Aufzeichnung der Netzwerkaktivität in spinalen nozizeptiven Schaltkreisen unter Verwendung von Mikroelektrodenarrays

Die kombinierte Verwendung von Mikroelektroden-Array-Technologie und 4-Aminopyridin-induzierter chemischer Stimulation zur Untersuchung der nozizeptiven Aktivität auf Netzwerkebene im Rückenmarksdorsalhorn wird skizziert.

Die Rollen und die Konnektivität bestimmter Arten von Neuronen innerhalb des Rückenmarkshorns (DH) werden mit hoher Geschwindigkeit abgegrenzt, um einen immer detaillierteren Überblick über die Schaltkreise zu erhalten, die der Verarbeitung von Wirbelsäulenschmerzen zugrunde liegen. Die Auswirkungen dieser Verbindungen auf eine breitere Netzwerkaktivität in der DH bleiben jedoch weniger gut verstanden, da sich die meisten Studien auf die Aktivität einzelner Neuronen und kleiner Mikroschaltkreise konzentrieren. Alternativ bietet die Verwendung von Mikroelektrodenarrays (MEAs), die die elektrische Aktivität in vielen Zellen überwachen können, eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung der neuronalen Aktivität. Hier wird die Verwendung von MEAs mit Rückenmarksschnitten der Maus beschrieben, um die DH-Aktivität zu untersuchen, die durch chemisch stimulierende DH-Schaltkreise mit 4-Aminopyridin (4-AP) induziert wird. Die resultierende rhythmische Aktivität ist auf das oberflächliche DH beschränkt, über die Zeit stabil, durch Tetrodotoxin blockiert und kann in verschiedenen Scheibenorientierungen untersucht werden. Zusammen bietet dieses Präparat eine Plattform, um die DH-Schaltkreisaktivität im Gewebe von naiven Tieren, Tiermodellen chronischer Schmerzen und Mäusen mit genetisch veränderter nozizeptiver Funktion zu untersuchen. Darüber hinaus können MEA-Aufnahmen in 4-AP-stimulierten Rückenmarksschnitten als Schnellscreening-Werkzeug verwendet werden, um die Fähigkeit neuartiger antinozizeptiver Verbindungen zur Störung der Aktivität im Rückenmark DH zu beurteilen.

Die Rolle bestimmter Arten von inhibitorischen und exzitatorischen Interneuronen innerhalb des Rückenmarks DH wird mit einer schnellen Rate aufgedeckt 1,2,3,4. Zusammen machen Interneuronen über 95% der Neuronen im DH aus und sind an der sensorischen Verarbeitung, einschließlich der Nozizeption, beteiligt. Darüber hinaus sind diese Interneuronenschaltkreise wichtig, um festzustellen, ob periphere Signale die Neuroachse hinaufsteigen, um das Gehirn zu erreichen und zur Schmerzwahrnehmung beizutragen ^5,6,7. Bisher haben die meisten Studien die Rolle von DH-Neuronen auf Einzelzell- oder Ganzorganismenebene untersucht, indem sie Kombinationen von intrazellulärer In-vitro-Elektrophysiologie, neuroanatomischer Markierung und In-vivo-Verhaltensanalyse ^{verwendet haben 1,3,8,9,10,11,12,13,14} . Diese Ansätze haben das Verständnis der Rolle bestimmter Neuronenpopulationen bei der Schmerzverarbeitung erheblich verbessert. Es bleibt jedoch eine Lücke im Verständnis, wie bestimmte Zelltypen und kleine Makroschaltkreise große Populationen von Neuronen auf Mikroschaltkreisebene beeinflussen, um anschließend die Ausgabe der DH, Verhaltensreaktionen und die Schmerzerfahrung zu beeinflussen.

Eine Technologie, die die Funktion von Makroschaltungen oder Mehrzellen untersuchen kann, ist das Mikroelektrodenarray (MEA) ^15,16. MEAs werden seit mehreren Jahrzehnten verwendet, um die Funktion des Nervensystems zu untersuchen^17,18. Im Gehirn haben sie das Studium der neuronalen Entwicklung, der synaptischen Plastizität, des pharmakologischen Screenings und der Toxizitätstests erleichtert^17,18. Sie können je nach Art der MEA sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Anwendungen eingesetzt werden. Darüber hinaus hat sich die Entwicklung von MEAs rasant weiterentwickelt, wobei verschiedene Elektrodennummern und -konfigurationen jetzt verfügbar^{sind 19}. Ein wesentlicher Vorteil von MEAs ist ihre Fähigkeit, die elektrische Aktivität in vielen Neuronen gleichzeitig mit hoher räumlicher und zeitlicher Genauigkeit über mehrere Elektroden zu bewerten^15,16. Dies bietet eine breitere Ablesung dessen, wie Neuronen in Schaltkreisen und Netzwerken, unter Kontrollbedingungen und in Gegenwart von lokal applizierten Verbindungen interagieren.

Eine Herausforderung bei In-vitro-DH-Präparaten besteht darin, dass die laufende Aktivität in der Regel niedrig ist. Hier wird diese Herausforderung in Rückenmark-DH-Schaltungen mit dem spannungsgesteuerten K⁺-Kanalblocker 4-Aminopryidin (4-AP) angegangen, um DH-Schaltkreise chemisch zu stimulieren. Dieses Medikament wurde zuvor verwendet^, um rhythmische synchrone elektrische Aktivität im DH von akuten Rückenmarksschnitten und unter akuten In-vivo-Bedingungen ^{20,21,22,23,24} zu etablieren. Diese Experimente haben Einzelzellpflaster und extrazelluläre Aufzeichnung oder Kalziumbildgebung verwendet, um die 4-AP-induzierte Aktivität^{20,21,22,23,24,25} zu charakterisieren. Zusammen hat diese Arbeit die Notwendigkeit einer exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Übertragung und elektrischer Synapsen für rhythmische 4-AP-induzierte Aktivität gezeigt. Daher wurde die 4-AP-Antwort als ein Ansatz angesehen, der native polysynaptische DH-Schaltkreise mit biologischer Relevanz und nicht als medikamenteninduziertes Epiphänomen entlarvt. Darüber hinaus zeigt die 4-AP-induzierte Aktivität ein ähnliches Ansprechprofil auf Analgetika und Antiepileptika wie neuropathische Schmerzzustände und wurde verwendet, um neuartige spinalbasierte Analgetika-Ziele wie die Connexine^20,21,22 vorzuschlagen.

Hier wird ein Präparat beschrieben, das MEAs und chemische Aktivierung des spinalen DH mit 4-AP kombiniert, um diese nozizeptive Schaltung auf der Makroschaltungs- oder Netzwerkebene der Analyse zu untersuchen. Dieser Ansatz bietet eine stabile und reproduzierbare Plattform für die Untersuchung nozizeptiver Schaltkreise unter naiven und neuropathischen "schmerzähnlichen" Bedingungen. Dieses Präparat ist auch leicht anwendbar, um die Wirkung bekannter Analgetika auf Schaltkreisebene zu testen und neuartige Analgetika im hyperaktiven Rückenmark zu screenen.

Es wurden Studien an männlichen und weiblichen c57Bl/6-Mäusen im Alter von 3-12 Monaten durchgeführt. Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Tierpflege- und Ethikkommission der University of Newcastle durchgeführt (Protokolle A-2013-312 und A-2020-002).

1. In-vitro-Elektrophysiologie

1. Herstellung von Lösungen für die Präparation und Aufzeichnung von Rückenmarksschnitten
   1. Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit
      HINWEIS: Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) wird in einer Grenzflächeninkubationskammer verwendet, in der die Scheiben bis zum Beginn der Aufzeichnung und während der Experimente als Perfusat und Verdünnungsmittel für Medikamente gelagert werden. Die detaillierte Zusammensetzung ist Tabelle 1 zu entnehmen.

Tabelle 1: Zusammensetzung der künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit Abkürzung: aCSF = künstliche Zerebrospinalflüssigkeit.

1. Es wird aCSF mit (in mM) 118 NaCl, 25_NaHCO3, 10 Glukose, 2,5 KCl, 1_NaH2PO4, 1 MgCl2 und 2,5 CaCl2 hergestellt, indem die erforderlichen Mengen der vorstehenden, ausgenommen _CaCl2, zu 2 L destilliertem Wasser hinzugefügt werden.
2. Die obige Lösung mit Carbogen (95%_O2, 5% CO 2) für 5 min blasen und CaCl₂ hinzufügen_.
   HINWEIS: Dieser Schritt verhindert CaCl_{2-Niederschlag} , d.h. die Lösung sollte nicht trüb werden. Für die Arzneimittelanwendung während der Experimente verdünnen Sie die Arzneimittelbestandslösungen in aCSF auf die gewünschten Endkonzentrationen.

2. Saccharose-substituierte künstliche Zerebrospinalflüssigkeit
   HINWEIS: Saccharose-substituiertes aCSF wird während der Dissektion und Rückenmarksschnitt verwendet. Wie der Name schon sagt, wird Saccharose durch NaCl ersetzt, um die neuronale Erregung während dieser Verfahren zu reduzieren und gleichzeitig die Osmolarität aufrechtzuerhalten. Die detaillierte Zusammensetzung ist Tabelle 1 zu entnehmen.
   1. Saccharose-substituierte aCSF mit (in mM) 250 Saccharose, 25_NaHCO3, 10 Glukose, 2,5 KCl, 1_NaH2PO4, 1 MgCl2 und 2,5 CaCl2 werden hergestellt, indem die erforderlichen Mengen aller oben genannten, ausgenommen _CaCl2, zu 300 ml destilliertem Wasser hinzugefügt werden.
   2. Blasen Sie die Lösung mit Carbogen für 5 min und fügen Sie dann CaCl₂ hinzu.
   3. Lagern Sie die Lösung in einem -80 °C Gefrierschrank für ca. 40 min oder bis die Lösung eine Aufschlämmung bildet. Vermeiden Sie das Einfrieren von Feststoffen und verwenden Sie sie in der Güllekonsistenz.

2. Vorbereitung von Mikroelektroden-Arrays
   HINWEIS: Die Kontaktfläche des MEA erfordert eine Vorbehandlung, um es hydrophil zu machen.
   1. Vor dem Experiment füllen Sie die MEA 30 min lang entweder mit fetalem Rinderserum (FBS) oder Pferdeserum (HS).
   2. Entfernen Sie das FBS oder HS und spülen Sie MEA gründlich mit etwa fünf Waschungen destilliertem Wasser ab, bis das destillierte Wasser nicht mehr schaumig ist. Füllen Sie den Brunnen mit aCSF, bereit für den Einsatz.
3. Akute Rückenmarksschnittvorbereitung
   HINWEIS: Die Vorbereitung der Rückenmarksschnitte der Maus ist wie zuvor von Smith et ^al.2 beschrieben. Idealerweise sollte die Entfernung der lumbosakralen Vergrößerung nicht länger als 8-10 Minuten dauern (Schritte 1.3.2-1.3.11 unten).
   1. Betäuben Sie die Maus tief mit 100 mg/kg Ketamin (i.p.) und enthaupten Sie sie dann mit einer großen chirurgischen Schere.
   2. Entfernen Sie die Haut über der Bauchregion, indem Sie einen kleinen Schnitt in der Haut auf Höhe der Hüften machen. Ziehen Sie die Haut auf beiden Seiten des Schnitts rostral, bis die gesamte Haut entfernt ist, d. H. Von der Oberseite des Brustkorbs bis zur Oberseite des Beckens (sowohl ventral als auch dorsal).
   3. Legen Sie den Körper auf Eis und verwenden Sie einen ventralen Ansatz, um die Wirbelsäule freizulegen, indem Sie alle Eingeweide entfernen und die Rippen seitlich zum Brustbein schneiden.
   4. Entfernen Sie den ventralen Brustkorb, beide Schulterblätter (bei etwa T2 abgeschnitten) und die unteren Gliedmaßen und das Becken (etwa an der Oberseite des Kreuzbeins abgeschnitten).
   5. Übertragen Sie die Wirbelsäule und die Rippenvorbereitung in ein Sezierbad, das eiskalte Saccharose aCSF enthält. Stecken Sie alle vier Ecken des Präparats (ventrale Oberfläche nach oben), indem Sie Stifte durch die unteren Rückenmuskeln und die befestigten oberen Rippen legen.
   6. Entfernen Sie alle Muskeln und Bindegewebe, die die ventrale Oberfläche der Wirbel mit Rongeurs überlagern, und identifizieren Sie die Wirbelregion über der lumbosakralen Vergrößerung, die ungefähr unter den T12- bis L2-Wirbelkörpern liegt.
   7. Entfernen Sie einen Wirbelkörper, der kaudal zur lumbosakralen Vergrößerungsregion ist, um den Zugang zum Rückenmark zu ermöglichen, während es im Wirbelkanal sitzt.
   8. Schneiden Sie mit einer gekrümmten Federschere die Wirbelstiele bilateral durch, während Sie den Wirbelkörper rostral anheben und ziehen, um die ventralen und dorsalen Aspekte der Wirbel zu trennen und das Rückenmark freizulegen.
   9. Sobald die Wirbelkörper entfernt wurden, um die lumbosakrale Vergrößerung zu enthüllen, reinigen Sie vorsichtig die verbleibenden Wurzeln, die das Rückenmark mit einer Federschere verankern, bis das Kord frei schwebt.
   10. Isolieren Sie das Rückenmark mit rostralen und kaudalen Schnitten weit über und unter der lumbosakralen Vergrößerung, so dass die Zielregion des Rückenmarks "frei schweben" kann.
       HINWEIS: Die bevorzugte Schnittausrichtung bestimmt, wie das Kabel anschließend zum Schneiden montiert wird (Abbildung 1).
   11. Für Querschnitte heben Sie das lumbosakrale Segment durch eine befestigte Wurzel an und legen Sie es auf einen vorgeschnittenen Polystyrolblock (Styropor) (1 cm x 1 cm x 1 cm) mit einem flachen Kanalschnitt in der Mitte. Verwenden Sie Cyanacrylat-Klebstoff (siehe Materialtabelle), um den Block und die Schnur an der Trennplattform zu befestigen und in das Schneidbad zu legen, das eiskalte Saccharose aCSF (Aufschlämmung) enthält.
       HINWEIS: Der flache Kanal hilft, das Rückenmark zu sichern und zu orientieren, wobei die Rückenseite freigelegt ist und das thorakale Ende des Schnabels am unteren Rand des Blocks liegt.
   12. Für sagittale Scheiben legen Sie eine dünne Linie von Cyanacrylat-Klebstoff auf die Trennplattform, heben Sie die lumbosakrale Vergrößerung durch eine befestigte Wurzel an und legen Sie die Schnur entlang der Leimlinie, um sicherzustellen, dass sich eine seitliche Oberfläche im Klebstoff befindet und die andere nach oben zeigt. Legen Sie es in das Schneidbad, das eiskalte Saccharose aCSF (Slurry) enthält.
   13. Für horizontale Scheiben eine dünne Linie aus Cyanacrylat-Klebstoff auf die Trennplattform legen. Heben Sie die lumbosakrale Vergrößerung durch eine befestigte Wurzel an und platzieren Sie die lumbosakrale Vergrößerung entlang der Klebstofflinie, um sicherzustellen, dass sich die ventrale Oberfläche im Klebstoff befindet und die dorsale Oberfläche nach oben zeigt. Verwenden Sie angebrachte Wurzeln, um das Kabel zu positionieren. Legen Sie es in das Schneidbad, das eiskalte Saccharose aCSF (Slurry) enthält.

Abbildung 1: Orientierungen der Rückenmarksschnitte, Montage- und Schneidmethoden. (A) Querschnitte erfordern einen Styropor-Schneidblock, in den eine Stütznut geschnitten ist. Das Rückenmark ruht gegen den Block in der Stütznut, die dorsale Seite des Rückenmarks zeigt vom Block weg. Block und Kordel werden mit Cyanacrylat-Klebstoff auf eine Schneidstufe geklebt. (B) Sagittal-Scheiben werden hergestellt, indem eine dünne Linie Cyanacrylat-Klebstoff auf die Schneidstufe aufgetragen und dann das Rückenmark auf der Seite auf dem Kleber positioniert wird. (C) Horizontale Scheiben werden hergestellt, indem eine dünne Linie Cyanacrylatkleber auf die Schneidstufe gelegt und dann die ventrale Seite des Rückenmarks nach unten auf dem Kleber positioniert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

14. Erhalten Sie 300 μm dicke Scheiben (L1-L5, gleiche Dicke unabhängig von der Ausrichtung) mit einem vibrierenden Mikrotom mit den folgenden Einstellungen: Geschwindigkeit 0,06 mm/s, Amplitude 2,50 mm und kalibriert auf eine Amplitudenabweichung von ±0,02 Höhe.
15. Übertragen Sie die Scheiben in eine Inkubationskammer mit Luftschnittstelle, die sauerstoffreiches aCSF enthält.
16. Lassen Sie die Scheiben vor der Aufnahme 1 h bei Raumtemperatur (20-24 °C) ausgleichen.

4. Mikroelektroden-Array-Aufnahmen
   HINWEIS: In den folgenden Schritten wird detailliert beschrieben, wie Sie Aufzeichnungsdaten aus MEA-basierten Experimenten auf Rückenmarksschnitten verwenden. Je nach Experiment können mehrere MEA-Designs verwendet werden. Designdetails für MEAs, die in diesen Experimenten verwendet wurden, sind in Tabelle 2 und Abbildung 2. Detaillierte Designinformationen wurden von Egert et al. veröffentlicht.²⁶ und Thiebaud et al.²⁷ für planare bzw. 3-dimensionale (3D) MEAs. Beide MEA-Typen bestehen aus 60 Titannitrid-Elektroden mit einer Siliziumnitrid-Isolierschicht sowie Titannitrid-Spuren und Kontaktpads.
   1. Versuchsaufbau
      1. Schalten Sie den Computer und die Schnittstellenkarte ein und starten Sie die Aufnahmesoftware.
      2. Laden Sie die vormontierte Aufzeichnungsvorlage (Abbildung 3A). Benennen Sie die Dateien für den Tag auf der Registerkarte Aufzeichnung.
      3. ACSF mit Carbogen (5% CO₂, 95%_O2) für die Dauer des Experiments kontinuierlich blasen.
      4. Schalten Sie das Perfusionssystem ein, das von einer Peristaltikpumpe gesteuert wird. Legen Sie die Einlassleitung in aCSF und das Einlassende in ein Abfallbecherglas. Grundieren Sie die Perfusionslinien mit aCSF.
      5. Bereiten Sie 4-AP und alle anderen Arzneimittellösungen vor, indem Sie die Bestände in 50 ml aCSF auf die erforderliche Endkonzentration (z. B. 200 μM für 4-AP) verdünnen.
      6. Legen Sie die Arzneimittellösungen in Medikamententöpfe und blasen Sie sie mit Carbogen auf.
   2. 4-AP-Aktivität
      1. Nach der Inkubation eine einzelne Scheibe aus dem Inkubator mit einer großspitzen Pasteur-Pipette übertragen, die mit aCSF gefüllt ist.
      2. Legen Sie das Segment in das MEA-Bohrloch und fügen Sie zusätzliches aCSF hinzu.
      3. Positionieren Sie die Scheibe mit einem feinen Kurzhaarpinsel über dem 60-Elektroden-Aufnahmefeld. Vermeiden Sie es, die Elektroden mit dem Pinsel zu berühren oder das Gewebe über die Elektroden zu ziehen, insbesondere wenn Sie 3D-Arrays verwenden.
         HINWEIS: Je nach MEA-Layout kann dies mit oder ohne Hilfe eines Mikroskops für eine genaue Positionierung erfolgen.
      4. Nachdem Sie die Scheibe positioniert haben, legen Sie ein gewichtetes Netz über das Gewebe, um es an Ort und Stelle zu halten und einen guten Kontakt mit MEA-Elektroden zu fördern.
         HINWEIS: Das Slice muss nach der Nettoplatzierung möglicherweise neu positioniert werden.
      5. Platzieren Sie die MEA in der Aufzeichnungskopfbühne (Abbildung 2A,B).
      6. Überprüfen Sie die Position des Gewebes über den Elektroden mit einem inversen Mikroskop (2-fache Vergrößerung), um zu bestätigen, dass sich so viele Elektroden wie möglich unter dem oberflächlichen DH (SDH) befinden. Stellen Sie sicher, dass mindestens 2-6 Elektroden den Schnitt nicht berühren, da diese Elektroden für die Subtraktion von Rauschen und die Aufzeichnung von Artefakten während der Analyse wichtig sind (Abbildung 2E).
      7. Schalten Sie die Kamera ein, schließen Sie sie an das Gerät an und nehmen Sie ein Referenzbild des Slices relativ zum MEA auf, das während der Analyse verwendet werden kann.
      8. Drücken Sie in der Aufzeichnungssoftware auf Datenerfassung starten , und vergewissern Sie sich, dass alle Elektroden ein klares Signal empfangen.
         HINWEIS: Wenn das Signal laut ist, lösen Sie die Kopfstufe und reinigen Sie sowohl die MEA-Kontaktpads als auch die Goldfederkontakte mit 70% Ethanol (verwenden Sie ein Labortuch, um sicherzustellen, dass die Pads und Kontakte nach der Reinigung trocken sind). Wenn das Signal immer noch verrauscht ist, schalten Sie die fehlerhaften Elektroden in der Aufnahmesoftware aus oder notieren Sie sich den Ausschluss später während der Analyse.
      9. Befestigen Sie die Perfusionseinlass- und -auslassleitungen an der MEA-Vertiefung (zuvor mit aCSF gefüllt) und schalten Sie das Perfusionssystem ein. Überprüfen Sie die Durchflussrate, idealerweise 4-6 Badvolumen pro Minute, und stellen Sie sicher, dass der Abfluss ausreicht, um einen Überlauf des Superfusats zu verhindern.
      10. Lassen Sie das Gewebe 5 Minuten lang ausgleichen und zeichnen Sie dann 5 Minuten rohe, ungefilterte Basisdaten auf.
      11. Verschieben Sie die Perfusionseinlassleitung von aCSF auf eine 4-AP-Lösung und warten Sie 12 Minuten, bis die 4-AP-induzierte rhythmische Aktivität einen stabilen Zustand erreicht hat (2 Minuten, bis Medikamente das Bad erreichen, und 10 Minuten, bis die Aktivität ihren Höhepunkt erreicht und dann ein Plateau erreicht).
      12. Zeichnen Sie 5 Minuten 4-AP-induzierte Aktivität auf. Seien Sie auf nachfolgende Aufnahmen vorbereitet, um die Medikamente zu testen oder die Stabilität von 4-AP zu überprüfen.

Tabelle 2: Layouts von Mikroelektrodenarrays

Abbildung 2: Gewebepositionierung auf dem Mikroelektrodenarray . (A) Das Bild zeigt eine offene MEA-Kopfbühne mit einem MEA in Position. (B) Wie A mit geschlossener MEA-Kopfstufe für Aufzeichnungen und vorhandenem Gewebeperfusionssystem. (C) Das Bild zeigt eine MEA, wie sie vom Hersteller geliefert wird. Gezeigt werden Kontaktpads, die mit den Goldfedern der Kopfbühne verbunden sind, und das MEA-Gewebebad, in dem sich die Gewebebadelösung und die Gewebescheibe befinden. Der Bereich, der durch das rote Quadrat in der Mitte hervorgehoben wird, ist die Position des Elektrodenarrays. (D) Die Schaltpläne zeigen die beiden in dieser Studie verwendeten MEA-Elektrodenkonfigurationen, wobei weitere Einzelheiten in Tabelle 2 dargestellt sind. Die Referenzelektrode ist durch das blaue Trapez gekennzeichnet. Das linke MEA-Elektrodenlayout zeigt eine quadratische Konfiguration mit 60 Elektroden, die am häufigsten in den vorgestellten Arbeitsmodellen 60MEA200/30iR-Ti mit Elektroden mit einem Durchmesser von 30 μm im Abstand von 200 μm oder 200 μm im Abstand und 100 μm im Abstand von 3-dimensionalen MEAs (60MEA200/12/50iR-Ti und 60MEA100/12/40iR-Ti) mit Elektroden mit einem Durchmesser von 12 μm und einer Höhe von entweder 50 μm oder 40 μm verwendet wird. beziehungsweise. Das linke MEA-Elektrodenlayout zeigt ein rechteckiges 6 x 10-Elektroden-Layout-60MEA500/30iR-Ti. (E) Hochvergrößerungsbild eines quadratischen MEA 60MEA100/12/40iR-Ti mit quer angeordnetem Rückenmarksschnitt für die Aufnahme. Die Scheibe sitzt auf den Elektrodenreihen 3-8. Die obere Reihe von Elektroden, die kein Gewebe berühren, dienen als Referenzelektroden. Der SDH-Bereich erscheint als halbtransparentes Band. In diesem Fall überlagert das SDH Elektroden in den Zeilen 4, 5 und 6 und den Spalten 2, 3, 4, 5 und 7 der MEA. Maßstabsleiste = 200 μm. Abkürzungen: MEA = Mikroelektrodenarray; SDH = oberflächliches Rückenhorn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

3. Ändern von Segmenten
   1. Nach jeder Aufnahmesitzung spülen Sie die Zeilen mit aCSF.
   2. Entfernen Sie die MEA von der Kopfbühne.
   3. Entfernen Sie das Netz und das Gewebe aus dem MEA-Brunnen, spülen Sie sie gut mit aCSF ab und wiederholen Sie die obigen Schritte mit einer neuen Scheibe.

2. Datenverarbeitung und -analyse

HINWEIS: In den folgenden Schritten wird beschrieben, wie die Analysesoftware für MEA-Experimente an Rückenmarksschnitten verwendet wird. Eine der 60 Elektroden dient als interne Referenz (markiert durch ein Trapez in Abbildung 2 C,D), während zwischen vier und fünfundzwanzig der verbleibenden 59 unter dem SDH in einer erwachsenen Maus-Rückenmarksscheibe positioniert sind. Die anschließende Analyse erkennt extrazelluläre Aktionspotential- (EAP) und lokale Feldpotentialwellenformen (LFP) (siehe Abbildung 3B für Beispiele) aus dem Rohsignal in diesem Bereich.

1. Rohdatenverarbeitung
   1. Öffnen Sie die Analysesoftware und laden Sie das vorgefertigte Analyselayout (Abbildung 3B).
   2. Öffnen Sie die Datei von Interesse und deaktivieren Sie die Referenzelektrode (Elektrode 15 in 8 x 8 MEA- oder Elektrode E1 in 6 x 10 MEA-Konfiguration) und alle Elektroden, die als übermäßig laut erachtet werden.
   3. Legen Sie das Zeitfenster für die Analyse fest (0:00 → 5:00 min).
   4. Wechseln zur Registerkarte Cross-channel filter Wählen Sie Komplexe Referenz und wählen Sie die Referenzelektroden basierend auf dem aufgenommenen Bild und den während des Experiments gemachten Notizen (d. h. den Elektroden, die nicht unter Gewebe liegen) aus. Um dies anzuwenden und zu überprüfen, drücken Sie Durchsuchen , bevor Sie fortfahren.
   5. Wechseln Sie zur Registerkarte EAP-Filter und wenden Sie einen Hochpass-Butterworth-Filter 2. Ordnung an (200 Hz abgeschnitten), um LFP-Aktivitäten zu^entfernen.
   6. Wechseln Sie zur Registerkarte LFP-Filter und wenden Sie einen Butterworth-Filter 2. Ordnung (Deltafrequenzen von 0,5-4 Hz) an, um EAP-Aktivitäten zu^entfernen.
   7. Wechseln Sie zur Registerkarte EAP-Detektor, und wählen Sie Automatischer Schwellenwert aus. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Steigende und fallende Kante und stellen Sie die Totzeit auf 0,5 ms ein.
   8. Legen Sie basierend auf den Daten positive und negative Schwellenwerte fest. Überprüfen Sie die Daten, indem Sie zum Bildschirm des Rohdatenanalysators zurückkehren, die Zeitmarkierung verschieben und dann zur Registerkarte EAP-Detektor zurückkehren und auf Durchsuchen klicken. Wiederholen Sie den Vorgang, bis Sie sich vergewissert haben, dass der eingestellte Erkennungsschwellenwert EAPs erfasst, ohne Rauschen/nicht-physiologische Aktivitäten zu erfassen. Verwenden Sie die Referenzelektroden, um Rauschen/nicht-physiologische Aktivität zu identifizieren.
      HINWEIS: Es muss sichergestellt werden, dass eine minimale Anzahl von EAPs in Referenzelektroden erkannt wird, in denen keine physiologische Aktivität auftritt. Eher geringfügige Abweichungen in der Baseline können jedoch fälschlicherweise als EAPs erkannt werden. Dies zielt gleichzeitig darauf ab, die Anzahl der in den aktiven Elektroden erkannten realen Ereignisse zu maximieren.
   9. Wechseln Sie zur Registerkarte LFP-Detektor, wählen Sie den manuellen Schwellenwert aus, aktivieren Sie die Kontrollkästchen Steigende und fallende Kante und stellen Sie die Totzeit auf 3 ms ein.
   10. Wiederholen Sie Schritt 2.1.8 für eine Elektrode, indem Sie eine Elektrode mit LFP-Aktivität auswählen. Wenn Sie zufrieden sind, wählen Sie Auf alle anwenden aus, da die Schwellenwerte nur auf eine einzelne Elektrode angewendet werden, wenn eine manuelle Schwellenwertierung durchgeführt wird.
   11. Beachten Sie bei der Untersuchung der LFP-Daten auf der Registerkarte Detektor die maximale Anzahl von Schwellenwertübergängen für die eine LFP-Wellenform und die maximale Zeittrennung der Schwellenübergänge für die eine LFP-Wellenform zur Verwendung in der späteren Analyse.
   12. Drücken Sie Analyse starten.
   13. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, wechseln Sie zur Registerkarte EAP Analyzer und exportieren Sie die Daten. Machen Sie dasselbe auf der Registerkarte LFP-Analysator .
   14. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle anderen Dateien aus demselben Segment.
   15. Konvertieren Sie die Dateien nach dem Datenexport in das xlsx-Format, damit sie vom verwendeten Programmierskript gelesen werden können. Benennen Sie die Dateien gemäß der folgenden Konvention, damit das bereitgestellte Skript sie lesen kann: Experimentname (z. B. Beispieldaten) - Slice-Nummer (z. B. S1) - Aufzeichnungsnummer (z. B. R1) - Aktivitätstyp (z. B. Spitzen oder SPs, entsprechend EAPs bzw. LFPs).
       HINWEIS: Die hier beschriebene EAP-Analyse behandelt Spiking aus einzelnen Kanälen als eine einzige Population, obwohl diese Aktivität üblicherweise von mehreren Neuronen in unmittelbarer Nähe der Aufzeichnungselektrode ausgehen würde. Wenn die Anzahl der Neuronen, die zu EAPs in einem Kanal beitragen, gewünscht wird, können an anderer Stelle beschriebene Multispike-Sortiertechniken angewendet werden, um verschiedene Populationen von Spikes basierend auf Wellenformmerkmalen^{zu unterscheiden 28}.

Abbildung 3: Datenaufzeichnungs- und Analysewerkzeuglayouts und Beispielaufzeichnungen von Mikroelektrodenarrays, die extrazelluläres Aktionspotential und lokale Feldpotentialwellenformen zeigen . (A) Der Schaltplan zeigt eine vorkonfigurierte Aufzeichnungsvorlage, die für die Erfassung von MEA-Daten verwendet wird. Durch die Verknüpfung des MEA2100 mit dem Aufzeichnungstool (Headstage/Verstärker) können die Daten benannt und gespeichert werden. Vier Beispielspuren von Rohdaten (rechts, 5-minütige Epochen) wurden von einem MEA-Kanal gesammelt, der die Aktivität zu Studienbeginn, 12 Minuten nach der 4-AP-Anwendung, weitere 15 Minuten nach der etablierten 4-AP-Aktivität und nach der Badanwendung von TTX (1 μM) zeigte. Beachten Sie, dass das Hinzufügen von 4-AP (zweite Spur) zu einem deutlichen Anstieg der Hintergrundgeräusche und der EAP / LFP-Aktivität führt. Wichtig ist, dass die Aktivität für mindestens 15 Minuten relativ stabil bleibt, nachdem eine 4-AP-induzierte Aktivität festgestellt wurde (dritte Spur). Durch die Zugabe von TTX (1 μM) wird die gesamte Aktivität aufgehoben (untere Spur). (B) Der Schaltplan (links) zeigt die Konfiguration der Analysesoftware für die Datenanalyse. Das Rohdaten-Explorer-Tool wird verwendet, um Aufzeichnungen zu importieren, die von der Aufzeichnungssoftware gesammelt wurden. Diese Daten werden dann durch ein Cross-Channel-Filterwerkzeug geleitet, das die ausgewählten Referenzelektrodensignale von anderen Elektroden subtrahiert, um Hintergrundgeräusche zu entfernen. Die Daten durchlaufen den EAP-Filter und die LFP-Filterwerkzeuge, um die Signal-Rausch-Beziehungen für jede Wellenform zu optimieren. Nach diesem Schritt gelangen die EAP-Pfaddaten in das EAP-Detektorwerkzeug, in dem Schwellenwerte festgelegt werden. EAPs werden erkannt und dann an das EAP-Analysetool gesendet, wo die Latenzen jedes Ereignisses aufgezeichnet und als txt exportiert werden. Datei. Ein identischer Workflow für LFP-Daten erfolgt unter Verwendung eines entsprechenden LFP-Toolkits. Rechte Spuren zeigen Daten von einem einzelnen MEA-Kanal, der verschiedene extrazelluläre Wellenformen enthält. Die Position von EAP- und LFP-Signalen wird in den obigen "Zählrastern" hervorgehoben. Untere Spuren sind Epochen aus der oberen Aufzeichnung (gekennzeichnet durch rote Balken), die Wellenformen auf einer erweiterten Zeitskala zeigen, einschließlich verschiedener LFP-Signale (beachten Sie die Vielfalt der Erscheinungen) und einzelner extrazellulärer EAPs (rote Kreise). Beachten Sie, dass LFP/EAP-Wellenform und Polarität relativ zur Anzahl der Neuronen, die diese Signale erzeugen, ihrer Nähe zur Aufnahmeelektrode und ihrer Position in Bezug auf die nahe gelegenen Elektroden, variieren. Abkürzungen: MEA = Mikroelektrodenarray; EAP = extrazelluläres Aktionspotential; LFP = lokales Feldpotential; 4-AP = 4-Aminopyridin; TTX = Tetrodotoxin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

2. Synchronitätsanalyse
   HINWEIS: Die Synchronizität oder die Anzahl der "zufälligen" Ereignisse zwischen zwei Elektroden wurde unter Verwendung des Koinzidenzkriteriums innerhalb der von Satuvuori et al. beschriebenen A-SPIKE-Synchronisationsmethode bestimmt. ²⁹. Das hier verwendete Skript vergleicht nur nebeneinander liegende Elektroden hinsichtlich ihrer Effizienz (d. h. horizontale, vertikale und diagonale Nachbarn); Das Skript könnte jedoch umgeschrieben werden, um bei Bedarf alle Elektroden zu vergleichen.
   1. Führen Sie die Datenanalyse mit einem benutzerdefinierten Programmierskript durch, das Latenzzeitstempel für jede Elektrode aus den .xlsx Dateien extrahiert.
      HINWEIS: Dies kann manuell erfolgen.
   2. Zeichnen Sie in Schritt 2.1.11 die maximale Anzahl von Schwellenübergängen und die maximale Zeittrennung der Schwellenübergänge für die eine LFP-Wellenform auf. Ändern Sie das Skript für die Eingabe dieser LFP-definierenden Parameter für jedes Segment, bevor Sie das Skript ausführen.
      HINWEIS: Schwellenwerte, die zuvor in der Analysesoftware durchgeführt wurden, erfassen EAPs eindeutig als ein einzelnes Ereignis. LFPs bestehen jedoch aus einer variablen Anzahl von Peaks, abhängig von der Form der Wellenform und der anschließenden Anzahl der Schwellenübergänge durch das eine Ereignis.
   3. Ändern Sie das Skript, um die gewünschten Elektroden vor der Analyse einzugeben.
   4. Um die Synchronizität zu bestimmen (definiert im Skript durch veränderbare Zeitrahmen für synchrone Aktivitäten), trennen und analysieren Sie die extrahierten Latenzen, um zufällige Ereignisse zu erkennen.
      HINWEIS: Das Skript lässt die maximale Zeit zwischen zufälligen Ereignissen zu. Diese sind auf 20 ms für EAPs und 200 ms für LFPs festgelegt.
   5. Führen Sie das Skript aus, um Latenzzeitstempel zu extrahieren.
      HINWEIS: Die .xlsx Ausgabedatei enthält die Interpretationen von Latenzdaten, bei denen es sich um EAP- und LFP-Anzahl, Frequenzen und gleichzeitige Ereigniszählungen für einzelne Elektroden und ganze Slices handelt. Diese Daten werden verwendet, um die Frequenz, die EAP/LFP-Zählung, die Anzahl der aktiven Elektroden, die Anzahl der gleichzeitig auftretenden Ereignisse, die Anzahl der verknüpften Elektroden und die durchschnittliche Stärke dieser Verbindungen zu bewerten.

Modell der Netzwerkaktivität im Rückenmark Rückenhorn
Die Anwendung von 4-AP induziert zuverlässig eine synchrone rhythmische Aktivität im Rückenmark DH. Solche Aktivitäten stellen sich als verstärkte EAPs und LFPs dar. Das spätere Signal ist eine niederfrequente Wellenform, die zuvor in MEA-Aufnahmen³⁰ beschrieben wurde. Veränderungen der EAP- und/oder LFP-Aktivität nach der Arzneimittelanwendung spiegeln eine veränderte neuronale Aktivität wider. Beispiele für UAP und LFPs sind in Abbildung 3B und Abbildung 4 dargestellt. Der Fokus liegt dabei auf den folgenden Parametern oder Merkmalen der EAP/LFP-Daten: Frequenz, Gesamtzählungen, aktive Elektrodenzählungen, Synchronizität, gekennzeichnet durch die Anzahl der über mehrere Elektroden detektierten koinzidenden auftretenden Ereignisse, Anzahl der verknüpften benachbarten Elektroden und die Stärke der Verbindungen zwischen benachbarten Elektroden. Repräsentative Ergebnisse sind in Tabelle 3 und Abbildung 3, Abbildung 4, Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7 und Abbildung 8 dargestellt. Sie zeigen einen signifikanten Anstieg aller gemessenen Parameter (alle p<0,001 durch gepaarten t-Test oder den nichtparametrischen Äquivalenttest von Wilcoxon Signed-Rank) sowohl für EAPs (Abbildung 5 und Abbildung 6) als auch für LFPs (Abbildung 7 und Abbildung 8) nach 4-AP-Stimulation und dann relative Stabilität für den Rest der Aufnahmen. Die Daten wurden vor der statistischen Analyse auf Normalität getestet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass 4-AP EAP- und LFP-Aktivität im Rückenmark DH induziert, und verschiedene Merkmale der Daten können aus den MEA-Aufzeichnungen extrahiert werden. Die Aktivität ist reproduzierbar, und ein Großteil der Aktivität, insbesondere für LFPs, ist rhythmisch und synchron.

Tabelle 3: 4-Aminopyridin-induzierte Aktivität. Alle werden als Mittel ± SEM dargestellt.

Abbildung 4: Beispielhafte extrazelluläre Aktionspotentialaktivität zu Studienbeginn. Panels zeigen EAP-Aktivitäten an (Aufzeichnungen stammen aus verschiedenen Slices). Die meisten Elektroden in einer bestimmten Slice-Aufzeichnung zeigten keine EAP-Basisaktivität (oberes Feld). Gelegentlich wurden zu Studienbeginn sporadische niederfrequente EAPs beobachtet, die möglicherweise mehrere Spike-Wellenformen enthielten (mittleres Panel). Hochfrequente EAP-Aktivität wurde selten in Aufzeichnungen zu Studienbeginn (unteres Panel) beobachtet. Insets zeigen einzelne EAPs aus entsprechenden Aufnahmen auf einer erweiterten Zeitskala. Abkürzung: EAP = extracellular action potential. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Segmentausrichtung
Die durch 4-AP aktivierte DH-Schaltung ist in allen drei Dimensionen verbunden. Daher ist die Scheibenorientierung ein wichtiger Aspekt für In-vitro-Präparate . Sagittales oder horizontales Schneiden kann für die Beobachtung der intersegmentalen Signalgebung bevorzugt sein, während transversale Schnitte die mediolaterale und dorsoventrale Konnektivität besser erhalten. Unter Berücksichtigung dieser Überlegungen ist zu erkennen, dass die 4-AP-Stimulation unabhängig von der Slice-Ausrichtung eine ähnliche rhythmische Aktivität im SDH induziert (siehe Abbildung 9).

Langzeitstabilität der 4-AP-induzierten Aktivität
Die Stabilität der 4-AP-induzierten Aktivität ist offensichtlich entscheidend bei der Untersuchung der Auswirkungen von angewandten Medikamenten. Daher wurde die Stabilität von 4-AP-induzierten Aktivitätsparametern charakterisiert, und dies ist in Abbildung 5, Abbildung 6, Abbildung 7 und Abbildung 8 und Tabelle 4 dargestellt. Alle Aktivitätsmerkmale sowie die Koinzidenz der Aktivität für LFPs waren stabil, basierend auf der Ähnlichkeit der 4-AP-induzierten Aktivität bei 12 min nach 4-AP-Anwendung und 15 min später (S>0,05). Andere LFP-Synchronitätsmerkmale, die Anzahl der verknüpften benachbarten Elektroden und die Verbindungsstärke zwischen benachbarten Elektroden nahmen über 15 Minuten ab (p = 0,016 bzw. p = 0,033), obwohl der Unterschied bescheiden war. Diese allmähliche Veränderung konnte leicht von den unmittelbareren Wirkungen eines Testmedikaments während pharmakologischer Studien unterschieden werden (siehe unten). Die Daten wurden vor statistischen Vergleichen auf Normalverteilung getestet und dann mit gepaarten t-Tests oder nicht-parametrischen Wilcoxon Signed-Rank-Tests bewertet.

Tabelle 4: 4-Stabilität der Aminopyridinaktivität. Alle werden als Mittel ± SEM dargestellt.

Pharmakologische Untersuchung von Aktivitätsmerkmalen
Um zu zeigen, dass MEA-aufgezeichnete 4-AP-induzierte Aktivität für pharmakologische Manipulationen leicht zugänglich ist, wurde die Abhängigkeit dieser Signale von der entladenen Wirkung hervorgehoben. Die Anwendung des spannungsgesteuerten Natriumkanalantagonisten Tetrodotoxin (TTX, 1 μM) beseitigte sowohl die EAP- als auch die LFP-Aktivität und bestätigte die Spike-Abhängigkeit dieser Signale. Beispielablaufverfolgungen sind in Abbildung 3A dargestellt. Dieses Ergebnis ist auch ein Beispiel für den Nutzen der Vorbereitung für zukünftige pharmakologische Untersuchungen, bei denen neuartige Verbindungen und etablierte Analgetika auf ihre Wirkung in aktivierten spinalen DH-Schaltkreisen untersucht werden können. Um die Relevanz der 4-AP-Aktivierung der DH-Netzwerke weiter zu beleuchten, wurde schließlich ein alternativer Ansatz erprobt, um eine moderate Depolarisierung des DH-Netzwerks zu erreichen. Bei diesem Ansatz wurde eine erhöhte Kaliumlösung (4,5 mM) aCSF-Lösung (Tabelle 1) im Bad aufgetragen und es wurde gezeigt, dass sie eine ähnliche DH-Reaktion auf die 4-AP-Stimulation hervorruft. Diese Manipulation rief eine LFP-Aktivität hervor, die die gleichen synchronen Eigenschaften wie 4-AP-induzierte Reaktionen aufwies (Abbildung 10), was auf einen ähnlichen Mechanismus und eine ähnliche zugrunde liegende Schaltung hindeutet.

Abbildung 5: Beispiel 4-Aminopyridin-induzierte extrazelluläre Aktionspotentialaktivität. (A) Rasterdiagramme zeigen die EAP-Aktivität von aktiven Kanälen, die zu Studienbeginn (oben) und an zwei Zeitpunkten (12 min - etabliert und 27 min) nach dem Hinzufügen von 4-AP (Mitte und unten) erkannt wurden. Vertikale blaue Fenster heben Perioden synchroner Aktivität (Schließlatenz) in mehr als 5 Aufzeichnungselektroden hervor. (B) Die Panels fassen die EAP-Aktivitätskartenanalyse von MEA-Daten zusammen. Das linke Schema zeigt die Ausrichtung der Rückenmarksscheibe relativ zum Elektrodenarray. Das mittlere linke Feld fasst die Aktivität zu Studienbeginn (aktive Elektroden rot gefärbt) und die EAP-Frequenz zusammen, die durch weiße Schattierung um aktive Elektroden angezeigt wird (Schattierungsintensität bedeutet erhöhte Aktivität). Das mittlere rechte Feld zeigt die Aktivität im selben Schnitt nach 12 Minuten 4-AP-Belichtung. Beachten Sie, dass die Anzahl der aktiven Elektroden (rot) zusammen mit der EAP-Frequenz zugenommen hat. Darüber hinaus wird die Synchronität zwischen benachbarten Elektroden durch rote Verbindungslinien angezeigt, wodurch eine Netzwerkkarte der Aktivität erzeugt wird (die Liniendicke bezeichnet den Grad der EAP-Ähnlichkeit zwischen den Elektroden). Das rechte Feld zeigt die Aktivität im selben Slice nach weiteren 15 Minuten 4-AP-Belichtung. Beachten Sie, dass die Anzahl der aktiven Elektroden (rot), der Grad der EAP-Aktivität (weiß) und die Netzwerkstruktur (rote Linien) in diesem Zeitraum stabil geblieben sind. Abkürzungen: 4-AP = 4-Aminopyridin; EAP = extrazelluläres Aktionspotential; MEA = Mikroelektroden-Array. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 6: Zusammenfassung der Gruppendaten der 4-Aminopyridin-induzierten extrazellulären Aktionspotentialaktivität. (A-F) Gruppendatendiagramme, die EAP-Eigenschaften aus mehreren Experimenten zusammenfassen, die mit den in Abbildung 4 dargestellten EAP-Daten identisch sind (Daten sind auch in Tabelle 3 und Tabelle 4 zusammengefasst). Die EAP-Frequenz (A), die Anzahl (B), die zufälligen Ereignisse (C), die aktiven Elektroden (D), die verknüpften Elektroden (E) und die durchschnittliche Verbindungsstärke (F) stiegen nach der Anwendung von 4-AP im Bad an und waren dann nach der Etablierung einer 4-AP-induzierten Aktivität für 15 Minuten stabil. Die Daten stammen aus 11 Experimenten (die Daten in Rot stammen aus dem Experiment in Abbildung 5). Abkürzungen: 4-AP = 4-Aminopyridin; EAP = extrazelluläres Aktionspotential. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: 4-Aminopyridin-induzierte lokale Feldpotentialaktivität. Die Daten sind wie in Abbildung 5 dargestellt, mit Ausnahme von LFP-Daten. (A) Rasterdiagramme zeigen LFP-Aktivität aus mehreren Kanälen, die zu Studienbeginn (oben) und an zwei Zeitpunkten (12 min - etabliert und 27 min) nach dem Hinzufügen von 4-AP (Mitte und unten) erkannt wurden. Vertikale blaue Fenster heben Perioden synchroner Aktivität (Schließlatenz) in mehr als 5 Aufzeichnungselektroden hervor. (B) Die Panels fassen die LFP-Aktivitätskartenanalyse von MEA-Daten zusammen. Das linke Schema zeigt die Ausrichtung der Rückenmarksscheibe relativ zum Elektrodenarray. Das mittlere linke Feld fasst die Aktivität zu Studienbeginn zusammen (aktive Elektroden rot gefärbt), wobei die minimale LFP-Frequenz durch weiße Schattierungen um aktive Elektroden angezeigt wird (die Schattierungsintensität bedeutet eine erhöhte Aktivität). Das mittlere rechte Feld zeigt die Aktivität im selben Schnitt nach 12 Minuten 4-AP-Belichtung. Die Anzahl der aktiven Elektroden (rot) und die LFP-Frequenz werden erheblich erhöht. Darüber hinaus zeigt die Synchronität zwischen benachbarten Elektroden (rote Verbindungslinien) eine starke Netzwerkkarte der LFP-Aktivität (die Liniendicke bezeichnet den Grad der Ähnlichkeit zwischen den Elektroden). Das rechte Feld zeigt die LFP-Aktivität im selben Slice nach weiteren 15 Minuten 4-AP-Belichtung. Beachten Sie, dass die Anzahl der aktiven Elektroden (rot), der Grad der LFP-Aktivität (weiß) und die Netzwerkstruktur (rote Linien) in diesem Zeitraum relativ stabil sind. Abkürzungen: 4-AP = 4-Aminopyridin; MEA = Mikroelektroden-Array; LFP = lokales Feldpotential. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 8: Zusammenfassung der Gruppendaten der 4-Aminopyridin-induzierten lokalen Feldpotentialaktivität. (A-F) Gruppendatendiagramme, die LFP-Eigenschaften aus mehreren Experimenten zusammenfassen, die mit den in Abbildung 7 dargestellten EAP-Daten identisch sind (die Daten sind auch in Tabelle 3 und Tabelle 4 zusammengefasst). LFP-Frequenz (A), Anzahl (B), koinzidente Ereignisse (C) und aktive Elektroden (D) waren 15 Minuten lang stabil, nachdem der 4-AP-Effekt seinen Höhepunkt erreicht hatte (Daten in Rot stammen aus dem Experiment in Abbildung 7). Die verknüpften Elektroden (E) und die durchschnittliche LFP-Verbindungsstärke (F) nahmen jedoch im Laufe der Zeit ab (beide p<0,05). Die Daten stammen aus 11 Experimenten (die Daten in Rot stammen aus dem Experiment in Abbildung 7). Abkürzungen: 4-AP = 4-Aminopyridin; LFP = lokales Feldpotential. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 9: 4-Aminopyridin-induziertes extrazelluläres Aktionspotential und lokale Feldpotentialaktivität in sagittalen und horizontalen Schnitten. Die Panels fassen die EAP- und LFP-Aktivität in der MEA-Netzwerkkartenanalyse der 4-AP-induzierten Signalgebung in sagittalen (A) und horizontalen (B) Rückenmarksschnitten zusammen. Schaltpläne (ganz links) zeigen die Ausrichtung von Rückenmarksschnitten relativ zu rechteckigen Elektrodenarrays. Linke Netzwerkkarten zeigen die EAP- und LFP-Basisaktivität in sagittalen (A) und horizontalen (B) Rückenmarksschnitten (aktive Elektroden sind rot, Frequenz durch weiße Schattierungsintensität und Synchronität zwischen benachbarten Elektroden durch rote Verbindungslinien mit Dicke, die den Grad der Synchronität angibt). Rechte Netzwerkkarten zeigen die EAP- und LFP-Aktivität in derselben Schicht nach 12 Minuten 4-AP-Exposition in sagittalen (A) und horizontalen (B) Rückenmarksschnitten. Beachten Sie die erhebliche Zunahme der Anzahl der aktiven Elektroden, der Aktivitätsfrequenz und der Synchronität dieser Signale nach 4-AP-Belichtung, wodurch Netzwerke in beiden Slice-Orientierungen demaskiert werden. Abkürzungen: MEA = Mikroelektrodenarray; EAP = extrazelluläres Aktionspotential; LFP = lokales Feldpotential; 4-AP = 4-Aminopyridin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 10: Erhöhte Kalium (hohe K⁺)-induzierte lokale Feldpotentialaktivität. Die Panels fassen die hohe K+ (4,5 mM⁾ aCSF-induzierte LFP-Aktivität zusammen. (A) Beispielspuren von einem MEA-Kanal zu Studienbeginn und nach der Badzugabe von hohem K⁺ aCSF (5-minütige Epochen). Die Erhöhung der K+-Konzentration führte zu einer klaren LFP-Aktivität, die zu Studienbeginn fehlte, ähnlich wie bei der ^{4-AP-Anwendung} (Abbildung 3). Inset zeigt eine LFP-Wellenform auf einer erweiterten Zeitskala. (B) Die Panels fassen die LFP-Netzwerkaktivität zusammen, die durch hohe K⁺ aCSF induziert wird. Das linke Schema zeigt die Ausrichtung der Rückenmarksschnitte relativ zu quadratischen Elektrodenarrays. Netzwerkkarten vergleichen die Basislinie und die hohe K⁺-evozierte LFP-Aktivität (aktive Elektroden rot, Frequenz durch weiße Schattierungsintensität und Synchronität zwischen benachbarten Elektroden durch rote Verbindungslinien mit Dicke, die den Grad der Synchronität angibt). Beachten Sie den erheblichen Anstieg der Anzahl der aktiven Elektroden, der Aktivitätsfrequenz und der Synchronität dieser Signale nach einer hohen K ⁺ aCSF-Exposition, wodurch das zugrunde liegende Netzwerk ähnlich wie bei 4-AP entlarvt wird. Abkürzungen: aCSF = künstliche Zerebrospinalflüssigkeit; MEA = Mikroelektroden-Array; EAP = extrazelluläres Aktionspotential; LFP = lokales Feldpotential; 4-AP = 4-Aminopyridin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Trotz der Bedeutung der spinalen DH für die nozizeptive Signalgebung, Verarbeitung und die daraus resultierenden Verhaltens- und emotionalen Reaktionen, die den Schmerz charakterisieren, bleiben die Schaltkreise in dieser Region schlecht verstanden. Eine zentrale Herausforderung bei der Untersuchung dieses Problems war die Vielfalt der Neuronenpopulationen, aus denen diese Schaltkreise^bestehen 6,31,32. Jüngste Fortschritte in transgenen Technologien, angeführt von Optogenetik und Chemogenetik, beginnen, diese wichtigen Verbindungen zu entwirren und die Mikroschaltkreise zu definieren, die sensorische Informationen verarbeiten 1,2,3,4,8,9,10,11,12,13,14 . Die Abstimmung, wie diese Mikroschaltkreise zusammenkommen, um die Aktivität in größeren Netzwerken von DH-Neuronen zu formen, bleibt eine Herausforderung, insbesondere für die Entwicklung neuer und wirksamerer Schmerzbehandlungen. Hier wird ein Funktionsmodell der DH-Aktivität beschrieben, die auf MEAs überwacht wird und 4-AP-stimulierte rhythmische Aktivität verwendet, um eine breitere Netzwerkkonnektivität zu untersuchen. Dieses Modell zeigt lokales extrazelluläres Spiking (EAPs) und größere netzwerkbasierte LFPs, die von der Entladung des Aktionspotentials abhängen und zur Abbildung von Änderungen der Netzwerkeigenschaften verwendet werden können. Durch die Kombination der Verwendung von MEAs zur Erleichterung der Schaltungsuntersuchung und 4-AP zur Aufdeckung der zugrunde liegenden Schaltkreise ermöglicht diese Vorbereitung, die DH-Schaltungsfunktion auf regionaler oder "makroskopischer" Ebene zu untersuchen.

Zu den Vorteilen des MEA/4-AP-Rückenmarksschnittmodells gehören eine strenge experimentelle Kontrolle eines In-vitro-Präparats , das einer detaillierten pharmakologischen Untersuchung zugänglich ist und eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung der neuronalen Aktivität von Individuum bietet, d. H. EAPs und LFPs über eine große Geweberegion und Mehrkanaldaten, die die Signalübertragung über Netzwerke und Regionen hinweg bewerten können. Wichtig ist, dass die 4-AP-induzierte rhythmische Aktivität zuverlässig und reproduzierbar ist und in verschiedenen Rückenmarksschnittorientierungen untersucht werden kann. Dieses Präparat hilft, die Lücke zwischen Einzelzell- und Ganztieruntersuchungen zu schließen und kann Veränderungen innerhalb dieser Schaltkreise sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen aufdecken. Die Auswirkungen verschiedener Medikamente auf die Netzwerkaktivität können ebenfalls bestimmt werden. Somit könnte diese Plattform als Screening-Tool für die Untersuchung der Wirkung bestehender und neuartiger Analgetika auf DH-Schaltkreisen dienen.

Es gibt mehrere kritische Schritte in diesem Protokoll. Erstens ist eine sorgfältige Gewebevorbereitung der Schlüssel zur Herstellung von Scheiben, die für Experimente geeignet und unabhängig von der Schichtorientierung empfindlich auf 4-AP reagieren. Hier wird eine Reihe von Ressourcen hervorgehoben, die detaillierte Informationen und Ratschläge zur Fehlerbehebung enthalten. Kurz gesagt, Genauigkeit bei der Herstellung von Lösungen, schnelle, aber sorgfältige Dissektion des Rückenmarks, optimierte Schnittparameter zur Minimierung von Gewebekompression und -schädigung sowie Sorgfalt beim Transfer von Scheiben an jedem Punkt sind wichtige Faktoren in der Vorbereitungsphase. Der sorgfältige Umgang mit MEAs, insbesondere in unmittelbarer Nähe zu den Elektroden, ist der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Funktion dieser Komponenten. Die optimale Position des DH über der maximalen Anzahl von MEA-Elektroden ist wichtig, um die Aufzeichnungsausbeute jedes Experiments zu erhöhen. Bei der Verwendung von 3D-MEAs sind mehr Sorgfalt und Übung erforderlich, insbesondere beim Positionieren und Entfernen von Scheiben. Es ist einfach, das Gewebe über hervorstehende MEA-Elektroden zu ziehen und die zukünftige Verwendung zu beeinträchtigen.

Es gibt einige Vorbehalte zu dem hier beschriebenen Ansatz. Anders als bei Einzelzellaufzeichnungen, bei denen die Identität der untersuchten Neuronen entweder durch genetische Markierung oder Post-hoc-Immunmarkierung bestimmt werden kann, kann die genaue Quelle der von MEAs detektierten elektrischen Signale nicht bestimmt werden. Eine weitere Herausforderung ist das Niveau der Baseline-Aktivität in Rückenmarksschnitten. Obwohl einige Berichte tonal aktive DH-Neuronen zu Studienbeginn beschreiben, ist die jüngste Arbeit in jungem neonatalem Gewebe^33,34. Darüber hinaus wird die Tonikaaktivität, die in adultem Gewebe berichtet wird, typischerweise mit einer Suchstrategie aufgezeichnet, bei der Elektroden vorgeschoben werden, um diese Aktivität zuerst zu identifizieren und dann zu untersuchen³⁵. Wenn ein unvoreingenommener Probenahmeansatz verwendet wird, bei dem die Aufzeichnung vor der Beurteilung der Aktivität erstellt wird, zeigen weniger als 20% der erwachsenen DH-Neuronen einen anhaltenden Anstieg (28/150 Aufzeichnungen), und eine regelmäßige Entladung wurde nur in 2% dieser Zellen beobachtet (3/^150)36.

Angesichts dieses Verhältnisses und der festen Natur der Elektroden im Verhältnis zu einer Gewebescheibe ist es nicht verwunderlich, dass nur wenige MEA-Elektroden (~ 2 Elektroden / Schicht in diesen MEAs) zu Studienbeginn eine Aktivität aufweisen. Dieser Mangel an Aktivität ist der Hauptgrund, warum die hier beschriebene Methode darin besteht, Slices mit 4-AP zu stimulieren, um EAPs und hervorgerufene LFP-Aktivität zu verbessern. Dieser Ansatz basiert auf der Verwendung von 4-AP zur Aktivierung der rhythmischen Schaltkreisaktivität in vielen In-vitro-Präparaten, von der Untersuchung epileptiformer Mechanismen im Kortex und Hippocampus bis hin zur fiktiven lokomotorischen Aktivität im ventralen Horn des Rückenmarks^37,38,39. Eine umfangreiche Literatur hebt auch hervor, dass 4-AP Aktivität induziert, die auf oberflächliche ^{DH-Schaltkreise} in Wirbelsäulenschnitten beschränkt ist, und von exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Übertragungen sowie elektrischen Synapsen ^{abhängt 20,21,22}. Darüber hinaus führt die In-vivo-4-AP-Verabreichung zu einem dosisabhängigen Anstieg der rezeptiven Felder von DH-Neuronen, ohne die Reaktionen auf eine abgestufte Stimulation in der zentralen rezeptiven Zone zu verändern oder degenerierte Reaktionen zu verursachen²⁴. Schließlich kann gesehen werden, dass eine moderate Depolarisation dieser Schaltkreise durch Erhöhung der extrazellulären Kaliumionenkonzentration auch eine vergleichbare LFP-Aktivität erzeugt. Zusammen unterstützen diese Beobachtungen die Ansicht, dass 4-AP funktional relevante Netzwerke innerhalb des oberflächlichen DH demaskiert, die mit MEAs untersucht werden können. Schließlich ist die genaue Quelle der LFP-Aktivität unklar, obwohl angenommen wird, dass diese Wellenformen eine Summe der Aktivität darstellen, die von mehreren Neuronen erkannt wurde, die eine Elektrode umgeben. Sie können sich auf die Berstaktivität in Neuronen beziehen oder daraus resultieren oder synaptischen Potentialen^{entsprechen 30}. Unabhängig von ihrer Herkunft können die Eigenschaften von LFPs innerhalb und zwischen den Slices (multiple recordings/drug applications) verglichen werden, was eine wertvolle Ablesung der Schaltungs- und Netzwerkfunktion ermöglicht.

Die Art der In-vitro-Schneidepräparate verdient ebenfalls eine Überlegung, mit der möglichen Störung neuronaler Schaltkreise und der Schädigung von Zellen auf der Schnittoberfläche. Trotzdem bietet das Schneiden des Gewebes einen direkteren elektrischen Zugang zu den relevanten DH-Schaltkreisen und einen ununterbrochenen pharmakologischen Zugang. Diese experimentellen Vor- und Nachteile sollten sorgfältig abgewogen werden, wobei betont werden sollte, wie wichtig es ist, die Slice-Orientierung zu berücksichtigen, um die Konnektivität in den interessierenden Netzwerken maximal zu erhalten. Für die überwiegende Mehrheit der in dieser Arbeit vorgestellten Daten werden die medial-laterale Ausbreitung der Aktivität innerhalb des dorsalen Horns und die intrinsische Konnektivität der Neuronen in dieser Region dargestellt. Zur Untersuchung der rostro-kaudalen Aktivitätsausbreitung wird durch die Verwendung von sagittalen oder horizontalen Schnitten vorzugsweise die Konnektivität zwischen den Wirbelsäulensegmenten aufrechterhalten, wie in Abbildung 9 dargestellt.

Darüber hinaus ist es unvermeidlich, dass das Schneiden des Rückenmarks zu einem gewissen Grad an der Oberfläche der Scheiben führt. Die Minimierung dieses Schadens geht auf die sorgfältige Vorbereitung des Gewebes, das Schneiden von Parametern - einschließlich langsamer Vorschubgeschwindigkeit und hochfrequenter Klingenschwingungen - und Lösungen und Bedingungen zurück, die während dieses Prozesses neuroprotektiv sind. Eine detaillierte Bewertung des Nutzens verschiedener Erkrankungen für die Gesundheit von Rückenmarksschnitten^{wurde zuvor veröffentlicht 40}. Ungeachtet der potenziellen Auswirkungen der Slice-Integrität auf MEA-Aufzeichnungen stellt die interne Konsistenz bei den Slice-Vorbereitungsverfahren sicher, dass sich dieser Faktor gleichermaßen auf die Ergebnisse eines Datasets auswirkt. Es sollte auch beachtet werden, dass MEA-Elektroden Signale aufnehmen, die etwa 30-100 μm von der Aktivitätsquelle entfernt entstehen. Da die beschädigte Schnittoberfläche wahrscheinlich die oberste Zellschicht von etwa 15-30 μm überspannt, können die Auswirkungen von Slicing-bedingten Schäden auf MEA-Aufzeichnungen verwaltet und gemildert werden, um dennoch wertvolle Datensätze und Erkenntnisse über die DH-Netzwerkaktivität zu erhalten^15,41.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der hier beschriebene MEA / 4-AP-Rückenmarksschnittansatz eine Plattform für das Verständnis der Konnektivität von DH-Schaltkreisen bietet und wie die Netzwerke, die sie bilden, die Verarbeitung von Wirbelsäulenschmerzen vorantreiben. Es besteht auch Potenzial für eine weitere methodische Erweiterung in Bezug auf Analyseparameter, Netzwerkstimulationsquelle und ihre Fähigkeit, als Plattform für pharmakologisches Screening oder die Verwendung mit Modellen pathologischer Schmerzen verwendet zu werden.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Diese Arbeit wurde vom National Health and Medical Research Council (NHMRC) of Australia (Zuschüsse 631000, 1043933, 1144638 und 1184974 an B.A.G. und R.J.C.) und dem Hunter Medical Research Institute (Zuschuss an B.A.G. und R.J.C.) finanziert.