El cultivo a gran escala de nematodos para estudiar sus comportamientos colectivos

Aquí, se reporta un sistema para estudiar los comportamientos colectivos de los nematodos mediante su cultivo a granel utilizando medio agar alimento para perros. Este sistema permite a los investigadores propagar un gran número de gusanos dauer y se puede aplicar a Caenorhabditis elegans y otras especies relacionadas.

Los animales exhiben comportamientos colectivos dinámicos, como se observa en bandadas de aves, bancos de peces y multitudes de humanos. Los comportamientos colectivos de los animales han sido investigados tanto en los campos de la biología como de la física. En el laboratorio, los investigadores han utilizado varios animales modelo, como la mosca de la fruta y el pez cebra, durante aproximadamente un siglo, pero sigue siendo un gran desafío estudiar el comportamiento colectivo complejo a gran escala orquestado por estos animales modelo genéticamente manejables. En este trabajo se presenta un protocolo para crear un sistema experimental de comportamientos colectivos en Caenorhabditis elegans. Los gusanos propagados trepan por la tapa de la placa de Petri y muestran un comportamiento de enjambre colectivo. El sistema también controla las interacciones y comportamientos de los gusanos cambiando la humedad y la estimulación de la luz. Este sistema nos permite examinar los mecanismos subyacentes a los comportamientos colectivos mediante el cambio de las condiciones ambientales y el examen de los efectos de la locomoción a nivel individual en los comportamientos colectivos utilizando mutantes. Por lo tanto, el sistema es útil para futuras investigaciones tanto en física como en biología.

Tanto los no científicos como los científicos están fascinados con los comportamientos colectivos de los animales, como en las bandadas de pájaros y los bancos de peces. Los comportamientos colectivos se han analizado en una amplia gama de campos, como la física, la biología, las matemáticas y la robótica. En particular, la física de la materia activa es un campo de investigación en crecimiento que se centra en sistemas compuestos por elementos autopropulsados, es decir, sistemas disipativos, como bandadas de aves, bancos de peces, biopelículas de bacterias móviles, citoesqueletos compuestos por moléculas activas y grupos de coloides autopropulsados. La teoría de la física de la materia activa sostiene que, por muy complejos que sean los comportamientos de los individuos, los movimientos colectivos de un gran número de seres vivos se rigen por un pequeño número de reglas simples. Por ejemplo, el modelo de Vicsek, candidato para una descripción unificada del movimiento colectivo de partículas autopropulsadas, predice que se requiere una interacción de alineación de corto alcance de objetos en movimiento para formar una fase ordenada de largo alcance con fluctuación excéntrica en 2D, como en las manadas de animales¹. Los enfoques experimentales de arriba hacia abajo relacionados con la física de la materia activa se están desarrollando rápidamente. Experimentos previos confirmaron la formación de una fase ordenada de largo alcance en Escherichia^{coli 2}. Otros trabajos recientes emplearon células ^3,4, bacterias⁵, coloides móviles⁶ o proteínas en movimiento ^7,8. Modelos minimalistas simples, como el modelo de Vicsek, describieron con éxito estos fenómenos reales. A diferencia de estos sistemas experimentales unicelulares, los comportamientos colectivos de los animales suelen observarse en la naturaleza, ya que nadie podría esperar realizar experimentos controlados con 10.000 aves o peces reales.

Los biólogos comparten el mismo interés que los físicos: cómo los individuos interactúan entre sí y se comportan funcionalmente como grupo. Uno de los campos de investigación tradicionales para analizar el comportamiento individual es la neurociencia, en la que se han examinado los mecanismos subyacentes al comportamiento a nivel neuronal y molecular. Hasta ahora se han desarrollado muchos enfoques neurocientíficos de abajo hacia arriba. Los enfoques de arriba hacia abajo en física y los enfoques de abajo hacia arriba en biología pueden facilitarse utilizando animales modelo como la mosca de la fruta, el gusano Caenorhabditis elegans y el ratón⁹. Sin embargo, ha habido pocos hallazgos sobre el comportamiento colectivo a gran escala de estos animales modelo en el laboratorio¹⁰; Todavía es difícil preparar animales modelo genéticamente tratables a gran escala en el laboratorio. Por lo tanto, en la investigación actual sobre comportamientos colectivos en biología y física, ha sido difícil para los científicos que suelen investigar en el laboratorio estudiar los comportamientos colectivos de los animales.

En este estudio, establecimos un método para el cultivo a gran escala de nematodos para estudiar sus comportamientos colectivos. Este sistema nos permite cambiar las condiciones ambientales y examinar el efecto de la locomoción a nivel individual en los comportamientos colectivos utilizando mutantes¹⁰. En física de la materia activa, los parámetros del modelo matemático se pueden controlar tanto en experimentos como en simulaciones, lo que permite verificar ese modelo para identificar descripciones unificadas. La genética se utiliza para comprender el mecanismo del circuito neuronal que subyace al comportamiento colectivo¹¹.

1. Preparación de lombrices

NOTA: Prepare la cepa¹² y la cepa ZX899 de Bristol N2 de tipo salvaje (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])¹³ para la observación de comportamientos colectivos y experimentos optogenéticos, respectivamente. Mantenga la cepa ZX899 en condiciones de oscuridad.

1. Depositar cuatro gusanos adultos bien alimentados en una placa de 60 mm que contenga 14 mL de medio de crecimiento de nematodos (NGM) con agar y sembrar con E. coli OP50¹².
2. Cultive gusanos F1 hasta la inanición en la placa NGM a 23 °C durante 7 días. El rendimiento de los gusanos F1 es de aproximadamente 100 gusanos/placa en este punto. Las etapas de los gusanos comprenden una población mixta de larvas de dauer y L1 hambrientas.

2. Preparación de placas medianas de agar de comida para perros (DFA)

1. Esterilizar en autoclave un frasco de vidrio que contiene 2 g de alimento en polvo para perros y 5 ml de medio de agar al 1% y enfriarlo a temperatura ambiente (Figura 1A).
   NOTA: En este experimento se pueden utilizar otros alimentos para perros de diferentes fabricantes.

3. Inoculación de lombrices a placas de medio DFA

1. Transfiera pequeñas cantidades (aproximadamente 0,5 g) de medio DFA al centro de una placa NGM sembrada con E. coli OP50 (Figura 1B). Para experimentos optogenéticos, vierta 40 μL de 50 μM all-trans-retinal, el cofactor del canal rodopsina 2, en el DFA antes de la inoculación de los gusanos.
2. Recoja los gusanos hambrientos de cuatro placas NGM usando agua esterilizada en autoclave.
3. Coloque un pequeño fragmento de comida para perros (aproximadamente 0,5 g) en el medio DFA, a unos 2 mm de distancia de la tapa del plato.
4. Ilumine la placa NGM con luz ultravioleta durante 15 minutos dentro de un banco limpio para evitar la contaminación.
5. Inocular los gusanos recolectados (aproximadamente 400 gusanos) en el medio DFA en placas NGM. No selle la placa con parafilm para evitar aumentar la humedad dentro de la placa de Petri y generar gotas de agua que atrapen gusanos en una tapa.
6. Propagar los gusanos a 23 °C y dejar que suban hasta la tapa de la placa durante aproximadamente 10-14 días.
   NOTA: Debido a que el número de gusanos en los párpados apenas aumentó después de 10 a 14 días, se presumió que los gusanos probablemente se habían quedado sin comida.

4. Observación del comportamiento colectivo

1. El día del experimento, coloque una nueva placa NGM que no incluyera E. coli y medio de agar alimento para perros en una placa de aluminio en la platina de un microscopio con zoom macro (Figura 2A). Mantenga la parte inferior de esta nueva placa NGM a 23 °C utilizando una unidad controladora de temperatura Peltier durante al menos 5 minutos (Figura 2B). Luego, reemplace la tapa de esta nueva placa NGM con la tapa de la placa a la que treparon los gusanos. Utilice la lente del objetivo (x2, NA = 0,5) como objetivo de bajo aumento (Figura 2A).
2. Aumente la temperatura de la parte inferior de la placa de Petri de 23 °C a 26 °C para alterar la humedad dentro de esa placa (Figura 2).
3. Adquiera imágenes de la superficie interior de la tapa de la placa con la cámara a 20 fotogramas s⁻¹ (vídeo suplementario S1).
4. Guarde las imágenes adquiridas en el formato Archivo de imagen etiquetada.

5. Experimento optogenético

1. Utilice una lámpara de mercurio de 100 W para suministrar luz azul, filtrada con un juego de filtros. Controle el tiempo de iluminación con precisión mediante un sistema de obturador electromagnético (Figura 2B).
2. Mantenga el ZX899 en DFA en estas condiciones durante 5 minutos antes de la iluminación de luz azul.
3. Ilumine los gusanos ZX899 adheridos a la tapa de una placa de Petri en la platina del microscopio mantenida a 23 °C.
4. Adquiera imágenes de la superficie interior de la tapa de la placa con una cámara a 20 fotogramas s⁻¹ (vídeo complementario S2).

Aquí, se utilizaron gusanos dauer de tipo salvaje para observaciones colectivas del comportamiento. Los gusanos se cultivaron a 23 °C durante aproximadamente 10-14 días y subieron hasta la superficie interna de la tapa de una placa mediana DFA. En el día experimental, solo la tapa se transfirió a una nueva placa NGM sin E. coli y medio DFA. La parte inferior de esta placa de Petri se mantuvo inicialmente a 23 °C utilizando el sistema Peltier, y luego se aumentó su temperatura a 26 °C. Se tomó una película bajo el microscopio. En la figura 3 se muestran instantáneas de la película. Las lombrices remodelaron dinámicamente sus patrones de red durante el cambio de humedad. A medida que aumenta la humedad, el tamaño de los compartimentos de la red también aumenta. Finalmente, las redes colapsaron y los grupos de gusanos latentes permanecieron en la superficie interna de la tapa.

Figura 1: Fotos del medio DFA para cultivar un gran número de lombrices. (A) Foto del medio DFA preparado en una botella de vidrio. (B) Foto de la placa NGM con medio DFA justo después de que se inocularon los gusanos recolectados. Abreviaturas: DFA = agar alimento para perros; NGM = medio de crecimiento de nematodos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Sistema experimental para la observación de la conducta colectiva. (A) Microscopía para la observación de la conducta colectiva. (B) Controlador mecánico del obturador y sistema de control de temperatura mediante el sistema Peltier. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Datos representativos de la dependencia del patrón de red colectiva de la humedad. Dependencia de la red de C. elegans de la humedad ambiental. La velocidad de fotogramas de la cámara es de 1 fps. Barra de escala = 4 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video complementario S1: Formaciones colectivas en red. Los gusanos dauer de tipo salvaje se propagaron utilizando DFA en NGM en una placa de Petri. Los gusanos se autoorganizaron dentro de la tapa. La humedad se cambió mediante un dispositivo Peltier. Las imágenes fueron tomadas desde arriba de la tapa. La película se reproduce 80 veces más rápido que la velocidad de grabación en tiempo real. Abreviaturas: DFA = agar alimento para perros; NGM = medio de crecimiento de nematodos. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Video complementario S2: Manipulación optogenética de colectivos de gusanos. La optogenética se realizó con iluminaciones de luz azul de 1, 2, 4, 8, 32 y 128 s. Esta activación provocó inicialmente la arborización y el colapso de los paquetes. Finalmente, se conformó una red diferente a la estructura inicial. La película se reproduce 20 veces más rápido que la velocidad de grabación en tiempo real. Haga clic aquí para descargar este archivo.

En este estudio, mostramos un protocolo para preparar un sistema para el comportamiento colectivo a gran escala de C. elegans en el laboratorio. El método basado en DFA se estableció originalmente con Caenorhabditis japonica¹⁴ y Neoaplectana carpocapsae Weiser¹⁵, ambos animales no modelo. Sin embargo, este método no se aplicó para investigar comportamientos colectivos. El C. elegans es un animal modelo genéticamente tratable^11,12. Los estudios genéticos conductuales con C. elegans han contribuido a la investigación de la investigación conductual a nivel individual. Sin embargo, en la larga historia de la investigación de C. elegans, aunque se observó un patrón de aglomeración simple 16,17,18,19, ningún reporte ha demostrado la formación de patrones dinámicos a través del comportamiento a nivel de grupo de C. elegans. Una idea clave de este estudio es el uso del medio DFA para facilitar el mantenimiento de un gran número de gusanos durante mucho tiempo en una placa de Petri. Utilizando el medio DFA, presentamos la observación del comportamiento colectivo dinámico por parte de C. elegans, introduciendo así un nuevo paradigma conductual.

Anteriormente, se han reportado varios métodos de producción masiva de gusanos. En comparación con estos métodos, la ventaja de este método es permitir la investigación del comportamiento colectivo en una tapa sin un proceso para el aislamiento de gusanos dauer. Recientemente, publicamos un artículo que informa de la transferencia de gusanos dauer nictantes a través de un espacio entre una tapa y un medio DFA utilizando interacciones electrostáticas con la tapa²⁰. Esta transferencia de gusanos se produce cuando los gusanos forman una columna de nictación compuesta por aproximadamente 100 gusanos. Este estudio muestra que solo los gusanos dauer pueden transferirse cuando las formaciones dauer son inducidas por un exceso de hacinamiento en DFA. Es probable que el número de gusanos producidos por este método sea menor que el de otros métodos, como los métodos basados en yema de huevo. Sin embargo, para realizar un ensayo de comportamiento en una tapa, podemos utilizar la población de gusanos dauer, que difícilmente incluye otros gusanos en etapa como larvas L1 hambrientas, mientras que los métodos anteriores requieren un proceso para el aislamiento de gusanos dauer. Por lo tanto, este método permite un examen de comportamiento colectivo más preciso utilizando gusanos dauer. Además, el experimentador también puede controlar la densidad de gusanos en el siguiente procedimiento. En primer lugar, se utilizó agua esterilizada en autoclave para recoger y lavar los gusanos que se movían hasta la tapa. Luego, se determinó la concentración de lombrices en el agua contando las lombrices en una alícuota de la suspensión de lombrices, y la suspensión de lombrices se dejó caer sobre un sustrato. En conjunto, nuestro sistema es más controlable en términos de la etapa y la densidad del gusano para los experimentos de comportamiento.

El comportamiento colectivo ha sido analizado desde la perspectiva de la física activa de la materia, que busca identificar descripciones unificadas de los movimientos colectivos de partículas autopropulsadas vivas y no vivas. Con este objetivo, se han desarrollado muchos sistemas experimentales para partículas y células autopropulsadas no vivas, pero se han desarrollado menos sistemas para organismos multicelulares, que exhiben comportamientos mucho más complejos basados en el circuito neuronal. Por lo tanto, nuestro sistema amplía la posibilidad de que exista la descripción unificada de los movimientos colectivos. Con respecto a la manipulación de la humedad, nuestra simulación numérica previa basada en un modelo sugirió que las fuerzas de atracción entre gusanos, probablemente inducidas por la humedad en el experimento, inducen cambios en el patrón, que fueron cualitativamente consistentes con los cambios en el patrón inducidos por la humedad¹⁰. Sin embargo, creemos que no hay evidencia experimental determinista que demuestre que los cambios de patrón fueron inducidos por la humedad en lugar de la temperatura. Por lo tanto, el experimentador debe tener cuidado con si los cambios de comportamiento colectivo pueden atribuirse únicamente al cambio de humedad en lugar del cambio de temperatura o no.

Comprender el mecanismo neuronal que subyace a los comportamientos colectivos en los animales es un nuevo reto en el campo de la biología. Los comportamientos colectivos conducen a la aparición de una nueva función que no aparece a nivel individual. Como los animales tienen un sistema nervioso, tienen memoria y habilidades de aprendizaje, y es intrigante examinar las diferencias en estas funciones neuronales a nivel individual y poblacional. Se ha observado que los comportamientos colectivos mejoran la sensibilidad de detección de organismos extraños y presas y mejoran la capacidad para la toma de decisiones correctas 21,22,23. C. elegans también tiene un sistema nervioso compuesto por 302 neuronas y, por lo tanto, memoriza la temperatura de cultivo^{pasada 24} y migra a un lugar con humedad preferible²⁵. Por lo tanto, sería interesante investigar la relación entre las funciones neuronales y los comportamientos colectivos en C. elegans. Además, se pueden esperar extraer parámetros mecánicos a través de la observación del comportamiento de una población de gusanos. Por ejemplo, la observación de las propiedades viscoelásticas en multitudes de C. elegans permitiría estimar la elasticidad de un solo gusano y la tensión superficial entre gusanos. La distribución del tamaño de los grupos de lombrices debe estar relacionada con la tensión superficial entre ellos. La fuerza propulsora del individuo de C. elegans también se puede estimar a partir de la frecuencia con la que el gusano se mueve en respuesta a la tensión superficial. Por lo tanto, podemos esperar estimar los parámetros mecánicos a nivel de gusanos individuales basándonos solo en información macroscópica de la población de gusanos.

En conclusión, la física de la materia activa tiene como objetivo identificar descripciones unificadas de comportamientos colectivos, y este campo requiere una verificación más experimental de los modelos matemáticos propuestos mediante el control de parámetros. Además, la importancia funcional de la formación de patrones colectivos de cada animal y su relevancia mecánica para las funciones neuronales son importantes preguntas abiertas. Además, dado que uno de los objetivos de la 'robótica blanda' es el control preciso de colectivos de robots, esperamos que se pueda establecer un algoritmo a través de los experimentos de los comportamientos colectivos de los gusanos para su aplicación al control de los movimientos colectivos de los robots blandos.

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecemos al Centro de Genética de Caenorhabditis por proporcionar las cepas utilizadas en este estudio. Esta publicación ha contado con el apoyo de JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (subvención número JP21H02532), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid on the Innovative Areas "Science of Soft Robot" (subvención número JP18H05474), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Transformative Research Areas B (subvención número JP23H03845), PRIME de la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (subvención número JP22gm6110022h9904), JST-Mirai Program (subvención número JPMJMI22G3), y el Programa JST-FOREST (subvención número JPMJFR214R).