Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu çalışma, transgenik channelrhodopsin-2 (ChR2) farelerinin bozulmamış murin kalplerinin kardiyak ritmini, bir mikro-LED dizisi ile lokal fotostimülasyon ve epikardiyal membran potansiyelinin eşzamanlı optik haritalamasını kullanarak kontrol etmek için bir yöntem bildirmektedir.
Ventriküler taşiaritmiler tüm dünyada mortalite ve morbiditenin önemli bir nedenidir. Yüksek enerjili elektrik şokları kullanan elektriksel defibrilasyon şu anda hayatı tehdit eden ventriküler fibrilasyonun tek tedavisidir. Bununla birlikte, defibrilasyonun dayanılmaz ağrı, doku hasarı ve prognozun kötüleşmesi gibi yan etkileri olabilir, bu da daha yumuşak kardiyak ritim yönetimi stratejilerinin geliştirilmesi için önemli bir tıbbi ihtiyacı gösterir. Enerji azaltıcı elektriksel yaklaşımların yanı sıra, kardiyak optogenetik, ışığa duyarlı membran iyon kanalları ve ışık darbeleri kullanarak kardiyak aktiviteyi etkilemek için güçlü bir araç olarak tanıtıldı. Bu çalışmada, Langendorff perfüze edilmiş sağlam murin kalplerinin başarılı fotostimülasyonu için sağlam ve geçerli bir yöntem, 3 x 3 mikro ışık yayan diyotlar dizisi (mikro-LED) uygulanan çok bölgeli pacing temelinde tanımlanacaktır. Epikardiyal membran voltaj dalgalarının eşzamanlı optik haritalanması, bölgeye özgü stimülasyonun etkilerinin araştırılmasına izin verir ve yeni indüklenen kardiyak aktiviteyi doğrudan yerinde değerlendirir. Elde edilen sonuçlar, defibrilasyonun etkinliğinin, kardiyak aritmi sırasında fotostimülasyon için seçilen parametrelere güçlü bir şekilde bağlı olduğunu göstermektedir. Kalbin aydınlatılmış bölgesinin sonlandırma başarısı için çok önemli bir rol oynadığı ve aritmi paternlerinin değiştirilmesi için aydınlatma sırasında kardiyak aktivitenin hedeflenen kontrolünün nasıl sağlanabileceği gösterilecektir. Özetle, bu teknik, kardiyak ritmin gerçek zamanlı geri besleme kontrolüne giden yolda yerinde mekanizma manipülasyonunu optimize etme imkanı ve bölgeye özgüllük açısından, spesifik olmayan elektrik şoku uygulamalarının kullanımına kıyasla kalp sistemine potansiyel zararı azaltmada yeni yaklaşımlar sunmaktadır.
Aritmi sırasında mekansal-zamansal dinamiklerin erken araştırmaları, kardiyak fibrilasyon sırasındaki karmaşık elektriksel paternlerin vorteks benzeri dönen uyarma dalgaları tarafından yönlendirildiğini ortaya koymuştur1. Bu bulgu, aritmilerin altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler verdi ve bu da daha sonra miyokard 2,3,4'ün çok bölgeli uyarılmasına dayanan yeni elektriksel sonlandırma tedavilerinin geliştirilmesine yol açtı. Bununla birlikte, elektrik alan stimülasyonu kullanan tedaviler lokal değildir ve kas dokusu da dahil olmak üzere çevredeki tüm uyarılabilir hücreleri innerve edebilir, hücresel ve doku hasarına ve dayanılmaz ağrıya neden olabilir. Elektriksel tedavilerin aksine, optogenetik yaklaşımlar, kardiyomiyosit aksiyon potansiyellerini yüksek uzamsal ve zamansal hassasiyetle uyandırmak için spesifik ve doku koruyucu bir teknik sağlar. Bu nedenle, optogenetik stimülasyon, kardiyak fibrilasyon sırasında kaotik aktivasyon paternlerinin minimal invaziv kontrolü için potansiyele sahiptir.
Işığa duyarlı iyon kanalı channelrhodopsin-2'nin (ChR2) genetik manipülasyon 5,6,7 yoluyla uyarılabilir hücrelere sokulması, fotostimülasyon kullanılarak uyarılabilir hücrelerin membran potansiyelinin depolarizasyonunu sağlamıştır. Nöronal ağların aktivasyonu, kardiyak aktivitenin kontrolü, görme ve işitmenin restorasyonu, omurilik yaralanmalarının tedavisi ve diğerleridahil olmak üzere çeşitli tıbbi uygulamalar geliştirilmiştir 8,9,10,11,12,13,14. ChR2'nin kardiyolojide uygulanması, milisaniye yanıt süresi15 nedeniyle önemli bir potansiyele sahiptir ve bu da onu aritmik kardiyak dinamiklerin hedeflenen kontrolü için çok uygun hale getirmektedir.
Bu çalışmada, transgenik bir fare modelinin sağlam kalplerinin çok bölgeli fotostimülasyonu gösterilmiştir. Özetle, Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı FP7/2007-2013 (HEALTH-F2-2009-241526) kapsamında transgenik bir alfa-MHC-ChR2 fare hattı kurulmuş ve Prof. S. E. Lehnart tarafından sağlanmıştır. Genel olarak, alfa-MHC kontrolü altında Cre-rekombinaz eksprese eden transgenik yetişkin erkek C57 / B6 / J, dişi B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm27.1 (CAG-COP4 * H134R / tdTomato) Hye / J ile çiftleşmek üzere eşleştirildi. Kardiyak STOP kaseti ikinci nesilde silindiğinden, yavrular stabil bir MHC-ChR2 ekspresyonu gösterdi ve kardiyak ışığa duyarlı kolonileri korumak için kullanıldı. Tüm deneyler, 36-48 haftalıkken her iki cinsiyetten yetişkin farelerle yapıldı. Aydınlatma, silikon bazlı mahfaza ve kısa optik cam elyaflarının uygulanmaması dışında,16,17'de açıklandığı gibi imal edilen 3 x 3 mikro-LED dizisi kullanılarak elde edilir. Kardiyak bir uygulamada ilk kullanımı18 yılında bulunur. Benzer bir imalat teknolojisine dayanan doğrusal bir mikro-LED dizisi, kalp hızı19 için nüfuz edici bir prob olarak uygulanmıştır. Mikro LED'ler, 550 μm'lik bir aralıkta 3 x 3'lük bir dizilim halinde düzenlenmiştir ve çok küçük bir alanda hem yüksek uzamsal çözünürlük hem de yüksek radyant gücü sağlar. Yazarlar bu çalışmada, yeni anti-aritmik tedavi yöntemlerinin geliştirilmesinin yolunu açabilecek çok yönlü bir yerel çok bölgeli fotostimülasyon göstermektedir.
Aşağıdaki deneysel protokol, kanüle aortun perfüzyon girişi olarak işlev gördüğü retrograd Langendorff perfüzyon ex vivo'yu içerir. Uygulanan perfüzyon basıncı ve kardiyak kasılma nedeniyle perfüzyon, aorttan ayrılan koroner arterlerden akmaktadır. Sunulan çalışmada, kalp, perfüzyon rezervuarlarının 1 m yüksekliğe, 73.2 mmHg'ye eşdeğer olarak 2.633 ± 0.583 mL / dak akış hızına ulaşmasıyla elde edilen sabit bir basınç ayarı kullanılarak perfüze edilir. Deney sırasında iki çeşit Tyrode çözeltisi perfüzyon olarak kullanılır. Düzenli Tyrode çözeltisi kararlı bir sinüs ritmini desteklerken, Low-K + Tyrode çözeltisi, murin kalplerinde aritmi indüksiyonunu sağlamak için Pinacidil ile karıştırılır. Altıgen bir su banyosunun kullanılması, kalbin altı farklı düzlemsel pencereden gözlemlenmesine izin verir ve birkaç optik bileşenin kırılma ile daha az bozulma ile birleştirilmesine izin verir.
Tüm deneyler, Alman mevzuatı, yerel hükümler ve Avrupa Laboratuvar Hayvanları Bilimi Dernekleri Federasyonu'nun (FELASA) tavsiyelerine uygun olarak hayvan refahı yönetmeliğini sıkı bir şekilde takip etti. Hayvan deneylerinin onaylanması için yapılan başvuru, sorumlu hayvan refahı otoritesi tarafından onaylanmış ve tüm deneyler hayvan refahı temsilcilerimize bildirilmiştir.
1. Deney hazırlama ve materyalleri
2. Deneysel prosedürler
Protokol, LED 1 ve LED 2 (Şekil 1) tarafından üretilen fotostimülasyon darbelerini kullanarak sağlam murin kalplerde ventriküler aritmilerin indüklenmesine izin verir ve 25 Hz ile 35 Hz arasında bir frekans f ind ve 2 ms ile 10 ms arasında bir nabız süresi Wind. Bu kadar hızlı ışık darbelerinin amacının kalp ritmini yakalamak değil, kardiyak aktivitenin dengesini bozmak olduğunu, böylece düzensiz elektrik dalgalarının üretilebileceğini ve bunun da bir aritmi kolaylaştırdığını lütfen unutmayın. Elektriksel stimülasyon ile indüksiyona göre ışıkla aritmi indüklemenin avantajı, EKG'de hiçbir artefaktın provoke edilmemesi, elde edilen sinyali kısıtlama olmaksızın post-analiz etme ve hatta hızlı tempo sırasında kalbin elektriksel tepkisini değerlendirme imkanı sağlamasıdır, bu gerçek aynı zamanda foto-defibrilasyon sırasında kalp davranışını gözlemleme imkanı sağlar. Bu, elektriksel indüksiyon veya defibrilasyon yöntemleri ile mümkün değildir. Bununla birlikte, kullanılan kurulum harici yüksek güçlü LED'lerin kullanılmasına izin vermiyorsa, örneğin, yer kısıtlamaları nedeniyle, başka bir yerde gösterildiği gibi aritmi indüklemek için kalbe ek bir pacing elektrodu yerleştirilebilir 3,22,24.
Fibrilasyon indüklendikten sonra aritmi, devam etmesini sağlamak için en az 5 saniye sürmelidir, daha sonra mikro-LED tabanlı defibrilasyon girişimleri başlatılır. Kardiyak aritmi, örneğin temel siklus uzunluğu veya baskın frekans, genlik ve morfoloji gibi ana parametreleri sürekli değiştiğinden ve hangi fotodefibrilasyon parametrelerinin en iyi sonucu sağladığını tahmin etmek güncel olmadığından, frekans, nabız genişliği arasında bir ilişki olup olmadığını anlamak büyük ilgi görmüştür. fotostimülasyon alanı ve sonlandırma oranı. Bu nedenle, farklı frekanslarda fdef, mikro-LED sayısı ve Wdef darbe süreleri ile bir dizi deney test edildi ve Şekil 3'te gösterildiği gibi N = 11 fareler için başarı oranı çıkarıldı.
1 ila 20 ms süreli darbelerin farklı başarı oranları ile defibrillenebileceği gösterilebilir(Şekil 3). Adım 2.4.6'da belirtildiği gibi, her fotostimülasyon darbesi sırasında ışık yoğunluğu LIμLED sabit tutulduğundan ve üç mikro-LED'in dokuza karşı başarı oranı önemli ölçüde daha düşük olduğundan, sunulan sonuçlar kalpte kaplanan alanın, mikro-LED'lerin sayısının ve dolayısıyla uygulanan toplam radyant akının defibrilasyonun sağlanmasında çok önemli faktörler olduğunu göstermektedir. Dizideki her mikro-LED'in bir Lambertian ışık kaynağı olduğu ve dokuya yaklaşık mesafenin sıfır olması için doğrudan kalbin yüzeyine yerleştirildiği göz önüne alındığında, tek bir mikro-LED kullanıldığında kalpteki aydınlatılmış alanın ışıma konturunun AμLED = 0.059 mm²'ye eşdeğer olduğu varsayılabilir, düz dikdörtgen LED'ler için25'te de gösterildiği gibi. Ayrıca, bazı fotonlar mikro-LED'i kenarlardan yanal olarak terk edebilse de, bunların toplam ışık yoğunluğuna katkısı o kadar küçük kabul edilir ki, etkileri ihmal edilebilir. Dizinin ışınlanmış ışığını ölçmek için, yazarlar mikro-LED dizisinden gelen radyant akıyı ticari bir güç ölçerle ölçtüler ve Tablo 1'de gösterildiği gibi kalbe ulaşan ışık yoğunluğunu hesapladılar. Tablo 1'den , radyant akının kullanılan mikro-LED'lerin sayısıyla arttığı, ancak daha önce bahsedilen aydınlatma profili etkileri nedeniyle ışık yoğunluğunun sabit kaldığı da okunabilir.
İlginçtir ki, defibrilasyon frekansında W def = 1 ms (Şekil 3a) ve W def = 20 ms (Şekil 3d) olan dokuz LED'in başarı oranının f def = 18 Hz ve f def = 20 Hz ile karşılaştırılabilir derecede yüksek olduğu da gözlemlenebilir. İndüklenen aritmilerin ortalama sıklığının 22.55 ± 4.03 Hz olduğu göz önüne alındığında, bu gerçek ChR2 murin kalpleri için başarı hızının önemli ölçüde arttığını gösterebilir. Bu aynı zamanda sayısal simülasyonlarda da gösterilmiştir26. Bununla birlikte, bu kolayca genelleştirilemez, çünkü karmaşık aritmilerin baskın frekansı sürekli değişmektedir. Bunu göstermek için, Şekil 4, fdef = 14 Hz ile iki farklı defibrilasyon girişimini göstermektedir. Şekil 4a'da EKG segmentinin başlangıcında ve EKG sinyalinin morfolojisine göre ventriküler fibrilasyon (VF) gösterilmiştir. Mikro-LED fotostimülasyon başladığında, fibrilasyon ventriküler taşikardi (VT) olma olasılığı daha yüksek olan daha düzenli bir modele dönüştürülür. Mikro-LED dizisi her kapatıldığında, orijinal kaotik VF dalgaları tekrar devralır. Böylece aritmi sonlandırılmaz. Bu örnekte VF verilen parametrelerle sonlandırılamamasına rağmen, rahatsız edilir ve daha düzenli bir desene (VT) değiştirilebilir. Şekil 4b Segment 1, fotostimülasyon başlayana kadar 24 Hz'lik baskın frekansın hafifçe arttığını ve VF'nin, baskın frekansın 14 Hz'e düştüğü Segment 2'de bir VT'ye dönüştüğünü göstermektedir. Ayrıca, Şekil 4c, Şekil 4a'dakiyle aynı f def ile sonlandırılabilen, ancak farklı bir Wdef ile sonlandırılabilen birVT'yi göstermektedir. İlk olarak, mikro-LED fotostimülasyon aritmi morfolojisini değiştirir ve sonunda 19. darbeden itibaren 1: 1 tempolu yakalama ile sonlandırır. Bu sonuçlar, fotodefibrilasyon parametrelerinin, örneğin Wdef'in, zaman içinde aritminin morfoloji değişikliğine uyum sağlaması gerektiği anlamına gelebilir. Bu sonuçlara yol açan deneyler, eylem potansiyeli süresinde (APD) 27 ortaya çıkan değişiklik nedeniyle Blebbistatin kullanılmadan gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle, bu serilerde optik haritalama yapılmamıştır.
Kırmızıya kaymış potansiyometrik boya kullanılarak optik haritalama için başka bir deney seti gerçekleştirildi (Adım 2.1.4). Yüksek hızlı kameralarla optik haritalama, sinüs ritmi (Şekil 5) ve karmaşık taşiaritmiler28 sırasında kalbin yüzeyinde yayılan uyarma dalgalarını gözlemlemeyi sağlar. Potansiyometrik boyanın fraksiyonel değişimi çok düşük olduğundan, elde edilen videolar matematiksel bir programlama dili kullanılarak sonradan işlenmiştir. Optik sinyallerin kalitesini artırmanın ilk adımı, σ = 1 standart sapmasına sahip bir Gauss yumuşatma filtresi uygulayarak gürültüyü ortadan kaldırmak, ardından köşe frekansları fyüksek = 0,1 Hz ve fdüşük = 70 Hz olan bir bandpass filtresi uygulamaktır. Fyüksekliğindeki durdurma bandı, kalbin 3 Hz < f sinüs frekansı ile 8 Hz arasında kalansinüs frekansı ile ilgili olmayan sinyaldeki yavaş değişiklikleri <, fdüşük durdurma bandı ise kamera tarafından yakalanan yüksek frekanslı gürültüyü ortadan kaldırır. Hem LED 1, LED 2 hem de mikro-LED dizisinden gelen mavi ışık emisyonlarının çapraz konuşmaya ve optik haritalamada çok yüksek bir parazit sinyaline neden olabileceğini belirtmek önemlidir. Ek olarak, kameranın önünde, Adım 1.2.3'te belirtildiği gibi, dalga boyu λfiltre-kam ile çok dar bir bandpass filtresinin bile mavi ışığın etkisini filtreleyemeyeceği gözlenmiştir. Bu kısmen boyanın kendisinin uyarma tepkisinden kaynaklanabilir. Bu nedenle, optik haritalama için optik seçerken çok dikkatli olun. Video analizi araçları için, mavi ışığın kaydedildiği tüm karelerin ihmal edilmesi gerekiyordu, böylece birçok durumda, başka bir çalışmada da belirtildiği gibi, fotostimülasyon sırasında kalbi görselleştirmek mümkün değildir29.
Şekil 1: Elektrik ve optik kurulumun şeması. (a) LED 1 ve LED 2, aritmi indüksiyonu ve yedek defibrilasyon için kullanılan mavi bir ışık kaynağı sağlar. LED 3, kırmızıya kayan boya DI-4-ANBDQPQ için bir uyarma ışık kaynağı olarak kullanılır. Kırmızı ışık, dikroik ayna DM aracılığıyla kalbe yönlendirilir. Koyu kırmızı renkte gösterilen emisyon ışığı, metinde belirtildiği gibi yüksek hızlı kamera tarafından bir emisyon filtresi aracılığıyla kaydedilir. LED 2 ve EKG elektrotları basitlik için gösterilmemiştir. (b) Kaydedilen EKG sinyalinin kırmızı renkle gösterilen bir segmenti. Koyu mavi, LED 1 ve LED 2'den gelen ışık darbelerini f ind = 35 Hz ve Wind = 4 ms frekansında fibrilasyonuindüklemek için kullanılan bir frekansta gösterir. Işık uyaranını bitirdikten hemen sonra, ventriküler fibrilasyon (VF) gözlenebilir. Açık mavi renkte gösterilen mikro-LED tabanlı fotostimülasyon (f def = 16 Hz, Wdef = 20 ms) aritmi başarıyla sonlandırır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kalp hazırlığı . (a) Sağlam kalbi ve çevresindeki organları gösteren bir farenin açık göğsü. (b) Daha fazla hazırlık için buz gibi soğuk Tyrode'un çözeltisine batırılmış ekşimiş kalp. (c) Fare kalbi künt bir iğneye düzgün bir şekilde bağlanmıştır. (d) Murine'in kalbi Tyrode'un çözümünde askıya alındı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Deneysel olarak çıkarılan başarı oranları. Farklı darbe sürelerinde üç, altı ve dokuz LED kullanan 30 mikro-LED tabanlı fotostimülasyon darbesi için başarı oranları W def ve N = 11 için fdef frekansları. Ortalama S.E.M.'nin standart hatasıyla gösterilen hata çubukları. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Fotostimülasyon yoluyla kardiyak ritmin manipülasyonu . (a) Sonlandırılmamış bir aritmi EKG kaydının segmenti. (b) Panel a'da gösterilen EKG'nin spektrogramı. Segment (1)'in güç spektral yoğunluğu (PSD), baskın frekansı 24 Hz. olan bir aritmi gösterir. Başarılı bir defibrilasyon girişiminin baskın frekansının 14 Hz. Segment (3) Başarısız sonlandırma ve baskın frekans 24 Hz. (c) EKG'si ile aritmik davranışa geri döndüğü gözlenebilir. (d) Panel c'de görüntülenen başarılı sonlandırmanın spektrogramı. Segment (1), baskın frekansı 23 Hz olan bir ventriküler taşikardi (VT) gösterir. gösterilen ayarları kullanarak segment (2) fotostimülasyonu. Segment (3), 3.5 Hz'lik temel bir frekansa sahip normal bir sinüs ritmine ve bunun sonucunda ortaya çıkan harmoniklere yol açan başarılı bir sonlandırma görüntüler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Tüm kalbin optik haritalanması. Normal sinüs ritminde kalbin tek bir atışı sırasında floresan yoğunluğunun değişimi gösterilmiştir. Kalp, sağ ve sol ventrikül görünür olacak şekilde kameraya bakacak şekilde konumlandırıldı (RV, LV). Yıldız işareti, üstte gösterilen işlem potansiyelinin alındığı pikseli gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
MicroLED sayısı | Işınlanmış alan Aμled [mm2] | Radyant akı φ [mW] | Işık Yoğunluğu LI [mW mm-2] |
3 | 0.178 | 5.9 ± 0.47 | 33,11 ± 2,66 |
6 | 0.356 | 11,91 ± 0,84 | 33,42 ± 2,37 |
9 | 0.535 | 17,85 ± 0,61 | 33,39 ± 1,14 |
Tablo 1: Mikro-LED dizisinin ölçülen radyant akısı ve buna karşılık gelen ışık yoğunluğu.
Kardiyak taşiaritmilerin başarılı bir tedavisi kardiyak tedavinin anahtarıdır. Ancak aritmi başlangıcı, sürekliliği ve sonlandırılmasının altında yatan biyofiziksel mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Bu nedenle, kardiyak araştırmalar, elektrik şoku tedavisini aritmilerin daha yumuşak bir şekilde sonlandırılmasına yönelik olarak optimize etmeyi ve böylece hastaların yaşam kalitesini arttırmayı amaçlamaktadır 28,29,30,31. Düşük enerjili elektriksel yaklaşımlar, ciddi yan etkilerin önemli ölçüde azaltılmasını vaat eder, ancak yine de istenmeyen kas uyarımına neden olabilir. Kardiyak optogenetik bu sınırlamanın üstesinden gelebilir ve sadece doku-nazik bir sonlandırma tekniği değil, aynı zamanda sağlam murin kalbindeki ve hücre kültürlerinde vorteks benzeri uyarma dalgalarının aritmi-spesifik hedefli kontrolünü araştırmak için esnek bir platform sağlayabilir32,33.
Bu motivasyon göz önüne alındığında, sağlam bir fotostimülasyon kurulumunun yanı sıra bir protokol tasarlandı ve uygulandı, her ikisi de üç boyutlu panoramik optik haritalama çalışmalarına kolayca genişletilebilecek son derece uyarlanabilir bir optik sistem sunuyor34.
Kardiyak aritmilerin, fotostimülasyon için seçilen parametrelere, örneğin kalpteki aydınlatılmış alana bağlı olarak farklı başarı oranları ile başarılı bir şekilde sonlandırılabileceği gösterilebilir. Sunulan sonuçlar, ışınlanmış yüzeyin arttırılmasının,22'de de gösterildiği gibi, iletim bloğu ile kaotik aktiviteyi söndüren kritik sayıda kardiyomiyosit aldığını göstermektedir. Bu çalışmada, fotodefibrillate için gereken enerji E = 10.69 ± 0.37 mJ'dir (dokuz mikro LED, 30 darbe ve darbe genişliği Wdef = 20 ms kullanılarak). Bu, sırasıyla daha büyük bir alan 22 veya tüm kalp 24'ün aydınlatıldığı E 22 = 228.8 mJ ve E 24 = 153.6 mJ ile 22,24'te daha önce bildirilenden daha düşük olduğu ortaya çıktı. Bununla birlikte, iyi sınırlandırılmış desenli bir alanın, E 35 = 1.8 mJ ile sonuçlanan 10 fotodefibrilasyon darbesi ile aydınlatıldığı 35'te gösterilen yaklaşımla karşılaştırıldığında, bu çalışmadaki fotodefibrilasyon enerjisi önemli ölçüde daha yüksektir. Diğer üç yaklaşımın aksine, sunulan protokol ile %90'ın üzerinde bir başarı oranına ulaşılamamıştır. Daha yüksek bir fotodefibrilasyon enerjisine rağmen düşük performansın olası bir nedeni, altta yatan aritminin karmaşıklığının dikkate alınmaması olabilir. Kalpteki küçük bir alanı aydınlatarak ve aynı anda bir aritminin mekansal-zamansal dinamiklerini ölçerek yüksek bir sonlandırma oranının elde edildiği 35'te sunulan sonuçlarla ilgili olarak, sunulan yaklaşım, kalbin mevcut durumuna bağlı olarak farklı bir mikro-LED aydınlatma paterni ile yanıt veren geri bildirim kontrolü göz önünde bulundurularak kesinlikle daha da geliştirilebilir. Ayrıca, aritmilerin her zaman mevcut yöntemle sonlandırılamamasına rağmen, fotostimülasyon sırasında içsel kompleks dinamiklerin bozularak daha düzenli bir zamansal duruma yol açabileceği de gösterilmiştir. 36'da gösterildiği gibi, monomorfik (daha sıralı) ve polimorfik (daha az sıralı) aritmilere hitap ederken sonlandırma oranı önemli ölçüde farklıdır. Bu nedenle, daha iyi bir defibrilasyon hızına doğru atılacak mantıklı adım, bir VF atağı sırasında kardiyak dinamikleri etkilemek, aritmi daha az karmaşık bir modele dönüştürmek ve başka bir darbe seti ile sona erdirmek ve bu şekilde iki aşamalı bir fotostimülasyon yaklaşımı oluşturmak olabilir.
Perfüzyon protokolü ile ilgili olarak, en kritik adımlar kalbin doğru ekstraksiyonu ve hazırlanmasında ve ayrıca optik haritalama optiklerinin doğru ayarlanmasında bulunur. Optik haritalama dahil olmak kesinlikle boya spektrumlarının doğru seçimini, uygun uyarma ışık kaynaklarını ve kamera29 için iyi seçilmiş optik filtreleri gerektirir. Aksi takdirde, kaydedilen optik sinyaller çok gürültülü olabilir ve ayrıca boya uyarımı ile fotostimülasyonun çapraz konuşmasını içerebilir. Bu nedenle, sonraki analizler, sinyallerin birkaç analitik filtreyle sonradan işlenmesini ve genellikle kötüleşmeye neden olan görüntü yumuşatma işlemini gerektirecektir.
Bu protokoldeki bir diğer önemli adım, mikro-LED dizisinin doğru ve hassas bir şekilde yerleştirilmesidir. Mikro-LED dizisi ile sürücü arasındaki ara bağlantı ucu çok ince ve esnek olduğundan, dizinin her deney için kalp yüzeyinde yaklaşık olarak aynı yere yerleştirilmesini sağlamak bazen zordur. Konumlandırmayı kolaylaştırmak ve mikro-LED dizisinin edinilen konumunu sabitlemek için, dizinin bir mikromanipülatöre bağlanmasına izin veren bir tutucu 3D olarak tasarlanmış ve basılmıştır. Bu, Tyrode'un çözümündeki dizinin hareketi üzerinde daha fazla kontrol sağlar. Mikro-LED dizisinin birbirine bağlanan ucu için seçilen malzemeye bağlı olarak, bir tutucunun kullanılması gerekli olmayabilir.
Ayrıca, protokolün bir diğer kritik adımı, örneğin Pinacidil37 gibi aritmi yanlısı ilaçların eklenmesidir. Birkaç kimyasal bileşiğin kalbin fizyolojik tepkisini değiştirdiği iyi bilindiğinden, sonuçları analiz ederken ve yorumlarken bu dikkate alınmalıdır. Optik haritalama söz konusu olduğunda, önerilen protokol mekanik bir çözücü olarak Blebbistatin'i kullanır. Bu, kayıt sırasında hareket artefaktlarını kaldırma avantajına sahiptir, ancak APD27'yi de uzatabilir. Bu dezavantajın üstesinden gelmek için, kayıt sırasında hareket izleme yöntemlerini analiz etmek38,39 olarak kabul edilebilir. Bu şekilde, kalbin normal fizyolojik durumu korunur ve yüksek kaliteli bir sinyal elde edilebilir.
Sunulan protokolün çok bölgeli foto-defibrilasyon için kullanılabileceği kanıtlanmış olmasına rağmen, hala bazı sınırlamaları vardır. Bazı durumlarda fibrilasyonun mikro-LED bazlı fotostimülasyon ile sonlandırılamayacağı, ancak sadece bozulabileceği ve frekans değişikliklerine neden olduğu bulunmuştur. Bir hipotez, kalpteki kıvrımlı dalgaların sadece sol ventrikülden yer değiştirdiği ve kalbin diğer bölgelerinde kendilerini yenilediğidir. Global aydınlatma24 gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, mevcut yöntem kalbin daha küçük bir kapsama alanı nedeniyle daha düşük bir başarı oranı sunmaktadır. Bununla birlikte, spiral aktivitenin uygun donanım tabanlı tanıma yöntemiyle, sonlandırma başarı oranının iyileştirilmesinin mümkün olduğundan eminiz.
Sonuç olarak, sunulan fotostimülasyon sistemi, kardiyak aritmi ile ilgili çoklu kardiyoversiyon yaklaşımları ve manipülasyon çalışmaları için güçlü bir deneysel araç oluşturmaktadır. Bu sistemde öğrenilen bilgiler, klinik olarak ilgili büyük hayvan modellerinde yeni potansiyel (fotoğraf) defibrilasyon protokollerini araştırmak ve değerlendirmek için kullanılacaktır.
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Yazarlar, deneyler sırasında mükemmel teknik destekleri için Marion Kunze ve Tina Althaus'a teşekkür eder. Sonuçlara yol açan araştırma, Avrupa Topluluğu'nun Yedinci Çerçeve Programı FP7/2007-2013'ten HEALTH-F2-2009-241526 hibe anlaşması numarası altında fon almıştır. Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi, DZHK e.V. (Proje MD28), ortak site Goettingen, Alman Araştırma Vakfı CRC 1002 (proje C03) ve Max Planck Derneği tarafından da destek sağlandı. Bu çalışma kısmen Alman Araştırma Vakfı tarafından finanse edilen BrainLinks-BrainTools, Mükemmellik Kümesi (DFG, hibe numarası EXC 1086) tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemical Components | |||
Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
Electrical Setup | |||
Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
Hexagonal water bath | |||
LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
micro-LED Array Components | |||
Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
Optical Mapping | |||
Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25x36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks - LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs - Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır