Bu protokol, PhyB ve PIF3 kullanarak kırmızı ve uzak kırmızı ışıkla gen ekspresyonunu kontrol etmek için optogenetik deneylerin nasıl yapılacağını açıklar. Gen ekspresyonunun veya diğer optogenetiğin bir bilgisayarla kontrol edilmesini sağlayan basit ve esnek bir aydınlatma sistemi oluşturmak için adım adım talimatlar dahildir.

Işık kullanarak biyolojik süreçleri kontrol etmek, araştırmacıların birçok biyolojik süreci manipüle edebilecekleri doğruluğu ve hızı artırmıştır. Optik kontrol, fonksiyonu diseke etmek için benzeri görülmemiş bir yeteneğe izin verir ve yeni genetik tedavileri etkinleştirme potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, optogenetik deneyler, araştırmacılar için genellikle bir darboğaz olan mekansal, zamansal veya yoğunluk kontrolüne sahip yeterli ışık kaynakları gerektirir. Burada, mevcut farklı optogenetik araçlar için kolayca özelleştirilebilen düşük maliyetli ve çok yönlü bir LED aydınlatma sisteminin nasıl oluşturulacağını detaylandırıyoruz. Bu sistem, ayarlanabilir LED yoğunluğu ile manuel veya bilgisayar kontrolü için yapılandırılabilir. Devreyi oluşturmak, bilgisayar kontrollü hale getirmek ve LED'leri oluşturmak için resimli bir adım adım kılavuz sunuyoruz. Bu cihazın montajını kolaylaştırmak için, bazı temel lehimleme tekniklerini de tartışıyoruz ve LED'leri kontrol etmek için kullanılan devreyi açıklıyoruz. Açık kaynaklı kullanıcı arayüzümüzü kullanarak, kullanıcılar kişisel bir bilgisayarda (PC) veya ucuz bir tablette hassas zamanlamayı ve ışığın yanıp sönmesini otomatikleştirebilirler. Bu otomasyon, sistemi, genleri, sinyal yollarını ve büyük zaman ölçeklerine yayılan diğer hücresel aktiviteleri kontrol etmek için LED'leri kullanan deneyler için kullanışlı hale getirir. Bu protokol için, ihtiyaç duyulan tüm parçaları inşa etmek veya optogenetik deneyler yapmak için aydınlatma sistemini kullanmak için elektronikte önceden uzmanlık gerekmez.

Optogenetik araçlar her yerde yaygınlaşıyor ve gen ekspresyonu, hücre sinyalizasyonu ve daha birçok ^1,2,3 gibi biyolojik süreçleri optik olarak kontrol etmek için sürekli olarak yeni teknoloji geliştiriliyor. Hücresel süreçleri ışıkla kontrol etme yeteneği, hızlı kinetik, sıkı mekansal kontrol ve ışık yoğunluğu ve maruz kalma süresi ile kontrol edilebilen doza bağlı düzenlemeye izin verir. Bu araçları kullanmak için, bu parametreleri kontrol etmek için bir cihaz gereklidir. Son zamanlarda, sırasıyla kırmızı / uzak kırmızı ışık kullanarak genleri geri dönüşümlü olarak aktive eden ve devre dışı bırakan genetik olarak kodlanmış bir PhyB-PIF3 memeli gen anahtarı geliştirdik,⁴. Bu sistem birkaç memeli hücre hattında test edildi ve ışık darbeleri de dahil olmak üzere çok az miktarda ışıkla bile gen ekspresyonunun benzersiz indüksiyonunu sağladı. PhyB anahtarı ve benzeri araçları kullanmak isteyen araştırmacılar ^5,6 aydınlatma yoğunluğunu ve süresini kontrol etme yöntemleri hakkında sık sık bilgi talep etmektedirler. Bu nedenle, bu protokolü optogenetik için bu araçların daha geniş çapta benimsenmesini sağlamak için adım adım talimatlarla geliştirdik.

LED'lerin yaygın kullanımından önce, fitokromlar⁷ gibi ışığa duyarlı proteinleri incelemek için filtreli geniş bant ışık kaynakları kullanılmıştır. Son zamanlarda, bazı LED aydınlatma sistemleri optogenetik araçlar 8,9,10,11,12 ile birlikte yayınlanmıştır, ancak bu protokoller elektronik / yazılım konusunda önemli uzmanlık gerektirebilir, özel ekipman gerektirebilir (örneğin, 3D yazıcılar, lazer kesim makineleri veya fotomaskeler) veya bazı araştırmacıların araştırma ihtiyaçları için ihtiyaç duyacakları adım adım talimatları sağlamaz. Çok kuyulu bir plakadaki bireysel kuyuların bağımsız kontrolü yararlı olsa da, araştırmacıların yalnızca açık ve koyu veya kırmızı ışıkta uzak kırmızı ışıkta birkaç farklı örneği karşılaştırmaları gerektiğinde genellikle gereksizdir. Ayrıca, mevcut birçok ticari sistem, sınırlı özelleştirme kabiliyeti ile pahalıdır. Bununla birlikte, bu protokolde açıklanan LED'ler uygun maliyetli, parlaktır ve birçok şekilde monte edilebilir; bu nedenle, birkaç farklı numune türünü aydınlatmak için kullanılabilirler. Protokol ve sağlanan yazılım ile ultraviyole (UV)'den NIR'e kadar değişen LED'ler, UVR8 13,14, Dronpa 15,16, LOV domainleri 17,18, Step Function Opsins ^19,20, CRY2^21,22, PhyB ^4,23,24 kullanılarak optogenetik deneyler yapmak için yazılımla birlikte kullanılabilir ve kontrol edilebilir. ^,25, bakteriyel fitokromlar^26,27,28,29 ve diğer ışığa duyarlı sistemler ^30,31,32.

Bu protokol, ışık stimülasyonu için farklı parametreleri kontrol etmek için gereken devrelerin ve diğer donanımların yanı sıra bir optogenetik deney yürütmek için moleküler / hücresel araçların montajı için bir öğretici oluşturur. Ek olarak, klonlama için daha küçük ve daha kararlı olan Kyriakakis ve ^ark.4'ten optimize edilmiş plazmidleri rapor ediyoruz. Bu protokol sayesinde, elektronik ve optik konusunda uzmanlığı olmayan biyologlar, esnek ve sağlam aydınlatma sistemleri kurabilirler. Adım adım bir şekilde, optogenetik araçların daha geniş çapta benimsenmesi için teknik darboğazı ortadan kaldırarak LED sistemlerinin nasıl oluşturulacağını gösteriyoruz. Bu sistem, çoğu hücre kültürü inkübatöründe, tel portları içermese bile kolayca kullanılabilir. Örneğin, LED sistemini nemlendirilmiş bir CO₂ inkübatöründe performansta herhangi bir düşüş olmadan 6 aydan fazla bir süre boyunca sürekli olarak tuttuk. Ayrıca, LED sisteminin bir bilgisayara nasıl bağlanacağını ve GitHub'da (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces) sağladığımız açık kaynaklı yazılımlarla nasıl arayüzleneceğini de açıklıyoruz. Bu protokolü kullanarak bir sistem oluşturmak, araştırmacılara potansiyel sorunları ayıklamak, parçaları değiştirmek ve işlevleri iyileştirmek / genişletmek için temel bilgileri sağlar.

Sisteme genel bakış

Aydınlatma sisteminin kurulması (1) elektronik devreyi kurmayı, (2) çevre birimlerini (güç kaynağı kablosu, güç anahtarı, vb.) inşa etmeyi, (3) LED'leri oluşturmayı, (4) tüm bu bileşenleri birleştirmeyi ve (5) LED'leri bir kullanıcı arayüzü ile kontrol etmek için yazılımı yüklemeyi içerir (Şekil 1A). Tamamlandığında, aydınlatma sistemi bir kullanıcı arayüzü ile bağımsız olarak dört adede kadar LED'i kontrol edebilir (Şekil 1B). Kullanıcı arayüzü, her LED'in belirli zaman aralıklarında yanıp sönmesini ve belirli bir süre sonra kapanmasını sağlar. Aydınlatma programlarına belirli bir zamanda başlamak için bir başlangıç gecikmesi de vardır. Potansiyometreler (POT'lar) her LED'in yoğunluğunu bağımsız olarak düzenler veya bilgisayar olmadan manuel LED kontrolü için kullanılabilir. LED'lere giden teller, herhangi bir özel uzunlukta olabilir, bu da bir inkübatöre veya laboratuar alanına kolayca yerleştirilmelerini sağlar. Bu LED'lerin yüksek gücü nedeniyle, geniş bir alanı uzaktan tek bir LED ile aydınlatmak için kullanılabilirler.

LED sürücü açıklaması

LED'lerin yoğunluğuna güç sağlamak ve kontrol etmek için, bu protokol bir "LED sürücü" oluşturmak için adımlardan geçecektir. Her LED'in çalıştığı bir voltaj aralığı vardır (Şekil 1C). Çalışma sırasında, regülatörün ışık yoğunluğunu kontrol eden çıkış voltajı bir potansiyometre ile ayarlanabilir. POT, çıkış voltajını/parlaklığını ayarlayarak direnci değiştirir. 1kΩ (1 kilo-ohm) POT ile ayarlama, "yüksek voltaj devresi" dediğimiz şeyi verir ve 1,35 V ila 2,9 V aralığına sahiptir. 2,9 V, düşük voltajlı LED'leri çalıştırmak için çok yüksek olduğundan (Şekil 1C), aralığı düşük voltajlı LED'lerle eşleşecek şekilde sınırlayan tek bir modifikasyon (Direnç 3 veya "R3" Ek Şekil 1A) gösteririz. R3, potansiyometreye paralel olarak LED'lere uygulanan maksimum voltajı 1,85 V'a ( Ek Şekil 8'de ayrıntılı olarak açıklanan montaj) düşürmeye yarar. Akım yerine parlaklığı kontrol etmek için voltaj kullanarak, sistem farklı çalışma voltajlarına sahip LED'ler için daha esnektir. Şekil 1C, optimum devre seçimine rehberlik etmek için yüksek ve düşük voltajlı LED'lerin bir listesini içerir. Bu tasarım, minimum voltajı yeterince düşük tutar, böylece potansiyometre kapalıyken LED tamamen kapanır ve voltajın LED'in tipik çalışma voltajının üzerine çıkmasına izin vermez. PhyB optogenetics için, düşük voltaj devresini kullanan koyu kırmızı ve uzak kırmızı LED'ler kullanıyoruz.

LED bilgisayar kontrol sistemi açıklaması

LED aydınlatma sistemi, bilgisayar veya mikrodenetleyici olmadan sürekli aydınlatma için kullanılabilir. Bununla birlikte, darbeli programlar ve bireysel LED zamanlamasını kontrol etmek için bir mikrodenetleyici kurulmalıdır. LED'leri kontrol etmek için bir mikrodenetleyici kullanmak için, mikrodenetleyiciyi devreye bağlamak için bir transistör gereklidir. Bu transistör, mikrodenetleyiciden gelen voltajı algılar ve iletken veya yalıtkan olmaktan çıkar. "Açık" ve "kapalı" yı kontrol etmek için, R2 boyunca kontrol edilebilir bir şant olarak "NPN anahtarlama tipi transistör" (2N2222) olarak adlandırılan şeyi kullanıyoruz (Ek Şekil 1A). Mikrodenetleyiciden gelen voltaj transistör tabanına uygulandığında, transistör iletken hale gelir ve LED voltajını düşük yapar, LED'i kapatır. Böylece, LED ve transistör açma ve kapama durumları doğrudan PC'ye yüklenen yazılım tarafından kontrol edilen mikrodenetleyici tarafından kontrol edilir.

Aydınlatma sistemini yapmak için aşağıdaki adımlar gereklidir: Elektrik devresini oluşturun; güç kaynağını, manuel güç anahtarını, POT'ları ve mikrodenetleyici bağlantısını kurmak; LED'leri oluşturmak; aydınlatma sistemine uyacak şekilde bir kara kutu yerleştirin; tüm kabloları ve cihazları bağlayın; LED kontrol yazılımını kurun, hücreleri ışıkla uyarın; çift lusiferaz testi kullanarak gen ekspresyonunu ölçün.

1. Elektrik devresini kurun

NOT: Kullanılabilir bir LED için tek bir devre oluşturma protokolü burada açıklanmıştır. Bunu dört LED'e kadar genişletme talimatları ek bilgilere dahil edilmiştir.

1. Duman emiciyi ve havyayı açın. Silme süngerine su ekleyin, lehimi elinizin altında bulundurun.
   DİKKAT: Dumanı gidermek ve yanıkları önlemek için güvenlik önlemleri aldığınızdan emin olun.
2. Devre bileşenlerini, ek panellerde gösterilen sırayla baskılı devre kartına (PCB kartı) lehimlemeye başlayın.
   NOT: Önce bileşenin metalini ve PCB kartını ısıtmak için havya ucunda az miktarda lehim kullanın ve ek lehimi doğrudan bileşenlerin üzerine eritin; akı çok yardımcı olabilir.
3. Lehim atlama teli telleri ve bileşenleri (Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3).
   1. Jumper telleri için (devre kartındaki iki noktayı birbirine bağlayan yalıtımlı kablolama), jumper kitinden iki parça turuncu [7,6 mm (0,3 inç)] ve sarı [12 mm (0,4 inç)] tel kullanın.
   2. PCB kartını "yardım ellerinine" takın ve jumper tellerini aşağıdaki iğne deliklerine yerleştirin, terminalleri 45 derece bükün ve akı ekleyin (Şekil 2, Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3): a1 ve a3 → zemin (-) (turuncu), a7 → güç kaynağı (+) #7 (sarı), d2 → d6 (sarı).
   3. Lehimleyin ve ardından tellerin arkasını kesin.
   4. LM317T voltaj regülatörünü aşağıdaki iğne deliklerine takın, pimleri bükün ve akı ekleyin (Şekil 2 ve Ek Şekil 4): Adj → e5, V_çıkış → e6, V → e7_.
   5. Önce sol ve sağ terminalleri lehimleyin, kırpın, sonra lehimleyin ve orta terminali kesin.
   6. Devrenin düşük voltaj aralığını ayarlamak için, 820 Ω bir direnci iğne deliklerine, lehimlere ve c2 → c5'e kadar yerleştirin (Şekil 2 ve Ek Şekil 5).
   7. Mikrodenetleyici tarafından LED kontrolünü etkinleştirmek için, transistörü b3-b5 içine takın (Şekil 2 ve Ek Şekil 6): Toplayıcı → b3, Baz → b4, Yayıcı → b5.
      NOT: Doğru şekilde takmak için transistörün yönüne dikkat edin; Collector, Base ve Emitter tanımını bulmak için teknik özellikleri kontrol edin.
4. POT, LED, mikrodenetleyici ve güç kaynağı için telden kabloya konektörleri lehimleyin.
   NOT: Telden kabloya konektörlerin tellerinin rengine ve dişi veya erkek telden kabloya konektör kullanıp kullanmadığına dikkat edin.
   1. İstenilen LED için bir "düşük voltaj" devresi mi yoksa "yüksek voltaj" devresi mi gerekli olduğunu belirleyin (Şekil 1C).
      NOT: LED "düşük voltaj" listesindeyse, POT'a paralel bir direnç gereklidir.
   2. "Düşük voltaj" veya "yüksek voltaj" devresi için, teli dişi bir telden kabloya konektörden a5 deliğinden yerleştirin (Ek Şekil 7). Alçak gerilim devresini yaparken henüz yerine lehimlemeyin.
      NOT: Küçük tel kılların pul pul dökülmemesi için çıplak tel uçlarını bükün. Tel, yıpranmadan iğne deliğinden itilemeyecek kadar kalın görünüyorsa, 2-6 ipliği kesin ve sonra bunları tekrar bir araya getirin (Ek Şekil 7B-D).
   3. "Yüksek voltaj" devresini yapıyorsanız, adım 1.4.5'e atlayın. "Düşük voltaj" devresini yapıyorsanız, 560Ω'luk bir direnci aynı delikten (a5) itin ve telden kabloya konektör kablosuyla lehimleyin.
   4. Direncin diğer ucunu toprağa bağlayın (Ek Şekil 7G).
   5. Lehimlenmiş dişi telden kabloya konektörün diğer ucunu, toprağa bağlayan a5 deliğine yerleştirin ve lehimleyin (Ek Şekil 8A, B).
   6. Mikrodenetleyici bağlantısı için, bir erkek telden tel konektörün bir ucunu a4 deliğine ve diğerini toprağa bağlı bir deliğe yerleştirin (Ek Şekil 9A-C).
   7. LED bağlantısı için, dişi telden kabloya konektörün bir ucunu a2 deliğine ve diğer ucunu toprağa bağlı bir deliğe yerleştirin (Ek Şekil 9D, E).

2. Güç kaynağı, manuel güç anahtarı, POT'lar ve mikrodenetleyici bağlantısı oluşturun

1. Güç kaynağını oluşturun.
   1. Turuncu [7,6 mm (0,3 inç)] bir jumper'ı a29'dan yere lehimleyin (Ek Şekil 10).
   2. Dişi telden kabloya konektörü a30'dan güç kaynağına (+) lehimleyin (Ek Şekil 11A-C).
   3. Erkek telden kabloya konektörü c29'dan c30'a lehimleyin (Ek Şekil 11D-F).
   4. Konektörü bir güç kaynağı kablosundan kesin, kabloları açığa çıkarın ve sıyırın (Ek Şekil 12A-C).
   5. Bir akı kalemi kullanarak lehimlemeden önce tellere akı ekleyin (Ek Şekil 3G).
   6. Erkek telden kabloya konektörün etrafına 3,18 mm'lik (1/8 inç) bir büzülme tüpü ve güç kaynağı kablosunun üzerine 4,76 mm'lik (3/16 inç) daha kalın bir parça yerleştirin (Ek Şekil 12D).
   7. Güç kaynağından ve erkek telden kabloya konektörden kabloları birlikte çevirin ve lehimleyin (Ek Şekil 12E, 13A, B).
   8. Daha küçük çaplı büzülme borusunu 3,18 mm (1/8 inç) bağlantıların üzerine yerleştirin ve bir ısı tabancasıyla küçültün (Ek Şekil 13C, D).
   9. Daha küçük küçültme borusu 3,18 mm (1/8 inç) üzerine 4,76 mm (3/16 inç) daha büyük çaplı bir shrink tüp yerleştirin ve tekrar ısıtın (Ek Şekil 13E,F).
2. Manuel güç anahtarını oluşturun.
   1. Büzülme tüpünü 3,18 mm (1/8 inç) anahtarın tellerinin üzerine yerleştirin (Ek Şekil 14A).
   2. Erkek telden kabloya konektörün tellerini bükün ve lehimleyin (Ek Şekil 14B, C).
   3. Büzülme borusunu lehimli bölümlerin üzerine 3,18 mm (1/8 inç) yerleştirin ve bir ısı tabancasıyla küçültün (Ek Şekil 14D,E).
3. Erkek telden kabloya konektörü POT'a bağlayın.
   1. Telden kabloya konektörün siyah telini POT'un orta terminalinin etrafına iliştirin (Ek Şekil 15B).
   2. Terminalin etrafına sıkıca iliştirilmiş teli bükün ve lehimleyin (Ek Şekil 15C).
      NOT: Küçük hassas penseler sıkı bir büküm yapmanıza yardımcı olabilir.
   3. Ek Şekil 15D'de olduğu gibi terminale kırmızı tel bağlantısıyla tekrarlayın.
   4. Kırmızı okun yakınındaki metal tırnağı kırmak için pense kullanın (Ek Şekil 15E,F).
4. Mikrodenetleyici bağlantısını kurun (yalnızca bilgisayar kontrollü LED'ler için gereklidir).
   1. Birden fazla LED için bir LED sürücüsü yapıyorsanız, bir dişi telden kabloya konektör dışındaki tüm siyah telleri kesin (Ek Şekil 16A).
   2. Telden kabloya konektörlerin uçlarını gösterildiği gibi sıkın (Ek Şekil 16B-D).
   3. Kıvrımlı uçları dikdörtgen konektörden itin (Ek Şekil 16E).

3. LED'leri oluşturun

1. Tel uçlarını (~ 5 mm) sıyırın ve Ek Şekil 3G'de olduğu gibi bir akı kalemi kullanarak akı uygulayın.
   NOT: Kabloları LED tabanına verimli bir şekilde lehimlemek için, LED tabanındaki kontaklara ve tellere akı eklenmelidir.
2. Teli aşağıdan ısıtarak ve üstten lehim ekleyerek teli kalayın (Ek Şekil 17B).
3. LED tabanının yüzey temasına akı yerleştirmek için akı kalemini kullanın (Ek Şekil 17C).
4. Büyük bir lehimleme ucuna (~4–5 mm) bol miktarda lehim yerleştirin (Ek Şekil 17D), temastaki LED tabanını ısıtmak için kullanın (Ek Şekil 17E). Birkaç saniye sonra, lehimi kontak boyunca sürükleyin (Ek Şekil 17F). Diğer kontakta 3.3-3.4 arasındaki adımları tekrarlayın (Ek Şekil 17G).
   DİKKAT: LED taban lehimleme sırasında çok ısınabilir. LED tabanını erimeyecek veya yanmayacak bir yüzeye yerleştirin.
5. Siyah teli saç tokalarını kullanarak "C+" (katot) kontağına klipsleyin (Ek Şekil 18A).
6. Büyük lehimleme ucuna bol miktarda lehim yerleştirin (Ek Şekil 18B) ve LED tabanındaki lehim eriyene kadar telin üzerine bastırın (Ek Şekil 18C). Teli basılı tutun (Ek Şekil 18D) ve teli yerinde tutarken havyayı çıkarın (Ek Şekil 18E).
7. LED bağlantıları için pedlerin üzerine az miktarda lehim macunu yerleştirin (Ek Şekil 19A,B) ve LED'i forseps kullanarak pedlerin üzerine yerleştirin (Ek Şekil 19C).
   NOT: Yerleştirme biraz kapalıysa, sorun değil; lehim macunu eridikten sonra yerine oturacaktır.
8. Kırmızı teli "A+" (anot) üzerinde tutun ve bir saç tokası ile klipsleyin (Ek Şekil 20A-C).
9. Büyük lehimleme ucuna bol miktarda lehim yerleştirin (Ek Şekil 20D) ve LED tabanındaki lehim ve LED'in altındaki lehim macunu eriyene kadar telin üzerine bastırın (Ek Şekil 20E).
   NOT: Lehim macunu eridikten sonra renk gümüş olur (Ek Şekil 20H,I).
10. İstediğiniz kurulum için gereken telin uzunluğunu seçin. LED tellerini ve bir erkek telden tel konektörünü (Ek Şekil 21A) sıyırın ve ardından Ek Şekil 3G'de olduğu gibi akı ekleyin.
11. Shrink tüpünü tellerin üzerine yerleştirin. Telden kabloya konektörler üzerinde 3,18 mm (1/8 inç) büzülme tüpü ve tel üzerinde 4,76 mm (3/16 inç) büzülme tüpü kullanın (Ek Şekil 21B).
12. Telden kabloya konektörü bir "yardım elleri" ile kırpın ve konektör ucunu telle bükün (Ek Şekil 21C) ve lehimleyin. Diğer telle tekrarlayın (Ek Şekil 21D,E).
13. 3,18 mm (1/8 inç) shrink tüplerini lehim üzerine yerleştirin ve küçültün (Ek Şekil 21F-G).
14. 4,76 mm (3/16 inç) shrink tüpünü 3,18 mm (1/8 inç) shrink tüpünün üzerine yerleştirin ve küçültün (Ek Şekil 21H–I).
15. LED'i "yardım ellerini" altındaki bantla kablolayın (Ek Şekil 22A).
16. Epoksiyi üreticinin talimatlarına göre karıştırın ve lehimli LED'in üstüne yayın (Ek Şekil 22B). Tedavi etmek için gece boyunca bırakın.
17. Bir dokunmatik bağlantı elemanı kullanarak monte ediyorsanız, dokunmatik bağlantı elemanının küçük bir parçasını kesin (Ek Şekil 23A) ve LED'in arkasına 30 sn boyunca bastırın.
18. Kara kutunun kapağında bir çentik yapmak için yüksek hızlı bir döner alet kullanın (Ek Şekil 23C-E).
19. Bir gizlilik filmi aracılığıyla tek bir LED için montaj oluşturun.
    1. Kürek matkap ucunu kullanarak, LED'in yerleştirileceği kara kutunun üstünden 1,75 cm'lik (11/16 inç) bir delik açın (Ek Şekil 24A).
    2. Yüksek hızlı bir döner alet kullanarak, Ek Şekil 24A'da gösterildiği gibi, LED teline yer açmak için deliğin bir tarafında bir çentik yapın.
    3. Bir parça gizlilik filmi (25–30 mm) kesin ve LED'in aydınlatacağı deliği kaplayan kara kutunun içine bantlayın (Ek Şekil 24A).
    4. LED'i kara kutunun dışına deliğin üstüne, gizlilik filmi ve bandı elektrik bandı ile yerine yerleştirilmiş olarak yerleştirin (Ek Şekil 24B-E).

4. Aydınlatma sistemine uyacak şekilde bir kara kutu yerleştirin

1. Dört LED sistemi için, potansiyometrelerin takılacağı 3,81 cm (1,5 inç) aralıklı kapakta dört adet 0,83 cm (21/64 inç) delik açın (Ek Şekil 25).
2. Yüksek hızlı bir döner alet kullanarak, sol üst köşedeki 1,19 cm x 1,90 cm (0,47 inç x 0,75 inç) dikdörtgen bir delik kesin (Ek Şekil 25).
3. Kürek matkap ucunu kullanarak, kara kutunun üzerine 1,75 cm'lik (11/16 inç) bir delik açın (Ek Şekil 26).
4. Delikleri dosyalayın ve rommeti delinen deliğe yerleştirin (Ek Şekil 26).
5. Bilgisayar kontrollü LED'ler için, mikrodenetleyicinin yapıştırılacağı alanı kara kutuya zımparalamanın yanı sıra mikrodenetleyici tutucusunun alt tarafını da zımparalayın.
6. Tutucuyu kara kutuya sabitlemeden önce mikrodenetleyiciyi tutucunun üzerine takın ve ardından epoksi yerine oturtun (Ek Şekil 27A).
7. İki klipsin tabanını ve devrenin yerleştirileceği kara kutudaki alanı zımparalamak için zımpara kağıdı kullanın ve klipsleri kara kutunun içine epoksi ile sabitleyin (Ek Şekil 27A).
8. PCB kartını klipslere sabitleyin (Ek Şekil 27B).
9. Güç düğmesini Ek Şekil 25'te yapılan kapaktaki kare delikten geçirin ve yerine oturtun (Ek Şekil 28A).
10. POT'ları kapaktaki deliklerden itin, yerine vidalayın (Ek Şekil 28A) ve düğmeyi POT'un üzerine yerleştirin (Ek Şekil 28B).

5. Tüm kabloları ve cihazları bağlayın

1. Telden kabloya konektörleri etiketleyin (örneğin, LED, POT, COM) (Ek Şekil 29A).
2. Adım 2.4'te (Ek Şekil 16) yapılan kıvrımlı konektörleri, iki dişi konektör (POT ve LED) arasındaki erkek telden kabloya konektöre takın (Ek Şekil 7A ve S37).
3. Kıvrımlı uçları mikrodenetleyiciye bağlayın (Ek Şekil 30).
4. USB kablosunu rommetten çekin ve mikrodenetleyiciye takın.
5. LED'lerin tellerini rommetten çekin ve mikrodenetleyici bağlantısının solundaki dişi telden kabloya konektöre bağlayın (Ek Şekil 9D ve 38).
6. Güç kaynağının telini rommetten çekin ve PCB kartının sağ tarafındaki erkek telden kabloya konektöre bağlayın (Ek Şekil 11D).
7. Erkek telden kabloya konektörü güç anahtarından PCB kartının sağındaki dişi telden kabloya konektöre bağlayın (Ek Şekil 11A).
8. Erkek telden kabloya konektörleri kapaktaki POT'lardan PCB kartındaki dişi telden kabloya konektörlere bağlayın (Ek Şekil 8 ve 36).
   NOT: Potansiyometreler bağlı olmadan devreyi açmayın.

6. LED kontrol yazılımını yükleyin

NOT: Github'daki ek dosyadaki ayrıntılı Yazılım Yükleme Talimatları'na bakın. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces

1. Mikrodenetleyiciyi programlamak için yazılımı indirin ve yükleyin
2. Paket yöneticisini indirin ve yükleyin.
3. Mikrodenetleyiciyi programlayın.
4. Çalışma zamanı altyapısını indirin ve yükleyin.
5. Kullanıcı arabirimini indirin.

7. Hücreleri ışıkla uyarın

1. Transfect HEK293 hücreleri.
   1. Plaka HEK293 hücreleri, 24 kuyucuklu bir plakada kuyu başına 100k hücrede.
   2. Serumsuz ortamları, Polietilenimin (PEI) ve DNA hacimlerini (Ek Şekil 39) hesaplamak ve üreticinin protokolünü kullanarak transfekt yapmak için örnek tabloyu kullanın.
2. Işıkla hücreleri uyarmak.
   NOT: Transfeksiyondan sonra hücreler karanlıkta tutulmalı veya optogenetik sistemi uyarmayan bir ışık kaynağı kullanılarak ele alınmalıdır.
   1. Hücrelerde ne tür bir stimülasyon kullanılacağına karar verin (sürekli ışık, darbe yoğunluğu vb.).
   2. POT'lar kapalıyken (saat yönünün tersine), LED güç kaynağını açın.
   3. Kara kutunun içine hücrelerin yerleştirileceği bir ışık ölçer yerleştirin ve kapağı LED ile sayacın üzerine yerleştirin. Işık yoğunluğunu gerektiği gibi ayarlayın.
   4. LED'leri kontrol etmek için bilgisayarı kullanıyorsanız, kullanıcı arabirimi yazılımını açın.
   5. Kullanıcı arayüzünü programlayın (Şekil 5A,B).
      1. Sol üst panelde, mikrodenetleyici için COM portunu seçin ve Bağlan'a tıklayın.
      2. Her LED'i programlamak için sağdaki panelleri kullanın. Sürekli ışık için, "Açık Zaman" da sıfır dışında herhangi bir zamanı seçin ve "Zaman Kapalı" yı sıfır olarak ayarlayın.
      3. Sağ alt panelde, ana zamanlama kontrolünü programlayın.
         1. Aydınlatmayı geciktirmek için bir başlangıç gecikmesi (HH:MM) seçin.
         2. Belirlenen bir süreden sonra tüm LED'leri kapatmak için bir çalışma zamanı (HH:MM) seçin.
         3. Çalıştır düğmesine tıklayarak aydınlatma programını başlatın (Şekil 5A).

8. Çift lusiferaz testi kullanarak gen ekspresyonunu ölçün

1. 1 mL lusiferaz tamponunu lusiferaz reaktifi ile karıştırarak lusiferaz reaktifini hazırlayın ve 1 mL tüplerde aliquot 1 yıla kadar -80 °C'de saklanacak.
2. N + 2 kuyucukları için 100 μL için lizis tamponunu 5x'ten 1x'e hazırlayın. Örneğin, 30 numune için, 30 x 20 μL 5X lizis tamponu ve 30 x 80 μL MQ H₂O.
3. Renilla substrat çözeltisini hazırlayın: 1 mL Renilla tamponu için 20 μL Renilla substratı (bu miktar 10 tahlil için uygundur).
4. Hücreleri inkübatörden çıkarın, ortamı aspire edin, kuyucuk başına 100 μL 1x lizis tamponu ekleyin ve 15 dakika boyunca 100 RPM'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
5. En az 1 saat boyunca -20 °C'ye yerleştirin.
6. Numune başına 100 μL lusiferaz reaktifini beyaz bir 96 delikli plakanın bir kuyucuğuna ekleyin.
7. Plaka okuyucuyu lüminesans için ayarlayın. Plaka okuyucunun luminometre modülünü kullanarak, entegrasyonu 1 s için ayarlayın.
8. Lusiferaz reaktifinin altındaki kuyucuklara çözülmüş lizatlar ekleyin. Çok kanallı pipet kullanarak, 20 μL numuneyi lusiferaz reaktifine karıştırın ve parlaklığı hemen ölçün.
9. Okuma platosu sonrasında, 100 μL Renilla substrat çözeltisi ekleyin ve tekrar tarayın.
10. Transfeksiyon verimliliğini hesaba katmak için Luciferaz sinyalini Renilla sinyaline bölün.
11. Transfeksiyon verimliliği için normalleştirilmiş lusiferaz sinyallerini karşılaştırın (örneğin; kırmızı ışıkla aydınlatılmış ve uzak kırmızı ışıkla aydınlatılmış örneklerden gelen sinyali karşılaştırın).

Güç devresi, güç kaynağı, güç anahtarı, POT'lar ve bir LED monte edildikten sonra ( Ek Şekil 21'e kadar), devre test edilebilir. Tüm POT'lar yerindeyken, POT LED yoğunluğunu kontrol edecektir. Ek Şekil 29'a kadar montaj tamamlandıktan sonra, sistem optogenetik veya diğer uygulamalar için manuel olarak kullanılabilir. Tüm sistem gücü, güç anahtarı ile manuel olarak kontrol edilebilir. Her LED'in yoğunluğu, her devreye bağlı POT kullanılarak bağımsız olarak kontrol edilebilir.

Yazılımı kurduktan ve mikrodenetleyiciyi programladıktan sonra, kullanıcı arayüzü mikrodenetleyici ile iletişim kurabilir. Kullanıcı arayüzü ile LED'ler geçici olarak çeşitli şekillerde kontrol edilebilir: (1) her LED belirli bir süre açık kalacak şekilde programlanabilir, (2) her LED yanıp sönecek şekilde programlanabilir, (3) küresel bir başlatma gecikmesi (örneğin, 24 saat sonra ışığı çevirip parlatırken) programlanabilir (Şekil 6B), (4) programın gecikmeden sonra çalışması için toplam süre. Biri aynı anda iki LED'i kontrol edebilen daha büyük düğmelere sahip, diğeri dört LED'i kontrol edebilen iki Kullanıcı Arayüzü vardır (Şekil 5A, B). İki LED Kullanıcı Arayüzü tabletler için optimize edilmiştir ve birçok deney için kırmızı ve uzak kırmızı LED'leri kontrol etmek için yeterlidir.

Daha büyük deneyler için, ikinci kullanıcı arayüzü dört adede kadar LED'i kontrol etmek için kullanılabilir. Gen ekspresyonunu indüklerken, beklenen sonuç birkaç parametreye bağlıdır. Bunlar arasında indüksiyon süresi, indüksiyon seviyeleri (örneğin, ışık veya ilaç miktarı) ve hücredeki indüklenebilir yapının kopya sayısı bulunur. Bunu göstermek için, PhyB gen anahtarını farklı miktarlarda muhabir DNA (pPK-202) (transfekte edilen DNA'nın% 0.5,% 1,% 2,% 4'ü ve% 8'i) (Şekil 6A) ile birlikte transfekte ettik ve Şekil 6B'de gösterildiği gibi aydınlattık. PhyB içeren, ancak fikosiyanobilin (PCB-kromofor) üretmek için plazmid içermeyen (yani, ışığa yanıt vermeyen) örneklerde, lusiferaz gen ekspresyonu / sızıntısı, muhabir DNA miktarı ile artar (Şekil 6C) (Uzak kırmızı P < 0.0001, Doğrusal regresyon ve ardından bir Wald testi), (Kırmızı P < 0.0001, Doğrusal regresyon ve ardından bir Wald testi). Ek olarak, PCB-kromofor üreten plazmid (ışığa duyarlı hücreler) de dahil olmak üzere tüm PhyB gen anahtarı, Uzak kırmızı ışık için aydınlatıldığında, Luciferaz ekspresyonu, transfeksiyon karışımındaki artan muhabir yapı miktarları ile de artar (Şekil 6C, D) (Uzak kırmızı ışık P < 0.0001, Doğrusal regresyon ve ardından bir Wald testi). Benzer şekilde, ışığa duyarlı hücreler kırmızı ışıkla aydınlatıldığında, lusiferaz ekspresyonu da artan muhabir miktarı ile artar (P < 0.0001, Doğrusal regresyon ve ardından bir Wald testi). Kırmızı ışıkla muamele edilen hücrelerin indüksiyon seviyelerini uzak kırmızı ışıkla muamele edilen hücrelerle karşılaştırırken, artan muhabir miktarı ile katlama aktivasyonunda küçük bir azalma bulduk (Şekil 6E) (P = 0.0141, Doğrusal regresyon ve ardından bir Wald testi).

Resim 1: Tek bir LED için temel devre. (A) LED aydınlatma sistemini kurmak için gereken adımlara genel bir bakış gösteren bir akış şeması. (B) LED aydınlatma kontrol sistemi. (solda) LED yoğunluğunu ve zamanlamasını düzenlemek için kontrol kutusu. (ortada) LED'leri kontrol etmek için kullanıcı arabirimi çalıştıran bir PC tableti. (sağda) LED'leri monte etmek ve optik stimülasyon için hücreleri yerleştirmek için siyah bir kutu. (C) LED'in yüksek veya alçak gerilim devresi gerektirip gerektirmediğini belirlemek için tablo. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bileşenleri yerine lehimleme talimatları. (A) Devreyi inşa etmek için adım adım karikatür talimatlarına bir örnek. (B,C) Montajı yapılan cihazın resimlerini içeren örnek talimatlar. (D) Birden fazla devrenin aynı anda montajı için örnek talimatlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 3: Monte edilmiş bir LED kontrol sisteminin görüntüleri. (A) Montajlı sistemin üstten dış görünümü. (B) Birleştirilmiş dört LED aydınlatma sisteminin içeriden görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: LED'in ısı emici üzerine yeniden lehimlenmesi için talimatlar. (A) LED tabanı ve koyu kırmızı LED'in yakın çekimi. (B) Lehim macununun LED tabanına yerleştirilmesi. (C) Lehimli LED'in resmi. Kırmızı oklar lehimleme pedlerine işaret eder. Lehimlemeden önce gri ile karşılaştırıldığında (A), lehimlemeden sonra lehim metalik / parlak görünür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Optogenetik deneyleri kontrol etmek için yazılım. (A) Ucuz bir tabletle kolay kullanım için büyük düğmelere sahip iki LED kullanıcı arayüzü. (B) Dört LED'li Kullanıcı Arayüzü. Her iki arayüz de bağımsız LED kontrolüne izin verir. Darbeli çekim için, LED'ler belirli darbe genişlikleri ve belirtilen süreler için açılıp kapanacak şekilde programlanabilir. Darbeli atış ayrıca bir başlangıç gecikmesine ve önceden belirlenmiş bir toplam çalışma süresine sahip olabilir. (C) Bir hücre kültürü inkübatörüne monte edilmiş LED kontrol tableti. (D) Uzak kırmızı ışıkla aydınlatıldığında PhyB gen sisteminin gösterimi. Uzak kırmızı ışık, geni "kapalı" veya "karanlık" durumda tutar. (E) Kırmızı ışıkla aydınlatıldığında PhyB gen sisteminin gösterimi. Kırmızı ışık, PhyB ve PIF3 arasındaki etkileşimi teşvik ederek gen ekspresyonunu indükler. Bu etkileşim, PIF3 ile kaynaşmış gen aktivasyon alanını (AD) UAS promotörüne lokalize eder ve muhabir genini aktive eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: PhyB'yi kontrol etmek için LED sistemi kullanılarak beklenen sonuçlar. (A) PhyB + PIF3 iki hibrid ortağı (pPK-351) kodlayan bir plazmid, fikosiyanobilin (PCB-kromofor) sentez enzimlerini kodlayan bir plazmid (pPK-352) ve bir Luciferaz muhabir plazmidi (pPK-202). (B) C-E. (C) Bazal transkripsiyon seviyeleri (AKA sızıntısı) için artan miktarda muhabir DNA'sı ile ışık indüksiyon deneylerinin zaman çizelgesi. "Sızıntı" numuneleri pPK-352 ile transfekte edilmez (yani, ışığa tepki vermez), ancak kırmızı veya uzak kırmızı ışıkla aydınlatılır. Işık Anahtarı (LS) örnekleri tüm ışık gen anahtarı plazmidlerini içerir ve kırmızı veya uzak kırmızı ışıkla aydınlatılır. (D) Kırmızı ve uzak kırmızı ışığa tepki olarak ışık indüksiyon seviyeleri. (LS-Far-kırmızı ışık, C ve D'deki aynı verilerdir.) (E) Kırmızı ışık/uzak kırmızı ışıkla aydınlatılmış hücrelerde lusiferazın katlanarak indüklenmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

 Ek Şekil 1-39'u indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Birden fazla LED için Elektronik Sürücü Devresi. (A) Tek bir LED sistemi için devre şeması. (B) Dört LED'li bir sistemin devre şeması.

Ek Şekil 2: Devre ara bağlantılarının yerleştirilmesi. (A) PCB kartınızı yardım ellerinize takın. (B) Ana devre atlama tellerinin resimdeki geçiş deliklerine konumu. (C) Koordinatları haritalayan tel konektörlerin diyagramı. Dört LED sistemi için, gösterildiği gibi her devreyi bölen çizgiler çizin (siyah dikey çizgiler). Ek Şekil 31–38 , aynı anda dört devrenin montajını tanımlar.

Ek Şekil 3: Tellerin PCB üzerine lehimlenmesi. (A) Jumper'ları PCB ile doğrudan temas edecek ve lehimleme sırasında yerinde kalacak şekilde bükün. (B) Bükülmüş tellerin başka bir görünümü. (C) Lehimleme sonrası teller. (D) PCB üzerindeki kesilmiş teller. (E) Lehimle ısıtıldıktan sonra küçültülmüş yalıtım. (F) İzolasyonun zemini delik içinden kaplayacak konuma getirilmesi (mavi ok) (G) Bir tel ucuna veya terminaline akı eklenmesi.

Ek Şekil 4: Voltaj regülatörünün yerine lehimlenmesi. (A) Voltaj regülatörü koordinatlarının haritası. (B) Voltaj regülatörünün yerleştirilmesi. (C) Bükülmüş voltaj regülatörü uçları. (D) Lehimleme sonrası voltaj regülatör terminalleri.

Ek Şekil 5: R1 direncinin yerine lehimlenmesi. (A) R1 direnci (820Ω) koordinatlarının haritası. (B) Pense kullanarak direncin kurşun tarafından çekilmesi (C) PCB'ye yakın çekilen direnç. (D) PCB'ye yakın lehimli direnç.

Ek Şekil 6: Transistörün yerine lehimlenmesi. (A) Transistör koordinatlarının ve yönünün haritası. (B) Transistörün yönünü not edin; Bu modeldeki etiket voltaj regülatörüne (LM317T) bakmaktadır. "Yayıcı", "Taban" ve "Kollektör" ün doğru deliklerde olduğundan emin olmak için transistörün özelliklerini iki kez kontrol edin. (C) Lehimlemeden önce terminalleri bükülmüş transistör.

Ek Şekil 7: Potansiyometre için telden kabloya konektörün lehimlenmesi (artı düşük voltaj devresi için 560Ω direnç). (A) Telden kabloya konektörün koordinatlarının haritası (artı R3-560Ω alçak gerilim devresini inşa ediyorsa, telden tel konektör dirençten önceki deliğe yerleştirilir). (B) Dişi telden kabloya konektör. (C) Direncin ve telden kabloya konektörün geçiş deliğine takılmasını kolaylaştırmak için, örgülü telin 3-5 teli bükülür. (D) İplikler, yalıtıma mümkün olduğunca yakın tel kesiciler ile kesilir. (E) Bir dişi telden kabloya konektörün kırmızı teli a5 içinden geçen delikten takılır (düşük gerilim devresi için R3'ü aynı delikten takın). (F) Lehimlemeden önce direncin ve telden kabloya konektörün alt taraftan görünümü. (G) Zemine bağlı lehimli R3 direncinin görüntüsü (F = Dişi).

Ek Şekil 8: Potansiyometre için telden kabloya konektörün toprağa lehimlenmesi. (A) Potansiyometre telden kabloya konektör için toprak bağlantısının koordinatlarının haritası. (B) Potansiyometre telden tel konektörünün R3'e paralel olarak üstten görünümü (F = Dişi).

Ek Şekil 9: Mikrodenetleyicinin lehimlenmesi ve LED telden kabloya konnektörler. (A) 2N222A ve toprağı mikrodenetleyiciye bağlamak için telden kabloya konektörün koordinatlarının haritası. (B) Lehimlenmiş erkek telden kabloya konektör. (C) (B)'nin üstten görünümü. (D) Devrenin girişini ve şasisini LED'e bağlamak için dişi telden kabloya konektör koordinatlarının haritası. (E) Lehimlenmiş dişi telden kabloya konektör (F = Dişi, M = Erkek).

Ek Şekil 10: Güç kaynağı devresi için jumper'ın lehimlenmesi. (A) Güç kaynağını yere bağlamak için turuncu jumper'ın koordinatlarının haritası. (B) Turuncu kazak yerinde lehimlenmiş. (C) Jumper'ın alt yüzü yerinde lehimlenmiştir.

Ek Şekil 11: Güç anahtarının ve güç kaynağı telden kabloya konektörlerinin lehimlenmesi. (A) Güç anahtarını bağlamak için dişi telden kabloya konektörün koordinatlarının haritası. (B) Dişi telden kabloya konektör yerinde lehimlenmiştir. (C) (B)'nin başka bir görüşü. (D) Güç kaynağını bağlamak için erkek telden kabloya konektörün koordinatlarının haritası. (E) Lehimlenmiş erkek telden kabloya konektör. (F) (E)'nin başka bir görünümü (F = Dişi, M = Erkek).

Ek Şekil 12: Güç kaynağını bir erkek telden kabloya konektöre bağlama. (A) Değiştirilmemiş güç kaynağı. (B) Güç kaynağı kablolarının kesilmesi. (C) Güç kaynağı telleri sıyrılmış ve fazla yalıtımı kesilmiş olarak kesilmiş. (D) Güç kaynağı tellerinin etrafına büzülme borusunun yerleştirilmesi. İki bağlantıyı ayıran boru (kırmızı oklar) ve ayrılan telleri tutmak için boru (sarı ok). (E) Güç kaynağını dişi telden kabloya konektöre bağlayan bükülmüş teller.

Ek Şekil 13: Güç kaynağı bağlantısının erkek telden kabloya konektörüne lehimlenmesi ve yalıtılması. (A) Güç kaynağı toprağı ile dişi telden kabloya konektör arasındaki lehimli bağlantı. (B) Güç kaynağının pozitif terminali ile dişi telden kabloya konektör arasındaki lehimli bağlantı. (C) Lehimlenmiş münferit bağlantıların üzerine çekilen büzülme tüpü (kırmızı ok). (D) Her iki güç kaynağı bağlantısı lehimlenmiş ve ısıl işlem görmüş shrink tüp ile. (E) Büzülme tüpünün münferit bağlantılar üzerine yerleştirilmesi (sarı ok). (F) Tamamlanmış güç kaynağı.

Ek Şekil 14: Güç anahtarının erkek telden kabloya konektöre lehimlenmesi. (A) Soyulmuş teller ve tellerin üzerine yerleştirilmiş büzülme tüplü güç anahtarı (kırmızı oklar). (B) Lehimlemeden önce anahtarı ve erkek telden kabloya konektörü birbirine bağlayan teller. (C) Büzülme borusunun lehimli bağlantıların üzerine yerleştirilmesi. (D) Isıl işlem görmüş shrink tüp ile kaplanmış bağlantılar. (E) Erkek telden kabloya konektörle monte edilmiş bir güç anahtarı.

Ek Şekil 15: Bir potansiyometreyi erkek telden kabloya konektöre bağlamak. (A) Potansiyometre parçaları. (B) Potansiyometrenin orta terminalinin etrafına kanca takılmak üzere bükülmüş ve bükülmüş bir erkek telden kabloya konektör. (C) Potansiyometrenin orta terminali etrafında bükülmüş bir erkek telden kabloya konektör. (D) Lehimlenmiş telden kabloya bağlantılar. (E) Çıkarmadan önce metal tırnağa işaret eden kırmızı ok. (F) Metal tırnağın çıkarılmasından sonraki potansiyometre.

Ek Şekil 16: Mikrodenetleyici bağlantısının kablolanması. (A) Dişi telden kabloya konektörler için sıyrılmış ve sıkmaya hazırlık olarak kesilmiş teller. (B) Sıkmanın telden kabloya konektör üzerine yerleştirilmesi. (C) Telden kabloya konektörün kıvrılması. (D) Kıvrımlı telden kabloya konektör. (E) Tam montajlı mikrodenetleyici bağlantısı.

Ek Şekil 17: LED tabanı üzerine lehimleme telleri ve LED Bölüm 1. (A) LED'i LED tabanına lehimlemek için gerekli malzemeler. (B) Soyulmuş telin ucunun kalaylanması. (C) LED tabanının temasına akı uygulanması. (D) LED tabanını kalaylamak için büyük lehimleme ucuna lehim eklenmesi. (E) LED tabanını ısıtmak için lehimin kontak üzerine yerleştirilmesi. (F) Lehimleme ucunu kontak boyunca sürükledikten sonra LED tabanı. (G) Diğer kontakta da aynı prosedür.

Ek Şekil 18: LED tabanı üzerine lehimleme telleri ve LED Bölüm 2. (A) Bir saç tokası kullanılarak kontağa tutturulmuş kalaylı tel. Siyah telin katot "C-" ye lehimlendiğini unutmayın. (B) Lehimleme ucuna bol miktarda lehim eklenmesi. (C) Lehimleme ucu, tel üzerine bastırarak, LED tabanındaki lehimi ve teli eriterek. (D) Teli, havya çıkarıldığında yerinde kalacak şekilde tutmak. (E) Lehim sertleşene kadar teli yerinde tutmak.

Ek Şekil 19: LED tabanı üzerine lehimleme telleri ve LED Bölüm 3. (A) LED'i monte etmek üzere LED tabanına lehim macunu yerleştirmek için keskin bir uç kullanmak. (B) Lehimleme macunu yerinde olan LED taban. (C) LED'in, LED ve LED tabanının kontakları eşleşecek şekilde LED tabanına yerleştirilmesi.

Ek Şekil 20: LED tabanı üzerine lehimleme telleri ve LED Bölüm 4. (A) Siyah tel hala saç tokası tarafından kontağa tutturulmuştur. (B,C) İkinci bir saç tokası kullanılarak, kırmızı tel yerine tutulur. Kırmızı telin "A +" anotuna lehimlendiğini unutmayın. (D) Lehimleme ucuna bol miktarda lehim eklenmesi. (E) Lehimleme ucunun tel üzerine bastırılması, LED tabanındaki lehimin ve telin yanı sıra LED'in altındaki lehim macununun eritilmesi. (F) Lehimlemeden sonra sıcak LED taban soğutması. (G) Kabloların ve LED'in lehimlendiği LED tabanı. (H,I) Kırmızı oklar lehimleme pedlerine işaret eder. Lehimlemeden sonra, lehim metalik / parlak görünür (lehimlemeden önce griye kıyasla (Ek Şekil 16D)).

Ek Şekil 21: LED telinin erkek telden kabloya konektöre bağlanması. (A) Soyulmuş teller ve büzülme borusunun yanındaki erkek telden kabloya konektör ikiye bölünmüştür (1/8 inç ve 3/16 inç). (B) Lehimlemeden önce tellerin üzerine tüp yerleşimini küçültün. (C) Lehimlemeden önce birbirine bükülmüş teller. (D) Telden telden kabloya lehimlenmiş bağlantı. (E) Hem kırmızı hem de siyah teller birlikte lehimlenmiştir. (F) 1/8 inçlik shrink tüpün lehimli bağlantı üzerine yerleştirilmesi. (G) Isı tabancası ile büzüldükten sonra büzülme borusu. (H) 3/16 inç shrink tüpün daha küçük shrink tüpünün üzerine yerleştirilmesi. (I) Bağlantı, büzülme tüpü ile lehimlenmiş ve kapatılmıştır.

Ek Şekil 22: Tellerin ve LED'lerin epoksi kullanarak LED tabanına sabitlenmesi. (A) LED tabana epoksi yerleştirmek için ahşap bir aplikatör kullanmak. Damlayan epoksiyi yakalamak için aşağıya bir bant yerleştirilir. (B) Epoksi tüm yüzeye eşit olarak yayılır. (C) LED, kürlenmek üzere gece boyunca bırakılır.

Ek Şekil 23: LED'lerin bir kutu kapağının içine monte edilmesi. (A) Kolay montaj için dokunmatik bağlantı elemanı parçası takılı bir LED. (B) Bir dokunmatik bağlantı elemanı kullanılarak kara kutunun içine monte edilmiş farklı renkli LED'ler. (C) LED teline yer açmak için yüksek hızlı bir döner aletle yapılan kara kutunun kapağındaki bir çentik. (D) LED'i monte etmek için hücreleri dokunmatik bağlantı elemanlarıyla uyarmak için kullanılan kara kutu. (E) LED kutusunun dokunmatik bağlantı elemanı versiyonunun içine çok kuyulu bir kabın yerleştirilmesi.

Ek Şekil 24: LED'lerin bir kutu kapağının dışına monte edilmesi. (A) Telin (kırmızı ok) yer açması için yüksek hızlı döner aletten bir çentik ile kara kutunun kapağına delik açılmıştır. (B) LED, çentikteki tel ile deliğe yerleştirilir, elektrik bandı ile yerinde tutulur. (C) LED'i sabitlemek için iki parça daha bant kullanılır. Isı emicinin arka tarafı, ısı değişimini en üst düzeye çıkarmak için maruz kalır. (D) LED'in yerleştirileceği deliğin üzerine bantlanmış gizlilik filmi. Kırmızı ok gizlilik filmini işaret eder. (E) Kutunun dışına monte edilmiş bir LED ve aydınlatmayı dağıtmak için gizlilik filmi ile hücreleri uyarmak için bir kara kutu. (F) LED kutusunun harici LED + gizlilik filmi versiyonunun içine çok kuyulu bir kabın yerleştirilmesi.

Ek Şekil 25: Güç anahtarı ve potansiyometreler için kutu kapağında delikler açılması. (A) Kutu kapağının açıklamalı boyutlarına sahip bir CAD çizimi. (B) Potansiyometre ve güç şalteri delikli kutu kapağı.

Ek Şekil 26: Tel çıkış deliğinin hazırlanması. (A) Açıklamalı ölçümlendirmelere sahip bir CAD çizimi. (B) Delinmiş deliğin matkap ucu ile görüntüsü. (C) Yüksek hızlı döner alet veya dosyalama aleti ile çıkış deliğinin yumuşatılması. (D) Gromet'in çıkış deliğine yerleştirilmesi.

Ek Şekil 27: Mikrodenetleyicinin ve PCB'nin kutuya yerleştirilmesi. (A) Kutunun içindeki mikrodenetleyici tutucu (turuncu) ve PCB tutucular. (B) Mikrodenetleyici ve PCB kutuya sabitlenir.

Ek Şekil 28: Potansiyometrelerin ve güç anahtarının yerleştirilmesi. (A) Güç düğmesi ve dört POT içeren bir kutu kapağının önden görünümü. (B) Potansiyometre düğmeleri eklenmiş kutu kapağının önden görünümü. (C) Takılı bileşenlerle birlikte kutu kapağının arkadan görünümü.

Ek Şekil 29: Monte edilmiş LED kontrol sistemi. (A) Telleri bir etiket yazıcısı ile etiketlenmiş ve organizasyon için fermuarlı bağlanmış açık bir kontrol kutusu. (B) Kutu, PIN ile birlikte etiketlenmiş her bir POT ile tamamen monte edildikten sonra.

Ek Şekil 30: Kıvrılmış telden kabloya konektörün yerleştirilmesi. (A) Dört LED-mikrodenetleyici sistemi için kıvrımlı telden kabloya konektörlerin resmi. (B) Kıvrılmış konektörün mikrodenetleyici portlarına yerleştirilmesi.

Ek Şekil 31: Jumper tellerinin yerleştirilmesi. (A) Kırmızı atlama tellerinin koordinatları etiketlenmiş bir devre kartı. (B) Sarı jumper tellerinin koordinatları etiketlenmiş bir devre kartı.

Ek Şekil 32: Jumper tellerinin yerleştirilmesi. Sarı jumper tellerinin koordinatlarını gösteren bir devre kartı.

Ek Şekil 33: Voltaj regülatörlerinin eklenmesi. LM317T voltaj regülatörleri, koordinatları şemalarda etiketlenmiş olarak devreye eklenir.

Ek Şekil 34: 820Ω dirençlerin takılması. R1 dirençleri, koordinatları şemalarda etiketlenmiş olarak devreye eklenir.

Ek Şekil 35: Transistörlerin takılması. 2N2222A transistörler, koordinatları diyagramlarda etiketlenmiş olarak devreye eklenir.

Ek Şekil 36: POT bağlantısı için Dişi telden kabloya konektörlerin ve Dirençlerin (isteğe bağlı) takılması. Teller ve dirençler, koordinatları şemalarda etiketlenmiş olarak devreye eklenir. (A) Kırmızı teli ve ardından R2 direncini (560Ω) takın (yalnızca düşük voltaj devresi için). (B) Direncin diğer ucunu belirtilen toprak deliğine yerleştirin. (C) Siyah telleri toprağa bağlamak için işaretli deliklere yerleştirin. Not: R2 (560Ω) potansiyometreye paraleldir.

Ek Şekil 37: Mikrodenetleyici bağlantısı ve güç kaynağı için erkek telden kabloya konektörlerin takılması. Teller, koordinatları şemalarda etiketlenmiş olarak devreye eklenir. (A) Kırmızı telleri belirtilen deliklere yerleştirin. (B) Siyah telleri işaretli deliklere yerleştirin.

Ek Şekil 38: LED telden kabloya konektörler ekleme. (A) Kırmızı kurşun koordinatları vurgulanmış dişi telden kabloya konektörler. (B) Siyah kurşun koordinatları vurgulanmış dişi telden kabloya konektör.

Ek Şekil 39: Bir PhyB-PIF3 gen anahtarı deneyi kurulması. (A) İç kontrol için Renilla içeren bir ana karışımın örnek tablosu. (B) Bir PhyB-PIF3 optogenetik deneyinin Dual-Luciferase Reporter Testi için DNA karışımını kurmak için örnek bir tablo. (C) PEI transfeksiyon reaktifini kurmak ve karışımı hücrelere (damla damla) ayırmak için örnek bir tablo. (D) LED parlaklığını ayarlamak için ışık ölçerin yerleştirilmesi.

Burada açıklanan LED sistemi, laboratuarımızda çeşitli optogenetik araçları optimize etmek, karakterize etmek ve bunlarla çalışmak için kullanılmıştır. Kyriakakis ve ^ark.4'te, PhyB-PIF gen anahtarlarının birçok kombinasyonunu paralel olarak test ettik. Daha sonra bu sistemi, gen anahtarı kinetiğini ve etkili ışık yoğunluğunu ölçmek için farklı frekanslarda ışık darbelerini test etmek için kullandık. Bu sistem aynı zamanda stimülasyon için mavi ışık kullanan iki optogenetik sistemi optimize etmek ve karakterize etmek için kullanıldı ^5,6. Çoğu optogenetik aracı etkinleştirmek için yalnızca bir LED'in yeterince parlak olması gerektiğinden, her kuyucukta çok sayıda LED bulunan bir sistem satın almak her zaman gerekli değildir. Bu kurulum ucuzdur, güvenilirdir, yeniden yapılandırılması kolaydır ve montaj protokolünü takip etmek için önceden elektrik uzmanlığı gerektirmez.

Ek Şekil 31-38'de, sisteme dört adede kadar LED'in nasıl dahil edileceğini açıklıyoruz. Bu, çok sayıda paralel koşul gerektiren bazı deneyleri sınırlayabilirken, bu protokolde kullanılan 9 Volt güç kaynağını daha yüksek watt'lı bir kaynakla değiştirerek daha fazla LED eklenebilir. Benzer şekilde, her devreye paralel olarak birkaç düşük güçlü LED bağlanabilir. Bu ikinci düzenlemede, bazı LED'ler ayrı ayrı kontrol edilmeyecektir, ancak bu, daha geniş bir alanı kaplamak için birçok LED'in gerekli olması gerektiğinde yararlı olabilir. Bu sistemin elektroniğine aşina olduktan sonra, onu özelleştirmenin birçok yolu vardır. Sistemi özelleştirmek için ek stratejiler, LED'i numuneye daha uzağa veya daha yakın yerleştirmeyi ve homojen aydınlatma koşulları için filtreler / difüzörler aracılığıyla aydınlatmayı veya (Ek Şekil 23) ve Allen ve ^ark.5'te olduğu gibi ısınmayı önlemeyi içerir. LED tasarımımızın bir diğer dikkat çekici özelliği, epoksi içinde kapsüllenmiş olması ve arkasında bir dokunmatik bağlantı elemanına sahip olmasıdır; bu, LED'in hemen hemen her yere kolaylıkla güvenli bir şekilde yerleştirilmesini sağlar: inkübatörlere, balık tanklarına, hayvan kafeslerine, duvarlara vb.

Genleri, sinyal yollarını ve diğer hücresel aktiviteleri kontrol etmek için optogenetiği kullanan birçok deney genellikle nabız atışı gerektirir, büyük zaman ölçeklerine yayılır veya bir inkübatörde yapılması gerekir, bu nedenle mikroskop olmadan otomatikleştirme veya uzaktan manipülasyon gerektirir. Bu LED sistemi, nemlendirilmiş bir CO₂ inkübatöründe herhangi bir sorun olmadan birkaç ay boyunca sürekli olarak test edilmiştir. Ek olarak, PhyB optogenetik sistemler gibi geri dönüşümlü sistemlerle, deneycinin spesifik darbeli aydınlatma programlarını programlaması gerekebilir. Önceki çalışmamız^4'te, memeli hücrelerindeki bir PhyB-PIF3 anahtarının geri dönüşümlü dinamiklerini kullanıcı arayüzü aracılığıyla test etmek için darbeli programlar kullandık. Bu makalede açıklanan metodolojiyi kullanarak, bir titreşim protokolünün programlanması kolaydır ve birçok optogenetik deney türü için gereken esnekliği ve özerkliği kullanıcı dostu bir şekilde sağlar.

Bu sistemi kurmanın en kritik adımları, PCB kartı üzerindeki elektrik devresini bir araya getirmeyi ve bölüm 1 ve bölüm 2'de ayrıntılı olarak açıklanan bileşenleri bağlamayı içerir. Bu bölümlerdeki her adımı dikkatlice takip etmek ve her bir bileşeni lehimlemeden önce iğne deliği numaralarını satır satır iki kez kontrol etmek önemlidir. Bölüm 2, devreye bağlanacak bileşenlerin nasıl kurulacağını açıklar. Bileşenlerin doğru yönde bağlanması için, telden kabloya konektörlerdeki siyah ve kırmızı tellerin renklerinin eşleştiğinden emin olmak özellikle önemlidir. Bu iki bölümdeki küçük gözetimler büyük olasılıkla sistemin işlevselliğini etkileyecektir. Gerçekten de, bu yöntemle ilgili sorunları gidermenin ilk adımı, devrenin doğru şekilde inşa edildiğini ve tüm bağlantıların yerinde olup olmadığını kontrol etmek olacaktır. İkincisi, gevşek bağlantılar için lehimleme kalitesini ve devreyi kısaltabilecek alevli tel kılları için tellerin kontrol edilmesi özellikle önemlidir. Üçüncü bir adım, LED'lerin doğru çalıştığından emin olmaktır; bu, LED'in iki terminalini timsah klipsleriyle kırparak bir güç kaynağı veya 1,5 V pil kullanılarak yapılabilir. Potansiyel olarak kritik bir diğer husus, ısınmayı (LED'leri yüksek güçte kullanırken) veya daha geniş bir aydınlatma için ışığın yayılmasını önlemektir. Bu hususları ele almak için, LED'ler, Ek Şekil 23 ve Allen ve ^ark.5'te açıklandığı gibi, içinde "gizlilik filmi" bulunan bir kara kutunun dışına monte edilebilir. Bu sistemin basitliği nedeniyle, modüler bileşenleri doğrulamak, değiştirmek, yükseltmek veya onarmak için onu ayırmak zor değildir.

İndüklenebilir gen sistemleri için bir diğer kritik faktör, kontrol edilen biyolojik sistem için ne kadar aktivasyonun gerekli olduğunu veya ne kadar sızıntının kabul edilebilir olduğunu düşünmektir. Şekil 6'da gösterildiği gibi, bunlar muhabir DNA'sının miktarına göre değişebilir. Ek olarak, transfeksiyon verimliliği ve dolayısıyla her hücredeki muhabir yapılarının kopya sayısı değişecektir. Bazı deneyler için, sabit miktarda muhabir veya PhyB gen anahtarı bileşeni içeren bir hücre hattı yapmak ve genellikle ilaca neden olan sistemlerde olduğu gibi, istenen indüklenmiş ekspresyon aralığına sahip klonları taramak avantajlı olabilir. Lentiviral plazmid pPK-230^4'ün boyutu ve instabilitesi nedeniyle, pcDNA omurga pPK-351 (Addgene #157921) ve pPK-352'deki (Addgene #157922) PhyB anahtarının lentiviral olmayan plazmid versiyonlarını da yaptık.

Bu protokolü takip eden bu LED aydınlatma sistemini kurarak, kullanıcılar in vitro ve in vivo olarak çok çeşitli optogenetik deneyler yapmak için gerekli tüm bileşenlere sahip olurlar. Memeli hücrelerinde PhyB-PIF3 kullanma talimatlarıyla birleştirildiğinde, bu protokol mühendis olmayanların ve biyologların PhyB tabanlı optogenetiği esnek ve etkili bir şekilde çeşitli bağlamlarda kullanmalarına izin verecektir.

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang ve Molly Allen'a, geliştirilmekte olan LED sisteminin farklı versiyonlarını test ettikleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, UC San Diego'daki Kavli Beyin ve Zihin Enstitüsü ve Salk Enstitüsü, Ulusal Bilim Vakfı tarafından Grant CCF-0939370, NIH Grant NS060847 ve NIH Grant R21DC018237 altındaki NSF Bilgi Bilimi Merkezi aracılığıyla desteklenmiştir.