微小電極アレイを用いた脊髄侵害受容回路におけるネットワーク活動の記録

脊髄後角におけるネットワークレベルの侵害受容活性を調査するための微小電極アレイ技術と4-アミノピリジン誘発化学刺激の併用が概説される。

脊髄後角(DH)内の特定のタイプのニューロンの役割と接続性は、脊髄疼痛処理を支える回路のますます詳細なビューを提供するために、急速に描写されています。しかし、DHにおけるより広範なネットワーク活動に対するこれらの接続の効果は、ほとんどの研究が単一のニューロンおよび小さな微小回路の活動に焦点を当てているため、あまりよく理解されていないままである。あるいは、多くの細胞にわたる電気的活動を監視できる微小電極アレイ(MEA)の使用は、神経活動の高い空間的および時間的分解能を提供する。ここでは、4-アミノピリジン(4-AP)でDH回路を化学的に刺激することによって誘導されるDH活性を研究するために、マウス脊髄スライスを有するMEAの使用が記載されている。結果として生じるリズミカル活性は、表在DHに制限され、経時的に安定し、テトロドトキシンによって遮断され、異なるスライス配向で調査することができる。一緒に、この調製物は、ナイーブ動物、慢性疼痛の動物モデル、および遺伝的に変更された侵害受容機能を有するマウスからの組織におけるDH回路活性を調査するためのプラットフォームを提供する。さらに、4-AP刺激脊髄スライスにおけるMEA記録は、脊髄DHにおける活性を破壊する新規抗侵害受容性化合物の能力を評価するための迅速なスクリーニングツールとして使用することができる。

脊髄DH内の特定のタイプの抑制性および興奮性介在ニューロンの役割は、急速な速度で明らかにされている^1,2,3,4。一緒に、介在ニューロンはDHのニューロンの95%以上を占め、侵害受容を含む感覚処理に関与しています。さらに、これらのニューロン間回路は、末梢信号が神経軸を上昇して脳に到達し、痛みの知覚に寄与するかどうかを決定するために重要である⁵、^6、7。今日まで、ほとんどの研究は、in vitro細胞内電気生理学、神経解剖学的標識、およびin vivo行動分析の組み合わせを用いて、単一細胞または生物全体の分析のいずれかでDHニューロンの役割を調査してきた1,3,8,9,10,11,12,13,14 .これらのアプローチは、疼痛処理における特定のニューロン集団の役割の理解を著しく進歩させた。しかし、特定の細胞型と小さなマクロ回路が、マイクロ回路レベルでニューロンの大規模な集団にどのように影響し、その後DHの出力、行動応答、および疼痛経験を形成するかを理解するには、ギャップが残っています。

マクロ回路または多細胞レベルの機能を調査できる技術の1つは、微小電極アレイ(MEA)^15,16である。MEAは、数十年にわたって神経系の機能を調査するために使用されてきました^17,18。脳内では、ニューロン発生、シナプス可塑性、薬理学的スクリーニング、毒性試験の研究が容易になりました^17,18。これらは、MEAの種類に応じて、インビトロおよびインビボの両方の用途に使用できます。さらに、MEAの開発は急速に進化しており、さまざまな電極番号と構成が利用可能になりました¹⁹。MEAの主な利点は、複数の電極を介して高い空間的および時間的精度で多くのニューロンにおける電気的活動を同時に評価する能力である^15,16。これは、ニューロンが回路およびネットワーク内で、制御条件下で、局所的に適用された化合物の存在下でどのように相互作用するかのより広範な読み出しを提供する。

in vitroDH製剤の1つの課題は、進行中の活性レベルが典型的には低いことである。ここでは、この課題は、DH回路を化学的に刺激するために電位依存性K⁺チャネル遮断薬である4-アミノプリイジン(4-AP)を使用する脊髄DH回路で対処されています。この薬剤は、以前は急性脊髄スライスのDHにおいて、および急性in vivo条件下でのリズミカルな同期電気的活性を確立するために使用されてきた²⁰、²¹、^22、23、24。これらの実験は、4−AP誘導活性20、²¹、22、²³、^24、25を特徴付けるために^、単一細胞パッチおよび細胞外記録またはカルシウムイメージングを用いてきた。一緒に、この研究は、リズミカルな4-AP誘導活性のための興奮性および抑制性のシナプス伝達および電気シナプスの要件を実証した。したがって、4-AP応答は、薬物誘発性エピ現象としてではなく、生物学的関連性を有する天然の多シナプスDH回路を覆い隠すアプローチとして見なされてきた。さらに、4-AP誘導活性は、神経因性疼痛状態として鎮痛薬および抗てんかん薬に対して同様の応答プロファイルを示し、コネキシンなどの新規な脊髄ベースの鎮痛薬標的を提案するために使用されている^20、21、22。

ここでは、MEAsと脊髄DHの化学的活性化を4-APと組み合わせて、この侵害受容回路をマクロ回路またはネットワークレベルの分析で研究する調製物が記載されている。このアプローチは、素朴で神経因性の「痛みのような」条件下で侵害受容回路を調査するための安定した再現可能なプラットフォームを提供する。この調製物はまた、既知の鎮痛薬の回路レベルの作用を試験し、亢進性脊髄における新規鎮痛薬をスクリーニングするためにも容易に適用可能である。

生後3~12ヶ月の雄および雌のc57Bl/6マウスについて研究を行った。すべての実験手順は、ニューカッスル大学の動物ケアおよび倫理委員会(プロトコルA-2013-312、およびA-2020-002)に従って実施した。

1. 体外 電気生理学

1. 脊髄スライス調製および記録のための溶液の調製
   1. 人工脳脊髄液
      注:人工脳脊髄液(aCSF)は、インターフェースインキュベーションチャンバ内で使用され、スライスは記録が開始されるまで、および実験中に薬物の灌流液および希釈液の両方として保存される。詳細な組成については、 表1 を参照してください。

表1:人工脳脊髄液組成物。 略語: aCSF = 人工脳脊髄液.

1. 2 Lの蒸留水に、118NaCl、25 NaHCO3、10 グルコース、2.5 KCl、1 NaH_2PO4、1 MgCl₂、および 2.5_CaCl2 を含む aCSF (mM 単位) を調製します。
2. 上記の溶液をカルボゲン(95%O2、5%CO2)で5分間泡立て、_CaCl2を加える_。
   注:このステップはCaCl₂ の降水を防ぎます、すなわち、溶液は曇ってはなりません。実験中の薬物適用のために、薬物ストック溶液を所望の最終濃度にaCSFで希釈する。

2. スクロース置換人工脳脊髄液
   注:スクロース置換aCSFは、解剖および脊髄スライス中に使用される。名前が示すように、スクロースは、浸透圧を維持しながら、これらの手順中のニューロン興奮を減少させるためにNaClに置換される。詳細な組成については、 表1 を参照してください。
   1. 250個のスクロース、25個のNaHCO3、10個のグルコース、2.5個のKCl、1NaH2PO4、1MgCl2、および2.5個の_CaCl2を含むスクロース置換aCSFを、_CaCl2を除く上記の全ての必要量を300mLの蒸留水に添加して調製する。
   2. 溶液をカルボゲンで5分間泡立ててから、_CaCl2を加える。
   3. 溶液を-80°Cの冷凍庫に約40分間、または溶液がスラリーを形成するまで保管する。固体の凍結を避け、スラリー状の一貫性の中で使用してください。

2. 微小電極アレイ作製
   注:MEAの接触面は、親水性にするために前処理が必要です。
   1. 実験の前に、MEAをウシ胎児血清(FBS)または馬血清(HS)のいずれかで30分間よく満たします。
   2. FBSまたはHSを取り出し、蒸留水が泡立たなくなるまで、約5回の蒸留水でMEAを十分にすすいでください。井戸をaCSFで満たし、すぐに使用できます。
3. 急性脊髄スライス調製
   注:マウス脊髄スライス調製は、Smithらによって以前に記述された^{とおりである2}。理想的には、腰仙骨拡大の除去は8〜10分以内で完了する必要があります(以下のステップ1.3.2〜1.3.11)。
   1. マウスを100mg/kgのケタミン(i.p.)で深く麻酔し、大きな外科用はさみを使って断頭します。
   2. 腰の高さで皮膚に小さな切り込みを入れて、腹部の上の皮膚を取り除きます。すべての皮膚が取り除かれるまで、すなわち胸郭の上部から骨盤の上部(腹側および背側の両方)まで、切り込みの両側の皮膚を吻側に引っ張る。
   3. 体を氷の上に置き、腹側アプローチを使用して、すべての内臓を除去し、胸骨の横方向の肋骨を切断することによって、椎骨柱を露出させる。
   4. 腹側胸郭、肩甲骨(約T2で切断)、および下肢および骨盤(仙骨のほぼ上部で切断)の両方を除去する。
   5. 椎骨柱および肋骨調製物を氷冷スクロースaCSFを含む解剖浴に移す。下背筋と取り付けられた上肋骨を通してピンを配置して、準備の4つの角(腹面を上向き)すべて固定します。
   6. 椎骨の腹側表面を覆っているすべての筋肉および結合組織をロンガーで取り除き、T12〜L2椎体体のほぼ下にある腰仙骨拡大上の椎体領域を特定する。
   7. 腰仙骨拡大領域の尾側にある椎体を取り除き、脊髄が椎体管にあるときに脊髄へのアクセスを提供します。
   8. 湾曲したスプリングはさみを使用して、椎骨の腹側と背側の側面を分離し、脊髄を露出させるために、椎体を吻側に持ち上げて引っ張りながら、椎体椎弓根を両側に切断する。
   9. 脊椎体が取り除かれて腰仙骨の拡大が現れたら、脊髄を固定している残りの根をスプリングハサミで慎重に取り除き、コードが自由に浮かぶまで取り除きます。
   10. 腰仙骨の拡大の上下に吻側と尾側の切り込みで脊髄を隔離し、コードの標的領域を「自由に浮かせる」ようにします。
       メモ:スライスの向きによって、その後のセクショニングのためにコードをどのように取り付けるかが決まります(図1)。
   11. 横方向のスライスの場合は、腰仙骨セグメントを取り付けた根で持ち上げ、中央に浅いチャネルがカットされたあらかじめカットされたポリスチレン(発泡スチロール)ブロック(1 cm x 1 cm x 1 cm)の上に置きます。シアノアクリレート接着剤( 材料表を参照)を使用して、ブロックとコードをセクショニングプラットフォームに取り付け、氷冷スクロースaCSF(スラリー)を含む切断浴に入れます。
       メモ:浅いチャネルは、背側が露出し、コードの胸端がブロックの下部にある状態で、脊髄を固定して方向付けするのに役立ちます。
   12. 矢状スライスの場合は、セクショニングプラットフォーム上にシアノアクリレート接着剤の細い線を置き、取り付けられた根で腰仙骨の拡大を持ち上げ、接着剤の線に沿ってコードを置き、一方の側面が接着剤にあり、他方が上を向いていることを確認します。それを氷冷スクロースaCSF(スラリー)を含む切断浴に入れる。
   13. 水平スライスの場合は、シアノアクリレート接着剤の細い線をセクショニングプラットフォームに置きます。取り付けられた根で腰仙骨拡大を持ち上げ、腹側表面が接着剤にあり、背側表面が上を向いていることを確認しながら、腰仙骨拡大を接着剤の線に沿って配置します。取り付けられた根を使用してコードを配置します。それを氷冷スクロースaCSF(スラリー)を含む切断浴に入れる。

図1:脊髄スライスの向き、取り付け方法、切断方法 (A)横方向スライスには、支持溝がカットされた発泡スチロール切断ブロックが必要です。脊髄は支持溝内のブロックに対して置かれ、コードの背側はブロックから離れて向いている。ブロックとコードは、シアノアクリレート接着剤で切断ステージに接着されています。(B)矢状スライスは、切断ステージ上にシアノアクリレート接着剤の細い線を置き、次いで脊髄を接着剤上のその側面に置くことによって調製される。(C)水平スライスは、切断ステージ上にシアノアクリレート接着剤の細い線を置き、次いで脊髄腹側を接着剤の上に下方に置くことによって調製される。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

14. 振動ミクロトームを使用して、厚さ300 μmのスライス(L1-L5、向きに関係なく同じ厚さ)を、速度0.06 mm/s、振幅2.50 mm、高さ±0.02以内に較正した振幅偏差で取得します。
15. スライスを酸素化aCSFを含む空気界面インキュベーションチャンバに移す。
16. 記録する前に、スライスを室温(20-24°C)で1時間平衡化させます。

4. 微小電極アレイ記録
   注: 次の手順では、脊髄スライスで MEA ベースの実験からのレコード データを使用する方法を詳しく説明します。実験に応じていくつかのMEA計画を使用できます。これらの実験で使用したMEAの設計の詳細は、 表 2 そして 図2.詳細な設計情報は、Egertらによって公開されている。²⁶ とティーボーら²⁷ 平面 MEA と 3 次元 (3D) MEA にそれぞれ使用します。どちらのMEAタイプも、窒化シリコン絶縁層と窒化チタントラックとコンタクトパッドを備えた60個の窒化チタン電極で構成されています。
   1. 実験セットアップ
      1. コンピュータとインタフェースボードの電源を入れ、録音ソフトウェアを起動します。
      2. 組み立て済みの記録テンプレートをロードします(図3A)。[レコーダー] タブでその日のファイルに名前を付けます。
      3. 実験の期間中、カルボゲン(5%_CO2、95%_O2)でaCSFを連続的にバブル化した。
      4. 蠕動ポンプによって制御される灌流システムをオンにします。入口ラインをaCSFに置き、入口端を廃棄物ビーカーに入れます。aCSFで灌流ラインをプライムします。
      5. ストックを50mLのaCSFで必要な最終濃度(例えば、4-APの場合は200μM)に希釈することによって、4-APおよび他の薬物溶液を調製する。
      6. 薬液を薬のポットに入れ、カルボゲンで泡立てます。
   2. 4 AP アクティビティ
      1. インキュベーションに続いて、aCSFで満たされた大きな先端パスツールピペットを用いてインキュベーターから単一のスライスを移す。
      2. スライスをMEAウェルに配置し、aCSFを追加します。
      3. スライスを60電極の記録アレイの上に、細い短いヘアペイントブラシを使用して配置します。特に3Dアレイを使用する場合は、電極をペイントブラシに接触させたり、電極を横切って組織をドラッグしたりしないでください。
         メモ:MEAレイアウトに応じて、これは正確な位置決めのために顕微鏡の助けを借りるかどうかにかかわらず行うことができます。
      4. スライスを位置決めした後、組織の上に加重ネットを置き、所定の位置に保持し、MEA電極との良好な接触を促進します。
         メモ: スライスは、ネット配置後に再配置が必要な場合があります。
      5. MEAを記録ヘッドステージに置きます(図2A、B)。
      6. 倒立顕微鏡(倍率2倍)を使用して電極上の組織の位置を確認し、できるだけ多くの電極が表層DH(SDH)の下にあることを確認します。これらの電極は、ノイズを減算し、解析中のアーティファクトを記録するために重要であるため、少なくとも2〜6個の電極がスライスに接触 していない ことを確認してください(図2E)。
      7. カメラの電源を入れ、デバイスに接続し、解析中に使用するためにMEAを基準にしたスライスの参照画像を撮影します。
      8. 録音ソフトウェアの スタートDAQ を押し、すべての電極がクリア信号を受信していることを確認します。
         メモ:信号にノイズがうるさい場合は、ヘッドステージのクリップを外し、MEAコンタクトパッドとゴールドスプリングコンタクトの両方を70%エタノールでクリーニングします(クリーニング後にパッドとコンタクトが乾いていることを確認するために、実験室用ワイプを使用してください)。信号がまだノイズが多い場合は、記録ソフトウェアの誤動作している電極をオフにするか、後で分析中に除外できるようにメモしておきます。
      9. 灌流入口と出口のラインをMEAウェル(以前はaCSFで満たされていた)に取り付け、灌流システムをオンにします。流量、理想的には毎分4〜6個の浴容積を確認し、流出が超溶融物のオーバーフローを防ぐのに十分であることを確認してください。
      10. 組織を 5 分間平衡化してから、フィルター処理されていない生のベースライン データを 5 分間記録します。
      11. 灌流入口ラインをaCSFから4-AP溶液に移動し、4-AP誘発リズミカル活性が定常状態に達するまで12分間待ちます(薬物が浴槽に到達するには2分間、活性がピークに達してからプラトーに達するには10分間)。
      12. 4-AP誘導活性の5分間を記録する。薬物をテストしたり、4-APの安定性を確認したりするために、その後の録音に備えてください。

表2:微小電極アレイのレイアウト

図2:微小電極アレイ上の組織位置決め(A)画像は、MEAを所定の位置に配置した開いたMEAヘッドステージを示しています。(B)MEAヘッドステージを閉じて記録し、組織灌流システムを配置したAと同じ。(C)画像は、製造元から提供されたMEAを示しています。ヘッドステージの金バネとインターフェースするコンタクトパッド、および組織入浴液および組織スライスを保持するMEA組織浴が示されている。中央の赤い四角で強調表示されている領域が電極アレイの位置です。(D)回路図は、この研究で使用された2つのMEA電極構成を示し、さらに詳細を表2に示す。参照電極は青色台形によって示される。左側のMEA電極レイアウトは、直径12μm、高さ50μmまたは40μmの電極を備えた直径30μmの電極、または200μm間隔および100μmの間隔をあけた3次元MEA(60MEA200/12/50iR-Tiおよび60MEA100/12/40iR-Ti)を備えた、提示されたワークモデル60MEA200/30iR-Tiで最も使用される60電極の正方形構成を示し、 それぞれ。左側のMEA電極レイアウトは、6 x 10電極長方形レイアウト-60MEA500/30iR-Tiを示しています。(E)60MEA100/12/40iR-Ti正方形MEAの高倍率画像で、横方向の脊髄スライスが記録用に配置されている。スライスは電極列3〜8の上に座る。どの組織にも接触しない電極の一番上の列は、参照電極として機能します。SDH 領域は半透明のバンドとして表示されます。この場合、SDH は MEA の行 4、5、および 6 および列 2、3、4、5、および 7 の電極を覆います。スケールバー = 200 μm。略語:MEA=微小電極アレイ;SDH = 表在性背角。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. スライスの変更
   1. 各記録セッションの後、aCSFでラインをすすぎます。
   2. ヘッドステージからMEAを取り外します。
   3. MEAウェルからネットと組織を取り出し、aCSFでよくすすぎ、新しいスライスで上記の手順を繰り返します。

2. データの処理と分析

注:次の手順では、脊髄スライスのMEA実験に分析ソフトウェアを使用する方法を詳しく説明します。60個の電極のうちの1個は内部基準( 図2の C、Dでは台形によってマークされる)として機能し、残りの59個のうち4個から25個は成体マウスの脊髄スライスのSDHの下に位置する。その後の解析では、この領域の生信号から細胞外活動電位(EAP)および局所電界電位(LFP)波形(例については 図3B を参照)を検出します。

1. 生データ処理
   1. 解析ソフトウェアを開き、あらかじめ作成された解析レイアウトをロードします(図3B)。
   2. 目的のファイルを開き、参照電極 (8 x 8 MEA の電極 15 または 6 x 10 MEA 構成の電極 E1) と、ノイズが多すぎると見なされる電極の選択を解除します。
   3. 分析のタイム ウィンドウを設定します (0:00 → 5:00 分)。
   4. 「クロスチャンネルフィルター」タブに移動します。[複雑な参照]を選択し、実験中に撮影した画像とメモ(つまり、組織の下にない電極)に基づいて参照電極を選択します。これを適用して確認するには、続行する前に [探索] を押します。
   5. EAP フィルター タブに移動し、2^次ハイパス バターワース フィルター (200 Hz カットオフ) を適用して LFP アクティビティを削除します。
   6. LFP フィルタタブに移動し、2^次バンドパスバターワースフィルタ(デルタ周波数 0.5 ~ 4 Hz)を適用して EAP アクティビティを削除します。
   7. [EAP 検出器] タブに移動し、[自動しきい値] を選択します。「立ち上がり」と「立ち下がり」のエッジボックスにチェックマークを付け、「デッドタイム」を 0.5 ミリ秒に設定します。
   8. データに基づいて 正 と 負のしきい値 を設定します。データを検査するには、[ 生データ アナライザー ] 画面に戻り、タイム マーカーを移動してから、[ EAP 検出器 ] タブに戻り、[ 探索] を押します。設定された検出しきい値が、ノイズ/非生理学的活性をキャプチャせずにEAPをキャプチャしていることが満たされるまで繰り返します。参照電極を使用して、ノイズ/非生理学的活動を特定します。
      注:生理活性が発生しない参照電極で検出されるEAPの数は最小限に抑える必要があります。ただし、ベースラインのわずかな偏差が EAP として誤って検出される可能性があります。これは、活性電極で検出される実事象の数を最大化することを依然として目指している。
   9. LFP検出器タブに移動し、手動しきい値を選択し、立ち上がりエッジボックスと立ち下がりエッジボックスにチェックマークを付け、デッドタイムを3ミリ秒に設定します。
   10. LFP 活性のある電極を選択して、1 つの電極に対して手順 2.1.8 を繰り返します。満足したら、[ すべてに適用] を選択すると、しきい値は手動しきい値を設定するときに単一の電極にのみ適用されます。
   11. [検出器]タブでLFPデータを調べる際に、1つのLFP波形のスレッショルド交差の最大数と、後の解析で使用するために1つのLFP波形のスレッショルド交差の最大時間分離に注意してください。
   12. [分析の開始] を押します。
   13. 分析が完了したら、[ EAP アナライザー ] タブに移動し、データをエクスポートします。 LFPアナライザ タブで同じ操作を行います。
   14. 同じスライスの他のすべてのファイルに対して、このプロセスを繰り返します。
   15. データのエクスポート後に、ファイルを xlsx 形式に変換して、使用するプログラミング スクリプトで読み取れるようにします。提供されたスクリプトがファイルを読み取るための次の規則に従ってファイルに名前を付けます:実験名(例:サンプルデータ) - スライス番号(例:S1) - 記録番号(例:R1) - アクティビティタイプ(例:スパイクまたはSP、それぞれEAPまたはLFPに対応します)。
       注:ここで説明するEAP分析は、この活動が記録電極に近接した複数のニューロンから一般的に生じるにもかかわらず、個々のチャネルからのスパイクを単一の集団として扱います。チャネル内のEAPに寄与するニューロンの数が望まれる場合、他の箇所で説明したマルチスパイクソーティング技術を適用して、波形特性²⁸に基づいてスパイクの別個の集団を区別することができる。

図3:データ記録および解析ツールのレイアウト、および細胞外活動電位および局所電界電位波形を示すマイクロ電極アレイ記録の例。 (A)回路図は、MEAデータの取得に使用される事前設定された記録テンプレートを示しています。MEA2100と記録(ヘッドステージ/アンプ)ツールをリンクすることで、データに名前を付けて保存することができます。生データの4つのサンプルトレース(右、5分エポック)を、ベースラインでの活性、4-AP適用後12分、確立された4-AP活性の15分後、およびTTX(1μM)の浴適用後を示す1つのMEAチャネルによって収集された。4-AP(2 番目のトレース)を追加すると、バックグラウンド ノイズと EAP/LFP アクティビティが明らかに増加します。重要なことに、活性は、4−AP誘導活性が確立されてから少なくとも15分間、比較的安定なままである(第3の痕跡)。TTX(1 μM)を添加すると、すべての活性が消失する(ボトムトレース)。(B)回路図(左)は、データ解析用の分析ソフトウェア構成を示しています。生データエクスプローラツールは、記録ソフトウェアによって収集された記録をインポートするために使用されます。これらのデータは、選択した参照電極の信号を他の電極から減算してバックグラウンドノイズを除去するクロスチャネルフィルタツールを介して実行されます。データはEAPフィルタとLFPフィルタツールを通過し、各波形の信号対ノイズ関係を最適化します。この手順の後、EAP パス データは、しきい値が設定されている EAP 検出器ツールに入ります。EAP が検出され、EAP アナライザー ツールに送信され、各イベントの待機時間が記録され、txt としてエクスポートされます。ファイル。LFP データに対して、対応する LFP ツールキットを使用して同一のワークフローが発生します。右のトレースは、さまざまな細胞外波形を含む単一のMEAチャネルからのデータを示しています。EAP信号とLFP信号の位置は、上記の「カウントラスター」で強調表示されています。下のトレースは、さまざまなLFP信号(さまざまな外観に注意してください)や個々の細胞外EAP(赤い円)を含む、拡張されたタイムスケールの波形を示す上部記録(赤いバーで示されます)からのエポックです。LFP/EAPの波形と極性は、これらの信号を生成するニューロンの数、記録電極への近接度、および近くの電極に対するニューロンの位置に応じて変化することに注意してください。略語:MEA=微小電極アレイ;EAP = 細胞外活動電位;LFP = 局所場電位;4-AP=4-アミノピリジン;TTX = テトロドトキシン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. シンクロニシティ分析
   注:同期性、または2つの電極間の「一致」事象の数は、Satuvuoriらによって概説されたA-PIKE同期法内の一致基準を使用して決定された 。²⁹. ここで使用されるスクリプトは、効率のために互いに隣接する電極(すなわち、水平、垂直、および対角線の隣人)を比較するだけです。ただし、必要に応じてスクリプトを書き換えて、すべての電極を比較することができます。
   1. カスタムプログラミングスクリプトを使用してデータ分析を実行し、.xlsxファイルから各電極のレイテンシタイムスタンプを抽出します。
      メモ: これは手動で行うことができます。
   2. ステップ2.1.11で、1つのLFP波形のスレッショルド交差の最大数とスレッショルド交差の最大時間分離を記録します。スクリプトを実行する前に、スライスごとにこれらの LFP 定義パラメータを入力するスクリプトを変更します。
      注: 以前に分析ソフトウェアで実行されていたしきい値設定では、EAP が 1 つのイベントとして明確にキャプチャされます。しかし、LFPは、波形の形状と、1つの事象によるその後の閾値交差の数に応じて可変数のピークで構成される。
   3. 解析前に目的の電極を入力するようにスクリプトを変更します。
   4. 同期性 (同期アクティビティが発生するための変更可能な時間枠によってスクリプトで定義される) を判断するには、抽出された待機時間を分離して分析し、一致するイベントを検出します。
      メモ: このスクリプトでは、一致イベント間の最大時間を設定できます。これらは、EAP の場合は 20 ミリ秒、LFP の場合は 200 ミリ秒に設定されます。
   5. スクリプトを実行して、待機タイムスタンプを抽出します。
      メモ: .xlsx出力ファイルには、個々の電極とスライス全体の EAP および LFP カウント、頻度、および一致イベントカウントなどのレイテンシデータの解釈が含まれています。これらのデータは、周波数、EAP/LFP数、アクティブ電極数、一致イベント数、リンクされた電極の数、およびこれらのリンケージの平均強度を評価するために使用されます。

脊髄後角におけるネットワーク活動モデル
4-APの適用は、脊髄DHにおける同期リズミカルな活動を確実に誘導する。このようなアクティビティは、EAP および LFP の増加として表示されます。後述の信号は、MEA記録³⁰において既に説明した低周波波形である。薬物適用後のEAPおよび/またはLFP活性の変化は、神経活動の変化を反映する。EAP および LFP の例を図 3B および図 4 に示します。ここでは、EAP/LFPデータの次のパラメータまたは特徴に焦点を当てています:周波数、総数、アクティブ電極数、複数の電極にわたって検出された一致イベントの数、リンクされた隣接する電極の数、および隣接する電極間の結合の強さによって特徴付けられる同期性。代表的な結果を表3及び図3、図4、図5、図6、図7、及び図8に示す。 彼らは、4-AP刺激後のEAP(図5および図6)およびLFP(図7および図8)の両方について測定されたすべてのパラメータ(対応のあるt検定またはWilcoxon Signed-Rankノンパラメトリック等価検定によるすべてのp<0.001)の有意な増加を示し、その後、残りの記録について相対安定性を示した。データは、統計分析の前に正規性について検定された。要約すると、4−APは脊髄DHにおけるEAPおよびLFP活性を誘導し、MEA記録からデータの様々な特徴を抽出することができる。この活性は再現性があり、特にLFPの場合、活性の多くはリズミカルで同期的である。

表3:4-アミノピリジン誘導活性。 すべてSEM±手段として提示されます。

図4:模範的ベースライン細胞外活動電位活性。 パネルには EAP アクティビティが表示されます (記録は異なるスライスからのものです)。所与のスライス記録におけるほとんどの電極は、ベースラインEAP活性を示さなかった(上パネル)。低周波散発性EAPはベースラインで時折観察され、複数のスパイク波形を含む可能性があります(中央パネル)。高頻度EAP活性は、ベースライン(下パネル)での記録ではめったに観察されなかった。インセットには、対応する録画の個々の EAP が拡張されたタイムスケールで表示されます。略語:EAP = 細胞外活動電位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

スライスの向き
4-AP によってアクティブ化される DH 回路は、3 次元すべてで接続されます。したがって、スライス配向は、 in vitro 調製物にとって重要な考慮事項である。矢状または水平スライスは、セグメント間シグナル伝達を観察するために優先的であり得るが、横スライスは、中側および背腹側の接続性をよりよく保持する。これらの考察を考慮すると、4-AP刺激は、スライスの向きに関係なく、SDHにおいて同様のリズミカル活性を誘導することがわかる( 図9参照)。

4-AP誘導活性の長期安定性
4-AP誘導活性の安定性は、適用薬物の効果を研究する際に明らかに重要である。したがって、4−AP誘導活性パラメータの安定性が特徴付けられ、これを図 5、 図6、図 7、ならびに図 8 および 表4に提示する。すべての活性特性とLFPの活性の一致は、4-AP適用後12分と15分後における4-AP誘導活性の類似性に基づいて安定していた(p>0.05)。他のLFP同期性特性、リンクされた隣接電極の数、および隣接する電極間のリンケージ強度は、差はわずかであったが、15分にわたって減少した(それぞれp=0.016およびp=0.033)。この漸進的な変化は、薬理学的研究中の試験薬のより直接的な作用と容易に区別することができる(下記参照)。データは、統計的比較の前に正規分布について検定され、必要に応じて対応のある t検定またはノンパラメトリックWilcoxon符号順位検定を使用して評価されました。

表4:4-アミノピリジン活性安定性。 すべてSEM±手段として提示されます。

活性特性の薬理学的調査
MEA記録された4-AP誘導活性が薬理学的操作に容易に順応可能であることを実証するために、これらのシグナルの活動電位放電に対する依存性が強調された。電位依存性ナトリウムチャネルアンタゴニストであるテトロドトキシン(TTX、1μM)の浴中適用は、EAPおよびLFP活性の両方を消失させ、これらのシグナルのスパイク依存性を確認した。トレースの例を 図 3A に示します。この結果はまた、活性化脊髄DH回路におけるそれらの作用について新規化合物および確立された鎮痛薬が評価され得る将来の薬理学的調査のための調製物の有用性の例を提供する。最後に、DHネットワークの4-AP活性化の関連性をさらに明らかにするために、DHネットワークの控えめな脱分極を達成するために代替アプローチが試みられた。このアプローチでは、上昇したカリウム(4.5 mM)aCSF溶液(表1)を浴中適用し、4-AP刺激に対して同様のDH応答を誘発することが示された。この操作は、4-AP誘導応答と同じ同期特性を特徴とするLFP活性を誘発し(図10)、同様のメカニズムと基礎となる回路を示唆しています。

図5:実施例4-アミノピリジン誘導細胞外活動電位活性。 (A) ラスター プロットは、ベースライン (上) と 4-AP の浴加後の 2 つの時点 (12 分 - 確立、および 27 分) で検出されたアクティブ チャネルからの EAP アクティビティを示します。垂直の青いウィンドウは、5つ以上の記録電極における同期(クローズレイテンシ)アクティビティの期間を強調表示します。(B)パネルは、MEAデータのEAP活動マップ分析を要約する。左の概略図は、電極アレイに対する脊髄スライスの向きを示す。中央左パネルは、ベースライン(赤色の活性電極)および活性電極の周囲に白い網かけで示されるEAP周波数(網かけ強度は活性の増加を示す)における活性を要約する。中央の右パネルは、4-AP 曝露の 12 分後の同じスライス内のアクティビティを示しています。アクティブ電極(赤)の数はEAP周波数とともに増加していることに注意してください。さらに、隣接する電極間の同期は赤色の接続線で示され、活性のネットワークマップを生成する(線の太さは電極間のEAP類似性の程度を示す)。右側のパネルは、さらに15分間の4-AP曝露後の同じスライス内の活性を示す。活性電極の数(赤色)、EAP活性度(白色)、およびネットワーク構造(赤色の線)は、この期間にわたって安定していることに注意してください。略語:4-AP=4-アミノピリジン;EAP = 細胞外活動電位;MEA = 微小電極アレイ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

(A-F)図4に提示されたEAPデータと同一のいくつかの実験からのEAP特性を要約したグループデータプロット(データは表3および表4にも要約されている)。EAP周波数(A)、カウント(B)、一致事象(C)、活性電極(D)、リンク電極(E)、および平均リンケージ強度(F)は、4-APの浴適用後に上昇し、その後、4-AP誘導活性の確立後15分間安定であった。データは11回の実験からのものです(赤色のデータは図5の実験からのものです)。略語:4-AP=4-アミノピリジン;EAP = 細胞外活動電位。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:4-アミノピリジン誘導局所電界電位活性。 LFP データを除き、データは 図 5 のように表示されます。(A) ラスター プロットは、ベースライン (上) と 4-AP の浴加後の 2 つの時点 (12 分 - 確立、および 27 分) で検出された複数のチャネルからの LFP アクティビティを示します。垂直の青いウィンドウは、5つ以上の記録電極における同期(クローズレイテンシ)アクティビティの期間を強調表示します。(B)パネルは、MEAデータのLFP活動マップ分析を要約する。左の概略図は、電極アレイに対する脊髄スライスの向きを示す。中央左パネルは、ベースライン(赤色の活性電極)における活性を要約し、活性電極の周囲に白い網かけで示される最小のLFP頻度(陰影強度は活性の増加を示す)を有する。中央の右パネルは、4-AP 曝露の 12 分後の同じスライス内のアクティビティを示しています。活性電極の数(赤色)およびLFP周波数は実質的に増加する。さらに、隣接する電極間の同期(赤色の接続線)は、LFP活性の強いネットワークマップを示す(線の太さは電極間の類似性の程度を示す)。右側のパネルは、さらに15分間の4-AP曝露後の同じスライスにおけるLFP活性を示す。活性電極の数(赤色)、LFP活性の程度(白色)、および網目構造(赤色の線)は、この期間にわたって比較的安定していることに注意してください。略語:4-AP=4-アミノピリジン;MEA = 微小電極アレイ;LFP = 局所場電位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

(A-F)図7に提示されたEAPデータと同一のいくつかの実験からのLFP特性を要約したグループデータプロット(データは表3および表4にも要約されている)。LFP周波数(A)、カウント(B)、一致事象(C)、および活性電極(D)は、4-AP効果がピークに達した後15分間安定していた(赤色のデータは図7の実験からのものである)。しかしながら、連結電極(E)および平均LFP結合強度(F)は、経時的に減少した(共にp<0.05)。データは11回の実験からのものである(赤色のデータは図7の実験からのものである)。略語:4-AP=4-アミノピリジン;LFP = 局所場電位。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:矢状および水平スライスにおける4-アミノピリジン誘発細胞外活動電位および局所電界電位活性。 パネルは、矢状(A)および水平(B)脊髄スライスにおける4-AP誘導シグナル伝達のMEAネットワークマップ解析におけるEAPおよびLFP活性を要約する。回路図(左端)は、矩形の電極アレイに対する脊髄スライスの向きを示しています。左のネットワークマップは、矢状(A)および水平(B)脊髄スライスにおけるベースラインEAPおよびLFP活性を示す(活性電極は赤色、白色のシェーディング強度で示される頻度、および隣接する電極間の同期は、同期の程度を示す厚さを有する赤色の接続線による)。右側のネットワーク マップは、矢状(A)および水平(B)脊髄スライスで 4-AP ばく露を 12 分間行った後の同じスライス内の EAP と LFP のアクティビティを示しています。4-AP ばく露後のアクティブ電極の数、活動頻度、およびこれらの信号の同期が大幅に増加し、両方のスライス方向でネットワークのマスクが解除されることに注意してください。略語:MEA=微小電極アレイ;EAP = 細胞外活動電位;LFP = 局所場電位;4-AP=4-アミノピリジン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図10:カリウム(高K⁺)誘発性局所電界電位活性の上昇。 パネルは、高いK⁺ (4.5mM)aCSF誘導LFP活性を要約する。(A)例:ベースラインおよび高K⁺ aCSF(5分エポック)の浴添加後の1つのMEAチャネルからのトレース。K⁺ 濃度の上昇は、ベースライン時には存在しなかった明確なLFP活性を生じ、4-APアプリケーションで見られるものと同様であった(図3)。インセットは、拡張されたタイムスケールでのLFP波形を示しています。(B)パネルは、高いK⁺ aCSFによって誘導されるLFPネットワーク活性を要約する。左の概略図は、正方形電極アレイに対する脊髄スライスの向きを示す。ネットワークマップは、ベースラインと高いK⁺誘発LFP活性(活性電極は赤色、頻度は白色のシェーディング強度で示され、隣接する電極間の同期は赤色の接続線と厚さは同期の程度を示す)を比較します。高いK ⁺ aCSF曝露後の活性電極の数、活性頻度、およびこれらの信号の同期の大幅な増加に注意し、4-APと同様の方法で基礎となるネットワークをマスク解除する。MEA = 微小電極アレイ;EAP = 細胞外活動電位;LFP = 局所場電位;4-AP=4-アミノピリジン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

侵害受容性シグナル伝達、処理、および痛みを特徴付ける結果として生じる行動的および感情的応答における脊髄DHの重要性にもかかわらず、この領域内の回路はほとんど理解されていないままである。この問題を調査する上での重要な課題は、これらの回路^6,31,32を構成するニューロン集団の多様性であった。光遺伝学と化学遺伝学に牽引されたトランスジェニック技術の最近の進歩は、これらの重要なつながりを解き明かし始めており、感覚情報を処理する微小回路を定義し始めています1,2,3,4,8,9,10,11,12,13,14 .これらの微細回路がどのように一緒になってDHニューロンのより大きなネットワークにおける活性を形成するかを調整することは、特に新しくより効果的な疼痛治療を開発するために、依然として困難である。ここでは、MEA上でモニタリングされ、より広範なネットワーク接続性を研究するために4-AP刺激リズミカル活性を使用するDH活性の機能モデルが記載されている。このモデルは、活動電位放電に依存し、ネットワーク特性の変化をマッピングするために使用することができる局所細胞外スパイキング(EAP)およびより大きなネットワークベースのLFPを明らかにする。この準備により、回路調査を容易にするためのMEAと基礎となる回路を明らかにするための4-APの使用を組み合わせることにより、DH回路機能を地域的または「巨視的」レベルで研究することができます。

MEA/4-AP脊髄スライスモデルの利点には、詳細な薬理学的調査に適しており、神経活動個体の高い空間的および時間的分解能、すなわち、大きな組織領域にわたるEAPおよびLFPおよびネットワークおよび領域にわたるシグナル伝達を評価できるマルチチャネルデータを提供する 、in vitro 製剤の厳密な実験的制御が含まれる。重要なことに、4-AP誘導性リズミカル活性は信頼性が高く、再現性があり、異なる脊髄スライスの向きで研究することができる。この調製は、単一細胞および全動物調査の間のギャップを埋めるのに役立ち、正常および病理学的状態の両方でこれらの回路内の変化を明らかにすることができる。ネットワーク活性に対する様々な薬物の効果も決定することができる。したがって、このプラットフォームは、DH回路上の既存および新規鎮痛薬の作用を調査するためのスクリーニングツールとして機能する可能性がある。

このプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。まず、慎重な組織調製は、スライスの向きに関係なく、実験に適しており、4-APに敏感なスライスを製造するための鍵です。ここでは、詳細な情報とトラブルシューティングのアドバイスを提供する多くのリソースが強調表示されています。簡単に言えば、溶液を作る際の精度、脊髄の迅速かつ細心の注意を払った解剖、組織の圧縮と損傷を最小限に抑えるための最適化されたスライスパラメータ、および任意の時点でスライスを移す際の注意はすべて、準備段階の重要な要素です。MEAの慎重な取り扱いは、特に電極に近接している場合、これらのコンポーネントの機能を維持するための鍵です。最大数のMEA電極にわたるDHの最適位置は、各実験の記録収率を増加させるために重要である。3D MEA を使用する場合は、特にスライスの位置決めと削除を行う際に、より多くの注意と練習が必要です。突出したMEA電極に組織をドラッグし、将来の使用を損なうのは簡単です。

ここで説明するアプローチにはいくつかの注意点があります。研究中のニューロンの同一性が遺伝子標識または事後免疫標識のいずれかを使用して決定され得る単一細胞記録とは異なり、MEAによって検出された電気信号の正確な源を決定することはできない。もう一つの課題は、脊髄スライスにおけるベースライン活性のレベルである。ベースライン時に強壮的に活性なDHニューロンを記載する報告もあるが、最新の研究は若年新生児組織^33,34である。さらに、成人組織において報告された強直活性は、典型的には、電極が最初にこの活性を同定し次いで研究するために進行される探索戦略を用いて記録される³⁵。活性を評価する前に記録を確立するバイアスのないサンプリングアプローチを使用すると、成体DHニューロンの20%未満が継続的なスパイクを示し(28/150記録)、定期的な排出はこれらの細胞の2%(3/150)でしか観察されなかった³⁶。

この比率と、組織スライスに対する電極の固定された性質を考えると、ベースラインで活性を示すMEA電極(これらのMEAでは〜2電極/スライス)がほとんどないことは驚くことではありません。この活性の欠如は、ここで説明する方法が、EAPおよび誘発されたLFP活性を増強するために4-APでスライスを刺激することを含む主な理由である。このアプローチは、皮質および海馬におけるてんかん様メカニズムの研究から脊髄の腹角における架空の自発運動活動まで、多くのin vitro調製物におけるリズミカル回路活性を活性化するための4-APの使用に基づいている³⁷、^38、39。広範な文献はまた、4-APが脊椎スライスの表面DH回路に限定された活性を誘導し、興奮性および抑制性のシナプス伝達ならびに電気シナプスに依存することを強調している^20,21,22。さらに、インビボ4−AP投与は、中枢受容ゾーンにおける段階的刺激に対する応答を変化させることなく、または縮退応答を引き起こすことなく、DHニューロン受容野の用量依存的増加を生じる²⁴。最後に、細胞外カリウムイオン濃度の上昇によるこれらの回路の適度な脱分極も同等のLFP活性を生じることがわかる。これらの観測結果をまとめれば、4-AP が MEA で研究できる表面 DH 内の機能的に関連するネットワークを覆い隠すという見解が裏付けられています。最後に、LFP活性の正確な原因は不明であるが、これらの波形は、電極を囲む複数のニューロンから検出された活性の総和を表すと考えられている。それらは、ニューロンにおけるバースト活動に関連するか、またはニューロンから生じるか、またはシナプス電位に対応し得る³⁰。その起源に関係なく、LFPの特性はスライス内およびスライス間(複数の記録/薬物アプリケーション)で比較でき、回路およびネットワーク機能の貴重な読み出しを提供します。

in vitroスライス調製物の性質も考慮する必要があり、ニューロン回路の破壊およびスライス表面上の細胞への損傷の可能性を伴う。それにもかかわらず、組織をスライスすることは、関連するDH回路へのより直接的な電気的アクセスおよび中断のない薬理学的アクセスを提供する。これらの実験的な長所と短所は、関心のあるネットワーク内の接続性を最大限に維持するためにスライスの向きを考慮することの重要性を強調して、慎重に検討する必要があります。この論文で提示されたデータの大部分について、背角内の活動の内側 - 側方広がりと、この領域におけるニューロンの本質的な接続性が提示されている。ロストロ - 尾部活動の広がりを調べるために、矢状または水平スライスの使用は、図9で強調されているように、脊髄セグメント間の接続性を優先的に維持する。

さらに、脊髄を切除すると、スライスの表面にある程度の損傷が生じることは避けられません。この損傷を最小限に抑えるには、組織の慎重な準備、スライスパラメータ(遅い前進速度や高周波ブレード振動など)、およびこのプロセス中の神経保護的なソリューションと条件に戻ります。脊髄スライスの健康に対する異なる条件の利点の詳細な評価は、以前に^{公開されている 40}.スライスの正常性が MEA 記録に及ぼす潜在的な影響にもかかわらず、スライス準備手順の内部整合性により、この要因がデータセット全体の結果に等しく影響することが保証されます。また、MEA電極は、活性源から約30〜100μm離れたところで生じる信号を拾うと考えられていることにも留意すべきである。損傷したスライス表面は最上部の細胞層(約15~30μm)にまたがる可能性が高いため、スライス関連の損傷がMEA記録に及ぼす影響を管理および軽減して、DHネットワーク活動に関する貴重なデータセットと洞察を得ることができます^15,41。

要約すると、ここで説明するMEA/4-AP脊髄スライスアプローチは、DH回路の接続性と、DH回路が形成するネットワークが脊髄痛処理をどのように駆動するかを理解するためのプラットフォームを提供します。また、解析パラメータ、ネットワーク刺激源、および薬理学的スクリーニングのプラットフォームとして、または病理学的疼痛のモデルでの使用のためのプラットフォームとして使用されるその能力に関して、さらなる方法論的拡張の可能性もある。

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

この研究は、オーストラリアの国立保健医療研究評議会(NHMRC)(B.A.G.およびR.J.C.への助成金631000、1043933、1144638、および1184974)とハンター医学研究所(B.A.G.およびR.J.C.への助成金)から資金提供を受けました。