Method Article
Omurilik dorsal boynuzunda ağ düzeyinde nosiseptif aktiviteyi araştırmak için mikroelektrot dizisi teknolojisinin ve 4-aminopiridin kaynaklı kimyasal stimülasyonun kombine kullanımı özetlenmiştir.
Omurilik dorsal boynuzundaki (DH) spesifik nöron tiplerinin rolleri ve bağlanabilirliği, spinal ağrı işlemeyi destekleyen devrelerin giderek daha ayrıntılı bir görünümünü sağlamak için hızlı bir şekilde tanımlanmaktadır. Bununla birlikte, bu bağlantıların DH'deki daha geniş ağ aktivitesi için etkileri daha az anlaşılmıştır, çünkü çoğu çalışma tek nöronların ve küçük mikro devrelerin aktivitesine odaklanmaktadır. Alternatif olarak, birçok hücredeki elektriksel aktiviteyi izleyebilen mikroelektrot dizilerinin (MEA'lar) kullanılması, nöral aktivitenin yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğünü sağlar. Burada, 4-aminopiridin (4-AP) ile kimyasal olarak uyarılan DH devrelerinin indüklediği DH aktivitesini incelemek için fare omurilik dilimleri ile MEA'ların kullanımı açıklanmaktadır. Ortaya çıkan ritmik aktivite, zamanla stabil, tetrodotoksin tarafından bloke edilen yüzeysel DH ile sınırlıdır ve farklı dilim oryantasyonlarında araştırılabilir. Birlikte, bu preparat, naif hayvanlardan, kronik ağrının hayvan modellerinden ve genetik olarak değiştirilmiş nosiseptif fonksiyona sahip farelerden dokudaki DH devre aktivitesini araştırmak için bir platform sağlar. Ayrıca, 4-AP ile uyarılmış omurilik dilimlerindeki MEA kayıtları, yeni antinosiseptif bileşiklerin omurilik DH'deki aktiviteyi bozma kapasitesini değerlendirmek için hızlı bir tarama aracı olarak kullanılabilir.
Spinal kord DH içindeki spesifik inhibitör ve uyarıcı internöron tiplerinin rolleri 1,2,3,4 oranında hızlı bir şekilde ortaya çıkarılmaktadır. Birlikte, internöronlar DH'deki nöronların% 95'inden fazlasını oluşturur ve nosiseptif de dahil olmak üzere duyusal işlemede rol oynarlar. Ayrıca, bu internöron devreleri, periferik sinyallerin beyne ulaşmak için nöroaksiye yükselip yükselmediğini ve ağrı algısına katkıda bulunup bulunmadığını belirlemek için önemlidir 5,6,7. Bugüne kadar, çoğu çalışma, in vitro hücre içi elektrofizyoloji, nöroanatomik etiketleme ve in vivo davranışsal analiz 1,3,8,9,10,11,12,13,14 kombinasyonlarını kullanarak DH nöronlarının tek hücreli veya tüm organizma analiz düzeyindeki rolünü araştırmıştır. . Bu yaklaşımlar, spesifik nöron popülasyonlarının ağrı işlemedeki rolünün anlaşılmasını önemli ölçüde geliştirmiştir. Bununla birlikte, spesifik hücre tiplerinin ve küçük makro devrelerin, DH'nin çıktısını, davranışsal tepkileri ve ağrı deneyimini şekillendirmek için mikrodevre düzeyinde büyük nöron popülasyonlarını nasıl etkilediğini anlamada bir boşluk kalmaktadır.
Makro devre veya çok hücreli seviye fonksiyonunu araştırabilen bir teknoloji, mikroelektrot dizisidir (MEA)15,16. MEA'lar birkaç on yıldır sinir sistemi fonksiyonunu araştırmak için kullanılmıştır17,18. Beyinde, nöronal gelişim, sinaptik plastisite, farmakolojik tarama ve toksisite testi17,18 çalışmasını kolaylaştırmışlardır. MEA tipine bağlı olarak hem in vitro hem de in vivo uygulamalar için kullanılabilirler. Ayrıca, MEA'ların gelişimi hızla gelişti, farklı elektrot sayıları ve konfigürasyonları artık mevcut19. MEA'ların önemli bir avantajı, birçok nörondaki elektriksel aktiviteyi aynı anda çoklu elektrotlar aracılığıyla yüksek uzamsal ve zamansal doğrulukla değerlendirme kapasiteleridir15,16. Bu, nöronların devrelerde ve ağlarda, kontrol koşulları altında ve yerel olarak uygulanan bileşiklerin varlığında nasıl etkileşime girdiğine dair daha geniş bir okuma sağlar.
İn vitro DH preparatlarının bir zorluğu, devam eden aktivite seviyelerinin tipik olarak düşük olmasıdır. Burada, bu zorluk, DH devrelerini kimyasal olarak uyarmak için voltaj kapılı K + kanal blokeri, 4-aminopryidine (4-AP) kullanan omurilik DH devrelerinde ele alınmaktadır. Bu ilaç daha önce akut omurilik dilimlerinin DH'sinde ve akut in vivo koşullar altında ritmik senkron elektriksel aktivite oluşturmak için kullanılmıştır20,21,22,23,24. Bu deneyler, 4-AP ile indüklenen aktivite 20,21,22,23,24,25'i karakterize etmek için tek hücreli yama ve hücre dışı kayıt veya kalsiyum görüntüleme kullanmıştır. Birlikte, bu çalışma ritmik 4-AP kaynaklı aktivite için uyarıcı ve inhibitör sinaptik iletim ve elektriksel sinapsların gerekliliğini göstermiştir. Bu nedenle, 4-AP yanıtı, doğal polisinaptik DH devrelerini ilaca bağlı bir epifenomen olarak değil, biyolojik alaka düzeyi ile maskeleyen bir yaklaşım olarak görülmüştür. Ayrıca, 4-AP ile indüklenen aktivite, nöropatik ağrı koşulları olarak analjezik ve antiepileptik ilaçlara benzer bir yanıt profili sergiler ve konneksinler20,21,22 gibi yeni spinal bazlı analjezik ilaç hedefleri önermek için kullanılmıştır.
Burada, bu nosiseptif devreyi makro devrede veya ağ analiz düzeyinde incelemek için MEA'ları ve spinal DH'nin kimyasal aktivasyonunu 4-AP ile birleştiren bir preparat açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, naif ve nöropatik 'ağrı benzeri' koşullar altında nosiseptif devreleri araştırmak için kararlı ve tekrarlanabilir bir platform sağlar. Bu preparat aynı zamanda bilinen analjeziklerin devre seviyesindeki etkisini test etmek ve hiperaktif omurilikteki yeni analjezikleri taramak için de kolayca uygulanabilir.
3-12 aylık erkek ve dişi c57Bl/6 fareler üzerinde çalışmalar yapıldı. Tüm deneysel prosedürler Newcastle Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi'ne (protokoller A-2013-312 ve A-2020-002) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. İn vitro elektrofizyoloji
Kimyasal | aCSF (mM) | aCSF (g/100 mL) | Sakkaroz ikame edilmiş aCSF (mM) | Sakkaroz yerine geçen aCSF (g/100 mL) | Yüksek potasyumlu aCSF (mM) | Yüksek potasyumlu aCSF (g/100 mL) |
Sodyum klorür (NaCl) | 118 | 0.690 | - | - | 118 | 0.690 |
Sodyum hidrojen karbonat (NaHCO3) | 25 | 0.210 | 25 | 0.210 | 25 | 0.210 |
Glikoz | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 |
Potasyum klorür (KCl) | 2.5 | 0.019 | 2.5 | 0.019 | 4.5 | 0.034 |
Sodyum dihidrojen fosfat (NaH2PO4) | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 |
Magnezyum klorür (MgCl2) | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 |
Kalsiyum klorür (CaCl2) | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 |
Sakaroz | - | - | 250 | 8.558 | - | - |
Tablo 1: Suni Beyin Omurilik Sıvısı bileşimleri. Kısaltma: aCSF = yapay beyin omurilik sıvısı.
Resim 1: Omurilik dilimi oryantasyonları, montaj ve kesme yöntemleri. (A) Enine dilimler, içine bir destek oluğu kesilmiş bir strafor kesme bloğu gerektirir. Omurilik, destek oluğundaki bloğa yaslanır, kordonun dorsal tarafı bloktan uzağa bakar. Blok ve kordon, siyanoakrilat yapıştırıcı ile bir kesme aşamasına yapıştırılır. (B) Sagital dilimler, kesme aşamasına ince bir siyanoakrilat yapıştırıcı çizgisi yerleştirilerek ve daha sonra omuriliğin tutkal üzerinde yan tarafına konumlandırılmasıyla hazırlanır. (C) Yatay dilimler, kesme aşamasına ince bir siyanoakrilat yapıştırıcı çizgisi yerleştirilerek ve daha sonra omurilik ventral tarafının tutkal üzerine yerleştirilmesiyle hazırlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Mikroelektrot Dizi Düzenekleri | ||||
Mikroelektrot Dizi Modeli | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
Düzlemsel veya 3 Boyutlu (3D) | Düzlemsel | 3D | 3D | Düzlemsel |
Elektrot Izgarası | 8 x 8 | 8 x 8 | 8 x 8 | 6 x 10 |
Elektrot Aralığı | 200 μm | 100 μm | 200 μm | 500 μm |
Elektrot Çapı | 30 μm | 12 μm | 12 μm | 30 μm |
Elektrot Yüksekliği (3D) | Yok | 40 μm | 50 μm | Yok |
Deney | Enine dilim | Enine dilim | Sagital + Yatay | Sagital + Yatay |
Tablo 2: Mikroelektrot dizi düzenleri.
Şekil 2: Mikroelektrot dizisi üzerinde doku konumlandırması . (A) Görüntü, bir MEA'nın yerine yerleştirildiği açık bir MEA başlığını göstermektedir. (B) Kayıtlar için MEA baş sahnesi kapalı olan A ile aynıdır ve doku perfüzyon sistemi mevcuttur. (C) Resim, üretici tarafından sağlanan bir MEA'yı göstermektedir. Başın altın yayları ile arayüz oluşturan temas pedleri ve doku banyosu solüsyonunu ve doku dilimini tutan MEA doku banyosu gösterilmiştir. Merkezdeki kırmızı kare ile vurgulanan alan, elektrot dizisinin yeridir. (D) Şemalar, bu çalışmada kullanılan iki MEA elektrot konfigürasyonunu göstermektedir ve daha fazla ayrıntı Tablo 2'de sunulmuştur. Referans elektrodu mavi yamuk ile gösterilir. Sol MEA elektrot düzeni, sunulan çalışma modellerinde en çok kullanılan 60 elektrot kare konfigürasyonunu gösterir 60MEA200/30iR-Ti, 200 μm aralıklı 30 μm çaplı elektrotlar veya 200 μm aralıklı ve 100 μm aralıklı 3 boyutlu MEA'lar (60MEA200/12/50iR-Ti ve 60MEA100/12/40iR-Ti), 12 μm çapında ve 50 μm veya 40 μm yüksekliğinde elektrotlarla, sırasıyla. Sol MEA elektrot düzeni, 6 x 10 elektrot dikdörtgen düzeni-60MEA500/30iR-Ti gösterir. (E) Kayıt için konumlandırılmış enine omurilik dilimine sahip 60MEA100/12/40iR-Ti kare MEA'nın yüksek büyütmeli görüntüsü. Dilim elektrot sıraları 3-8 üzerine oturur. Herhangi bir dokuya temas etmeyen elektrotların üst sırası, referans elektrotları görevi görür. SDH alanı yarı saydam bir bant olarak görünür. Bu durumda, SDH, MEA'nın 4, 5 ve 6. satırlarındaki ve 2, 3, 4, 5 ve 7. sütunlarındaki elektrotların üzerine biner. Ölçek çubuğu = 200 μm. Kısaltmalar: MEA = mikroelektrot dizisi; SDH = yüzeysel sırt boynuzu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Veri işleme ve analizi
NOT: Aşağıdaki adımlarda, omurilik dilimleri üzerinde MEA deneyleri için analiz yazılımının nasıl kullanılacağı ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. 60 elektrottan biri iç referans görevi görürken ( Şekil 2 C, D'de bir yamuk ile işaretlenmiştir), kalan 59'un dört ila yirmi beşi arasında ise yetişkin bir fare omurilik diliminde SDH'nin altına yerleştirilmiştir. Sonraki analizler, bu bölgedeki ham sinyalden hücre dışı aksiyon potansiyelini (EAP) ve yerel alan potansiyeli (LFP) dalga formlarını (örnekler için Şekil 3B'ye bakın) tespit eder.
Şekil 3: Veri kayıt ve analiz aracı düzenleri ve hücre dışı aksiyon potansiyelini ve yerel alan potansiyeli dalga formlarını gösteren örnek mikroelektrot dizisi kayıtları . (A) Şematik, MEA verilerinin elde edilmesi için kullanılan önceden yapılandırılmış kayıt şablonunu gösterir. MEA2100 ve kayıt (headstage/amplifikatör) aracının birbirine bağlanması, verilerin adlandırılmasını ve kaydedilmesini sağlar. Dört örnek ham veri izi (sağda, 5 dakikalık dönemler), başlangıçta aktivite gösteren bir MEA kanalı tarafından, 4-AP uygulamasından 12 dakika sonra, 4-AP aktivitesi kurulduktan sonra 15 dakika daha ve TTX'in banyo uygulamasını (1 μM) takiben toplanmıştır. Not, 4-AP (ikinci izleme) eklenmesi, arka plan gürültüsünde ve EAP / LFP etkinliğinde net bir artış sağlar. Önemli olarak, aktivite 4-AP kaynaklı aktivite kurulduktan sonra en az 15 dakika boyunca nispeten sabit kalır (üçüncü iz). TTX'in (1 μM) eklenmesi tüm aktiviteyi (alt iz) ortadan kaldırır. (B) Şematik (solda), veri analizi için analizör yazılım yapılandırmasını gösterir. Ham veri gezgini aracı, kayıt yazılımı tarafından toplanan kayıtları içe aktarmak için kullanılır. Bu veriler daha sonra arka plan gürültüsünü gidermek için seçilen referans elektrot sinyallerini diğer elektrotlardan çıkaran bir çapraz kanal filtre aracından geçirilir. Her dalga formu için sinyal-gürültü ilişkilerini optimize etmek üzere EAP filtresinden ve LFP filtre araçlarından veri geçişi. Bu adımın ardından, EAP yol verileri, eşiklerin ayarlandığı EAP algılayıcı aracına girer. EAP'ler algılanır ve ardından her olayın gecikme sürelerinin kaydedildiği ve txt olarak verildiği EAP çözümleyici aracına gönderilir. dosya. Karşılık gelen bir LFP araç seti kullanılarak LFP verileri için aynı iş akışı oluşur. Sağ izler, çeşitli hücre dışı dalga formları içeren tek bir MEA kanalından gelen verileri gösterir. EAP ve LFP sinyallerinin konumu yukarıdaki 'sayım rasterleri'nde vurgulanmıştır. Alt izler, çeşitli LFP sinyalleri (görünüm çeşitliliğine dikkat edin) ve bireysel hücre dışı EAP'ler (kırmızı daireler) dahil olmak üzere genişletilmiş bir zaman ölçeğinde dalga formlarını gösteren üst kayıttan (kırmızı çubuklarla gösterilir) gelen dönemlerdir. Not, LFP / EAP dalga formu ve polarite, bu sinyalleri üreten nöronların sayısına, kayıt elektroduna yakınlıklarına ve yakındaki elektrotlara göre konumlarına göre değişir. Kısaltmalar: MEA = mikroelektrot dizisi; EAP = hücre dışı aksiyon potansiyeli; LFP = yerel alan potansiyeli; 4-AP = 4-aminopiridin; TTX = tetrodotoksin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Omurilik dorsal boynuzunda ağ aktivitesi modeli
4-AP uygulaması, omurilik DH'sinde senkron ritmik aktiviteyi güvenilir bir şekilde indükler. Bu tür faaliyetler artan EAP'ler ve LFP'ler olarak ortaya çıkar. Daha sonraki sinyal, daha önce MEA kayıtları30'da açıklanan düşük frekanslı bir dalga şeklidir. İlaç uygulamasından sonra EAP ve/veya LFP aktivitesindeki değişiklikler değişmiş nöral aktiviteyi yansıtır. EAP ve LFP örnekleri Şekil 3B ve Şekil 4'te gösterilmiştir. Buradaki odak noktası, EAP / LFP verilerinin aşağıdaki parametreleri veya özellikleridir: frekans, toplam sayımlar, aktif elektrot sayımları, birden fazla elektrot arasında tespit edilen tesadüf olaylarının sayısı, bağlı bitişik elektrotların sayısı ve bitişik elektrotlar arasındaki bağlantıların gücü ile karakterize edilen eşzamanlılık. Temsili sonuçlar Tablo 3 ve Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7 ve Şekil 8'de gösterilmiştir. 4-AP stimülasyonunu takiben hem EAP'ler (Şekil 5 ve Şekil 6) hem de LFP'ler (Şekil 7 ve Şekil 8) için ölçülen tüm parametrelerde (eşleştirilmiş t-testi veya Wilcoxon Signed-Rank parametrik olmayan eşdeğer test ile tüm p<0.001) ve daha sonra kayıtların geri kalanı için göreceli stabilitede anlamlı bir artış göstermektedir. Veriler istatistiksel analizden önce normallik açısından test edilmiştir. Özetle, 4-AP, omurilik DH'sinde EAP ve LFP aktivitesini indükler ve verilerin çeşitli özellikleri MEA kayıtlarından çıkarılabilir. Aktivite tekrarlanabilir ve aktivitenin çoğu, özellikle LFP'ler için, ritmik ve senkrondur.
Aktivite Özelliği | Taban çizgisi | 4-Aminopiridin | Önemli Fark |
Hücre Dışı Aksiyon Potansiyelleri (EAP'ler) | |||
Frekans | 0.07 ± 0.01 | 0.88 ± 0.09 | s<0.001 |
Toplam Başak Sayısı | 261,41 ± 70,62 | 3289. 57 ± 484,38 | s<0.001 |
Aktif Elektrot Sayısı | 2,36 ± 0,34 | 8,95 ± 0,68 | s<0.001 |
Tesadüfi Ani Artışların Sayısı | 9,26 ± 4,01 | 966,94 ± 189,21 | s<0.001 |
Bağlı Elektrot Sayısı | 2,03 ± 0,42 | 24,06 ± 1,96 | s<0.001 |
Elektrotlar Arasındaki Bağlantıların Gücü | 1.97 ± 0.58 | 29,13 ± 4,60 | s<0.001 |
Yerel Alan Potansiyelleri (LFP'ler) | |||
Frekans | 0.00 ± 0.00 | 0.28 ± 0.03 | s<0.001 |
Toplam Başak Sayısı | 4,79 ± 0,82 | 688,47 ± 121,16 | s<0.001 |
Aktif Elektrot Sayısı | 0.41 ± 0.16 | 7,64 ± 0,73 | s<0.001 |
Tesadüfi Ani Artışların Sayısı | 0.43 ± 0.23 | 108,06 ± 278,22 | s<0.001 |
Bağlı Elektrot Sayısı | 0.24 ± 0.15 | 22,91 ± 2,46 | s<0.001 |
Elektrotlar Arasındaki Bağlantıların Gücü | 0.34 ± 0.19 | 29,20 ± 3,59 | s<0.001 |
Tablo 3: 4-Aminopiridin kaynaklı aktivite. Hepsi SEM ± araç olarak sunulur.
Şekil 4: Örnek bazal hücre dışı aksiyon potansiyeli aktivitesi. Panellerde EAP etkinliği gösterilir (kayıtlar farklı dilimlerdendir). Belirli bir dilim kaydındaki elektrotların çoğu temel EAP aktivitesini göstermedi (üst panel). Düşük frekanslı sporadik EAP'ler bazen başlangıçta gözlendi ve potansiyel olarak çoklu başak dalga formları (orta panel) içeriyordu. Yüksek frekanslı EAP aktivitesi, başlangıçtaki kayıtlarda nadiren gözlenmiştir (alt panel). Kümeler, genişletilmiş bir zaman ölçeğinde karşılık gelen kayıtlardan tek tek EAP'leri gösterir. Kısaltma: EAP = hücre dışı aksiyon potansiyeli. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Dilim oryantasyonu
4-AP tarafından etkinleştirilen DH devresi her üç boyutta da bağlanır. Bu nedenle, dilim oryantasyonu in vitro preparatlar için önemli bir husustur. Sagital veya yatay dilimleme, intersegmental sinyalleşmeyi gözlemlemek için tercih edilebilirken, enine dilimler mediolateral ve dorsoventral bağlantıyı daha iyi korur. Bu hususlar göz önüne alındığında, 4-AP stimülasyonunun, dilim oryantasyonundan bağımsız olarak, SDH'de benzer ritmik aktiviteyi indüklediği görülebilir (bkz. Şekil 9).
4-AP kaynaklı aktivitenin uzun süreli stabilitesi
4-AP kaynaklı aktivitenin stabilitesi, uygulanan ilaçların etkilerini incelerken açıkça çok önemlidir. Bu nedenle, 4-AP kaynaklı aktivite parametrelerinin kararlılığı karakterize edildi ve bu Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7 ve Şekil 8 ve Tablo 4'te sunulmuştur. Tüm aktivite özellikleri ve LFP'ler için aktivitenin çakışması, 4-AP uygulamasından 12 dakika sonra ve 15 dakika sonra 4-AP kaynaklı aktivitenin benzerliğine dayanarak kararlıydı (p>0.05). Diğer LFP eşzamanlılık özellikleri, bağlı bitişik elektrotların sayısı ve bitişik elektrotlar arasındaki bağlantı gücü 15 dakika boyunca azalmıştır (sırasıyla p = 0.016 ve p = 0.033), ancak fark mütevazıydı. Bu kademeli değişim, farmakolojik çalışmalar sırasında bir test ilacının daha acil eylemlerinden kolayca ayırt edilebilir (aşağıya bakınız). Veriler, istatistiksel karşılaştırmalardan önce normal dağılım için test edildi ve daha sonra eşleştirilmiş t-testleri veya parametrik olmayan Wilcoxon Signed-Rank testleri kullanılarak uygun şekilde değerlendirildi.
Aktivite Özelliği | 4-Aminopiridin | 4-Aminopiridin (15 dk.) | Önemli Fark |
Hücre Dışı Aksiyon Potansiyelleri (EAP'ler) | |||
Frekans | 0.8 ± 0.13 | 0.85 ± 0.10 | p>0.05 (dif yok.) |
Toplam Başak Sayısı | 2706,36 ± 510,96 | 2838,09 ± 447,73 | p>0.05 (dif yok.) |
Aktif Elektrot Sayısı | 9,32 ± 0,70 | 10,09 ± 0,56 | p>0.05 (dif yok.) |
Tesadüfi Ani Artışların Sayısı | 1037,63 ± 306,84 | 1013,09 ± 269,80 | p>0.05 (dif yok.) |
Bağlı Elektrot Sayısı | 22.00 ± 3.37 | 22,41 ± 2,56 | p>0.05 (dif yok.) |
Elektrotlar Arasındaki Bağlantıların Gücü | 30,44 ± 6,27 | 31,88 ± 7,68 | p>0.05 (dif yok.) |
Yerel Alan Potansiyelleri (LFP'ler) | |||
Frekans | 0.25 ± 0.03 | 0.17 ± 0.03 | p>0.05 (dif yok.) |
Toplam Başak Sayısı | 792,32 ± 155,83 | 546,32 ± 120,93 | p>0.05 (dif yok.) |
Aktif Elektrot Sayısı | 9,50 ± 1,11 | 7.86 ± 1.00 | p>0.05 (dif yok.) |
Tesadüfi Ani Artışların Sayısı | 1631,27 ± 734,77 | 1073,00 ± 490,85 | p>0.05 (dif yok.) |
Bağlı Elektrot Sayısı | 26,68 ± 4,58 | 20,95 ± 3,68 | p<0.05 |
Elektrotlar Arasındaki Bağlantıların Gücü | 33,35 ± 6,19 | 24,81 ± 5,41 | p<0.05 |
Tablo 4: 4-Aminopiridin aktivite stabilitesi. Hepsi SEM ± araç olarak sunulur.
Aktivite özelliklerinin farmakolojik olarak araştırılması
MEA ile kaydedilmiş 4-AP kaynaklı aktivitenin farmakolojik manipülasyonlara kolayca uygun olduğunu göstermek için, bu sinyallerin aksiyon potansiyeli deşarjına bağımlılığı vurgulanmıştır. Voltaj kapılı sodyum kanal antagonisti tetrodotoksinin (TTX, 1 μM) banyo uygulaması, hem EAP hem de LFP aktivitesini ortadan kaldırarak bu sinyallerin ani bağımlılığını doğruladı. Örnek izler Şekil 3A'da gösterilmiştir. Bu sonuç aynı zamanda, yeni bileşiklerin ve yerleşik analjeziklerin aktif spinal DH devrelerindeki etkileri için değerlendirilebildiği gelecekteki farmakolojik araştırmalar için preparatın yararlılığına bir örnek sunmaktadır. Son olarak, DH ağlarının 4-AP aktivasyonunun alaka düzeyine daha fazla ışık tutmak için, DH ağının mütevazı depolarizasyonunu sağlamak için alternatif bir yaklaşım denenmiştir. Bu yaklaşımda, yüksek potasyum (4.5 mM) aCSF çözeltisi (Tablo 1) banyoya uygulanmış ve 4-AP stimülasyonuna benzer bir DH yanıtı uyandırdığı gösterilmiştir. Bu manipülasyon, 4-AP kaynaklı yanıtlarla aynı senkron özelliklere sahip LFP aktivitesini uyandırdı (Şekil 10), benzer bir mekanizma ve altta yatan devreyi düşündürdü.
Şekil 5: Örnek 4-aminopiridin kaynaklı hücre dışı aksiyon potansiyeli aktivitesi. (A) Raster grafikleri, 4-AP'lik (orta ve alt) banyo ilavesini takiben taban çizgisinde (üstte) ve iki zaman noktasında (12 dakika - kurulmuş ve 27 dakika) algılanan etkin kanallardan EAP etkinliğini gösterir. Dikey mavi pencereler, 5'ten fazla kayıt elektrotunda senkron (yakın gecikmeli) etkinlik dönemlerini vurgular. (B) Paneller, MEA verilerinin EAP etkinlik haritası analizini özetler. Sol şematik, omurilik diliminin elektrot dizisine göre yönünü gösterir. Orta sol panel, başlangıçtaki aktiviteyi (kırmızı renkli aktif elektrotlar) ve aktif elektrotların etrafındaki beyaz gölgelendirme ile gösterilen EAP frekansını özetler (gölgelendirme yoğunluğu, artan aktiviteyi gösterir). Orta sağ panel, 12 dakikalık 4-AP pozlamadan sonra aynı dilimdeki aktiviteyi gösterir. Aktif elektrotların (kırmızı) sayısının EAP frekansı ile birlikte arttığını unutmayın. Ek olarak, bitişik elektrotlar arasındaki senkron, bir ağ aktivite haritası üreten kırmızı bağlantı çizgileri ile gösterilir (çizgi kalınlığı, elektrotlar arasındaki EAP benzerlik derecesini gösterir). Sağ panel, 15 dakika daha 4-AP pozlamanın ardından aynı dilimdeki etkinliği gösterir. Aktif elektrotların sayısı (kırmızı), EAP aktivitesinin derecesi (beyaz) ve ağ yapısının (kırmızı çizgiler) bu süre zarfında sabit kaldığına dikkat edin. Kısaltmalar: 4-AP = 4-aminopiridin; EAP = hücre dışı aksiyon potansiyeli; MEA = mikroelektrot dizisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: 4-aminopiridin kaynaklı hücre dışı aksiyon potansiyeli aktivitesinin grup veri özeti. (A-F) Şekil 4'te sunulan EAP verileriyle aynı olan birkaç deneyden EAP özelliklerini özetleyen grup veri grafikleri (veriler ayrıca Tablo 3 ve Tablo 4'te özetlenmiştir). EAP frekansı (A), sayı (B), tesadüf olayları (C), aktif elektrotlar (D), bağlı elektrotlar (E) ve ortalama bağlantı mukavemeti (F), 4-AP'nin banyo uygulamasından sonra artmış ve daha sonra 4-AP kaynaklı aktivitenin oluşturulmasını takiben 15 dakika boyunca stabil kalmıştır. Veriler 11 deneyden alınmıştır (kırmızı renkteki veriler Şekil 5'teki deneydendir). Kısaltmalar: 4-AP = 4-aminopiridin; EAP = hücre dışı aksiyon potansiyeli. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: 4-Aminopiridin kaynaklı lokal alan potansiyel aktivitesi. Veriler, LFP verileri dışında Şekil 5'teki gibi sunulmuştur. (A) Raster grafikleri, 4-AP'lik (orta ve alt) banyo ilavesini takiben taban çizgisinde (üstte) ve iki zaman noktasında (12 dakika - kurulmuş ve 27 dakika) tespit edilen birden fazla kanaldan LFP aktivitesini gösterir. Dikey mavi pencereler, 5'ten fazla kayıt elektrotunda senkron (yakın gecikmeli) etkinlik dönemlerini vurgular. (B) Paneller, MEA verilerinin LFP aktivite haritası analizini özetler. Sol şematik, omurilik diliminin elektrot dizisine göre yönünü gösterir. Orta sol panel, aktif elektrotların etrafındaki beyaz gölgelendirme ile gösterilen minimum LFP frekansı ile başlangıçtaki aktiviteyi (kırmızı renkli aktif elektrotlar) özetler (gölgelendirme yoğunluğu, artan aktiviteyi gösterir). Orta sağ panel, 12 dakikalık 4-AP pozlamadan sonra aynı dilimdeki aktiviteyi gösterir. Aktif elektrotların sayısı (kırmızı) ve LFP frekansı önemli ölçüde artar. Ek olarak, bitişik elektrotlar arasındaki senkronizasyon (kırmızı bağlantı çizgileri), LFP aktivitesinin güçlü bir ağ haritasını gösterir (çizgi kalınlığı, elektrotlar arasındaki benzerlik derecesini gösterir). Sağ panel, 15 dakika daha 4-AP pozlamanın ardından aynı dilimde LFP aktivitesini gösterir. Aktif elektrot sayısı (kırmızı), LFP aktivitesinin derecesi (beyaz) ve ağ yapısının (kırmızı çizgiler) bu süre zarfında nispeten kararlı olduğuna dikkat edin. Kısaltmalar: 4-AP = 4-aminopiridin; MEA = mikroelektrot dizisi; LFP = yerel alan potansiyeli. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: 4-aminopiridin kaynaklı yerel alan potansiyel aktivitesinin grup veri özeti. (A-F) Şekil 7'de sunulan EAP verileriyle aynı olan birkaç deneyden LFP özelliklerini özetleyen grup veri grafikleri (veriler ayrıca Tablo 3 ve Tablo 4'te özetlenmiştir). LFP frekansı (A), sayı (B), tesadüf olayları (C) ve aktif elektrotlar (D), 4-AP etkisi zirveye ulaştıktan sonra 15 dakika boyunca kararlıydı (kırmızı renkteki veriler Şekil 7'deki deneyden). Bununla birlikte, bağlı elektrotlar (E) ve ortalama LFP bağlantı gücü (F) zamanla azalmıştır (her ikisi de p<0.05). Veriler 11 deneyden alınmıştır (kırmızı renkteki veriler Şekil 7'deki deneydendir). Kısaltmalar: 4-AP = 4-aminopiridin; LFP = yerel alan potansiyeli. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: 4-Aminopiridin kaynaklı hücre dışı aksiyon potansiyeli ve sagital ve yatay dilimlerde lokal alan potansiyeli aktivitesi. Paneller, sagital (A) ve yatay (B) omurilik dilimlerinde 4-AP kaynaklı sinyalleşmenin MEA ağ haritası analizinde EAP ve LFP aktivitesini özetlemektedir. Şemalar (en solda), omurilik dilimlerinin dikdörtgen elektrot dizilerine göre yönünü gösterir. Sol ağ haritaları, sagital (A) ve yatay (B) omurilik dilimlerinde temel EAP ve LFP aktivitesini gösterir (aktif elektrotlar kırmızıdır, frekans beyaz gölgelendirme yoğunluğu ile gösterilir ve bitişik elektrotlar arasındaki senkron, senkron derecesini gösteren kalınlığa sahip kırmızı bağlantı çizgileri ile). Sağ ağ haritaları, sagital (A) ve yatay (B) omurilik dilimlerinde 12 dakikalık 4-AP maruziyetinden sonra EAP ve LFP aktivitesini aynı dilimde gösterir. Aktif elektrot sayısındaki, aktivite sıklığındaki ve 4-AP maruziyetini takiben bu sinyallerin senkronizasyonundaki önemli artışa dikkat edin, her iki dilim oryantasyonunda da ağları maskeleyin. Kısaltmalar: MEA = mikroelektrot dizisi; EAP = hücre dışı aksiyon potansiyeli; LFP = yerel alan potansiyeli; 4-AP = 4-aminopiridin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Yüksek potasyum (yüksek K +) kaynaklı yerel alan potansiyel aktivitesi. Paneller, yüksek K+ (4,5 mM) aCSF kaynaklı LFP aktivitesini özetler. (A) Başlangıçta ve yüksek K+ aCSF'nin (5 dakikalık dönemler) banyo ilavesini takiben bir MEA kanalından örnek izler. K + konsantrasyonunun yükselmesi, 4-AP uygulamasında görülene benzer şekilde, başlangıçta bulunmayan net LFP aktivitesi üretti (Şekil 3). Inset, genişletilmiş bir zaman ölçeğinde bir LFP dalga formu gösterir. (B) Paneller, yüksek K+ aCSF'nin neden olduğu LFP ağ etkinliğini özetler. Sol şematik, omurilik dilimlerinin kare elektrot dizilerine göre yönelimini gösterir. Ağ haritaları, taban çizgisini ve yüksek K + 'dan uyarılmış LFP aktivitesini karşılaştırır (aktif elektrotlar kırmızı, beyaz gölgelendirme yoğunluğu ile gösterilen frekans ve bitişik elektrotlar arasındaki senkron, senkron derecesini gösteren kalınlığa sahip kırmızı bağlantı çizgileri ile). Yüksek K + aCSF maruziyetini takiben aktif elektrot sayısında, aktivite sıklığında ve bu sinyallerin senkronizasyonundaki önemli artışa dikkat edin, altta yatan ağın maskesini 4-AP'ye benzer şekilde kaldırın. kısaltmalar: aCSF = yapay beyin omurilik sıvısı; MEA = mikroelektrot dizisi; EAP = hücre dışı aksiyon potansiyeli; LFP = yerel alan potansiyeli; 4-AP = 4-aminopiridin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Spinal DH'nin nosiseptif sinyalleme, işleme ve bunun sonucunda ağrıyı karakterize eden davranışsal ve duygusal tepkilerdeki önemine rağmen, bu bölgedeki devreler tam olarak anlaşılamamıştır. Bu konunun araştırılmasında önemli bir zorluk, bu devreleri oluşturan nöron popülasyonlarının çeşitliliği olmuştur 6,31,32. Optogenetik ve kemogenetik tarafından yönetilen transgenik teknolojilerdeki son gelişmeler, bu önemli bağlantıları çözmeye ve duyusal bilgiyi işleyen mikro devreleri tanımlamaya başlıyor 1,2,3,4,8,9,10,11,12,13,14 . Bu mikro devrelerin DH nöronlarının daha büyük ağlarındaki aktiviteyi şekillendirmek için nasıl bir araya geldiklerini uzlaştırmak, özellikle yeni ve daha etkili ağrı tedavileri geliştirmek için zor olmaya devam etmektedir. Burada, MEA'larda izlenen ve daha geniş ağ bağlantısını incelemek için 4-AP ile uyarılmış ritmik aktivite kullanan DH aktivitesinin fonksiyonel bir modeli açıklanmaktadır. Bu model, eylem potansiyeli deşarjına bağlı olan ve ağ özelliklerindeki değişiklikleri eşlemek için kullanılabilen yerel hücre dışı ani artışları (EAP'ler) ve daha büyük ağ tabanlı LFP'leri ortaya çıkarır. Devre araştırmasını kolaylaştırmak için MEA'ların ve altta yatan devreleri ortaya çıkarmak için 4-AP'nin kullanımını birleştirerek, bu hazırlık DH devre fonksiyonunun bölgesel veya 'makroskobik' düzeyde çalışılmasını sağlar.
MEA / 4-AP omurilik dilimi modelinin avantajları, ayrıntılı farmakolojik araştırmaya uygun olan ve nöral aktivite-bireyin, yani EAP'lerin ve LFP'lerin büyük bir doku bölgesinde yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğünü sağlayan bir in vitro preparatın sıkı deneysel kontrolünü ve ağlar ve bölgeler arasında sinyalleşmeyi değerlendirebilen çok kanallı verileri içerir. Önemli olarak, 4-AP kaynaklı ritmik aktivite güvenilirdir, tekrarlanabilir ve farklı omurilik dilimi oryantasyonlarında incelenebilir. Bu preparat, tek hücreli ve tüm hayvan araştırmaları arasındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olur ve hem normal hem de patolojik koşullar altında bu devrelerdeki değişiklikleri ortaya çıkarabilir. Çeşitli ilaçların ağ aktivitesi üzerindeki etkileri de belirlenebilir. Bu nedenle, bu platform DH devreleri üzerindeki mevcut ve yeni analjeziklerin etkilerini araştırmak için bir tarama aracı olarak hareket edebilir.
Bu protokolde birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, dikkatli doku hazırlama, dilim oryantasyonundan bağımsız olarak, deneyler için uygun ve 4-AP'ye duyarlı dilimler üretmenin anahtarıdır. Burada ayrıntılı bilgi ve sorun giderme önerileri sağlayan bir dizi kaynak vurgulanmıştır. Kısaca, solüsyon yapımında doğruluk, omuriliğin hızlı ama titiz diseksiyonu, doku sıkışmasını ve hasarını en aza indirmek için optimize edilmiş dilimleme parametreleri ve dilimleri herhangi bir noktada aktarırken gösterilen özen, hazırlık aşamasında önemli faktörlerdir. MEA'ların dikkatli bir şekilde kullanılması, özellikle elektrotlara yakın olduğunda, bu bileşenlerin işlevini sürdürmenin anahtarıdır. DH'nin maksimum MEA elektrot sayısı üzerindeki optimum konumu, her deneyin kayıt verimini artırmak için önemlidir. 3D MEA'ları kullanırken, özellikle dilimleri konumlandırırken ve çıkarırken daha fazla özen ve pratik gereklidir. Dokuyu çıkıntılı MEA elektrotları boyunca sürüklemek ve gelecekteki kullanımdan ödün vermek kolaydır.
Burada açıklanan yaklaşıma bazı uyarılar vardır. İncelenen nöronların kimliğinin genetik etiketleme veya post hoc immünoetiketleme kullanılarak belirlenebildiği tek hücreli kayıtların aksine, MEA'lar tarafından tespit edilen elektrik sinyallerinin tam kaynağı belirlenemez. Diğer bir zorluk, omurilik dilimlerindeki temel aktivite seviyesidir. Bazı raporlar başlangıçta tonik olarak aktif DH nöronlarını tanımlasa da, en son çalışma genç yenidoğan dokusunda33,34'tür. Ayrıca, yetişkin dokuda bildirilen tonik aktivite tipik olarak, elektrotların önce bu aktiviteyi tanımlamak ve daha sonra incelemek için ilerletildiği bir arama stratejisi kullanılarak kaydedilir35. Tarafsız bir örnekleme yaklaşımı kullanıldığında, aktiviteyi değerlendirmeden önce kayıt oluşturulduğunda, yetişkin DH nöronlarının% 20'sinden azı devam eden ani artış gösterir (28/150 kayıt) ve düzenli deşarj bu hücrelerin sadece% 2'sinde gözlenmiştir (3/150)36.
Bu oran ve elektrotların bir doku dilimine göre sabit doğası göz önüne alındığında, az sayıda MEA elektrodunun (bu MEA'larda ~ 2 elektrot / dilim) başlangıçta aktivite göstermesi şaşırtıcı değildir. Bu aktivite eksikliği, burada açıklanan yöntemin, EAP'leri ve uyandırılmış LFP aktivitesini geliştirmek için 4-AP'li dilimleri uyarmayı içermesinin birincil nedenidir. Bu yaklaşım, korteks ve hipokampustaki epileptiform mekanizmaların incelenmesinden omuriliğin ventral boynuzunda kurgusal lokomotor aktiviteye kadar birçok in vitro preparatta ritmik devre aktivitesini aktive etmek için 4-AP'nin kullanılmasına dayanmaktadır37,38,39. Kapsamlı bir literatür ayrıca 4-AP'nin spinal dilimlerdeki yüzeysel DH devreleriyle sınırlı aktiviteyi indüklediğini ve uyarıcı ve inhibitör sinaptik iletimin yanı sıra elektriksel sinapslara bağlı olduğunu vurgulamaktadır 20,21,22. Ayrıca, in vivo 4-AP uygulaması, merkezi reseptif bölgedeki dereceli stimülasyona verilen yanıtları değiştirmeden veya dejenere yanıtlara neden olmadan DH nöron alıcı alanlarında doza bağımlı bir artış üretir24. Son olarak, hücre dışı potasyum iyon konsantrasyonunu yükselterek bu devrelerin mütevazı bir depolarizasyonunun da karşılaştırılabilir LFP aktivitesi ürettiği görülebilir. Birlikte, bu gözlemler, 4-AP'nin, MEA'larla çalışılabilecek yüzeysel DH içindeki işlevsel olarak ilgili ağların maskesini çıkardığı görüşünü desteklemektedir. Son olarak, LFP aktivitesinin kesin kaynağı belirsizdir, ancak bu dalga formlarının bir elektrodu çevreleyen çoklu nöronlardan tespit edilen aktivitenin bir toplamını temsil ettiği düşünülmektedir. Nöronlardaki patlama aktivitesi ile ilişkili veya bunlardan kaynaklanabilir veya sinaptik potansiyellere karşılık gelebilirler30. Kökenleri ne olursa olsun, LFP'lerin özellikleri dilimler içinde ve arasında karşılaştırılabilir (çoklu kayıtlar / ilaç uygulamaları), devre ve ağ işlevinin değerli bir okumasını sağlar.
İn vitro dilim preparatlarının doğası, nöronal devrelerin potansiyel olarak bozulması ve dilim yüzeyindeki hücrelere zarar vermesi ile birlikte dikkate alınmasını da gerektirir. Buna rağmen, dokunun dilimlenmesi, ilgili DH devrelerine daha doğrudan elektriksel erişim ve kesintisiz farmakolojik erişim sağlar. Bu deneysel avantajlar ve dezavantajlar, ilgilenilen ağlardaki bağlantıyı maksimum düzeyde korumak için dilim yönelimini göz önünde bulundurmanın önemine vurgu yapılarak dikkatlice düşünülmelidir. Bu yazıda sunulan verilerin büyük çoğunluğu için, dorsal boynuz içindeki aktivitenin medial-lateral yayılımı ve bu bölgedeki nöronların intrinsik bağlantısı sunulmuştur. Rostro-kaudal aktivite yayılımını araştırmak için, sagital veya yatay dilimlerin kullanımı, Şekil 9'da vurgulandığı gibi, spinal segmentler arasındaki bağlantıyı tercihen korur.
Ek olarak, omuriliğin kesilmesinin dilimlerin yüzeyinde bir dereceye kadar hasara neden olması kaçınılmazdır. Bu hasarı en aza indirmek, dokunun dikkatli bir şekilde hazırlanmasına, yavaş ilerleme hızı ve yüksek frekanslı bıçak salınımları dahil olmak üzere dilimleme parametrelerine ve bu işlem sırasında nöroprotektif olan çözeltilere ve koşullara geri döner. Omurilik dilimi sağlığı için farklı koşulların yararının ayrıntılı bir değerlendirmesi daha önceyayınlanmıştır 40. Dilim sağlığının MEA kayıtları üzerindeki potansiyel etkisine rağmen, dilim hazırlama prosedürlerindeki iç tutarlılık, bu faktörün bir veri kümesindeki sonuçları eşit şekilde etkilemesini sağlar. MEA elektrotlarının, aktivite kaynağından yaklaşık 30-100 μm uzakta ortaya çıkan sinyalleri aldığı düşünülmektedir. Hasarlı dilim yüzeyinin üst hücre katmanına (yaklaşık 15-30 μm) yayılması muhtemel olduğundan, dilimlemeyle ilgili hasarın MEA kayıtları üzerindeki etkileri, DH ağ etkinliği15,41 hakkında değerli veri kümeleri ve içgörüler elde etmek için yönetilebilir ve azaltılabilir.
Özetle, burada açıklanan MEA / 4-AP omurilik dilimi yaklaşımı, DH devrelerinin bağlantısını ve oluşturdukları ağların spinal ağrı işlemeyi nasıl yönlendirdiğini anlamak için bir platform sağlar. Analiz parametreleri, ağ stimülasyon kaynağı ve farmakolojik tarama için bir platform olarak kullanılma veya patolojik ağrı modelleriyle kullanım kapasitesi açısından daha fazla metodolojik genişleme potansiyeli de vardır.
Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Bu çalışma, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) (B.A.G. ve R.J.C.'ye 631000, 1043933, 1144638 ve 1184974 hibe) ve Hunter Tıbbi Araştırma Enstitüsü (B.A.G. ve R.J.C.'ye hibe) tarafından finanse edilmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
Carbonox (Carbogen - 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
Custom made air interface incubation chamber | |||
Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
MATLAB | MathWorks | R2018b | |
MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8x8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8x8 square grid (200/30) or a 6x10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır