Mikobakterilerin Doğal ve Rekombinant Hücre Dışı Veziküllerinin Zenginleştirilmesi

Bu protokol, Mycobacterium smegmatis'in (Msm) aksenik kültürlerinden doğal mikobakteriyel hücre dışı veziküllerin (mEV'ler) zenginleştirilmesini ve mCherry (kırmızı floresan raportör) içeren rekombinant MsmEV'lerin nasıl tasarlanabileceğini ve zenginleştirilebileceğini detaylandırır. Son olarak, Mycobacterium tuberculosis'in EsxA proteinini içeren MsmEV'lerin zenginleştirilmesiyle yeni yaklaşımı doğrulamaktadır.

Mikobakteriler de dahil olmak üzere çoğu bakteri, hücre dışı veziküller (EV'ler) üretir. Bakteriyel EV'ler (bEV'ler), metabolitler, lipitler, proteinler ve nükleik asitler dahil olmak üzere hücresel bileşenlerin bir alt kümesini içerdiğinden, birkaç grup, alt birim aşı adayları olarak koruyucu güçleri açısından bEV'lerin doğal veya rekombinant versiyonlarını değerlendirmiştir. Doğal EV'lerin aksine, rekombinant EV'ler, ilgilenilen bir veya daha fazla immünojen içerecek şekilde moleküler olarak tasarlanmıştır. Son on yılda, farklı gruplar rekombinant bEV'ler üretmek için çeşitli yaklaşımlar araştırdılar. Bununla birlikte, burada, mikobakterilerde rekombinant mikobakteriyel EV'lerin (mEV'ler) tasarımını, yapımını ve zenginleştirilmesini rapor ediyoruz. Bu doğrultuda, model sistem olarak avirulent bir toprak mikobakterisi olan Mycobacterium smegmatis'i (Msm) kullanıyoruz. İlk olarak, Msm'nin yerel EV'lerinin üretimini ve zenginleştirilmesini açıklıyoruz. Daha sonra, kırmızı bir floresan raportör proteini olan mCherry veya Mycobacterium tuberculosis'in belirgin bir immünojeni olan EsxA (Esat-6) içeren rekombinant mEV'lerin tasarımını ve yapımını açıklıyoruz. Bunu, mCherry ve EsxA N-terminalini küçük bir Msm proteini Cfp-29'un C-terminali ile ayrı ayrı kaynaştırarak başarıyoruz. Cfp-29, MsmEV'lerin bol miktarda bulunan birkaç proteininden biridir. Msm'den rekombinant mEV'ler üretme ve zenginleştirme protokolü, Msm'nin yerel EV'lerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi ile aynı kalır.

Bulaşıcı hastalıklara karşı çok çeşitli aşıların geliştirilmesine ve uygulanmasına rağmen, bugüne kadar bile, tüm insan ölümlerinin ~%30'u hala bulaşıcı hastalıklardan kaynaklanmaktadır¹. Tüberküloz (TB) aşısının ortaya çıkmasından önce - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - TB bir numaralı katildi (~10.000 ila 15.000 / 100.000 nüfus)². BCG'nin uygulanması ve birinci ve ikinci basamak anti-TB ilaçlarına kolay erişim ile 2022 yılına kadar, TB'ye bağlı ölümler 2022 yılına kadar ~1 milyon/yıl'a önemli ölçüde düşmüştür (yani, ~15-20/100.000 nüfus¹). Bununla birlikte, dünyanın TB endemik popülasyonlarında, TB'ye bağlı ölümler ~ 100-550 / 100.000 nüfusta^durmaya devam etmektedir 1. Uzmanlar bu çarpık sayılara yol açan çeşitli nedenleri kabul ederken, BCG aracılı korumanın yaşamın ilk on yılında bile sürmemesi^öne çıkan neden gibi görünmektedir 3,4,5,6,7. Sonuç olarak, BM'nin yenilenen 'Sürdürülebilir Kalkınma Hedefleri' ve DSÖ'nün 'Tüberkülozu Bitirme Stratejisi' göz önüne alındığında, belki de tüberkülozdan ömür boyu koruma sağlayan BCG'ye çok daha üstün bir aşı alternatifi geliştirmek için ortak bir küresel çaba var.

Bu amaca yönelik olarak, şu anda birkaç grup modifiye / rekombinant BCG suşlarını, BCG dışındaki patojenik olmayan ve zayıflatılmış mikobakteriyel türleri ve alt birim adaylarını^{değerlendirmektedir} 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Tipik olarak, alt birim aşılar, patojenin birkaç saflaştırılmış (~ 1-6) tam uzunlukta veya kesilmiş immünojenik proteini ile seçici olarak yüklenmiş lipozomlardır. Bununla birlikte, doğal olmayan konformasyonlara sahte katlanmaları ve/veya yüklü proteinler arasındaki rastgele işlevsel olmayan etkileşimler nedeniyle, alt birimler genellikle doğal ve germane epitoplarından yoksundur ve bu nedenle bağışıklık sistemini yeterince hazırlayamaz^14,19,20.

Sonuç olarak, bakterilerin hücre dışı vezikülleri (EV'ler) umut verici bir alternatif olarak hız kazanmıştır 21,22,23,24,25,26. Tipik olarak, bakteriyel EV'ler (bEV'ler), nükleik asitlerin, lipitlerin ve yüzlerce metabolit ve proteinin bazı kısımları dahil olmak üzere hücresel bileşenlerinin bir alt kümesini içerir^27,28. Birkaç saflaştırılmış proteinin yapay olarak yüklendiği lipozomların aksine, bEV'ler, özellikle adjuvanların ve Toll benzeri reseptör (TLR) agonistlerinin desteği/yardımı olmadan, bağışıklık sistemini hazırlamak için daha iyi bir eğilime sahip, doğal olarak yüklenmiş, doğal olarak katlanmış yüzlerce protein içerir^27,28,29. Bu araştırma hattında, biz ve diğerleri, mikobakteriyel EV'lerin BCG^30'a potansiyel alt birim güçlendiriciler olarak faydasını araştırdık. bEV'lerin tek tip antijen yüklerinden yoksun olduğuna dair endişelere rağmen, zayıflatılmış Neisseria meningitidis'ten elde edilen EV'ler, insanları serogrup B meningokoklarına karşı başarıyla korumuştur^31,32.

En azından teorik olarak, BCG'yi iyi bir şekilde artırabilecek en iyi EV'ler, patojenik bakterilerden zenginleştirilmiş EV'lerdir. Bununla birlikte, patojenik mikobakteri tarafından üretilen EV'leri zenginleştirmek pahalı, zaman alıcı ve risklidir. Ek olarak, patojen kaynaklı EV'ler koruyucu olmaktan çok öldürücü olabilir. Potansiyel riskler göz önüne alındığında, burada, avirulan bir mikobakteri olan aksenik olarak yetiştirilen Msm tarafından üretilen EV'lerin zenginleştirilmesi için iyi test edilmiş bir protokol bildiriyoruz.

Bununla birlikte, birkaç patojen protein ortologunu kodlamasına rağmen, avirulent mikobakteriler, bağışıklık sistemini korumaya yeterince hazırlamak için gerekli olan birkaç aşı antijeni/patojenik protein epitopundan yoksundur³³. Bu nedenle, moleküler mühendislik yoluyla Msm'nin rekombinant EV'lerini oluşturmayı ve zenginleştirmeyi de araştırdık, öyle ki Msm'de ifade edilen ve çevrilen herhangi bir patojenik proteinin önemli bir kısmı EV'lerine ulaşmalıdır. Msm EV'lerin en bol bulunan 10 proteininden bir veya daha fazlasının, ilgilenilen proteine kaynaştığında bu tür bir translokasyona yardımcı olacağını varsaydık.

Laboratuvarımızda mikobakteriyel EV'lerin (mEV'ler) zenginleştirilmesini standartlaştırmaya başlarken, 2011 yılında Prados-Rosales ve ark. ilk olarak mEV'lerin in vitro^30'un görselleştirilmesini ve zenginleştirilmesini bildirdi. Daha sonra, 2014 yılında, aynı grup 2011 yöntem^34'ün değiştirilmiş bir versiyonunu yayınladı. 2015 yılında, Lee ve ark. ayrıca mikobakterilerin³⁵ aksenik kültürlerinden mEV zenginleştirme için bağımsız olarak standartlaştırılmış bir yöntem bildirdiler. Her iki protokolü^{de 34,35} birleştirerek ve kapsamlı standardizasyondan sonra modifikasyonlarımızdan birkaçını dahil ederek^, burada mikobakterilerin ³⁶ aksenik kültürlerinden mEV'leri rutin olarak zenginleştirmeye yardımcı olan bir protokolü açıklıyoruz.

Burada, genel olarak mikobakteriyel EV'lerin zenginleştirilmesi için yayınlanmış bir protokol^36'nın bir uzantısı olan Msm'ye özgü EV'lerin zenginleştirilmesini özellikle detaylandırıyoruz. Ayrıca, mCherry proteinini (kırmızı floresan raportör olarak) ve EsxA'yı (Esat-6)^37,38,39, baskın bir immünojen ve Mycobacterium tuberculosis'in potansiyel bir alt birim aşılayıcısı olarak içeren rekombinant mEV'lerin (R-mEV'ler) nasıl oluşturulacağını da detaylandırıyoruz. R-mEV'leri zenginleştirme protokolü, Msm'den yerel EV'leri zenginleştirmek için tanımladığımız protokolle aynı kalır.

1. Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli ve türevlerinin büyüme koşulları

1. Medya
   1. Middlebrook 7H9 sıvı et suyu
      1. Gerekli hacimde çift damıtılmış suyu (ddw) bir cam beherde mikrodalgada ~45-50 ^oC'ye önceden ısıtarak %20 Tween-80 stok çözeltisi hazırlayın, uygun bir ölçüm silindiri kullanarak gerekli hacimde Tween-80 ekleyin ve %20 Tween-80'i homojen bir çözelti haline getirmek için küçük bir manyetik karıştırıcı üzerinde sürekli karıştırın. %20 Tween-80'i 0,22 um atma filtresinden süzün ve soluk sarı stok çözeltisini 4 ^{° C'de}saklayın.
         NOT: Doğru nihai konsantrasyon için ölçüm silindirindeki tüm Tween-80 izleri behere aktarılmalıdır. Hazırlanan Tween-80 stoğunu otoklavlamayın. Filtre (0,22 μM kullanın) sterilize edin ve 4 ^{° C'de}saklayın.
      2. 7H9 suyunun hazırlanması için üreticinin talimatlarını izleyin. 900 mL ddw içinde 4.7 g 7H9 tozunu süspanse edin. 2 mL gliserol ekleyin, içindekileri karıştırın ve 121 ^°C'de, 15 psi'de 20 dakika otoklavlayın.
         NOT: Otoklavlamadan önce Middlebrook ADC zenginleştirme (ADC) ve Tween-80 eklemeyin.
      3. Otoklavlanmış ortam oda sıcaklığına (RT, yani ~ 25 ^oC) soğuduktan sonra, standart bir A2 tipi biyogüvenlik kabininde, aseptik olarak 10x 100 mL ADC stoğu (son 1x) ve 2,5 mL (son %0,05) %20 Tween-80 ekleyin. Karışımı 0,22 μm tek kullanımlık filtre ünitesinden süzün ve çok açık sarımsı yeşil, şeffaf stok çözeltisini 4 ^°C'de saklayın.
         NOT: Ortamın pH'ı ~6.6 ila 6.8 olmalıdır (<6.4 veya >7.0 ise, atın ve taze yapın). 4 ^{° C'de}saklayın (3-4 hafta stabil). 7H9 ortamının (ADC ve Tween-80 eklendikten sonra) iki bağımsız 0,22 μm tek kullanımlık filtre ünitesinden iki kez filtrelenmesi şiddetle tavsiye edilir.
   2. Sauton'un (minimal medya) sıvı suyu
      1. L-asparagin (% 0.4 w / v) ve sitrik asidi (% 0.2 w / v) 950 mL ddw içinde çözün. Taze hazırlanmış 1.000x stoğun her birine 1 mL ekleyin (ddw cinsinden) dibazik potasyum fosfat (renksiz; stok 10 g / 20 mL; son 1x 0.5 g / L); magnezyum sülfat heptahidrat (renksiz; stok 10 g/20 mL; son 1x 0,5 g/L); ve ferrik amonyum sitrat (çok açık kahverengi; stok 1.6 g/40 mL; son 1x 0.04 g/L) ve manyetik bir karıştırıcı üzerinde iyice karıştırın.
         NOT: En iyi ihtimalle, 1.000x hisse senedi 2 haftalık olabilir; bundan daha eskiyse, taze stoklar hazırlayın; bunları karanlıkta RT'de saklayın (örneğin, bir dolap / raf içinde). Ferrik amonyum sitrat koyu kahverengiyse, atın ve taze yapın. Üç tuzu adım 1.1.2.1'de belirtilen sırayla eklemek en iyisidir. Her tuz çözeltisini eklemeden önce çözeltiyi her seferinde döndürün.
      2. Bir pH metre kullanarak pH'ı ölçün ve not edin; 3.1 ila 3.2 civarında olduğundan emin olun. PH 3.7'den fazlaysa, stokları atın ve taze hazırlayın. PH'ı 7.4'e ayarlamak için, gerektiği kadar 10 N sodyum hidroksit damlası kullanın. Çözeltiyi/ortamı manyetik bir karıştırıcı üzerinde sürekli karıştırırken son pH'ı izleyin.
      3. 4.76 mL gliserol, 0.25 mL %20 Tween-80 (son %0.005, ayrıca adım 2.2.1.3 için nota bakınız) ekleyin ve ancak o zaman hacmi 1 L'ye yükseltin. Ardından, iki ayrı 0,22 μm atık filtre ile 1 L ortamı iki kez filtreyle sterilize edin. Berrak, renksiz ortamı 4 ^°C'de saklayın (2 hafta boyunca stabil).
         NOT: Sadece pH 7.4'e ayarlandıktan sonra gliserol ekleyin. Aksi takdirde, medya bulutlu beyaza döner. Bulutluysa, atın (ısıtmayı denemeyin) ve taze olarak hazırlayın. Tüm mEV preparatları için taze hazırlanmış Sauton'ları kullanın.
   3. Middlebrook 7H11 agar tabanı
      1. Hazırlık için üreticinin talimatlarını izleyin. 19 g 7H11 tozunu 900 mL ddw içinde süspanse edin. 5 mL gliserol ekleyin, homojen bir süspansiyon elde etmek için manyetik bir karıştırıcı üzerinde döndürün (soluk yeşil; pH 6.6 ila 6.8; >7.2 ise, atın ve taze hazırlayın) ve 121 ^oC'de, 15 psi'de ve 20 dakika boyunca otoklavlayın.
         NOT: Otoklavlamadan önce ADC ve %0.05 Tween-80 eklemeyin.
      2. Ortam ~ 50 ^°C'ye soğuduğunda, aseptik olarak A2 tipi bir biyogüvenlik kabininde, 100 mL ADC (RT'ye getirilir) ve 2,5 mL %20 (son %0,05) Tween-80 (RT'ye getirilir) ekleyin. Hemen aseptik olarak Petri kaplarına dağıtın.
         NOT: Plakalar en az 4-6 hafta boyunca 4 ^°C'de stabildir. Plakaları 4 ^°C'de saklama için sarmadan önce gece boyunca RT'de olduğundan emin olun. Aksi takdirde, 37 ^{° C'de}inkübasyon sırasında plakalarda nem sıkışacaktır.
   4. Miller Luria Bertani (LB) suyu ve Agar tabanı
      1. Hazırlık için üreticinin talimatlarını izleyin. LB Et Suyu hazırlamak için, 25 g tozu 1.000 mL ddw içinde süspanse edin ve manyetik bir karıştırıcı üzerinde bir cam beherde 5 dakika hafifçe karıştırın. Düzgün süspansiyon üzerine, gerekli hacimleri medya şişelerine (örneğin, 500 mL'lik bir medya şişesinde 300 mL) ve otoklava ayırın. LB Agar'ı hazırlamak için, 1.000 mL ddw ve otoklavda 40 g tozu askıya alın (500 mL'lik bir cam ortam şişesinde 300 mL ddw'de 12 g toz).
2. Büyüme koşulları
   NOT: Bakteri kültürü çalışmasının tüm adımları bir biyogüvenlik kabininde (A2 tipi) gerçekleştirilmelidir. Tüm kültürler steril tüpler, şişeler ve pipet uçları ile işlenmelidir.
   1. 1. Gün
      1. Msm gliserol stoğunun her birine 1 mL ekleyin (-80 o C dondurucudan) 2 x 10 mL'ye (50 mL steril konik santrifüjlü tüplerde) taze otoklavlanmış, soğutulmuş ve önceden ısıtılmış (~ 37 ^oC) 7H9 et suyu, üç kez döndürün, kapakları kapatın ve tüpleri gece boyunca 37 ^°C ve 200-220 rpm'de (inkübatör çalkalayıcı) inkübe edin.
         NOT: Mycobacterium tuberculosis'i (Mtb) büyütmek için benzer adımları izleyin, ancak 50 mL'lik tüpleri BSL3 ayarlarında 37 ^oC ve 120-150 rpm'de (inkübatör çalkalayıcı) 4-6 gün inkübe edin. Mtb ve kültürlerini kullanırken ve atarken BSL3 ve Risk Grubu 3 patojenlerinin TÜM uluslararası yönergelerini ve biyogüvenlik uygulamalarını takip edin. Mtb ve kültürlerini işlemek için B2 tipi biyogüvenlik kabini kullanın.
   2. 2. Gün
      1. OD₆₀₀ (A_600nm; hücre dansitometresi) ~ 1.0'a ulaştığında, Msm kültürlerini 3.200 × g ve RT'de (tezgah üstü santrifüj) 10 dakika santrifüjleyin. Steril 1 mL pipet uçları kullanarak süpernatantları atın.
         NOT: Yukarıdaki adım, gün sayısının 4-7 olması dışında Mtb kültürleri için aynı kalır. Pipet ucuyla bakteri peletine dokunmadığınızdan emin olun.
      2. Yıkama: Her bir Msm peletine 1 mL önceden ısıtılmış Soton's (RT'de) ortamı ekleyin (adım 1.1.2) ve düzgün bir süspansiyon elde etmek için 1 mL pipet uçlarıyla hafifçe yeniden süspanse edin. Steril pipet uçları kullanarak, aynı ortamla hacimleri 10 mL'ye (her birinde) kadar tamamlayın. Süspansiyonları 3.200 × g'de 10 dakika santrifüjleyin ve RT yapın ve süpernatantları atın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
         NOT: Yukarıdaki adım Mtb kültürleri için aynı kalır.
      3. İki kez yıkanmış Msm hücrelerini, önceden ısıtılmış Sauton'ların (bir plaka veya çalkalayıcı inkübatörde önceden ısıtılmış) 20 mL'sinde (her biri) yeniden süspanse edin ve hücrelerin optik yoğunluğunu 600 nm'de ölçün. Gerekli hacimde Msm kültürlerini, son OD₆₀₀ ~ 0.05 olacak şekilde ~ 330 mL steril Sauton içeren steril 1 L Erlenmeyer şişelerine aşılayın.
         NOT: Yeniden askıya almalar her zaman küçük bir hacimde başlamalıdır. Nihai hacim doğrudan pelete tek bir adım olarak eklenirse, hücreler dağınık topaklar olarak kalacaktır (zayıf yeniden süspansiyonun bir göstergesi). Sorunu çözmenin tek yolu, kültürleri döndürmek ve yeniden askıya almayı önerildiği gibi yeniden yapmaktır. Yukarıdaki adım Mtb kültürleri için aynı kalır.
   3. Gün 2/3
      1. 330 mL kültürü, inkübatör çalkalayıcıda 200 rpm ve 37 ^oC'de, OD₆₀₀ kültürü ~0.3'e ulaşana kadar inkübe edin. Ardından, hücreleri bir kez yıkayın (adım 1.2.2.2'ye benzer ancak eşit hacimde) ve ardından peleti aynı hacimde yeniden süspanse edin. Her biri 50 mL yeniden süspanse edilmiş kültürü, her biri 280 mL steril önceden ısıtılmış Soton'lar içeren altı steril 1 L steril Erlenmeyer şişesine dağıtın^ve normalde kullanılan 1/10'u (%0.05) Tween-80, yani %0.005 (ayrıca neden 1/10 olduğunu anlamak için 2.2.1.3. adımının^notuna bakın). Son OD₆₀₀ yaklaşık 0,05 olmalıdır.
         NOT: Mtb kültürleri için Erlenmeyer şişeleri yerine silindir şişeler (1/2/4 L kapasiteli) kullanın. Şişe başına kültür hacmini, merdane aparatı üzerinde tutulduğunda kültür şişenin ağzına ulaşmayacak şekilde ayarlayın. Silindir şişedeki gerçek hacim, silindir şişenin kapasitesine bağlı olacaktır.
      2. İnkübatör çalkalayıcıdaki 330 mL kültürlerin her birini 200 rpm'de ve 37 ^oC'de OD₆₀₀ 2.0 ila 2.5'e (~ 15-18 saat) ulaşana kadar inkübe edin.
         NOT: Mtb kültürleri için, son OD_600'ün ~ 1.0-1.2 (~ 5-8 gün sürer) olduğundan emin olun.

2. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanılarak Msm mEV'lerin zenginleştirilmesi

1. 4. Gün
   1. ~2 L orta üstel aşama Msm kültürlerini 6 x 400 mL steril santrifüj şişelerinde 4 ^oC'de 20 dakika ~8.000 × g'da santrifüjleyin (zemin modeli santrifüj). Harcanan ortam/kültür süpernatanı önceden soğutulmuş, otoklavlanmış 1 L Erlenmeyer şişelerinde toplayın ve herhangi bir analitik prosedür için peletin bir alikotunu saklayın (SDS-PAGE ve western blotting gibi-burada ayrıntılı olarak açıklanmamıştır).
      NOT: mEV'lerin bütünlüğünü daha iyi korumak için sonraki tüm adımlar soğukta (~ 4 °C) gerçekleştirilmelidir. mEV'ler RT'de oldukça kararlıdır, ancak uzun vadeli stabilite için soğutma bir zorunluluktur (tekrarlanan dondurma ve çözdürme önerilmez). Aksenik kültür büyümesi sırasında, mEV'ler Msm/Mtb'nin yüzeyinden ayrılır ve kültür süpernatanı/harcanan ortamda birikir.
   2. Tüm bakteri izlerini gidermek için Msm kültür süpernatantını önce 0.45 μm bertaraf filtre ünitesinden/ünitelerinden ve ardından 0.22 μm bertaraf filtre ünitesinden/ünitelerinden süzün.
      NOT: 0.22 μm filtrelerden doğrudan filtreleme genellikle filtre ünitelerini boğar (çünkü 2.1.1. adımını gerçekleştirirken bakteri peleti bozulabilir). Mtb kültür süpernatantları oluşturmak için, kültür filtratlarını BSL-0.45 ayarlarına taşımadan önce Mtb kültürlerinin üç filtrasyonunu gerçekleştirin (yani, 0.45 μm tek kullanımlık filtre ünitesi ile ilk filtrasyon adımı; 0.22 μm tek kullanımlık filtre üniteleri ile iki ardışık filtrasyon adımı).
2. Gün 4/5
   1. Kültür süzüntüsünü 4 ^oC, 20 dakika ve 3.200 × g'da santrifüjleyerek Msm kültür süzüntüsünü (~ 2 L) ~ 38 mL'ye kadar konsantre etmek için 30 kDa membran yoğunlaştırıcıları kullanın.
      1. Konsantratörleri önce steril, soğuk ddw (~15 mL) ile önceden yıkayın (4 ^{o C'de}, 5 dakikada ve 3.200 × g'da yıkayın).
      2. Tüm kimyasal kalıntılarını (üretim sırasında kullanılır) gidermek için ~15 mL önceden filtrelenmiş, soğuk Soton'larla (su ile aynı koşullar (2.2.1.1.)) yıkayın.
      3. ~2 L kültür süzüntüsünü konsantre etmek için teknik olarak ~130 sentrikon (yalnızca bir kullanımsa) gerektiğinden, gerekirse sentrikonları en az 3-4 kez yeniden kullanın. Şu adımları izleyin: 15 mL ila 0.5 ila 1.0 mL konsantre edin (adım 2.2.1'i izleyin), konsantreyi temiz, otoklavlanmış ve soğuk 38 mL ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve ardından kalan konsantre edilmemiş kültür süzüntüsünü tekrar konsantrasyon için kullanılan merkezlere yeniden aktarın.
         NOT: 2 L kültür süzüntüsünü konsantre etmek için 24, 30 kDa yoğunlaştırıcıların kullanılması 6 saate kadar sürecektir. Kültür filtratının konsantre edilmesinin ardından, Tween-80 de konsantre olur ve yoğunlaştırıcıyı bloke edebilir. Sauton'un ortamında Tween-80 ila %0,005 nihai (%0,05 yerine) kullanılması bu tıkanıklığın önlenmesine yardımcı olur. Tween-80'in azaltılmış konsantrasyonu, büyüme sırasında Msm'nin homojen süspansiyonunu etkilemez ve Msm hücrelerinin kümelenmesine neden olmaz. Bununla birlikte, Mtb hücreleri %0.005 Tween-80'de kümelendiğinden, Mtb'ye özgü EV'ler için %0.05 Tween-80 kullanın.
   2. Konsantre Msm kültür süzüntüsünü (~ 38 mL) temiz, yıkanmış (ddw ile) ve önceden soğutulmuş 40-50 mL polipropilen santrifüj tüpüne aktarın ve önce 4.000 × g ve daha sonra 15.000 × g'da, her iki adımda da 4 ^°C'de 20 dakika (tüm kalıntıları temizlemek için) olmak üzere iki aşamalı bir santrifüjlemeye tabi tutun. Bunun için zemin tipi bir santrifüj kullanın.
3. Gün 5/6
   1. Kültür süpernatanını önceden soğutulmuş 38.5 mL'lik bir polipropilen ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve 4 ^{° C'de 4 saat}boyunca 100.000 × g'de bir ultrasantrifüjde döndürün.
      NOT: Döner kova bu hızda en iyi şekilde çalışır. Ultrasantrifüj tüpünü ağzına kadar doldurduğunuzdan ve eşdeğer ağırlıkta bir denge ultrasantrifüj tüpüne sahip olduğunuzdan emin olun. Santrifüjlemeden sonra (yoğuşma nedeniyle meydana gelir) her iki tüp de döner kovaya yapışırsa, forseps kullanarak rotordan yavaşça çıkarın. Ultrasantrifüjlemeden önce ultrasantrifüjün dış yüzeyinde bulunan yoğuşmuş nemin silinmesi yapışmayı önler.
   2. Süpernatanı 50 mL'lik önceden soğutulmuş bir tüpte saklayın (nota bakın). Süpernatan izlerini gidermek için ultrasantrifüj tüpünü yeni, tüy bırakmayan emici bir kağıt üzerinde ters çevirin. Peletin 600 μL HEPES tampon çözeltisi (50 mM HEPES ve 150 mM NaCl, pH 7.4; kullanımdan önce filtreyle sterilize edilmesi) içinde yeniden süspanse edilmesi.
      NOT: Süpernatanı yalnızca yedek olarak kaydedin. Doğal mEV peleti, jöle benzeri, 5-7 mm çapında, donuk grimsi sarı ila yarı saydam bir nokta olarak görünür. Pelet görünmüyorsa, kaydedilen süpernatanı yeniden kullanarak adım 2.3.1'i tekrarlayın. Adım 2.3.1'i tekrarladıktan sonra pelet görünmüyorsa, atın ve adım 1.2'den yeniden başlatın. Peletin yeniden askıya alınması zaman alır. Kolay yeniden süspansiyon için HEPES tamponunun eklenmesi ve gece boyunca 4 ^{° C'de}bırakılması önerilir. Tek tip yeniden süspansiyona kadar nazikçe ancak tekrarlanan pipetleme ile (daha iyi süspansiyon için P200 uçlarını kullanın) yeniden askıya alın.
4. 6. Gün
   1. Yeniden süspanse edilmiş peleti 'iyodiksanol' bazlı yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeye tabi tutun.
      1. Yeniden süspanse edilmiş peleti 13 mL temiz, yıkanmış (ddw ile) ve önceden soğutulmuş ultra berrak polipropilen ultrasantrifüj tüpünün dibine yerleştirin ve ~4 mL inert yoğunluk gradyanlı 'iyodiksanol' çözeltisi (ticari olarak ~%60 w/v solüsyonu olarak temin edilebilir) ile hafifçe karıştırın (1 mL pipet kullanın). Yeniden süspanse edilmiş peleti tüpün dibine (maksimum 5 mL'ye kadar) katmanladıktan sonra, ilgili sırayla %40, %30, %20 ve %10 'iyodiksanol' alt stoklarının her biri 1 mL (a/h) ile kaplayın (%60 stoktan alt stokları (HEPES tamponu ile) hazırlayın). Ardından, tüpü doldurmak için en üste 4 mL %6 alt stok (HEPES tamponu ile %60 stoktan hazırlanır) ekleyin.
         NOT: Degradeyi kullanmadan hemen önce hazırlayın; Asla saklamayın ve kullanmayın.
      2. Dikkatlice (sallamadan), tüpü bir cam beherde tartın ve yavaşça sallanan kova rotoruna aktarın.
         NOT: Sahte bir tüp (ayrıca tartılır) ile dengelemek için tartım gereklidir.
      3. 4 ^{° C'de}16 saat boyunca 141.000 × g'da ultrasantrifüjlemeye tabi tutun.
5. 7. Gün
   1. Tüpü dikkatlice çıkarın (adım 2.3.1'in notuna bakın) ve 1 mL fraksiyonları yeni otoklavlanmış mikrosantrifüj tüplerinde toplayın; tipik olarak Msm mEV'leri içeren 4^{. ila 6. fraksiyonlara} dikkat edin.
      NOT: Bu fraksiyonlardan gelen mEV'ler normalde donuk beyaz renkli üç veya dört mEV bandına (biri ana banttır) ayrılır. mCherry içeren R-mEV'ler 5 inci ila 7^inci fraksiyonlarda parçalanır ve koyu mor ila macenta görünür. Mtb EV'ler tipik olarak 5^{. ila 7. fraksiyonlarda} parçalara ayrılır. Gradyandaki mEV'lerin ayrılması, kullanılan gradyan konsantrasyonuna ve gradyanın ne kadar iyi katmanlandığına bağlıdır. mEV'ler kısmen yırtılırsa, daha önceki fraksiyonlarda parçalanabilirler. Alternatif olarak, adım 2.3.2'den sonra elde edilen pelet iyi bir şekilde yeniden süspanse edilmezse, veziküller, daha sonraki fraksiyonlar olarak fraksiyonlanan yoğun mikropeletler oluşturur. Fraksiyonların hassas bir şekilde toplanmasını yalnızca kullanıcı 1 mL fraksiyonlardan hangisinin mEV'leri içerdiğini değerlendirmek istediğinde öneririz. Kullanıcılar, kolaylıklarına bağlı olarak daha küçük veya daha büyük fraksiyonlara ayrılmak isteyebilirler. Bunları belirli uygulamalar için kullandığımızda, örneğin BCG'ye potansiyel bir alt birim aşı güçlendiricisi olarak test ettiğimizde, mEV'lerin toplanmasını, fraksiyonların 250 μL'den daha azıyla (mEV'lerin fraksiyonlandığı yerlerde) sınırlandırırız, böylece yalnızca mEV bantlarını özel olarak toplayabilir ve 2.7.5'te belirtildiği gibi işleyebiliriz. Bu, aşağı akış deneylerimize müdahale edebilecek tüm iyodiksanol izlerini daha etkili bir şekilde ortadan kaldırmaya yardımcı olur.
6. 8. Gün
   1. mEV içeren fraksiyonları bir araya getirin, HEPES tamponu ile 38 mL'ye seyreltin ve ultrasantrifüjlemeyi 4 ^{° C'de}16 saat boyunca 100.000 × g'da tekrarlayın. Peletleri (adım 2.3.2'de olduğu gibi) ya HEPES tamponunda ya da protein tahmini, nano-izleme analizleri, negatif boyama, transmisyon elektron mikroskobu, western blotlama ve bağışıklık-altın etiketleme gibi aşağı akış deneylerinin (burada ayrıntılı olarak açıklanmamıştır) gerektirdiği herhangi bir tamponda yeniden süspanse edin.
      NOT: Daha iyi yeniden süspansiyon için, ultrasonik bir su banyosu sonikatörü kullanarak mEV içeren tüpü 10 dakika boyunca sonikleştirin. Daha uzun süre sonikasyon, bozulmamış mEV'lerin yırtılmasını ve kaybını başlatabilir. İyi askıya alınırsa, sonikasyon gereksizdir. 2.1'den 2.6'ya kadar olan tüm adımlar, Mtb tarafından üretilen EV'leri zenginleştirirken aynıdır.

3. Rekombinant mEV'lerin yapımı ve zenginleştirilmesi.

NOT: Msm EV'lerin en bol bulunan 10 proteininden biri (kütle spektrometresi ile tanımlanır) Cfp-29^30'dur. Küçük boyutu (29 kDa), basit ikincil yapısı 40, membrana^{lokalizasyonu 41} ve aksenik kültürlerde harcanan ortama salgılanma eğilimi göz önüne alındığında (örneğin, bir kültür süzüntü proteini olarak; hem Msm hem de Mtb^42,43 tarafından salgılanır, burada^, mEV'lere kırmızı bir floresan raportör ve ilgilenilen bir protein (EsxA_Mtb) vermek için kullanılmıştır. Bunu başarmak için,

1. Msm'den cfp-29'u amplifiye etmek için uygun ileri ve geri primerler (Tablo 1; pMV261 gibi bir mekik vektörüne doğrudan klonlanmak üzere uyumlu) kullanın. Şablon olarak ~50 ng yüksek moleküler ağırlıklı (~>20 kb) Msm genomik DNA kullanarak, PCR, cfp-29 gen fragmanını yüksek kaliteli bir prova okuma DNA polimeraz (Phusion veya Q5 gibi) ile çoğaltır. PCR için üreticinin tavsiyelerine uyun.
   NOT: İlgilenilen herhangi bir alternatif mekik vektörüne kolay klonlama için gerekli kısıtlama bölgelerini primerler halinde tasarlayın. PCR koşulları ve hacmi, kullanılan prova okuma DNA polimerazın türüne ve markasına göre değişecektir. Reaksiyon karışımının hacmi, DNA şablonunun miktarına ve düzeltme okuması DNA polimeraz miktarına bağlı olarak değişecektir. PCR koşulları, amplifikasyonun başarısı ve primerlerin spesifik olmayan tavlanmasının ortadan kaldırılması için üreticinin tavsiyelerine uyun.
2. PCR, ayrıştırılmış amplikonu piyasada bulunan herhangi bir PCR saflaştırma kiti ile saflaştırır ve standart agaroz jel elektroforezi ile amplikon uzunluğunu doğrular. Saflaştırılmış amplikonu sindirin.
   1. Bir spektrofotometrede saflaştırılmış amplikon miktarını tahmin edin. Sindirim için en az 2 μg cfp-29 amplikon kullanın.
   2. Önce BstB1 ile 65 ° C'de 1 saat sindirin (tampon ve enzim türü ve miktarı - üreticinin tavsiyelerine göre), reaksiyon sıcaklığını RT'ye düşürün ve ardından 37 ^°C'de 1 saat boyunca HindIII ile sindirin (tampon ve enzim türü ve miktarı - üreticinin tavsiyelerine göre).
   3. PCR, sindirilmiş amplikonu 50 μL otoklavlanmış nükleaz içermeyen ddw'de saflaştırır ve elüte eder.
   4. Bir spektrofotometre kullanarak sindirilmiş amplikonun konsantrasyonunu ve verimini tahmin edin. Ligasyon kurulumuna kadar -20 ^°C'de saklayın. NOT: PCR sonrası, amplikon uzunluğunu (~798 + 50 bp) doğrulayın ve %10'lik bir agaroz jel üzerinde 1 μL PCR reaksiyon karışımını elektroforezle elde edin. Bu enzim kombinasyonu ile çift sindirim mümkün olmasa da, uyumlu bir tampon, tekrarlanan PCR saflaştırmasını ve ardından sindirilmiş amplikon kaybını önleyecektir. Sindirilmiş amplikon konsantrasyonu, PCR saflaştırması için kullanılan kite göre değişir. Ayrıca, tercih edilen herhangi bir alternatif vektörün uzunluğuna (bp cinsinden) göre değişir.
3. İleri ve geri primerleri (Tablo 1), bir düzeltme okuması DNA polimerazı ve ~ 50 ng Mtb genomik DNA'yı kullanın, PCR, esxA- veya esxA-3X FLAG etiketine özgü amplikonu çoğaltır. PCR amplifiye mCherry'yi çoğaltmak için ~5 ng uygun plazmit DNA kullanın. Plazmid ve dizi detayları Ek Dosya 1'dedir.
   NOT: cfp-44,45 ve mCherry/esxA/esxA-4X FLAG arasında bir Glisin, Glisin, Glisin, Glisin^, Serin³(G3S) bağlayıcı kullanın;mCherry'nin başlamasından önce, G4S bağlayıcı, mCherry'nin sahte işlevsel olmayan kıvrımlara (Cfp-29 tarafından yönlendirilenler dahil) maruz kalmamasına yardımcı olur. Ek Dosya 1'deki cfp-29, hsp60 promozor, mCherry ve esxA dizilerine bakın. mCherry için şablon görevi gören plazmitler, farklı plazmit depolarında/bankalarında mevcuttur. Değiştirilmiş ileri ve geri primer dizileri gerektirecek farklı mCherry versiyonları (biraz değiştirilmiş diziler) mevcuttur. Primerler (Tablo 1), Ek Dosya 1'de belirtilen mCherry'nin yükseltilmesine yardımcı olur. mCherry/esxA/esxA::3XFLAG'ın N-terminalinin Cfp-29'un C-terminal ucuna füzyonu iyi çalışır.
4. mCherry/esxA/esxA::3XFLAG amplikonlarının 1 μg DNA'sını sindirin ve sindirilmiş DNA'yı saflaştırın.
   1. Her amplikonu HindIII ve HpaI ile 37 ^°C'de 1 saat boyunca (veya üreticinin tavsiyelerine göre) iki kez sindirin.
   2. Sindirilmiş amplikonu saflaştırmak için piyasada bulunan bir PCR saflaştırma kitini ve üreticinin önerilerini kullanın. Sindirilmiş amplikonu 50 μL otoklavlanmış nükleaz içermeyen ddw'de elute edin.
   3. Bir spektrofotometre kullanarak sindirilmiş amplikonun konsantrasyonunu ve verimini tahmin edin. Ligasyon kurulumuna kadar -20 ^°C'de saklayın.
5. 2 μg pMV261-Kan^R (Ek Dosya 1) veya tercih edilen enzim(ler) ile uygun bir klonlama vektörünü sindirin.
   1. Önce BstB1 ile 65 ° C'de 1 saat sindirin (tampon ve enzim türü ve miktarı - üreticinin tavsiyelerine göre), reaksiyon sıcaklığını RT'ye düşürün ve ardından 37 ^°C'de 1 saat boyunca HindIII ile sindirin (tampon ve enzim türü ve miktarı - üreticinin tavsiyelerine göre).
   2. Jel, 50 μL otoklavlanmış nükleaz içermeyen ddw'de saflaştırır ve elüte eder.
   3. Bir spektrofotometre kullanarak sindirilmiş vektörün konsantrasyonunu ve verimini tahmin edin. Ligasyon kurulumuna kadar -20 ^°C'de saklayın.
      NOT: pMV261 için yukarıdaki primerlerle tek adımlı iki parçalı klonlama mümkündür. Bir epizom olarak hayatta kalan herhangi bir alternatif mekik vektörü işe yarayacaktır. Bütünleştirici plazmitler de işe yarayacaktır, ancak rekombinant protein verimi hücre bazında nispeten daha az olacaktır.
6. Bağlayın ve uyumlu bir E. coli suşuna dönüştürün.
   1. Ligasyon için 125 ng vektör kullanın. 1:3 molar oranında uygun şekilde sindirilmiş mCherry/esxA/esxA::3XFLAG amplikonları kullanın. Soğutulmuş sirkülasyonlu su banyosunda 4 °C'de T16 DNA Ligaz (üreticinin tavsiyelerine göre miktar) kullanarak gece boyunca ligasyon gerçekleştirin.
      NOT: Sindirimin etkinliğini değerlendirmek ve klonlama başarısının verimliliğini tahmin etmek için yalnızca T4 DNA Ligaslı ve T4 DNA Ligas'sız vektör gibi uygun kontrolleri kullanın.
   2. Dönüşüm
      1. NEB5α kimyasal olarak yetkin hücre alikotlarını (dönüşüm başına ~ 100 μL) 15 dakika boyunca buz üzerinde çözdürün. Steril bir pipet ucuyla iki kez hafifçe karıştırın. Soğuk yetkin hücrelere ligasyon karışımı (20 μL'ye kadar) ekleyin.
      2. Pipet hücrelerini + bağlanmış DNA'yı yavaşça karıştırın. Karışımı buz üzerinde 30 dakika daha inkübe edin.
      3. 60 saniye boyunca 42 °C'de (sirkülasyonlu su banyosunda) ısı şoku sağlayın ve hemen 15 dakika daha buza geri aktarın.
      4. 1 mL SOC suyu (%2 Tripton, %0.5 Maya özütü, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM_MgSO4 ve 20 mM glikoz) ekleyerek dönüştürülmüş hücreleri geri kazanın ve 200 rpm'de 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      5. Geri kazanılan bakterileri 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde (3000 × g, RT ve 10 dakika) döndürün, süpernatanı atın, peleti 200 μL steril, önceden ısıtılmış, taze hazırlanmış LB ortamında yeniden süspanse edin ve süspansiyonu uygun konsantrasyonlarda gerekli antibiyotikleri içeren taze dökülmüş LB Miller agar plakalarına yayın.
      6. Petri kaplarını 37 ^oC'ye önceden ayarlanmış bir tabak inkübatörde inkübe edin.
7. Potansiyel klonlar için ekran (burada ayrıntılı olarak açıklanmamıştır), füzyonu doğrulamak için (koloni PCR-/restriksiyon enzimlerine dayalı)⁴⁶ ve bunları sıralayın (Sanger dizilimi).
8. Onaylanmış klonun (E. coli arka planı) plazmit DNA'sını (~ 200 ng / 1-2 μL; ticari olarak temin edilebilen herhangi bir kit) ekstrakte edin ve onu yeni yapılmış elektro-yetkin Msm hücrelerine dönüştürün.
9. Msm elektrokompetan hücrelerinin hazırlanması
   1. Taze Msm yetiştirin (1.2.1 ve 1.2.2 adımlarında olduğu gibi). Taze yetiştirilen Msm'yi 1.3.3 ve 1.3.4 adımlarındaki gibi yıkayın (Sauton'unki yerine 7H9 + ADC + Tween-80 (zengin) kullanın).
   2. 150 mL zengin ortam içeren steril bir 500 mL Erlenmeyer şişesinde ~ 0.05'lik son OD_600'e yıkanmış Msm hücrelerinin bir alikotunu ekleyin.
   3. Kültür OD 600 ~0.8 ila 1.0'a (~12-14 saat) ulaşana kadar inkübatör çalkalayıcıda₂₀₀ rpm ve 37 ^oC'de inkübe edin.
   4. Kültürü önceden soğutulmuş 400 mL'lik bir santrifüj şişesine aktarın ve 60-90 dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, hücreleri 4 ^{° C'de}4,000 × g'da 15 dakika boyunca peletleyin.
   5. Hücreleri iki kez yıkayın (her yıkamada 150 mL, 4.000 × g, 4 ^oC ve 15 dakikada) buz gibi, steril (otoklavlanmış)% 10 gliserol ile.
      NOT: Her yıkamada pelet gevşer. Tüm süpernatanı atarken dikkatli olun (her yıkamadan sonra). Aksi takdirde, hücrelerin çoğu atılan süpernatantta kaybolacaktır.
   6. Hücreleri bir kez daha %0.005 Tween-80 içeren 75 mL buz gibi, steril %10 gliserol ile yıkayın.
   7. Hücre peletini 7.5 mL %10 gliserol içinde %0.005 Tween-80 ile yeniden süspanse edin ve alikot 400 μL alikotlara dönüştürün.
      NOT: Msm elektrokompetan hücreler en az 4 ay yeten olsa da taze hazırlanmış elektrokompetan hücreler en iyi sonucu verir. Eski yetkin hücreleri kullanırken, pembe olmayan birkaç koloni (beyazlar) sahte dönüştürücüler olarak görünür. Yetkili hücreler ne kadar yaşlıysa, beyaz koloniler o kadar fazladır.
10. MSM'nin Dönüşümü
    1. Msm yetkin hücrelerini buz üzerinde çözdürün.
       NOT: RT'de çözülme ve bu tür hücrelerin dönüştürülmesi daha az verim sağlar.
    2. Soğuk yetkin hücrelere 1-2 μL plazmit DNA (toplam ~200 ng) ekleyin, 1 mL steril pipet ucuyla hafifçe karıştırın ve önceden soğutulmuş steril 2 mm'lik bir elektroporasyon küvetine aktarın.
    3. Msm yetkin hücreler + plazmid DNA karışımı ile kapalı küveti elektroporatörün faresine aktarın, kapağı yavaşça kapatın ve 2.5 kV (voltaj), 25 μF (kapasitans) ve 1000 Ω'de (direnç) bir darbe (üstel bozunma tipi) uygulayın.
    4. Küvete hemen 1 mL önceden ısıtılmış steril zengin (7H9 + ADC + Tween-80) ortam ekleyin, 1 mL steril pipet ucuyla hafifçe karıştırın ve tüm içeriği 10 mL steril bir tüpe aktarın.
    5. İçeriği 37 ^oC ve 200 rpm'ye ayarlanmış bir inkübatör çalkalayıcıda 3 saat inkübe edin. İçeriği bir mikrosantrifüj tüpünde (4.000 × g, RT ve 10 dakika) döndürün, süpernatanı atın, peleti 200 μL steril önceden ısıtılmış zengin ortamda yeniden süspanse edin ve süspansiyonu ADC, Tween-80 ve gerekli antibiyotikleri içeren taze dökülmüş 7H11 agar plakalarına yayın.
       NOT: Msm için gerektiğinde, sırasıyla 50 μg/mL, 25 μg/mL ve 50 μg/mL nihai konsantrasyonlarda Higromisin, Kanamisin ve Apramisin kullanın. Msm kendi başına bu antibiyotiklere dirençli DEĞİLDİR. Bu antibiyotikleri yalnızca transformantların/rekombinant Msm kolonilerinin seçimi/büyümesi için uygun dirençli genlere sahip plazmitler kullanırken kullanın.
    6. Petri kaplarını 37 ^°C'ye önceden ayarlanmış bir plaka inkübatörde inkübe edin Tipik olarak, dönüştürücüler 3-5 gün arasında ortaya çıkar.
       NOT: İlgilenilen bir protein Msm için toksik ise, dönüştürücüler daha sonra ortaya çıkabilir veya ortaya çıkmayabilir. Bu gibi durumlarda, tam uzunluğun kısaltılmış versiyonlarını klonlayın.
    7. Pozitif klonları doğruladıktan sonra ortaya çıkan Msm kolonilerinin gliserol stoklarını yapın (adım 3.7 ile aynı)
11. mCherry veya EsxA proteinleri içeren R-mEV'leri zenginleştirmek için, önce 1.2.1 ila 1.2.3 arasındaki adımları izleyerek mCherry veya exsA veya esxA::3X FLAG eksprese eden R-Msm'yi büyütün ve ardından 2.1 ila 2.6 arasındaki adımları izleyin. R-mEV'leri zenginleştirmek için. R-mEV'ler, yoğunluk gradyan dönüşü sonrası 4^{th-7 inci} fraksiyonlara dönüşür (adım 2.5). İlk ultrasantrifüj adımından sonra R-mEVs peleti (2.3.1). Adım 2.3.1 ile aynı işlemi gerçekleştirdikten sonra, R-mEV'lerin ultrasantrifüjün alt merkezinde koyu mor ila macenta 5-7 mm çapında bir pelet olarak göründüğünü onaylayın.
12. Zenginleştirilmiş R-mEV'ler içindeki ilgilenilen protein(ler)i tespit etmek için batı analizleri⁴⁷ (burada ayrıntılı olarak açıklanmamıştır) gerçekleştirin.

Hem doğal hem de rekombinant mEV'lerin (R-mEV'ler) zenginleşmesini göstermek için model mikobakteri olarak M. smegmatis (Msm) kullanıyoruz. Bu şematik olarak özetlenen mEV zenginleştirme protokolü (Şekil 1), Msm'nin R-mEV'lerinin ve Mtb'nin yerel EV'lerinin zenginleştirilmesi için de çalışır (1.2'nin protokol notlarında olduğu gibi küçük değişikliklerle). Zenginleştirilmiş mEV'lerin görselleştirilmesi, bunların bir transmisyon elektron mikroskobu³⁶ altında negatif olarak boyanmasını gerektirir (Şekil 2A). Tipik olarak, Msm'ye özgü EV'ler, 13 mL% 6-60 yoğunluk gradyanının 4 th-6^th 1^mL fraksiyonlarında ayrılır (Şekil 2B). EV'lerin yaklaşık 80-100 μg protein eşdeğeri rutin olarak 2 L orta logaritmik aksenik Msm kültürlerinden elde edilir. Çapları tipik olarak 20 nm ile 250 nm arasında değişir (Şekil 2C).

Laboratuvarımızın uzun vadeli hedeflerinden biri, farklı mikobakterilerin mEV'lerinin potansiyel olarak mevcut aşı BCG'ye bir alt birim güçlendirici olarak hareket edip edemeyeceğini değerlendirmektir. Patojenik bakteriler tarafından üretilen mEV'lerin zenginleştirilmesi zaman alıcı, riskli ve pahalı olduğundan, avirulan mikobakterilerden doğal ve rekombinant EV'lerden yararlanmak uygun bir alternatif olarak çalışabilir. Bu nedenle, protokolü yalnızca Msm'nin mEV'lerini zenginleştirmek için değil, aynı zamanda R-mEV'lerini inşa etmek ve zenginleştirmek için standartlaştırmayı amaçlıyoruz.

R-mEV'leri oluşturmak için, önce Msm EV'lerin en bol bulunan 10 proteinini seçtik (Tablo 1; bunları Msm EV'lerin ayrıntılı kütle spektrometrisi analizlerinden belirledik)³⁰. İlgilenilen yabancı bir proteinin bunlardan herhangi birine translasyonel olarak kaynaşması durumunda, mEV'lere lokalize olabilmesi gerektiğini varsaydık. Daha sonra, Cfp-29'u 10 arasında kısa listeye aldık çünkü aralarında en küçüğü (~29 kDa), membran lokalize ve nispeten basit bir ikincil yapıya sahip bir kültür süzüntü proteini^40,41,42,43. mCherry'nin (floresan protein) N-terminal ucunu Cfp-29'un C-terminal ucuna translasyonel olarak kaynaştırdık ve mEV'lere yüklenmesini/teslimatını değerlendirdik. Msm'nin zenginleştirilmiş mEV'lerinin bir kısmı pembeye döndü (Şekil 3), bu da Cfp-29'un ilgilenilen yabancı bir proteini Msm EV'lere taşıma yeteneğini gösteriyor.

Cfp-29'un bu yeteneği göz önüne alındığında (Şekil 3), daha sonra Msm EV'lere önemli bir immünojenik protein ^37,38,39 iletimi olan EsxA'yı (Esat-6) değerlendirdik. Yine, yalnızca Cfp-29 EsxA ve EsxA + 3X FLAG etiketinin C-terminaline (EsxA'nın C-terminaline kaynaşmış 3X FLAG) iki bağımsız çeviri füzyonu oluşturduk. Beklendiği gibi, Mtb'nin EsxA'sını Msm EV'lerde (şerit 5, 6 ve 10, Şekil 4A,B) düşük miktarlarda da olsa gözlemledik. İlginç bir şekilde, Cfp-29::EsxA::3XFLAG çok daha kararlıydı (şerit 3 ve 4 artı 8 ve 9; Şekil 4A) ve mEV'lerde daha yüksek seviyelerde birikir (şerit 3 ve 4 artı 8 ve 9; Şekil 4B). Özetle, ilgilenilen yabancı bir protein içeren R-mEV'lerin tasarımını, yapımını ve zenginleştirilmesini gösteriyoruz (Şekil 3 ve Şekil 4).

Şekil 1: Mikobakteriyel hücre dışı vezikül zenginleşmesinin şematik gösterimi. 'Günler' (kırmızı yazı tipinde, şeklin üstünde), mEV'leri Msm'den zenginleştirmek için gereken günleri ifade eder (özellikle protokol adımları 1 ve 2 için). "Adımlar" (siyah yazı tipinde, şeklin altında), protokol bölümünde açıklanan protokol adımlarını ifade eder. Mtb'den mEV'leri zenginleştirmek için, tüm adımlar benzer olsa da, farklı kültür adımlarının (adım 1) santrifüjlemenin ilk adımına (adım 2) kadar en az 10 gün sürer. Sonraki adımlar aynı süreyi gerektirir (kırmızı yazı tipiyle gösterildiği gibi). Yoğunluk gradyanından önce, mEV'ler peleti + hücre dışı kompleksler, hem doğal mEV'leri hem de R-mEV'leri zenginleştirirken renksiz görünür. Bununla birlikte, mCherry içeren mEV'leri zenginleştirirken pembemsi ila mavi görünecektir (bkz. Şekil 3). Yoğunluk gradyanını yayınlayın, mEV'ler yoğunluk gradyan tüpünde beyaz (doğal ve R-mEV'ler) veya pembe (mCherry içeriyorsa) görünecektir. Şekildeki mEV'lerin renkleri sadece netliği belirtmek içindir ve tam renkleri temsil etmez. Daha fazla netlik için Şekil 3'e bakın. Kısaltmalar: Msm = M. smegmatis; Mtb = M. tüberküloz; 0,45 ve 0,22 μm = atık filtre ünitelerinin gözenek boyutu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mikobakteriyel EV'ler daireseldir, yoğunluk gradyanları ile konsantre olurlar ve boyutları değişir . (A) Msm EV'lerin negatif boyama ile görselleştirilmesi ve transmisyon elektron mikroskobu altında görüntülenmesi üzerine temsili bir görüntüsü. Ölçek çubuğu = 200 nm. (B) %6-60'lık bir yoğunluk gradyanı gerçekleştirildikten sonra mEV'lerin ultrasantrifüj tüpünde nasıl göründüğünün temsili bir görüntüsü. %6-60 gradyan doğru bir şekilde katmanlanmazsa, mEV'lerin majör (üst açık ok) ve minör (alt açık ok) bantlarının konumu önemli ölçüde değişebilir ve böylece 1 mL kesir sayısı değişebilir. (C) Msm'nin zenginleştirilmiş mEV'lerinin nanoizleme analizi üzerine temsili bir görüntü. Nanoizleme analizleri, farklı büyüklükteki mEV'lerin oranlarını ve konsantrasyonlarını ve preparat içindeki toplam mEV sayısını ortaya koymaktadır. Ortalama olarak, burada ayrıntıları verilen protokol ile ~1-3 ×^{10 10} EV, 2 L Msm ve Mtb'den zenginleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: mCherry eksprese eden mEV'lerin zenginleşmesini gösteren farklı adımlar. (A) Cfp-29::mCherry ifade eden Msm axenic kültürünü gösteren temsili resim. (B) Cfp-29::mCherry eksprese eden Msm aksenik kültürünün santrifüj sonrası bakteriyel peletinin temsili görüntüsü. (C) Centricon yoğunlaştırıcılar aracılığıyla Cfp-29::mCherry eksprese eden Msm axenic kültürünün harcanan ortamının konsantre edilmesinden sonra elde edilen kültür süzüntü konsantresinin temsili görüntüsü. (D) Cfp-29::mCherry eksprese eden Msm aksenik kültüründen elde edilen kültür süzüntü konsantresinin ultrasantrifüj sonrası mEV'ler + hücre dışı kompleksler peletinin temsili görüntüsü. Bununla birlikte, mEV'ler, mCherry hariç herhangi bir yabancı protein(ler) için ya doğal ya da rekombinant (Cfp-29'a füzyon üzerine) olacaksa, pelet renksiz kalacaktır. (E) mEV'ler içeren mCherry'nin temsili görüntüleri. Tüm mEV'lerin pembe olmadığını unutmayın, bu da tüm mEV'lerin Cfp-29 içermediğini gösterir. İyi: Cfp-29::mCherry EV'ler için zenginleştirildikten sonra tipik olarak elde edilen farklı mEV bantlarını gösteren temsili bir görüntü. mCherry içeren EV'ler daha yoğun olduğundan, daha sonraki fraksiyonlara ayrılırlar. Zayıf: Zayıf ayrımı gösteren temsili bir görüntü (beyaz mEV'ler birinci/ikinci fraksiyonda ayrılır ve mCherry içeren mEV'ler 10^{. fraksiyonda} ayrılır (muhtemelen mEV peletinin zayıf yeniden süspansiyonu nedeniyle, yani, protokol adımı 2.3.2). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Msm toplam hücre lizatında ve Msm tarafından üretilen EV'lerde Mtb kodlu bir immünojen olan EsxA (ESAT-6) içeren rekombinant mEV'ler. (A) Coomassie jeli ve (B) batı analizi (ESAT6'ya özgü poliklonal antikor ile tespit edildi) cfp-29::esxA::3XFLAG (+ 3XFLAG, şerit 3 ve 4 (toplam lizat) ve şerit 8 ve 9 (mEV'ler)) veya cfp-29:: esxA (- 3XFLAG, şerit 5 ve 6 (toplam lizat) ve şerit 10 (mEVs)). Açık ve dolu oklar sırasıyla birikmiş Cfp-29::ExsA::3XFLAG ve Cfp-29::ExsA'yı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Primer dizileri. cfp-29, mCherry, esxA ve esxA::3X FLAG'i yükseltmek ve mekik vektörü pMV261'e klonlamak için İleri ve Ters primerler listelenmiştir.

Ek Dosya 1: A: pMV261, dairesel haritası, ana özellikleri ve tam nükleotid dizisi. Sarı vurgu-hsp60 promotör nükleotid dizisi; mCherry, esxA ve esxA::3X FLAG amplikonlarının klonlandığı yeşil ve camgöbeği vurgu kısıtlama siteleri. B, C ve D: Sırasıyla cfp-29, mCherry ve esxA'nın nükleotid dizileri. cfp-29, mCherry ve esxA'nın yeşil vurgu durdurma kodonu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

BCG'den daha üstün olan ve BCG'nin yerini alabilecek yeni bir TB aşısı geliştirmek zorlu bir zorluk olmaya devam ettiğinden, alternatif olarak birkaç grup BCG'nin gücünü artırabilecek ve koruyucu süresini uzatabilecek farklı alt birim TB aşılarının keşfini sürdürmektedir^48,49. Potansiyel alt birimler ve doğal adjuvanlar olarak bakteriyel EV'lere (bEV'ler) artan ilgi göz önüne alındığında^50,51, aşağı akış testleri/analizleri için yeterli miktarlarda mEV'lerin tutarlı bir şekilde zenginleştirilmesi önemli bir adım haline gelmiştir. Bu araştırma soruları göz önünde bulundurularak, bu protokol aksenik kültürlerden mEV'leri ve bunların rekombinant versiyonlarını zenginleştirmeyi amaçlamaktadır.

Msm EV'lerin ayrıntılı kütle spektrometrik proteom analizleri sırasında, Prados-Rosales ve ark. en bol bulunan 10 proteini^{tanımladı 30}. Ayrıca, yeterli moleküler mühendislik üzerine, bunlardan birinin, ilgilenilen yabancı bir proteini mEV'lere taşımak için yeterli olması gerektiğini varsaydık. İlginç bir şekilde, Cfp-29, 39,40,41,42 çeşitli özellikleri nedeniyle mümkün olan en iyi seçenek olarak göze çarpıyordu. Verilerimiz gerçekten de mCherry ve EsxA'yı taşımak için yeterli olduğunu gösteriyor (EsxA'nın daha kararlı olması için C-terminalinde küçük bir etiket gerektirse de) ve bunları mEV'lerde biriktirmek yeterli. Son zamanlarda, 2021'de Tang ve ark. Cfp-29'un boya renk giderici peroksidaz (DyP) tipi peroksidazları⁴⁰ taşıma kabiliyetine sahip bir kapsül olduğunu gösterdi. Belki de Cfp-29 diğer yabancı proteinleri de taşıyabilir.

EsxA'yı araştırdık çünkü belirgin bir Mtb immünojeni 37,38,39, hayvan modelinde bir alt birim aşı olarak koruyucu olabilir^37,38,39, boyut olarak küçüktür; ve ortoloğu (MSMEG_0066) ilginç bir şekilde Msm EV'lerde yoktur. Bunu burada tartışmasak da, Antijen 85B (Rv 1886c) dahil olmak üzere birkaç başka Mtb proteini (Mtb'de benzersiz bir şekilde bulunur ve Msm tarafından kodlanmaz) için R-mEV'leri başarıyla ürettik. Aynı zamanda, ilginç bir şekilde, tam uzunlukta Rv2660c ve Rv0288 de dahil olmak üzere birkaç kişi için R-mEV'ler üretemedik, çünkü proteinler Msm için toksiktir. Bu sonuca varıyoruz çünkü doğru nükleotid dizilerini klonlamasına ve tekrarlanan dönüşümleri gerçekleştirmesine rağmen, Msm'nin hiçbir transformantı ortaya çıkmadı. EsxA, mEV'lerde daha iyi birikim için C-terminal ucunda bir 3XFLAG etiketi gerektirdiğinden, değerlendirdiğimiz diğer tüm Mtb kodlu proteinlere bir 3XFLAG etiketi ekledik. Etikete rağmen, Msm hayatta kalamadı, bu da bazı Mtb proteinlerinin etiket füzyonuna rağmen toksik kaldığını gösteriyor. Bu durumlarda, sadece tahmin edilen epitop bölgelerini klonlamanın veya birkaç epitopun birbirine dikilmesinin işe yarayabileceğini düşünüyoruz (şu anda laboratuvarımızda değerlendiriliyor). İlgilenilen proteinin katlanması üzerindeki olumsuz etkiyi en aza indirmek için Cfp-29 ve mCherry / EsxA arasında küçük bir beş amino asit (dört Glisin ve bir Serin) bağlayıcı kullandık^44,45. Bu bağlayıcı olmadan, ilgilenilen katlanma proteininin Cfp-29 katlanmasından güçlü bir şekilde etkileneceğini tahmin ediyoruz.

Bu zenginleştirme protokolü, Mtb tarafından üretilen EV'lerin zenginleştirilmesine kolayca genişletilebilir. Ayrıca, çevresel mikobakterilerden mEV'lerin zenginleştirilmesinin de bu protokolle mümkün olması gerektiğini düşünüyoruz. Protokolün basit ve anlaşılır olmasına rağmen, Msm tarafından üretilen EV'leri ve R-mEV'leri zenginleştirmek için hala 7-8 gün gerekiyor. Buna karşılık, Mtb tarafından üretilen EV'lerin zenginleştirilmesi için 15-20 gün gerekir. EV'leri daha küçük bir hacme yoğunlaştırmak zaman alıcı ve pahalıdır ve şu anda 'zaman' sorununu çözmek için teğetsel akış filtrasyonu ve diğer yaklaşımları araştırıyoruz.

Son olarak, mEV'leri zenginleştirmek için 7H9'u değil Sauton'u kullanıyoruz çünkü 'ADC' takviyesi, mEV'lerin herhangi bir aşağı akış kullanımına müdahale edebilecek yüksek miktarda sığır serum albümini içeriyor. Bu protokol, mEV'lerin bileşimini değerlendirmek için kullanılması gereken diğer herhangi bir özel ortama (örneğin, düşük demirli ortam) kolayca genişletilebilir. Alternatif olarak, belirli uygulamalar için, son adımda (yani protokol adımı 2.7.5), HEPES tamponu yerine, çeşitli in vivo tabanlı analizler için farelere veya kobaylara enjekte edilirken steril salin kullanılabilir.

Tüm yazarlar, bu araştırma çalışmasının potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişki/çıkar olmadan yürütüldüğünü beyan eder.

Yazarlar, M. smegmatis mc²155 hissesini paylaşma nezaketini gösterdiği için Prof. Sarah M. Fortune'a içtenlikle teşekkür eder. Ayrıca, Şekil 1 için bazı temel unsurları sağladığı için Servier Medical Art'ı (smart.servier.com) kabul ederler. mEV zenginleştirme için inkübatör çalkalayıcıların, santrifüjlerin ve ultrasantrifüjlerin uzun kullanımı sırasında hasta ayarlamaları için laboratuvar üyelerinin geri kalanının desteğini içtenlikle kabul ederler. Ayrıca, gerekli cam eşyaların ve sarf malzemelerinin her zaman mevcut ve kullanışlı olduğundan emin olduğu için laboratuvar asistanı Bay Surjeet Yadav'a da teşekkür ediyorlar. Son olarak, THSTI'nin idari, satın alma ve finans ekiplerine sürekli destekleri ve projenin sorunsuz yürütülmesine yardımcı oldukları için teşekkür ederler.