve bu nedenle geçmiş yetiştirme sıcaklığını²⁴ ezberler ve tercih edilen nem²⁵ olan bir yere göç eder. Bu nedenle, C. elegans'ta nöral işlevler ve kolektif davranışlar arasındaki ilişkiyi araştırmak ilginç olacaktır. Ayrıca, bir solucan popülasyonunun davranışının gözlemlenmesi yoluyla mekanik parametrelerin çıkarılması beklenebilir. Örneğin, C. elegans kalabalıklarındaki viskoelastik özelliklerin gözlemlenmesi, tek bir solucanın esnekliğini ve solucanlar arasındaki yüzey gerilimini tahmin etmeyi mümkün kılacaktır. Solucan kümelerinin boyut dağılımı, aralarındaki yüzey gerilimi ile ilgili olmalıdır. C. elegans bireyinin itici kuvveti, solucanın yüzey gerilimine tepki olarak hareket etme sıklığından da tahmin edilebilir. Bu nedenle, yalnızca solucan popülasyonunun makroskopik bilgilerine dayanarak bireysel solucanlar düzeyinde mekanik parametreleri tahmin etmeyi bekleyebiliriz.

Sonuç olarak, aktif madde fiziği, kolektif davranışların birleşik tanımlarını tanımlamayı amaçlar ve bu alan, parametreleri kontrol ederek önerilen matematiksel modellerin daha deneysel olarak doğrulanmasını gerektirir. Ek olarak, her hayvanın kolektif model oluşumunun işlevsel önemi ve bunun sinirsel işlevlerle mekanik ilgisi önemli açık sorulardır. Ayrıca, 'yumuşak robotik'in amaçlarından birinin robot kolektiflerinin hassas kontrolü olduğu göz önüne alındığında, yumuşak robotların kolektif hareketlerini kontrol etmek için solucanların kolektif davranışlarının deneyleri yoluyla bir algoritma oluşturulabileceğini umuyoruz.

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışmada kullanılan suşları sağladığı için Caenorhabditis Genetik Merkezi'ne teşekkür ederiz. Bu yayın, JSPS KAKENHI Bilimsel Araştırma Hibesi (B) (hibe numarası JP21H02532), JSPS KAKENHI Yenilikçi Alanlar Yardım Hibesi "Yumuşak Robot Bilimi" projesi (hibe numarası JP18H05474), JSPS KAKENHI Dönüştürücü Araştırma Alanları için Yardım Hibesi B (hibe numarası JP23H03845), Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı'ndan PRIME (hibe numarası JP22gm6110022h9904), JST-Mirai Programı (hibe numarası JPMJMI22G3), ve JST-FOREST Programı (hibe numarası JPMJFR214R).