تسجيل نشاط الشبكة في الدوائر الحساسة للألم في العمود الفقري باستخدام صفائف الأقطاب الدقيقة

يتم تحديد الاستخدام المشترك لتكنولوجيا مصفوفة microelectrode والتحفيز الكيميائي الناجم عن 4-aminopyridine للتحقيق في نشاط مسبب للألم على مستوى الشبكة في القرن الظهري للحبل الشوكي.

يتم تحديد أدوار واتصال أنواع محددة من الخلايا العصبية داخل القرن الظهري للحبل الشوكي (DH) بمعدل سريع لتوفير رؤية مفصلة بشكل متزايد للدوائر التي تقوم عليها معالجة آلام العمود الفقري. ومع ذلك ، فإن آثار هذه الاتصالات على نشاط الشبكة الأوسع في DH لا تزال أقل فهما لأن معظم الدراسات تركز على نشاط الخلايا العصبية المفردة والدوائر الدقيقة الصغيرة. بدلا من ذلك ، فإن استخدام صفائف الأقطاب الكهربائية الدقيقة (MEAs) ، والتي يمكنها مراقبة النشاط الكهربائي عبر العديد من الخلايا ، يوفر دقة مكانية وزمنية عالية للنشاط العصبي. هنا ، يتم وصف استخدام MEAs مع شرائح الحبل الشوكي للفئران لدراسة نشاط DH الناجم عن دوائر DH المحفزة كيميائيا باستخدام 4-aminopyridine (4-AP). يقتصر النشاط الإيقاعي الناتج على DH السطحي ، المستقر بمرور الوقت ، المحظور بواسطة tetrodotoxin ، ويمكن التحقيق فيه في اتجاهات شريحة مختلفة. معا ، يوفر هذا المستحضر منصة للتحقيق في نشاط دائرة DH في الأنسجة من الحيوانات الساذجة ، والنماذج الحيوانية للألم المزمن ، والفئران ذات وظيفة مسببة للألم معدلة وراثيا. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام تسجيلات MEA في شرائح الحبل الشوكي المحفزة بتقنية 4-AP كأداة فحص سريع لتقييم قدرة المركبات الجديدة المضادة للحساسية على تعطيل النشاط في DH الحبل الشوكي.

يتم الكشف عن أدوار أنواع محددة من الخلايا العصبية المثبطة والمثيرة داخل الحبل الشوكي DH بمعدل سريع^1،2،^3،4. معا ، تشكل الخلايا العصبية الداخلية أكثر من 95٪ من الخلايا العصبية في DH وتشارك في المعالجة الحسية ، بما في ذلك nociception. علاوة على ذلك ، فإن هذه الدوائر بين الخلايا العصبية مهمة لتحديد ما إذا كانت الإشارات الطرفية تصعد إلى المحور العصبي للوصول إلى الدماغ والمساهمة في إدراك الألم^5،6،7. حتى الآن ، حققت معظم الدراسات في دور الخلايا العصبية DH على مستوى التحليل إما على مستوى الخلية الواحدة أو الكائن الحي بأكمله باستخدام مجموعات من الفيزيولوجيا الكهربية داخل الخلايا في المختبر ، ووضع العلامات التشريحية العصبية ، والتحليل السلوكي في الجسم الحي ¹،³،⁸،⁹،^10،11،12،^13،14 . وقد عززت هذه الأساليب بشكل كبير في فهم دور مجموعات محددة من الخلايا العصبية في معالجة الألم. ومع ذلك ، لا تزال هناك فجوة في فهم كيفية تأثير أنواع معينة من الخلايا والدوائر الكلية الصغيرة على مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية على مستوى الدائرة الدقيقة لتشكيل مخرجات DH والاستجابات السلوكية وتجربة الألم.

إحدى التقنيات التي يمكنها التحقيق في الدائرة الكلية أو وظيفة المستوى متعدد الخلايا هي مصفوفة القطب الدقيق (MEA) ^15,16. تم استخدام MEAs للتحقيق في وظيفة الجهاز العصبي لعدة عقود^17,18. في الدماغ ، قاموا بتسهيل دراسة تطور الخلايا العصبية ، واللدونة المشبكية ، والفحص الدوائي ، واختبار السمية^17،18. يمكن استخدامها لكل من التطبيقات في المختبر وفي الجسم الحي ، اعتمادا على نوع MEA. وعلاوة على ذلك، تطور تطوير الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف بسرعة، حيث أصبحت أعداد الأقطاب الكهربائية المختلفة وتكويناتها متاحة الآن¹⁹. تتمثل إحدى المزايا الرئيسية ل MEAs في قدرتها على تقييم النشاط الكهربائي في العديد من الخلايا العصبية في وقت واحد بدقة مكانية وزمنية عالية عبر أقطاب كهربائية متعددة^15,16. وهذا يوفر قراءة أوسع لكيفية تفاعل الخلايا العصبية في الدوائر والشبكات، في ظل ظروف التحكم وفي وجود المركبات المطبقة محليا.

أحد التحديات التي تواجه الاستعدادات في المختبر DH هو أن مستويات النشاط المستمرة عادة ما تكون منخفضة. هنا ، يتم التعامل مع هذا التحدي في دوائر DH للحبل الشوكي باستخدام مانع قناة K ⁺ ذو بوابات الجهد ، 4-aminopryidine (4-AP) ، لتحفيز دوائر DH كيميائيا. وقد استخدم هذا الدواء سابقا لإنشاء نشاط كهربائي متزامن إيقاعي في DH من شرائح الحبل الشوكي الحادة وتحت الظروف الحادة في الجسم الحي ²⁰،^21،22،^23،24. استخدمت هذه التجارب رقعة أحادية الخلية وتسجيلا خارج الخلية أو تصويرا بالكالسيوم لتوصيف النشاط الناجم عن 4-AP 20,21,22,23,24,25. معا ، أظهر هذا العمل متطلبات النقل المشبكي المثير والمثبط والمشابك الكهربائية للنشاط الإيقاعي الناجم عن 4-AP. وبالتالي ، فقد تم النظر إلى استجابة 4-AP على أنها نهج يكشف النقاب عن دوائر DH متعددة التشابك الأصلية ذات الصلة البيولوجية بدلا من كونها ظاهرة عرضية ناجمة عن المخدرات. علاوة على ذلك ، يظهر النشاط الناجم عن 4-AP ملف استجابة مشابها للأدوية المسكنة والمضادة للصرع كحالات ألم الأعصاب وقد تم استخدامه لاقتراح أهداف جديدة للعقاقير المسكنة القائمة على العمود الفقري مثل connexins^20,21,22.

هنا ، يتم وصف إعداد يجمع بين MEAs والتنشيط الكيميائي ل DH الشوكي مع 4-AP لدراسة هذه الدوائر المسببة للألم على مستوى الدائرة الكلية ، أو مستوى الشبكة من التحليل. يوفر هذا النهج منصة مستقرة وقابلة للتكرار للتحقيق في الدوائر المسببة للألم في ظل ظروف "تشبه الألم" الساذجة والاعتلال العصبي. هذا التحضير قابل للتطبيق بسهولة لاختبار عمل المسكنات المعروفة على مستوى الدائرة وفحص المسكنات الجديدة في الحبل الشوكي مفرط النشاط.

أجريت دراسات على ذكور وإناث فئران c57Bl/6 تتراوح أعمارهم بين 3-12 شهرا. تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقا للجنة رعاية الحيوان والأخلاقيات بجامعة نيوكاسل (البروتوكولان A-2013-312 و A-2020-002).

1. الفيزيولوجيا الكهربية في المختبر

1. إعداد حلول لإعداد وتسجيل شرائح الحبل الشوكي
   1. السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي
      ملاحظة: يستخدم السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (aCSF) في غرفة حضانة الوصلة البينية، حيث يتم تخزين الشرائح حتى يبدأ التسجيل وأثناء التجارب كمواد معطرة ومخففة للأدوية. انظر الجدول 1 للاطلاع على التكوين التفصيلي.

الجدول 1: تركيبات السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي. اختصار: aCSF = السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي.

1. تحضير aCSF يحتوي على (في mM) 118 كلوريد الصوديوم ، 25 NaHCO₃ ، 10 الجلوكوز ، 2.5 KCl ، 1 NaH 2 PO₄ ، 1 MgCl 2 ، و_2.5 CaCl 2 عن طريق إضافة الكميات المطلوبة مما سبق ، باستثناء CaCl 2 ، إلى ₂ لتر من الماء المقطر.
2. فقاعة الحل أعلاه مع carbogen (95٪ O 2 ، 5٪ CO 2) لمدة 5 دقائق وإضافة CaCl_2.
   ملاحظة: تمنع هذه الخطوة هطول الأمطار CaCl₂ ، أي يجب ألا يتحول الحل إلى غائم. لتطبيق الدواء أثناء التجارب ، قم بتخفيف محاليل مخزون الدواء في aCSF إلى التركيزات النهائية المطلوبة.

2. السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي البديل للسكروز
   ملاحظة: يستخدم aCSF البديل بالسكروز أثناء التشريح وتقطيع الحبل الشوكي. كما هو موضح بالاسم ، يتم استبدال السكروز بكلوريد الصوديوم لتقليل الإثارة العصبية أثناء هذه الإجراءات مع الحفاظ على الأسمولية. انظر الجدول 1 للاطلاع على التكوين التفصيلي.
   1. تحضير aCSF بديل للسكروز يحتوي على (في mM) 250 السكروز ، 25 NaHCO₃ ، 10 الجلوكوز ، 2.5 KCl ، 1 NaH 2 PO₄ ، 1 MgCl 2 ، و 2.5 CaCl 2 عن طريق إضافة الكميات المطلوبة من كل ما سبق ، باستثناء CaCl ₂ ، إلى 300 مل من الماء المقطر.
   2. فقاعة الحل مع كاربوجين لمدة 5 دقائق ثم إضافة CaCl₂.
   3. قم بتخزين المحلول في ثلاجة -80 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة تقريبا أو حتى يشكل المحلول ملطنا. تجنب تجميد المواد الصلبة واستخدامها أثناء اتساق الطين.

2. إعداد مصفوفة القطب الدقيق
   ملاحظة: يتطلب سطح التلامس في منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا معالجة مسبقة لجعله محب للماء.
   1. قبل التجربة، املأ MEA جيدا إما بمصل البقر الجنيني (FBS) أو مصل الحصان (HS) لمدة 30 دقيقة.
   2. قم بإزالة FBS أو HS وشطف MEA جيدا بحوالي خمس غسلات من الماء المقطر حتى لا يصبح الماء المقطر رغويا. املأ البئر ب aCSF ، جاهز للاستخدام.
3. إعداد شريحة الحبل الشوكي الحادة
   ملاحظة: إعداد شريحة الحبل الشوكي للفأر هو كما وصفه سابقا سميث وآخرون ². من الناحية المثالية ، يجب ألا تستغرق إزالة التوسيع القطني العجزي أكثر من 8-10 دقائق (الخطوات 1.3.2-1.3.11 أدناه).
   1. قم بتخدير الفأر بعمق باستخدام 100 مجم / كجم من الكيتامين (i.p) ثم قطع رأسه باستخدام مقص جراحي كبير.
   2. قم بإزالة الجلد فوق منطقة البطن عن طريق إجراء قطع صغير في الجلد على مستوى الوركين. اسحب الجلد على جانبي الجرح بشكل مستقيم حتى تتم إزالة الجلد بالكامل ، أي من أعلى القفص الصدري إلى أعلى الحوض (بطنيا وظهريا).
   3. ضع الجسم على الجليد واستخدم نهجا بطنيا لفضح العمود الفقري عن طريق إزالة جميع الأحشاء وقطع الأضلاع الجانبية إلى القص.
   4. قم بإزالة القفص الصدري البطني ، كل من الكتف (مقطوع عند T2 تقريبا) ، والأطراف السفلية والحوض (مقطوعة في الجزء العلوي من العجز تقريبا).
   5. انقل العمود الفقري وإعداد الأضلاع إلى حمام تشريح يحتوي على السكروز البارد المثلج aCSF. قم بتثبيت جميع الزوايا الأربع للتحضير (السطح البطني لأعلى) عن طريق وضع دبابيس عبر عضلات أسفل الظهر والأضلاع العلوية المرفقة.
   6. قم بإزالة جميع العضلات والأنسجة الضامة التي تغطي السطح البطني للفقرات باستخدام rongeurs وتحديد المنطقة الفقرية فوق التوسيع القطني العجزي ، والذي يقع تقريبا تحت الأجسام الفقرية T12 إلى L2.
   7. قم بإزالة جسم فقري ذيلي إلى منطقة التوسيع القطني العجزي لتوفير الوصول إلى الحبل الشوكي أثناء جلوسه في القناة الفقرية.
   8. باستخدام مقص زنبركي منحني ، قم بقطع عنيقات العمود الفقري بشكل ثنائي أثناء رفع وسحب الجسم الفقري بشكل كبير لفصل الجوانب البطنية والظهرية للفقرات وفضح الحبل الشوكي.
   9. بمجرد إزالة الأجسام الفقرية للكشف عن التوسيع القطني العجزي ، قم بمسح الجذور المتبقية بعناية التي تثبت الحبل الشوكي بمقص زنبركي حتى يطفو الحبل بحرية.
   10. اعزل الحبل الشوكي بجروح في السطح والذيلية أعلى وأسفل التوسيع القطني العجزي، مما يسمح للمنطقة المستهدفة من الحبل "بالطفو بحرية".
       ملاحظة: سيحدد اتجاه الشريحة المفضل كيفية تركيب السلك لاحقا للتقسيم (الشكل 1).
   11. بالنسبة للشرائح المستعرضة، ارفع الجزء القطني العجزي بواسطة جذر متصل وضعه على كتلة من البوليسترين (الستايروفوم) المقطوعة مسبقا (1 سم × 1 سم × 1 سم) مع قناة ضحلة مقطوعة في المنتصف. استخدم لاصق سيانو أكريليت (انظر جدول المواد) لتوصيل الكتلة والحبل بمنصة التقسيم ووضعها في حمام القطع الذي يحتوي على السكروز البارد المثلج aCSF (الطين).
       ملاحظة: تساعد القناة الضحلة على تأمين الحبل الشوكي وتوجيهه، مع تعرض الجانب الظهري والطرف الصدري للحبل في أسفل الكتلة.
   12. بالنسبة للشرائح السهمية ، ضع خطا رفيعا من لاصق cyanoacrylate على منصة التقسيم ، وارفع التوسيع القطني العجزي بواسطة جذر متصل ، وضع الحبل على طول خط الغراء ، مما يضمن وجود سطح جانبي واحد في المادة اللاصقة والوجوه الأخرى لأعلى. ضعه في حمام القطع الذي يحتوي على السكروز البارد المثلج aCSF (الطين).
   13. بالنسبة للشرائح الأفقية ، ضع خطا رفيعا من لاصق سيانو أكريليت على منصة التقسيم. ارفع التوسيع القطني العجزي بواسطة جذر متصل ، وضع التوسيع القطني العجزي على طول خط المادة اللاصقة ، مما يضمن وجود السطح البطني في المادة اللاصقة والسطح الظهري متجها لأعلى. استخدم الجذور المرفقة لوضع السلك. ضعه في حمام القطع الذي يحتوي على السكروز البارد المثلج aCSF (الطين).

الشكل 1: اتجاهات شرائح الحبل الشوكي وطرق التركيب والقطع. (أ) تتطلب الشرائح المستعرضة كتلة قطع من الستايروفوم مع أخدود داعم مقطوع فيها. يستريح الحبل الشوكي ضد الكتلة الموجودة في أخدود الدعم ، والجانب الظهري من الحبل يواجه بعيدا عن الكتلة. يتم لصق الكتلة والحبل على مرحلة القطع باستخدام مادة لاصقة cyanoacrylate. (ب) يتم تحضير شرائح القوس عن طريق وضع خط رفيع من لاصق سيانواكريليت على مرحلة القطع ثم وضع الحبل الشوكي على جانبه على الغراء. (ج) يتم تحضير الشرائح الأفقية عن طريق وضع خط رفيع من لاصق سيانواكريليت على مرحلة القطع ثم وضع الجانب البطني للحبل الشوكي لأسفل على الغراء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

14. احصل على شرائح بسماكة 300 ميكرومتر (L1-L5، بنفس السماكة بغض النظر عن الاتجاه) باستخدام ميكروتوم يهتز مع الإعدادات التالية: السرعة 0.06 مم/ثانية، والسعة 2.50 مم، ومعايرتها إلى ضمن انحراف سعة الارتفاع ±0.02.
15. انقل الشرائح إلى غرفة حضانة واجهة الهواء التي تحتوي على aCSF المؤكسج.
16. قبل التسجيل ، اسمح للشرائح بالتوازن لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (20-24 درجة مئوية).

4. تسجيلات مصفوفة ميكروكترود
   ملاحظة: توضح الخطوات التالية بالتفصيل كيفية استخدام بيانات السجل من التجارب القائمة على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف على شرائح الحبل الشوكي. يمكن استخدام العديد من تصاميم MEA اعتمادا على التجربة. وترد تفاصيل تصميم الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المستخدمة في هذه التجارب في الجدول 2 و الشكل 2. تم نشر معلومات التصميم التفصيلية من قبل Egert et al.²⁶ وثيبو وآخرون.²⁷ للاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المستوية وثلاثية الأبعاد (3D)، على التوالي. يتكون كلا النوعين من MEA من 60 قطبا كهربائيا من نيتريد التيتانيوم ، مع طبقة عازلة من نيتريد السيليكون ومسارات نيتريد التيتانيوم ومنصات الاتصال.
   1. الإعداد التجريبي
      1. قم بتشغيل الكمبيوتر ولوحة الواجهة ، وابدأ تشغيل برنامج التسجيل.
      2. قم بتحميل قالب التسجيل الذي تم تجميعه مسبقا (الشكل 3A). قم بتسمية الملفات الخاصة باليوم في علامة التبويب المسجل.
      3. فقاعة aCSF باستمرار مع carbogen (5٪ CO 2 ، 95٪ O₂) طوال مدة التجربة.
      4. قم بتشغيل نظام التروية ، الذي يتم التحكم فيه بواسطة مضخة تمعجية. ضع خط المدخل في aCSF ونهاية المدخل في كوب نفايات. قم بتعبئة خطوط التروية باستخدام aCSF.
      5. تحضير 4-AP وأي حلول دوائية أخرى عن طريق تخفيف المخزونات في 50 مل من aCSF إلى التركيز النهائي المطلوب (على سبيل المثال ، 200 ميكرومتر ل 4-AP).
      6. ضع المحاليل الدوائية في أواني الأدوية وقم بفقاعتها بمادة مكربوجينة.
   2. 4-نشاط AP
      1. بعد الحضانة ، انقل شريحة واحدة من الحاضنة باستخدام ماصة باستور كبيرة الطرف مليئة ب aCSF.
      2. ضع الشريحة في MEA جيدا وأضف aCSF إضافيا.
      3. ضع الشريحة فوق صفيف التسجيل المكون من 60 قطبا كهربائيا باستخدام فرشاة طلاء شعر قصيرة ناعمة. تجنب ملامسة الأقطاب الكهربائية بفرشاة الطلاء أو سحب الأنسجة عبر الأقطاب الكهربائية ، خاصة إذا كنت تستخدم صفائف 3D.
         ملاحظة: اعتمادا على تخطيط MEA ، يمكن القيام بذلك بمساعدة أو بدون مساعدة من المجهر لتحديد المواقع بدقة.
      4. بعد وضع الشريحة، ضع شبكة مرجحة فوق الأنسجة لتثبيتها في مكانها وتعزيز الاتصال الجيد مع أقطاب MEA.
         ملاحظة: قد تحتاج الشريحة إلى تغيير موضعها بعد الموضع الصافي.
      5. ضع MEA في منصة التسجيل (الشكل 2A و B).
      6. تحقق من موضع الأنسجة فوق الأقطاب الكهربائية باستخدام مجهر مقلوب (تكبير 2x) للتأكد من أن أكبر عدد ممكن من الأقطاب الكهربائية تحت DH السطحي (SDH). تأكد من أن 2-6 أقطاب كهربائية على الأقل لا تتصل بالشريحة لأن هذه الأقطاب الكهربائية مهمة لطرح الضوضاء وتسجيل القطع الأثرية أثناء التحليل (الشكل 2E).
      7. قم بتشغيل الكاميرا، وتوصيلها بالجهاز، والتقاط صورة مرجعية للشريحة المتعلقة ب MEA لاستخدامها أثناء التحليل.
      8. اضغط على Start DAQ في برنامج التسجيل، وتأكد من أن جميع الأقطاب الكهربائية تتلقى إشارة واضحة.
         ملاحظة: إذا كانت الإشارة صاخبة، فقم بفك الغطاء الرأسي وتنظيف كل من وسادات التلامس MEA وجهات اتصال زنبرك الذهب بنسبة 70٪ من الإيثانول (استخدم مسحة مخبرية للتأكد من جفاف الفوط وجهات الاتصال بعد التنظيف). إذا كانت الإشارة لا تزال صاخبة، فقم بإيقاف تشغيل الأقطاب الكهربائية المعطوبة في برنامج التسجيل أو قم بتدوين الملاحظات لاستبعادها لاحقا أثناء التحليل.
      9. قم بتوصيل خطوط مدخل ومخرج التروية ببئر MEA (المملوء سابقا ب aCSF) وقم بتشغيل نظام التروية. تحقق من معدل التدفق ، من الناحية المثالية 4-6 أحجام حمام في الدقيقة ، وتأكد من أن التدفق الخارجي كاف لمنع تجاوز الفوسات.
      10. اسمح للنسيج بالتوازن لمدة 5 دقائق ثم سجل 5 دقائق من بيانات خط الأساس الخام غير المصفاة.
      11. حرك خط مدخل التروية من aCSF إلى محلول 4-AP وانتظر لمدة 12 دقيقة حتى يصل النشاط الإيقاعي الناجم عن 4-AP إلى حالة ثابتة (دقيقتان للأدوية للوصول إلى الحمام و 10 دقائق حتى يصل النشاط إلى ذروته ثم الهضبة).
      12. سجل 5 دقائق من النشاط الناجم عن 4-AP. كن مستعدا للتسجيلات اللاحقة لاختبار الأدوية أو للتحقق من استقرار 4-AP.

الجدول 2: تخطيطات صفيف القطب الدقيق.

الشكل 2: وضع الأنسجة على مصفوفة القطب الدقيق . (أ) تظهر الصورة منصة أمامية مفتوحة في الشرق الأوسط وأفريقيا مع وضع MEA في موضعها. (ب) نفس المستوى ألف مع إغلاق منصة MEA الرئيسية للتسجيلات ونظام تروية الأنسجة المعمول به. (ج) تظهر الصورة شركة طيران الشرق الأوسط كما قدمتها الشركة المصنعة. يتم عرض منصات الاتصال ، التي تتفاعل مع الينابيع الذهبية للرأس ، وحمام الأنسجة MEA الذي يحمل محلول استحمام الأنسجة وشريحة الأنسجة. المنطقة التي أبرزها المربع الأحمر في الوسط هي موقع صفيف القطب الكهربائي. (د) تبين المخططات تكوينين قطبي MEA المستخدمين في هذه الدراسة، مع مزيد من التفاصيل في الجدول 2. يشار إلى القطب المرجعي بواسطة شبه المنحرف الأزرق. يظهر تخطيط القطب الكهربائي الأيسر MEA تكوينا مربعا من 60 قطبا كهربائيا ، يستخدم أكثر في نماذج العمل المقدمة 60MEA200/30iR-Ti مع أقطاب قطرها 30 ميكرومتر متباعدة 200 ميكرومتر ، أو 200 ميكرومتر متباعدة و 100 ميكرومتر متباعدة 3 أبعاد MEAs (60MEA200/12/50iR-Ti و 60MEA100/12/40iR-Ti) مع أقطاب كهربائية قطرها 12 ميكرومتر وإما 50 ميكرومتر أو 40 ميكرومتر ، على التوالي. يظهر تخطيط القطب الأيسر MEA تخطيطا مستطيلا للأقطاب الكهربائية 6 × 10-60MEA500/30iR-Ti. (ه) صورة عالية التكبير لمربع MEA 60MEA100/12/40iR-Ti مع شريحة مستعرضة للحبل الشوكي موضوعة للتسجيل. تقع الشريحة على صفوف القطب الكهربائي 3-8. الصف العلوي من الأقطاب الكهربائية ، التي لا تتصل بأي نسيج ، بمثابة أقطاب كهربائية. تظهر منطقة SDH كنطاق شبه شفاف. في هذه الحالة ، يعلو SDH الأقطاب الكهربائية في الصفوف 4 و 5 و 6 والأعمدة 2 و 3 و 4 و 5 و 7 من MEA. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. الاختصارات: MEA = مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة; SDH = القرن الظهري السطحي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. تغيير الشرائح
   1. بعد كل جلسة تسجيل، اشطف الخطوط باستخدام aCSF.
   2. أزل MEA من المنصة.
   3. قم بإزالة الشبكة والأنسجة من MEA جيدا ، وشطفها جيدا باستخدام aCSF ، وكرر الخطوات المذكورة أعلاه بشريحة جديدة.

2. معالجة البيانات وتحليلها

ملاحظة: توضح الخطوات التالية بالتفصيل كيفية استخدام برنامج التحليل لتجارب الشرق الأوسط وأفريقيا على شرائح الحبل الشوكي. يعمل أحد الأقطاب الكهربائية ال 60 كمرجع داخلي (يتميز بشبه منحرف في الشكل 2 C ، D) ، في حين يتم وضع ما بين أربعة وخمسة وعشرين من ال 59 المتبقية تحت SDH في شريحة الحبل الشوكي للفأر البالغ. يكتشف التحليل اللاحق إمكانات العمل خارج الخلية (EAP) والأشكال الموجية لإمكانات المجال المحلي (LFP) (انظر الشكل 3B للحصول على أمثلة) من الإشارة الخام في هذه المنطقة.

1. معالجة البيانات الخام
   1. افتح برنامج التحليل وقم بتحميل تخطيط التحليل المصنوع مسبقا (الشكل 3B).
   2. افتح الملف محل الاهتمام وقم بإلغاء تحديد القطب المرجعي (القطب الكهربائي 15 في 8 × 8 MEA- أو القطب E1 في تكوين 6 × 10 MEA) وأي أقطاب كهربائية تعتبر صاخبة بشكل مفرط.
   3. اضبط الإطار الزمني للتحليل (0:00 → 5:00 دقيقة).
   4. الانتقال إلى علامة التبويب عامل تصفية عبر القنوات . حدد مرجعا معقدا وحدد الأقطاب الكهربائية المرجعية بناء على الصورة التي تم التقاطها والملاحظات التي تم إجراؤها أثناء التجربة (أي تلك الأقطاب الكهربائية التي ليست تحت الأنسجة). للتطبيق والتحقق من ذلك، اضغط على استكشاف قبل المتابعة.
   5. انتقل إلى علامة تبويب مرشح EAP وقم بتطبيق مرشح Butterworth عالي التمرير بالترتيب^الثاني (200 هرتز مقطوع) لإزالة نشاط LFP.
   6. انتقل إلى علامة تبويب مرشح LFP وقم بتطبيق مرشح Butterworth لتمرير النطاق² من أجل الثاني (ترددات دلتا من 0.5-4 هرتز) لإزالة نشاط EAP.
   7. انتقل إلى علامة التبويب كاشف EAP وحدد عتبة تلقائية. حدد مربعات الحافة الصاعدة والمنخفضة واضبط الوقت الميت على 0.5 مللي ثانية.
   8. تعيين عتبات إيجابية وسلبية استنادا إلى البيانات. افحص البيانات عن طريق العودة إلى شاشة محلل بيانات Raw، وتحريك علامة الوقت، ثم العودة إلى علامة التبويب كاشف EAP والضغط على استكشاف. كرر ذلك حتى تقتنع بأن عتبة الكشف المحددة تلتقط EAPs دون التقاط الضوضاء / النشاط غير الفسيولوجي. استخدم الأقطاب الكهربائية المرجعية لتحديد الضوضاء / النشاط غير الفسيولوجي.
      ملاحظة: من الضروري التأكد من اكتشاف الحد الأدنى من EAPs في الأقطاب الكهربائية المرجعية حيث لن يحدث نشاط فسيولوجي. ومع ذلك ، قد يتم اكتشاف انحرافات طفيفة إلى حد ما في خط الأساس بشكل خاطئ على أنها EAPs. هذا في حين لا يزال يهدف إلى زيادة عدد الأحداث الحقيقية المكتشفة في الأقطاب الكهربائية النشطة.
   9. انتقل إلى علامة التبويب كاشف LFP ، وحدد العتبة اليدوية ، وحدد مربعات الحافة الصاعدة والهابطة ، واضبط الوقت الميت على 3 مللي ثانية.
   10. كرر الخطوة 2.1.8 لقطب واحد عن طريق تحديد قطب كهربائي مع نشاط LFP. بمجرد الرضا، حدد تطبيق على الجميع حيث سيتم تطبيق العتبات فقط على قطب كهربائي واحد عند إجراء العتبة اليدوية.
   11. أثناء فحص بيانات LFP في علامة التبويب Detector ، لاحظ الحد الأقصى لعدد معابر العتبة للشكل الموجي LFP الواحد والحد الأقصى للفصل الزمني لمعابر العتبة للشكل الموجي LFP الواحد للاستخدام في التحليل اللاحق.
   12. اضغط على بدء التحليل.
   13. عند اكتمال التحليل، انتقل إلى علامة التبويب محلل EAP وقم بتصدير البيانات. افعل الشيء نفسه في علامة التبويب محلل LFP .
   14. كرر هذه العملية لكافة الملفات الأخرى من نفس الشريحة.
   15. بعد تصدير البيانات ، قم بتحويل الملفات إلى تنسيق xlsx بحيث يمكن قراءتها بواسطة البرنامج النصي للبرمجة المستخدم. قم بتسمية الملفات وفقا للاصطلاح التالي للبرنامج النصي المقدم لقراءتها: اسم التجربة (على سبيل المثال ، بيانات العينة) - رقم الشريحة (على سبيل المثال ، S1) - رقم التسجيل (على سبيل المثال ، R1) - نوع النشاط (على سبيل المثال ، المسامير أو SPs ، المقابلة ل EAPs أو LFPs ، على التوالي).
       ملاحظة: يعامل تحليل EAP الموصوف هنا الارتفاع من القنوات الفردية كمجموعة سكانية واحدة ، على الرغم من أن هذا النشاط ينشأ عادة من خلايا عصبية متعددة على مقربة من قطب التسجيل. إذا كان عدد الخلايا العصبية التي تساهم في EAPs في قناة ما مرغوبا فيه ، فيمكن تطبيق تقنيات الفرز متعددة السنبلة الموصوفة في مكان آخر للتمييز بين مجموعات متميزة من المسامير بناء على خصائص الشكل الموجي²⁸.

الشكل 3: تخطيطات أدوات تسجيل البيانات وتحليلها وتسجيلات مصفوفة الأقطاب الدقيقة على سبيل المثال التي تظهر إمكانات العمل خارج الخلية والأشكال الموجية المحتملة للمجال المحلي . (أ) يوضح المخطط قالب التسجيل المكون مسبقا المستخدم للحصول على بيانات MEA. يتيح ربط MEA2100 وأداة التسجيل (الرأس / مكبر الصوت) تسمية البيانات وحفظها. تم جمع أربعة أمثلة على آثار البيانات الخام (يمين، عصور مدتها 5 دقائق) بواسطة قناة MEA واحدة تظهر النشاط عند خط الأساس، و 12 دقيقة بعد تطبيق 4-AP، و 15 دقيقة أخرى بعد نشاط 4-AP المحدد، وبعد تطبيق حمام TTX (1 ميكرومتر). لاحظ أن إضافة 4-AP (التتبع الثاني) تنتج زيادة واضحة في ضوضاء الخلفية ونشاط EAP / LFP. الأهم من ذلك ، أن النشاط يظل مستقرا نسبيا لمدة 15 دقيقة على الأقل بعد إنشاء النشاط الناجم عن 4-AP (التتبع الثالث). إضافة TTX (1 ميكرومتر) يلغي كل نشاط (تتبع القاع). (ب) يعرض المخطط (يسار) تكوين برنامج المحلل لتحليل البيانات. يتم استخدام أداة مستكشف البيانات الخام لاستيراد التسجيلات التي تم جمعها بواسطة برنامج التسجيل. ثم يتم تشغيل هذه البيانات من خلال أداة تصفية عبر القنوات تطرح إشارة (إشارات) القطب (الأقطاب الكهربائية) المرجعية المحددة من الأقطاب الكهربائية الأخرى لإزالة ضوضاء الخلفية. تمر البيانات عبر مرشح EAP وأدوات مرشح LFP لتحسين علاقات الإشارة إلى الضوضاء لكل شكل موجي. باتباع هذه الخطوة، تدخل بيانات مسار EAP أداة كاشف EAP، حيث يتم تعيين العتبات. يتم الكشف عن EAPs ثم إرسالها إلى أداة محلل EAP حيث يتم تسجيل زمن الانتقال لكل حدث وتصديره ك txt. ملف. يحدث سير عمل متطابق لبيانات LFP باستخدام مجموعة أدوات LFP مقابلة. تظهر الآثار الصحيحة بيانات من قناة MEA واحدة تحتوي على أشكال موجية مختلفة خارج الخلية. يتم تمييز موقع إشارات EAP و LFP في "حساب البيانات النقطية" أعلاه. الآثار السفلية هي عصور من التسجيل العلوي (يشار إليها بأشرطة حمراء) تظهر الأشكال الموجية على مقياس زمني موسع ، بما في ذلك إشارات LFP المختلفة (لاحظ تنوع المظاهر) و EAPs الفردية خارج الخلية (الدوائر الحمراء). لاحظ أن الشكل الموجي والقطبية LFP / EAP يختلفان بالنسبة لعدد الخلايا العصبية التي تنتج هذه الإشارات ، وقربها من قطب التسجيل ، وموقعها فيما يتعلق بالقطب (الأقطاب القريبة). الاختصارات: MEA = مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة; EAP = إمكانات العمل خارج الخلية. LFP = إمكانات المجال المحلي; 4-AP = 4-أمينوبيريدين ؛ TTX = تيترودوتوكسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. تحليل التزامن
   ملاحظة: تم تحديد التزامن ، أو عدد الأحداث "المصادفة" بين قطبين كهربائيين ، باستخدام معيار الصدفة ضمن طريقة A-SPIKE-synchronization التي حددها Satuvuori et al. ²⁹. يقارن البرنامج النصي المستخدم هنا فقط الأقطاب الكهربائية المتجاورة مع بعضها البعض من أجل الكفاءة (أي الجيران الأفقيين والرأسيين والقطريين) ؛ ومع ذلك ، يمكن إعادة كتابة البرنامج النصي لمقارنة جميع الأقطاب الكهربائية إذا لزم الأمر.
   1. قم بإجراء تحليل البيانات باستخدام برنامج نصي مخصص للبرمجة ، والذي يستخرج الطوابع الزمنية لزمن الوصول لكل قطب كهربائي من ملفات .xlsx.
      ملاحظة: يمكن القيام بذلك يدويا.
   2. في الخطوة 2.1.11 ، سجل الحد الأقصى لعدد معابر العتبة والحد الأقصى للفصل الزمني لمعابر العتبة للشكل الموجي LFP الواحد. قم بتعديل البرنامج النصي لإدخال معلمات تعريف LFP هذه لكل شريحة قبل تشغيل البرنامج النصي.
      ملاحظة: العتبة التي تم إجراؤها سابقا في برنامج التحليل تلتقط بوضوح EAPs كحدث واحد. ومع ذلك ، تتكون LFPs من عدد متغير من القمم اعتمادا على شكل الشكل الموجي والعدد اللاحق من عبور العتبة بواسطة حدث واحد.
   3. قم بتعديل البرنامج النصي لإدخال الأقطاب الكهربائية ذات الأهمية قبل التحليل.
   4. لتحديد التزامن (المعرف في البرنامج النصي بواسطة أطر زمنية قابلة للتعديل للنشاط المتزامن الذي سيحدث داخلها) ، قم بفصل وتحليل زمن الاستجابة المستخرجة للكشف عن الأحداث المتزامنة.
      ملاحظة: يسمح البرنامج النصي بتعيين الحد الأقصى للوقت بين الأحداث المتزامنة. يتم تعيين هذه في 20 مللي ثانية ل EAPs و 200 مللي ثانية ل LFPs.
   5. قم بتشغيل البرنامج النصي لاستخراج الطوابع الزمنية الكمون.
      ملاحظة: يحتوي ملف الإخراج .xlsx على تفسيرات بيانات الكمون، وهي أعداد EAP وLFP والترددات وعدد الأحداث المتزامنة للأقطاب الكهربائية الفردية والشرائح الكاملة. تستخدم هذه البيانات لتقييم التردد ، وعدد EAP / LFP ، وعدد الأقطاب الكهربائية النشطة ، وعدد الأحداث المتزامنة ، وعدد الأقطاب الكهربائية المرتبطة ، ومتوسط قوة هذه الروابط.

نموذج نشاط الشبكة في القرن الظهري للحبل الشوكي
تطبيق 4-AP يحفز بشكل موثوق النشاط الإيقاعي المتزامن في الحبل الشوكي DH. ويمثل هذا النشاط زيادة في EAPs و LFPs. الإشارة اللاحقة هي شكل موجي منخفض التردد ، والذي تم وصفه سابقا في تسجيلات MEA³⁰. تعكس التغيرات في نشاط EAP و / أو LFP بعد تطبيق الدواء النشاط العصبي المتغير. وترد أمثلة على EAPs و LFPs في الشكل 3B والشكل 4. ينصب التركيز هنا على المعلمات أو الميزات التالية لبيانات EAP / LFP: التردد ، العد الكلي ، عدد الأقطاب الكهربائية النشطة ، التزامن كما يتميز بعدد الأحداث المتزامنة المكتشفة عبر أقطاب كهربائية متعددة ، وعدد الأقطاب الكهربائية المجاورة المرتبطة ، وقوة الروابط بين الأقطاب الكهربائية المجاورة. وترد النتائج التمثيلية في الجدول 3 والشكل 3 والشكل 4 والشكل 5 والشكل 6 والشكل 7 والشكل 8. وهي تظهر زيادة كبيرة في جميع المعلمات المقاسة (جميع p<0.001 بواسطة اختبار t المقترن أو اختبار Wilcoxon Sign-Rank غير المكافئ المعلمي) لكل من EAPs (الشكل 5 والشكل 6) و LFPs (الشكل 7 والشكل 8) بعد التحفيز 4-AP ثم الاستقرار النسبي لبقية التسجيلات. تم اختبار البيانات للتأكد من أنها طبيعية قبل التحليل الإحصائي. باختصار ، يحفز 4-AP نشاط EAP و LFP في الحبل الشوكي DH ، ويمكن استخراج ميزات مختلفة من البيانات من تسجيلات MEA. النشاط قابل للتكرار ، والكثير من النشاط ، خاصة بالنسبة ل LFPs ، إيقاعي ومتزامن.

الجدول 3: 4-النشاط الناجم عن أمينوبيريدين. كل ما تم تقديمه كوسيلة ± SEM.

الشكل 4: النشاط المحتمل للفعل الأساسي خارج الخلية النموذجي. تعرض اللوحات نشاط EAP (التسجيلات من شرائح مختلفة). لم تظهر معظم الأقطاب الكهربائية في تسجيل شريحة معينة نشاط EAP الأساسي (اللوحة العلوية). وقد لوحظت أحيانا إيب متفرقة منخفضة التردد عند خط الأساس، يحتمل أن تحتوي على أشكال موجية متعددة (اللوحة الوسطى). ونادرا ما لوحظ نشاط EAP عالي التردد في التسجيلات عند خط الأساس (اللوحة السفلية). تعرض الإعدادات الداخلية EAPs فردية من التسجيلات المقابلة على نطاق زمني موسع. اختصار: EAP = إمكانات العمل خارج الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

اتجاه الشريحة
يتم توصيل دوائر DH التي يتم تنشيطها بواسطة 4-AP في جميع الأبعاد الثلاثة. وبالتالي ، فإن توجيه الشريحة هو اعتبار مهم للمستحضرات في المختبر . قد يكون التقطيع المقوس أو الأفقي تفضيليا لمراقبة الإشارات بين القطاعات ، في حين أن الشرائح المستعرضة تحافظ بشكل أفضل على الاتصال المتوسط الجانبي والظهري البطني. بالنظر إلى هذه الاعتبارات ، يمكن ملاحظة أن تحفيز 4-AP يحفز نشاطا إيقاعيا مشابها في SDH ، بغض النظر عن اتجاه الشريحة (انظر الشكل 9).

الاستقرار على المدى الطويل للنشاط الناجم عن 4-AP
من الواضح أن استقرار النشاط الناجم عن 4-AP أمر بالغ الأهمية عند دراسة آثار الأدوية التطبيقية. لذلك ، تم تمييز استقرار معلمات النشاط الناجم عن 4-AP ، وهذا معروض في الشكل 5 ، الشكل 6 ، الشكل 7 ، والشكل 8 والجدول 4. كانت جميع خصائص النشاط ، بالإضافة إلى تزامن النشاط بالنسبة ل LFPs ، مستقرة بناء على تشابه النشاط الناجم عن 4-AP في 12 دقيقة بعد تطبيق 4-AP و 15 دقيقة بعد (p>0.05). انخفضت خصائص تزامن LFP الأخرى ، وعدد الأقطاب الكهربائية المجاورة المرتبطة ، وقوة الارتباط بين الأقطاب الكهربائية المجاورة على مدى 15 دقيقة (p = 0.016 و p = 0.033 ، على التوالي) ، على الرغم من أن الفرق كان متواضعا. يمكن بسهولة تمييز هذا التغيير التدريجي عن الإجراءات الأكثر إلحاحا لدواء الاختبار أثناء الدراسات الدوائية (انظر أدناه). تم اختبار البيانات للتوزيع الطبيعي قبل المقارنات الإحصائية ثم تم تقييمها باستخدام اختبارات t المقترنة أو اختبارات Wilcoxon Sign-Rank غير البارامترية حسب الاقتضاء.

الجدول 4: 4-استقرار نشاط أمينوبيريدين. كل ما تم تقديمه كوسيلة ± SEM.

التحقيق الدوائي لخصائص النشاط
ولإثبات أن النشاط الناجم عن 4-AP المسجل في الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف قابل بسهولة للتلاعب الدوائي، سلط الضوء على اعتماد هذه الإشارات على التفريغ المحتمل للعمل. تطبيق الحمام لمضاد قناة الصوديوم ذو بوابات الجهد ، tetrodotoxin (TTX ، 1 ميكرومتر) ، ألغى كل من نشاط EAP و LFP ، مما يؤكد اعتماد الارتفاع لهذه الإشارات. ويرد في الشكل 3 ألف آثار الأمثلة. تقدم هذه النتيجة أيضا مثالا على فائدة التحضير للتحقيقات الدوائية المستقبلية ، حيث يمكن تقييم المركبات الجديدة والمسكنات الراسخة لعملها في دوائر DH الشوكية المنشطة. وأخيرا، ولإلقاء مزيد من الضوء على أهمية تفعيل شبكات DH 4-AP، تمت تجربة نهج بديل لتحقيق إزالة استقطاب متواضعة لشبكة DH. في هذا النهج ، تم تطبيق محلول aCSF مرتفع من البوتاسيوم (4.5 mM) (الجدول 1) على الحمام وتبين أنه يثير استجابة DH مماثلة لتحفيز 4-AP. أثار هذا التلاعب نشاط LFP الذي تميز بنفس الخصائص المتزامنة مثل الاستجابات التي يسببها 4-AP (الشكل 10) ، مما يشير إلى آلية مماثلة ودوائر أساسية.

الشكل 5: مثال 4-الأمينوبيريدين الناجم عن النشاط المحتمل للعمل خارج الخلية. (أ) تظهر مخططات البيانات النقطية نشاط EAP من القنوات النشطة، التي تم اكتشافها عند خط الأساس (العلوي) ونقطتين زمنيتين (12 دقيقة - تم إنشاؤها، و27 دقيقة) بعد إضافة الحمام 4-AP (الأوسط والسفلي). تسلط النوافذ الزرقاء العمودية الضوء على فترات النشاط المتزامن (الكمون القريب) في أكثر من 5 أقطاب تسجيل كهربائية. (ب) تلخص الأفرقة تحليل خريطة أنشطة برنامج الشراكة الأوروبية لبيانات الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. يوضح المخطط الأيسر اتجاه شريحة الحبل الشوكي بالنسبة إلى مصفوفة القطب الكهربائي. تلخص اللوحة الوسطى اليسرى النشاط عند خط الأساس (الأقطاب الكهربائية النشطة الملونة باللون الأحمر) وتردد EAP المشار إليه بالتظليل الأبيض حول الأقطاب الكهربائية النشطة (تشير شدة التظليل إلى زيادة النشاط). تعرض اللوحة الوسطى اليمنى النشاط في نفس الشريحة بعد 12 دقيقة من التعرض ل 4-AP. لاحظ أن عدد الأقطاب الكهربائية النشطة (الحمراء) زاد مع تردد EAP. بالإضافة إلى ذلك ، يشار إلى التزامن بين الأقطاب الكهربائية المجاورة بواسطة خطوط توصيل حمراء ، مما ينتج خريطة نشاط الشبكة (يشير سمك الخط إلى درجة تشابه EAP بين الأقطاب الكهربائية). تعرض اللوحة اليمنى النشاط في نفس الشريحة بعد 15 دقيقة أخرى من التعرض ل 4-AP. لاحظ أن عدد الأقطاب الكهربائية النشطة (الحمراء) ودرجة نشاط EAP (الأبيض) وبنية الشبكة (الخطوط الحمراء) ظلت مستقرة خلال هذه الفترة. الاختصارات: 4-AP = 4-أمينوبيريدين; EAP = إمكانات العمل خارج الخلية. MEA = مصفوفة القطب الدقيق. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: ملخص بيانات المجموعة للنشاط المحتمل للنشاط المحتمل للنشاط المحتمل للعمل خارج الخلية الناجم عن 4-أمينوبيريدين (A-F) مخططات بيانات المجموعة التي تلخص خصائص EAP من عدة تجارب مطابقة لبيانات EAP المعروضة في الشكل 4 (البيانات ملخصة أيضا في الجدول 3 والجدول 4). ارتفع تردد EAP (A) ، العد (B) ، الأحداث المتزامنة (C) ، الأقطاب الكهربائية النشطة (D) ، الأقطاب الكهربائية المرتبطة (E) ، ومتوسط قوة الربط (F) بعد تطبيق الحمام من 4-AP ثم استقرت لمدة 15 دقيقة بعد إنشاء نشاط 4-AP. البيانات مأخوذة من 11 تجربة (البيانات باللون الأحمر هي من التجربة في الشكل 5). الاختصارات: 4-AP = 4-أمينوبيريدين; EAP = إمكانات العمل خارج الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: 4-النشاط الميداني المحلي المحتمل الناجم عن أمينوبيريدين. يتم عرض البيانات كما في الشكل 5 باستثناء بيانات LFP. (أ) تظهر مخططات البيانات النقطية نشاط LFP من قنوات متعددة، يتم اكتشافها عند خط الأساس (العلوي) ونقطتين زمنيتين (12 دقيقة - ثابتة، و 27 دقيقة) بعد إضافة الحمام من 4-AP (الأوسط والسفلي). تسلط النوافذ الزرقاء العمودية الضوء على فترات النشاط المتزامن (الكمون القريب) في أكثر من 5 أقطاب تسجيل كهربائية. (ب) تلخص الأفرقة تحليل خريطة نشاط برنامج التمويل المنخفض المستوى لبيانات الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. يوضح المخطط الأيسر اتجاه شريحة الحبل الشوكي بالنسبة إلى مصفوفة القطب الكهربائي. تلخص اللوحة الوسطى اليسرى النشاط عند خط الأساس (الأقطاب الكهربائية النشطة الملونة باللون الأحمر) ، مع الحد الأدنى من تردد LFP المشار إليه بالتظليل الأبيض حول الأقطاب الكهربائية النشطة (تشير شدة التظليل إلى زيادة النشاط). تعرض اللوحة الوسطى اليمنى النشاط في نفس الشريحة بعد 12 دقيقة من التعرض ل 4-AP. يتم زيادة عدد الأقطاب الكهربائية النشطة (الحمراء) وتردد LFP بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك ، يظهر التزامن بين الأقطاب الكهربائية المجاورة (خطوط التوصيل الحمراء) خريطة شبكة قوية لنشاط LFP (يشير سمك الخط إلى درجة التشابه بين الأقطاب الكهربائية). تعرض اللوحة اليمنى نشاط LFP في نفس الشريحة بعد 15 دقيقة أخرى من التعرض ل 4-AP. لاحظ أن عدد الأقطاب الكهربائية النشطة (الحمراء) ودرجة نشاط LFP (الأبيض) وبنية الشبكة (الخطوط الحمراء) مستقرة نسبيا خلال هذه الفترة. الاختصارات: 4-AP = 4-أمينوبيريدين; MEA = مصفوفة القطب الدقيق; LFP = إمكانات المجال المحلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: ملخص بيانات المجموعة للنشاط الميداني المحلي المحتمل الناجم عن 4-aminopyridine. (A-F) مخططات بيانات المجموعة التي تلخص خصائص LFP من عدة تجارب مطابقة لبيانات EAP المعروضة في الشكل 7 (البيانات ملخصة أيضا في الجدول 3 والجدول 4). كان تردد LFP (A) ، والعدد (B) ، والأحداث المتزامنة (C) ، والأقطاب الكهربائية النشطة (D) مستقرة لمدة 15 دقيقة بعد أن بلغ تأثير 4-AP ذروته (البيانات باللون الأحمر هي من التجربة في الشكل 7). ومع ذلك ، انخفضت الأقطاب الكهربائية المرتبطة (E) ومتوسط قوة ربط LFP (F) بمرور الوقت (كلاهما p<0.05). البيانات مأخوذة من 11 تجربة (البيانات باللون الأحمر هي من التجربة في الشكل 7). الاختصارات: 4-AP = 4-أمينوبيريدين; LFP = إمكانات المجال المحلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: 4-إمكانات العمل خارج الخلية الناجمة عن أمينوبيريدين والنشاط الميداني المحلي المحتمل في الشرائح السهمية والأفقية. تلخص اللوحات نشاط EAP و LFP في تحليل خرائط شبكة MEA للإشارات التي يسببها 4-AP في شرائح الحبل الشوكي السهمي (A) والأفقي (B). تظهر المخططات (أقصى اليسار) اتجاه شرائح الحبل الشوكي بالنسبة إلى صفائف الأقطاب الكهربائية المستطيلة. تظهر خرائط الشبكة اليسرى نشاط خط الأساس EAP و LFP في شرائح الحبل الشوكي السهمي (A) والأفقية (B) (الأقطاب الكهربائية النشطة حمراء ، والتردد المشار إليه بكثافة التظليل الأبيض ، والتزامن بين الأقطاب الكهربائية المجاورة بواسطة خطوط توصيل حمراء بسماكة تشير إلى درجة التزامن). تظهر خرائط الشبكة اليمنى نشاط EAP و LFP في نفس الشريحة بعد 12 دقيقة من التعرض ل 4-AP في شرائح الحبل الشوكي السهمية (A) والأفقية (B). لاحظ الزيادة الكبيرة في عدد الأقطاب الكهربائية النشطة ، وتواتر النشاط ، وتزامن هذه الإشارات بعد التعرض ل 4-AP ، وكشف الشبكات في كلا اتجاهي الشريحة. الاختصارات: MEA = مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة; EAP = إمكانات العمل خارج الخلية. LFP = إمكانات المجال المحلي; 4-AP = 4-أمينوبيريدين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 10: النشاط المحتمل للحقل المحلي المرتفع (K +) الناجم عن ارتفاع K⁺). تلخص اللوحات نشاط LFP العالي K ⁺ (4.5 mM) الناجم عن aCSF. (أ) أمثلة تتبع من قناة MEA واحدة عند خط الأساس وبعد إضافة الحمام ل K⁺ aCSF عالية (عصور مدتها 5 دقائق). أنتج ارتفاع تركيز K ⁺ نشاطا واضحا ل LFP كان غائبا عند خط الأساس ، على غرار ذلك الذي شوهد مع تطبيق 4-AP (الشكل 3). يعرض Inset شكلا موجيا LFP على مقياس زمني موسع. (ب) تلخص اللوحات نشاط شبكة LFP الناجم عن ارتفاع K⁺ aCSF. يوضح المخطط الأيسر اتجاه شرائح الحبل الشوكي بالنسبة إلى صفائف الأقطاب الكهربائية المربعة. تقارن خرائط الشبكة بين خط الأساس ونشاط LFP العالي K ⁺ المستحضر (الأقطاب الكهربائية النشطة الحمراء ، والتردد المشار إليه بكثافة التظليل الأبيض ، والتزامن بين الأقطاب الكهربائية المجاورة بواسطة خطوط توصيل حمراء بسماكة تشير إلى درجة التزامن). لاحظ الزيادة الكبيرة في عدد الأقطاب الكهربائية النشطة ، وتواتر النشاط ، وتزامن هذه الإشارات بعد التعرض العالي ل K ⁺ aCSF ، مما يكشف عن الشبكة الأساسية بطريقة مماثلة ل 4-AP. الاختصارات: aCSF = السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي ؛ MEA = مصفوفة القطب الدقيق; EAP = إمكانات العمل خارج الخلية. LFP = إمكانات المجال المحلي; 4-AP = 4-أمينوبيريدين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

على الرغم من أهمية DH الشوكي في الإشارات المسببة للألم والمعالجة والاستجابات السلوكية والعاطفية الناتجة التي تميز الألم ، إلا أن الدوائر داخل هذه المنطقة لا تزال غير مفهومة بشكل جيد. كان التحدي الرئيسي في التحقيق في هذه المشكلة هو تنوع مجموعات الخلايا العصبية التي تشكل هذه الدوائر⁶،^31،32. بدأت التطورات الحديثة في التقنيات المعدلة وراثيا ، بقيادة علم البصريات الوراثي وعلم الوراثة الكيميائية ، في كشف هذه الروابط المهمة وتحديد الدوائر الدقيقة التي تعالج المعلومات الحسية¹،²،³،^4،8،⁹،¹⁰،¹¹،¹²،^13،14 . لا يزال التوفيق بين كيفية اجتماع هذه الدوائر الدقيقة معا لتشكيل النشاط في شبكات أكبر من الخلايا العصبية DH يمثل تحديا ، خاصة لتطوير علاجات ألم جديدة وأكثر فعالية. وهنا، يرد وصف لنموذج وظيفي لنشاط DH الذي يتم رصده على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف واستخدام نشاط إيقاعي محفز بتقنية 4-AP لدراسة توصيلية أوسع نطاقا بالشبكة. يكشف هذا النموذج عن الارتفاع المحلي خارج الخلية (EAPs) و LFPs الأكبر القائمة على الشبكة ، والتي تعتمد على التفريغ المحتمل للعمل ويمكن استخدامها لرسم خريطة للتغيرات في خصائص الشبكة. من خلال الجمع بين استخدام MEAs لتسهيل التحقيق في الدائرة و 4-AP للكشف عن الدوائر الأساسية ، يسمح هذا التحضير بدراسة وظيفة دائرة DH على المستوى الإقليمي أو "الماكروسكوبي".

تشمل مزايا نموذج شريحة الحبل الشوكي MEA/4-AP التحكم التجريبي الصارم في إعداد في المختبر ، وهو قابل للتحقيق الدوائي المفصل ويوفر دقة مكانية وزمنية عالية للنشاط العصبي الفردي، أي EAPs و LFPs عبر منطقة نسيج كبيرة وبيانات متعددة القنوات يمكنها تقييم الإشارات عبر الشبكات والمناطق. الأهم من ذلك ، أن النشاط الإيقاعي الناجم عن 4-AP موثوق به وقابل للتكرار ويمكن دراسته في اتجاهات شريحة الحبل الشوكي المختلفة. يساعد هذا المستحضر على سد الفجوة بين التحقيقات أحادية الخلية والحيوانات بأكملها ويمكن أن يكشف عن التغيرات داخل هذه الدوائر في ظل كل من الظروف الطبيعية والمرضية. يمكن أيضا تحديد آثار الأدوية المختلفة على نشاط الشبكة. وبالتالي ، يمكن أن تعمل هذه المنصة كأداة فحص للتحقيق في تصرفات المسكنات الحالية والجديدة على دوائر DH.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أولا ، يعد التحضير الدقيق للأنسجة أمرا أساسيا لإنتاج شرائح قابلة للتطبيق للتجارب وحساسة ل 4-AP ، بغض النظر عن اتجاه الشريحة. يتم تسليط الضوء هنا على عدد من الموارد التي توفر معلومات مفصلة ونصائح حول استكشاف الأخطاء وإصلاحها. باختصار ، الدقة في صنع الحلول ، والتشريح السريع ولكن الدقيق للحبل الشوكي ، ومعلمات التقطيع المحسنة لتقليل ضغط الأنسجة وتلفها ، والعناية عند نقل الشرائح في أي وقت كلها عوامل مهمة في مرحلة التحضير. ويعد التعامل الدقيق مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، ولا سيما عندما تكون على مقربة من الأقطاب الكهربائية، أمرا أساسيا للحفاظ على وظيفة هذه المكونات. يعد الوضع الأمثل ل DH على الحد الأقصى لعدد أقطاب MEA مهما لزيادة إنتاجية التسجيل لكل تجربة. عند استخدام 3D MEAs ، هناك حاجة إلى مزيد من الرعاية والممارسة ، خاصة عند تحديد المواقع وإزالة الشرائح. من السهل سحب الأنسجة عبر أقطاب MEA البارزة وتعريض الاستخدام المستقبلي للخطر.

هناك بعض المحاذير للنهج الموصوف هنا. وخلافا للتسجيلات أحادية الخلية، حيث يمكن تحديد هوية الخلايا العصبية التي تجري دراستها إما باستخدام الوسم الجيني أو وضع العلامات المناعية اللاحقة، لا يمكن تحديد المصدر الدقيق للإشارات الكهربائية التي تكتشفها الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. التحدي الآخر هو مستوى النشاط الأساسي في شرائح الحبل الشوكي. على الرغم من أن بعض التقارير تصف الخلايا العصبية DH النشطة نغميا عند خط الأساس ، إلا أن أحدث عمل هو في أنسجة حديثي الولادة الشباب^33,34. علاوة على ذلك ، عادة ما يتم تسجيل نشاط منشط تم الإبلاغ عنه في أنسجة البالغين باستخدام استراتيجية بحث حيث يتم تطوير الأقطاب الكهربائية لتحديد هذا النشاط أولا ثم دراسته³⁵. عند استخدام نهج أخذ العينات غير المتحيز ، وإنشاء التسجيل قبل تقييم النشاط ، فإن أقل من 20٪ من الخلايا العصبية DH البالغة تظهر ارتفاعا مستمرا (تسجيلات 28/150) ، ولم يلاحظ التفريغ المنتظم إلا في 2٪ من هذه الخلايا (3/150)³⁶.

وبالنظر إلى هذه النسبة والطبيعة الثابتة للأقطاب الكهربائية بالنسبة لشريحة الأنسجة، فليس من المستغرب أن عددا قليلا من أقطاب MEA (~ 2 قطب كهربائي/شريحة في هذه الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) يظهر نشاطا عند خط الأساس. هذا النقص في النشاط هو السبب الرئيسي في أن الطريقة الموصوفة هنا تنطوي على تحفيز الشرائح باستخدام 4-AP لتعزيز EAPs واستحضار نشاط LFP. يعتمد هذا النهج على استخدام 4-AP لتنشيط نشاط الدائرة الإيقاعية في العديد من المستحضرات في المختبر ، من دراسة آليات الصرع في القشرة والحصين إلى النشاط الحركي الخيالي في القرن البطني للحبل الشوكي³⁷،^38،39. كما تسلط الأدبيات المكثفة الضوء على أن 4-AP يحفز النشاط المحصور في دوائر DH السطحية في شرائح العمود الفقري ويعتمد على الإرسال المشبكي المثير والمثبط بالإضافة إلى المشابك الكهربائية ²⁰،^21،22. علاوة على ذلك ، في الجسم الحي 4-AP تنتج الإدارة زيادة تعتمد على الجرعة في الحقول الاستقبالية للخلايا العصبية DH دون تغيير الاستجابات للتحفيز المتدرج في منطقة الاستقبال المركزية أو التسبب في استجابات منحطة²⁴. أخيرا ، يمكن ملاحظة أن إزالة الاستقطاب المتواضعة لهذه الدوائر عن طريق رفع تركيز أيون البوتاسيوم خارج الخلية ينتج أيضا نشاطا مماثلا ل LFP. وتدعم هذه الملاحظات مجتمعة الرأي القائل بأن 4-AP يكشف النقاب عن الشبكات ذات الصلة وظيفيا داخل DH السطحية التي يمكن دراستها مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. وأخيرا، فإن المصدر الدقيق لنشاط LFP غير واضح، على الرغم من أنه يعتقد أن هذه الأشكال الموجية تمثل مجموع النشاط المكتشف من خلايا عصبية متعددة تحيط بقطب كهربائي. قد تتعلق أو تنتج عن نشاط الانفجار في الخلايا العصبية أو تتوافق مع إمكانات متشابكة³⁰. بغض النظر عن أصولها ، يمكن مقارنة خصائص LFPs داخل الشرائح وفيما بينها (تسجيلات متعددة / تطبيقات دوائية) ، مما يوفر قراءة قيمة لوظيفة الدائرة والشبكة.

كما أن طبيعة مستحضرات الشرائح في المختبر تستحق النظر فيها ، مع احتمال تعطل الدوائر العصبية وتلف الخلايا على سطح الشريحة. على الرغم من ذلك ، فإن تقطيع الأنسجة يوفر وصولا كهربائيا مباشرا إلى دوائر DH ذات الصلة والوصول الدوائي دون انقطاع. وينبغي النظر بعناية في هذه المزايا والعيوب التجريبية، مع التركيز على أهمية النظر في توجيه الشريحة للحفاظ على التوصيلية في الشبكات ذات الاهتمام إلى أقصى حد. بالنسبة للغالبية العظمى من البيانات المقدمة في هذه الورقة ، يتم عرض الانتشار الإنسي الجانبي للنشاط داخل القرن الظهري والاتصال الجوهري للخلايا العصبية في هذه المنطقة. للتحقيق في انتشار النشاط الوردي الذيلي ، فإن استخدام الشرائح السهمية أو الأفقية يحافظ بشكل تفضيلي على الاتصال بين شرائح العمود الفقري ، كما هو موضح في الشكل 9.

بالإضافة إلى ذلك ، لا مفر من أن يؤدي تقسيم الحبل الشوكي إلى درجة معينة من الضرر على سطح الشرائح. يعود تقليل هذا الضرر إلى الإعداد الدقيق للأنسجة ، وتقطيع المعلمات - بما في ذلك سرعة التقدم البطيء وتذبذبات الشفرة عالية التردد - والحلول والظروف التي تكون وقائية عصبيا أثناء هذه العملية. تم نشر تقييم مفصل لفائدة الظروف المختلفة لصحة شريحة الحبل الشوكي سابقا⁴⁰. وعلى الرغم من التأثير المحتمل لصحة الشرائح على تسجيلات الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف، فإن الاتساق الداخلي في إجراءات إعداد الشرائح يضمن أن يؤثر هذا العامل على النتائج عبر مجموعة البيانات على قدم المساواة. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه يعتقد أن أقطاب MEA تلتقط إشارات تنشأ على بعد حوالي 30-100 ميكرومتر من مصدر النشاط. وبما أنه من المرجح أن يمتد سطح الشريحة التالفة على طبقة الخلية العليا، حوالي 15-30 ميكرومتر، يمكن إدارة آثار الأضرار المرتبطة بالتقطيع على تسجيلات MEA وتخفيفها لتستمر في إنتاج مجموعات بيانات ورؤى قيمة حول نشاط شبكة DH^15,41.

باختصار، يوفر نهج شريحة الحبل الشوكي MEA/4-AP الموصوف هنا منصة لفهم اتصال دوائر DH وكيف أن الشبكات التي تشكلها تقود معالجة آلام العمود الفقري. وهناك أيضا إمكانية لمزيد من التوسع المنهجي من حيث بارامترات التحليل، ومصدر تحفيز الشبكة، وقدرتها على استخدامها كمنصة للفحص الدوائي أو استخدامها مع نماذج الألم المرضي.

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.

تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) في أستراليا (منح 631000 ، 1043933 ، 1144638 ، 1184974 إلى B.A.G. و R.J.C.) ومعهد هنتر للبحوث الطبية (منحة إلى B.A.G. و R.J.C.).