Этот протокол описывает, как проводить оптогенетические эксперименты по контролю экспрессии генов красным и дальним красным светом с использованием PhyB и PIF3. Включены пошаговые инструкции по созданию простой и гибкой системы освещения, которая позволяет контролировать экспрессию генов или другую оптогенетику с помощью компьютера.

Управление биологическими процессами с помощью света повысило точность и скорость, с которой исследователи могут манипулировать многими биологическими процессами. Оптический контроль обеспечивает беспрецедентную способность препарировать функцию и обладает потенциалом для создания новых методов генетической терапии. Тем не менее, оптогенетические эксперименты требуют адекватных источников света с пространственным, временным или интенсивным контролем, что часто является узким местом для исследователей. Здесь мы подробно расскажем, как построить недорогую и универсальную светодиодную систему освещения, которая легко настраивается для различных доступных оптогенетических инструментов. Эта система настраивается для ручного или компьютерного управления с регулируемой интенсивностью светодиодов. Мы предоставляем иллюстрированное пошаговое руководство по построению схемы, ее компьютерному управлению и созданию светодиодов. Чтобы облегчить сборку этого устройства, мы также обсудим некоторые основные методы пайки и объясним схему, используемую для управления светодиодами. Используя наш пользовательский интерфейс с открытым исходным кодом, пользователи могут автоматизировать точное время и пульсацию света на персональном компьютере (ПК) или недорогом планшете. Эта автоматизация делает систему полезной для экспериментов, которые используют светодиоды для управления генами, сигнальными путями и другими клеточными активностями, которые охватывают большие временные масштабы. Для этого протокола не требуется никаких предварительных знаний в области электроники для создания всех необходимых деталей или использования системы освещения для выполнения оптогенетических экспериментов.

Оптогенетические инструменты становятся повсеместными, и постоянно разрабатываются новые технологии для оптического контроля биологических процессов, таких как экспрессия генов, клеточная сигнализация и многие другие ^1,2,3. Способность управлять клеточными процессами с помощью света обеспечивает быструю кинетику, жесткий пространственный контроль и дозозависимую регуляцию, которая может контролироваться интенсивностью света и временем воздействия. Для использования этих инструментов необходимо устройство для управления этими параметрами. Недавно мы разработали генетически закодированный переключатель генов млекопитающих PhyB-PIF3, который обратимо активирует и деактивирует гены с помощью красного / дальнего красного света, соответственно⁴. Эта система была протестирована в нескольких клеточных линиях млекопитающих и позволила беспрецедентную индукцию экспрессии генов даже при очень небольшом количестве света, включая импульсы света. Исследователи, желающие использовать переключатель PhyB и аналогичные инструменты ^5,6, часто запрашивают информацию о методах контроля интенсивности и продолжительности освещения. Поэтому мы разработали этот протокол с пошаговыми инструкциями, чтобы обеспечить более широкое внедрение этих инструментов для оптогенетики.

До широкого использования светодиодов широкополосные источники света с фильтрами использовались для изучения светочувствительных белков, таких как фитохромы⁷. Недавно некоторые системы светодиодного освещения были опубликованы вместе с оптогенетическими инструментами 8,9,10,11,12, но эти протоколы могут потребовать значительных знаний в области электроники / программного обеспечения, требуют специализированного оборудования (например, 3D-принтеров, станков лазерной резки или фотомаск) или не предоставляют пошаговых инструкций, которые некоторые исследователи должны будут развернуть для своих исследовательских нужд. Хотя независимое управление отдельными скважинами в многолуночной пластине может быть полезным, оно часто не требуется, когда исследователям нужно только сравнить несколько различных образцов в светлом и темном или красном свете с дальним красным светом. Кроме того, многие существующие коммерческие системы являются дорогостоящими, с ограниченными возможностями настройки. Тем не менее, светодиоды, описанные в этом протоколе, являются экономически эффективными, яркими и могут быть установлены различными способами; поэтому их можно использовать для освещения нескольких различных типов образцов. С помощью протокола и программного обеспечения светодиоды в диапазоне от ультрафиолета (UV) до NIR могут использоваться и управляться с помощью программного обеспечения для выполнения оптогенетических экспериментов с использованием UVR8 ^13,14, Dronpa ^15,16, доменов LOV^17,18, ступенчатой функции Opsins^19,20, CRY2 ^21,22, PhyB ^{4,23,24 ,25}, бактериальные фитохромы 26,27,28,29 и другие светочувствительные системы 30,31,32.

Этот протокол представляет собой учебное пособие по сборке схем и другого оборудования, необходимого для управления различными параметрами световой стимуляции, а также молекулярные / клеточные инструменты для запуска оптогенетического эксперимента. Кроме того, мы сообщаем о плазмидах, оптимизированных из Kyriakakis et ^al.4 , которые меньше и более стабильны для клонирования. С помощью этого протокола биологи, не имеющие опыта в электронике и оптике, могут создавать гибкие и надежные системы освещения. Шаг за шагом мы показываем, как создавать светодиодные системы, устраняя техническое узкое место для более широкого внедрения оптогенетических инструментов. Эта система может быть легко использована в большинстве инкубаторов клеточных культур, даже если они не содержат проводных портов. Например, мы храним светодиодную систему в увлажненном инкубаторе CO₂ непрерывно более 6 месяцев без снижения производительности. Мы также объясняем, как подключить светодиодную систему к компьютеру и связать ее с программным обеспечением с открытым исходным кодом, которое мы предоставляем на GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). Построение системы с использованием этого протокола предоставляет исследователям базовые знания для отладки потенциальных проблем, замены деталей и улучшения / расширения функциональных возможностей.

Обзор системы

Построение системы освещения включает в себя (1) построение электронной схемы, (2) построение периферийных устройств (шнур питания, выключатель питания и т. Д.), (3) построение светодиодов, (4) сборку всех этих компонентов и (5) установку программного обеспечения для управления светодиодами с пользовательским интерфейсом (рисунок 1A). После завершения работы система освещения может управлять до четырех светодиодов независимо друг от друга с помощью пользовательского интерфейса (рисунок 1B). Пользовательский интерфейс позволяет каждому светодиоду пульсировать через заданные промежутки времени и отключаться через заданное время. Существует также запуск-задержка для начала программ освещения в указанное время. Потенциометры (POT) регулируют интенсивность каждого светодиода независимо или могут использоваться для ручного управления светодиодами без компьютера. Провода к светодиодам могут быть любой нестандартной длины, что позволяет легко размещать их в инкубаторе или лабораторном пространстве. Благодаря высокой мощности этих светодиодов, их можно использовать для освещения большой площади одним светодиодом на расстоянии.

Описание драйвера светодиода

Чтобы включить и контролировать интенсивность светодиодов, этот протокол будет проходить шаги по созданию «светодиодного драйвера». Каждый светодиод имеет диапазон напряжений, в которых он работает (рисунок 1С). Во время работы выходное напряжение регулятора, которое контролирует интенсивность света, может быть настроено потенциометром. POT изменяет сопротивление, регулируя выходное напряжение/яркость. Настройка с POT 1 кОм (1 килоОм) дает то, что мы называем «высоковольтной цепью» и имеет диапазон от 1,35 В до 2,9 В. Поскольку 2,9 В слишком высоко для работы светодиодов более низкого напряжения (рисунок 1C), мы показываем одну модификацию (резистор 3 или «R3» дополнительный рисунок 1A), которая ограничивает диапазон для соответствия светодиодам низкого напряжения. R3 служит для снижения максимального напряжения, подаваемого на светодиоды, до 1,85 В (сборка, описанная на дополнительном рисунке 8) параллельно с потенциометром. Используя напряжение для управления яркостью вместо тока, система более гибкая для светодиодов с различным рабочим напряжением. Рисунок 1С содержит список светодиодов высокого и низкого напряжения для оптимального выбора схемы. Эта конструкция поддерживает минимальное напряжение достаточно низким, так что светодиод полностью выключен, когда потенциометр выключен, и не позволяет напряжению превышать типичное рабочее напряжение светодиода. Для оптогенетики PhyB мы используем темно-красные и дальние красные светодиоды, которые используют низковольтную цепь.

Описание светодиодной компьютерной системы управления

Светодиодная система освещения может использоваться для постоянного освещения без компьютера или микроконтроллера. Однако для пульсирующих программ и для управления синхронизацией отдельных светодиодов необходимо установить микроконтроллер. Чтобы использовать микроконтроллер для управления светодиодами, требуется транзистор для подключения микроконтроллера к цепи. Этот транзистор воспринимает напряжение от микроконтроллера и переключается с проводящего или изолирующего. Для управления «включением» и «выключением» мы используем так называемый «транзистор коммутационного типа NPN» (2N2222) в качестве управляемого шунта через R2 (дополнительный рисунок 1A). Когда напряжение от микроконтроллера подается на основание транзистора, транзистор становится проводящим и делает напряжение светодиода низким, выключая светодиод. Таким образом, состояния включения и выключения светодиода и транзистора напрямую контролируются микроконтроллером, который контролируется программным обеспечением, установленным на ПК.

Для изготовления системы освещения требуются следующие шаги: Построить электрическую цепь; построить блок питания, ручной выключатель питания, POTs и подключение микроконтроллера; построить светодиоды; разместить черный ящик, чтобы соответствовать системе освещения; подключить всю проводку и приборы; установить светодиодное управляющее программное обеспечение, стимулировать клетки светом; измерять экспрессию генов с помощью двойного анализа люциферазы.

1. Постройте электрическую цепь

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол построения единой схемы для доступного светодиода описан здесь. Инструкции по расширению до четырех светодиодов включены в дополнительную информацию.

1. Включите дымоуловитель и паяльник. Добавьте воду в протирающую губку, имейте под рукой припой.
   ВНИМАНИЕ: Обязательно примите меры предосторожности, чтобы удалить дым и предотвратить ожоги.
2. Начните пайку компонентов схемы к печатной плате (печатной плате) в порядке, указанном на дополнительных панелях.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте небольшое количество припоя на кончике паяльника, чтобы сначала нагреть металл компонента и печатной платы и расплавить дополнительный припой непосредственно на компонентах; флюс может очень помочь.
3. Припойные перемычки проводов и компонентов (дополнительный рисунок 2 и дополнительный рисунок 3).
   1. Для проводов перемычек (изолированная проводка, соединяющая две точки на печатной плате) используйте два куска оранжевых [7,6 мм (0,3 дюйма)] и желтых [12 мм (0,4 дюйма)] проводов из комплекта перемычек.
   2. Прикрепите плату печатной платы к «рукам помощи» и вставьте провода перемычек в следующие отверстия, согните клеммы на 45 градусов и добавьте поток (рисунок 2, дополнительный рисунок 2 и дополнительный рисунок 3): a1 и a3 → заземление (-) (оранжевый), a7 → блок питания (+) #7 (желтый), d2 → d6 (желтый).
   3. Припаяйте, а затем обрежьте заднюю часть проводов.
   4. Вставьте стабилизатор напряжения LM317T в следующие точечные отверстия, согните контакты и добавьте поток (рисунок 2 и дополнительный рисунок 4): Adj → e5, V_out → e6, V_в → e7.
   5. Сначала припаяйте левую и правую клеммы, обрежьте их, затем припаяйте и обрежьте среднюю клемму.
   6. Чтобы установить диапазон низкого напряжения цепи, вставьте резистор 820 Ω в точечные отверстия, припой и обрезку c2 → c5 (рисунок 2 и дополнительный рисунок 5).
   7. Чтобы включить управление светодиодами с помощью микроконтроллера, вставьте транзистор в b3–b5 (рисунок 2 и дополнительный рисунок 6): Коллекторный → b3, Базовый → b4, Излучатель → b5.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Помните об ориентации транзистора для правильной вставки; Проверьте спецификации, чтобы найти обозначение Коллектор, База и Излучатель.
4. Припаяйте проводные разъемы для POT, светодиода, микроконтроллера и источника питания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание на цвет проводов разъемов wire-to-wire и на то, используется ли женский или мужской разъем wire-to-wire.
   1. Определите, требуется ли для требуемого светодиода цепь «низкого напряжения» или «высоковольтная» цепь (рисунок 1С).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если светодиод находится в списке «низкого напряжения», требуется резистор параллельно с POT.
   2. Для цепи "низкого напряжения" или "высокого напряжения" поместите провод от гнездового разъема провод-провод через отверстие a5 (дополнительный рисунок 7). Пока не паяйте на место, если делаете низковольтную цепь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поверните голые концы проволоки так, чтобы маленькие проволочные волоски не отслаивались. Если проволока кажется слишком толстой, чтобы протолкнуть точечное отверстие без износа, отрежьте 2-6 прядей, а затем скрутите их обратно вместе (дополнительный рисунок 7B-D).
   3. Если вы делаете «высоковольтную» схему, перейдите к шагу 1.4.5. Если вы делаете цепь «низкого напряжения», протолкните резистор 560 Ом через то же отверстие (a5) и припой со проводом разъема провод-провод.
   4. Подключите другой конец резистора к земле (дополнительный рисунок 7G).
   5. Вставьте другой конец гнездового разъема wire-to-wire, припаянного в отверстие a5, соединяющее его с землей, и припаяйте его (дополнительный рисунок 8A,B).
   6. Для подключения микроконтроллера вставьте один конец разъема между проводами в отверстие a4, а другой в отверстие, подключенное к земле (дополнительный рисунок 9A–C).
   7. Для подключения светодиодов вставьте один конец гнездового разъема wire-to-wire в отверстие a2, а другой конец в отверстие, соединенное с землей (дополнительный рисунок 9D,E).

2. Создайте блок питания, ручной выключатель питания, POTs и подключение микроконтроллера

1. Постройте блок питания.
   1. Припаяйте оранжевую [7,6 мм (0,3 дюйма)] перемычку от a29 к земле (дополнительный рисунок 10).
   2. Припаяйте гнездовой разъем от a30 к блоку питания (+) (дополнительный рисунок 11A–C).
   3. Припаяйте штекерный разъем от c29 до c30 (дополнительный рисунок 11D–F).
   4. Отрежьте разъем от шнура питания, обнажите провода и обрежьте их (дополнительный рисунок 12A–C).
   5. Добавьте флюс к проводам перед пайкой с помощью флюсовой ручки (дополнительный рисунок 3G).
   6. Поместите термоусадочную трубку диаметром 3,18 мм (1/8 дюйма) вокруг разъема между проводами и более толстый кусок 4,76 мм (3/16 дюйма) над проводом питания (дополнительный рисунок 12D).
   7. Скрутите провода от блока питания и разъема между проводами вместе и припоем (дополнительный рисунок 12E, 13A, B).
   8. Поместите термоусадочную трубку меньшего диаметра 3,18 мм (1/8 дюйма) над соединениями и сжимайте их с помощью тепловой пушки (дополнительный рисунок 13C, D).
   9. Поместите термоусадочную трубку большего диаметра 4,76 мм (3/16 дюйма) над меньшей термоусадочной трубкой 3,18 мм (1/8 дюйма) и снова нагрейте (дополнительный рисунок 13E, F).
2. Создайте ручной выключатель питания.
   1. Поместите термоусадочную трубку 3,18 мм (1/8 дюйма) на провода для переключателя (дополнительный рисунок 14A).
   2. Скручьте и припаяйте провода разъема между проводами (дополнительный рисунок 14B, C).
   3. Поместите термоусадочную трубку 3,18 мм (1/8 дюйма) на паяные участки и сжимайте с помощью тепловой пушки (дополнительный рисунок 14D,E).
3. Подключите штекерный разъем «провод к проводу» к POT.
   1. Обмотайте черный провод разъема между проводами вокруг средней клеммы POT (дополнительный рисунок 15B).
   2. Закрутите проволоку, которая плотно закольцована вокруг клеммы, и припаяйте ее (дополнительный рисунок 15C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшие прецизионные плоскогубцы могут помочь в создании плотного скручивания.
   3. Повторите с красным проводом подключение к клемме, как показано на дополнительном рисунке 15D.
   4. Используйте плоскогубцы, чтобы разбить металлический выступ рядом с красной стрелкой (дополнительный рисунок 15E,F).
4. Подключите микроконтроллер (необходимо только для светодиодов с компьютерным управлением).
   1. Если светодиодный драйвер предназначен для более чем одного светодиода, отрежьте черные провода от всех, кроме одного гнездового разъема провод-провод (дополнительный рисунок 16A).
   2. Обжимайте концы разъемов провод-провод, как показано на рисунке (дополнительный рисунок 16B–D).
   3. Протолкните обжатые концы через прямоугольный разъем (дополнительный рисунок 16E).

3. Сборка светодиодов

1. Снимите концы проволоки (~5 мм) и нанесите флюс с помощью флюсовой ручки, как показано на дополнительном рисунке 3G.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы эффективно припаять провода к светодиодному основанию, флюс должен быть добавлен к контактам на основании светодиода и проводам.
2. Очернить проволоку, нагревая проволоку снизу и добавляя припой сверху (дополнительный рисунок 17В).
3. Используйте флюсовую ручку для размещения флюса на поверхностном контакте светодиодного основания (дополнительный рисунок 17C).
4. Поместите большое количество припоя на большой паяльный наконечник (~4–5 мм) (дополнительный рисунок 17D), используйте его для нагрева светодиодного основания в контакте (дополнительный рисунок 17E). Через несколько секунд перетащите припой по контакту (дополнительный рисунок 17F). Повторите шаги 3.3–3.4 на другом контакте (дополнительный рисунок 17G).
   ВНИМАНИЕ: Светодиодное основание может стать очень горячим во время пайки. Поместите светодиодное основание на поверхность, которая не будет плавиться или гореть.
5. Закрепите черный провод на контакте «C+» (катод) с помощью заколок для волос (дополнительный рисунок 18A).
6. Поместите большое количество припоя на большой паяльный наконечник (дополнительный рисунок 18B) и прижмите его к проводу, пока припой на основе светодиода не расплавится (дополнительный рисунок 18C). Зажмите провод (дополнительный рисунок 18D) и извлеките паяльник, удерживая проволоку на месте (дополнительный рисунок 18E).
7. Поместите небольшое количество паяльной пасты на прокладки для светодиодных соединений (дополнительный рисунок 19A, B) и поместите светодиод поверх колодок с помощью щипцов (дополнительный рисунок 19C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если размещение немного не в порядке, это нормально; он встанет на место, как только паяльная паста расплавится.
8. Удерживайте красную проволоку на «A+» (аноде) и обрежьте ее заколкой для волос (дополнительный рисунок 20A–C).
9. Поместите большое количество припоя на большой паяльный наконечник (дополнительный рисунок 20D) и прижмите его к проводу до тех пор, пока припой на основе светодиода и паяльная паста под светодиодом не расплавятся (дополнительный рисунок 20E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как паяльная паста расплавится, цвет становится серебристым (дополнительный рисунок 20H,I).
10. Выберите длину провода, необходимую для нужной настройки. Снимите светодиодные провода и разъем между проводами (дополнительный рисунок 21A), затем добавьте поток, как показано на дополнительном рисунке 3G.
11. Поместите термоусадочную трубку на провода. Используйте усадочную трубку диаметром 3,18 мм (1/8 дюйма) над разъемами между проводами и усадочную трубку диаметром 4,76 мм (3/16 дюйма) над проволокой (дополнительный рисунок 21B).
12. Обрежьте разъем wire-to-wire «руками помощи» и скрутите конец разъема проводом (дополнительный рисунок 21C) и припаяйте их. Повторите с другим проводом (дополнительный рисунок 21D,E).
13. Поместите термоусадочные трубки размером 3,18 мм (1/8 дюйма) поверх припоя и усадите (дополнительный рисунок 21F–G).
14. Поместите термоусадочную трубку диаметром 4,76 мм (3/16 дюйма) над термоусадочной трубкой диаметром 3,18 мм (1/8 дюйма) и уменьшите ее (дополнительный рисунок 21H–I).
15. Обрежьте светодиодные провода «руками помощи» лентой под ним (дополнительный рисунок 22А).
16. Смешайте эпоксидную смолу в соответствии с инструкциями производителя и распределите поверх паяного светодиода (дополнительный рисунок 22B). Оставьте на ночь, чтобы вылечить.
17. При монтаже с помощью сенсорной застежки отрежьте небольшой кусочек сенсорного крепежа (дополнительный рисунок 23A) и прижмите его к задней части светодиода в течение 30 с.
18. Используйте высокоскоростной вращающийся инструмент, чтобы сделать выемку на крышке черного ящика (дополнительный рисунок 23C–E).
19. Постройте крепление для одного светодиода через защитную пленку.
    1. Используя лопаточное сверло, просверлите отверстие размером 1,75 см (11/16 дюйма) через верхнюю часть черного ящика, где будет размещен светодиод (дополнительный рисунок 24A).
    2. Используя высокоскоростной вращающийся инструмент, сделайте выемку на одной стороне отверстия, чтобы освободить место для светодиодного провода, как показано на дополнительном рисунке 24A.
    3. Вырежьте кусок пленки для конфиденциальности (25–30 мм) и лентой на внутренней стороне черного ящика, закрывающего отверстие, через которое светодиод будет освещаться (дополнительный рисунок 24A).
    4. Поместите светодиод за пределы черного ящика поверх отверстия с помощью защитной пленки и ленты на месте с помощью электрической ленты (дополнительный рисунок 24B–E).

4. Установите черный ящик, чтобы соответствовать системе освещения

1. Для четырех светодиодной системы просверлите четыре отверстия диаметром 0,83 см (21/64 дюйма) на крышке на расстоянии 3,81 см (1,5 дюйма) друг от друга, где будут прикреплены потенциометры (дополнительный рисунок 25).
2. С помощью высокоскоростного поворотного инструмента вырежьте прямоугольное отверстие размером 1,19 см x 1,90 см (0,47 дюйма x 0,75 дюйма) в левом верхнем углу (дополнительный рисунок 25).
3. Используя лопатовое сверло, просверлите отверстие размером 1,75 см (11/16 дюйма) на черном ящике (дополнительный рисунок 26).
4. Залейте отверстия и вставьте люверс в просверленное отверстие (дополнительный рисунок 26).
5. Для управляемых компьютером светодиодов наждачной бумагой область, где микроконтроллер будет вклеен в черный ящик, а также нижнюю сторону держателя микроконтроллера.
6. Закрепите микроконтроллер на держателе, прежде чем закрепить держатель в черном ящике, а затем эпоксидную смолу на месте (дополнительный рисунок 27A).
7. Используйте наждачную бумагу, чтобы отшлифовать дно двух зажимов и область в черном ящике, где будет помещена схема, и закрепите зажимы внутри черного ящика с помощью эпоксидной смолы (дополнительный рисунок 27A).
8. Закрепите плату печатной платы в зажимы (дополнительный рисунок 27B).
9. Протолкните выключатель питания через квадратное отверстие в крышке, выполненное на дополнительном рисунке 25 , и закрепите его на месте (дополнительный рисунок 28A).
10. Протолкните POTs через отверстия на крышке, вкрутите на место (дополнительный рисунок 28A) и поместите ручку на POT (дополнительный рисунок 28B).

5. Подключите всю проводку и устройства

1. Маркировка разъемов между проводами (например, LED, POT, COM) (дополнительный рисунок 29A).
2. Прикрепите обжатые разъемы, изготовленные на этапе 2.4 (дополнительный рисунок 16), к разъему между двумя гнездовыми разъемами (POT и LED) (дополнительные рисунки 7A и S37).
3. Подключите обжатые концы к микроконтроллеру (дополнительный рисунок 30).
4. Протяните USB-кабель через люверс и подключите его к микроконтроллеру.
5. Протяните провода для светодиодов через люверс и подключите к гнездовому разъему провод-провод слева от подключения микроконтроллера (дополнительные рисунки 9D и 38).
6. Протяните провод для блока питания через люверс и подключите его к разъему «провод-провод» на правой стороне печатной платы (дополнительный рисунок 11D).
7. Подключите разъем между проводами от выключателя питания к гнездовому разъему провод-провод справа от печатной платы (дополнительный рисунок 11A).
8. Подключите штекерные разъемы "провод-провод" от POTs на крышке к женским разъемам wire-to-wire на плате печатной платы (дополнительные рисунки 8 и 36).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не включайте цепь без подключенных потенциометров.

6. Установите программное обеспечение для управления светодиодами

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите подробные инструкции по установке программного обеспечения в дополнительном файле на Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces

1. Скачайте и установите программное обеспечение для программирования микроконтроллера
2. Загрузите и установите диспетчер пакетов.
3. Запрограммируйте микроконтроллер.
4. Загрузите и установите ядро среды выполнения.
5. Загрузите пользовательский интерфейс.

7. Стимулируйте клетки светом

1. Трансфектирование клеток HEK293.
   1. Пластинчатые ячейки HEK293 по 100 тыс. ячеек на скважину в 24-луночной пластине.
   2. Используйте пример таблицы для расчета объемов без сыворотки, полиэтиленимина (PEI) и ДНК (дополнительный рисунок 39) и трансфектирования с использованием протокола производителя.
2. Стимуляция клеток светом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки должны храниться в темноте после трансфекции или обрабатываться с использованием источника света, который не возбуждает оптогенетическую систему.
   1. Решите, какой тип стимуляции будет использоваться на клетках (непрерывный свет, интенсивность пульсации и т. Д.).
   2. Выключив POTs (против часовой стрелки), включите светодиодный блок питания.
   3. Поместите измеритель освещенности внутрь черного ящика, где будут размещены ячейки, и поместите крышку со светодиодом над счетчиком. При необходимости отрегулируйте интенсивность света.
   4. Если компьютер используется для управления светодиодами, откройте программное обеспечение пользовательского интерфейса.
   5. Программирование пользовательского интерфейса (рисунок 5A,B).
      1. На верхней левой панели выберите COM-порт для микроконтроллера и нажмите «Подключить».
      2. Используйте панели справа для программирования каждого светодиода. Для непрерывного света выберите любое время, кроме нуля в поле «Время включения» и установите «Время выключения» равным нулю.
      3. На нижней правой панели запрограммируйте основной элемент управления синхронизацией.
         1. Чтобы задержать освещение, выберите задержку запуска (ЧЧ:ММ).
         2. Чтобы отключить все светодиоды через назначенное время, выберите время выполнения (ЧЧ:ММ).
         3. Запустите программу подсветки, нажав на кнопку Run (выполнить рисунок 5A).

8. Измерение экспрессии генов с помощью двойного анализа люциферазы

1. Готовят реагент люциферазы путем смешивания 10 мл буфера люциферазы с реагентом люциферазы и аликвотой в пробирках по 1 мл для хранения при -80 °C до 1 года.
2. Подготовьте буфер лизиса 5x в 1x на 100 мкл для скважин N + 2. например, для 30 образцов, 30 x 20 мкл буфера лизиса 5X и 30 x 80 мкл MQ H₂O.
3. Приготовьте раствор подложки Renilla: 20 мкл субстрата Renilla на 1 мл буфера Renilla (это количество подходит для 10 анализов).
4. Извлеките клетки из инкубатора, аспирируйте среду, добавьте 100 мкл 1x лизисного буфера на лунку и поместите его на шейкер при 100 об/мин в течение 15 мин.
5. Поместите при температуре -20 °C не менее чем на 1 ч.
6. Добавьте 100 мкл реагента люциферазы на образец в лунку белой 96-луночной пластины.
7. Настройте считыватель пластин для люминесценции. Используя модуль люминометра пластинчатого считывателя, установите интеграцию на 1 с.
8. Добавьте размороженные лизаты в лунки ниже реагента люциферазы. Используя многоканальную пипетку, смешайте 20 мкл образца с реагентом люциферазы и немедленно измерьте люминесценцию.
9. После плато показаний добавьте 100 мкл раствора подложки Renilla и снова отсканируйте.
10. Разделите сигнал Люциферазы на сигнал Рениллы, чтобы учесть эффективность трансфекции.
11. Сравните сигналы люциферазы, нормализованные для эффективности трансфекции (например, сравните сигнал от образцов с красным светом и дальним красным светом).

После сборки цепи питания, блока питания, выключателя питания, POTs и светодиода (до дополнительного рисунка 21) схема может быть протестирована. Со всеми POT на месте, POT будет контролировать интенсивность светодиодов. После завершения сборки до дополнительного рисунка 29 система может использоваться вручную для оптогенетики или других применений. Питание всей системы можно контролировать вручную с помощью выключателя питания. Интенсивность каждого светодиода можно контролировать независимо с помощью POT, подключенного к каждой цепи.

После установки программного обеспечения и программирования микроконтроллера пользовательский интерфейс может взаимодействовать с микроконтроллером. С помощью пользовательского интерфейса светодиоды могут управляться временно несколькими способами: (1) каждый светодиод может быть запрограммирован на то, чтобы оставаться включенным в течение определенного времени, (2) каждый светодиод может быть запрограммирован на импульс, (3) глобальная задержка запуска (например, при трансфекции и сиянии света через 24 часа) может быть запрограммирована (рисунок 6B), (4) общее время работы программы после задержки. Есть два пользовательских интерфейса, один с большими кнопками, которые могут управлять двумя светодиодами одновременно, а другой, который может управлять четырьмя светодиодами (рисунок 5A, B). Пользовательский интерфейс с двумя светодиодами оптимизирован для планшетов и достаточен для управления красными и дальними красными светодиодами для многих экспериментов.

Для более крупных экспериментов второй пользовательский интерфейс можно использовать для управления до четырех светодиодов. При индуцировании экспрессии генов ожидаемый результат зависит от нескольких параметров. К ним относятся время индукции, уровни индукции (например, количество света или лекарственного средства) и номер копии индуцируемой конструкции в клетке. Чтобы показать это, мы трансфицировали переключатель гена PhyB вместе с различными количествами репортерной ДНК (pPK-202) (0,5%, 1%, 2%, 4% и 8% трансфектированной ДНК) (рисунок 6A) и освещали, как показано на рисунке 6B. В образцах, содержащих PhyB, но не имеющих плазмиды для получения фикоцианобилина (ПХБ-хромофора) (т.е. не реагирующего на свет), экспрессия гена люциферазы/утечка увеличивается с количеством репортерной ДНК (рисунок 6C) (Far-red P < 0,0001, линейная регрессия с последующей тестом Вальда), (Красная P < 0,0001, Линейная регрессия с последующим тестом Вальда). Кроме того, когда весь переключатель гена PhyB, включая плазмиду, продуцирующую ПХБ-хромофор (светочувствительные клетки), освещается для дальнего красного света, экспрессия люциферазы также увеличивается с увеличением объемов репортерной конструкции в трансфекционной смеси (рисунок 6C, D) (дальний красный свет P < 0,0001, линейная регрессия с последующей тестом Вальда). Аналогичным образом, когда светочувствительные клетки освещаются красным светом, экспрессия люциферазы также увеличивается с увеличением репортерного количества (P < 0,0001, линейная регрессия с последующей проверкой Вальда). При сравнении уровней индукции клеток, обработанных красным светом, с клетками, обработанными дальним красным светом, мы обнаружили небольшое снижение активации складки с увеличением количества репортера (рисунок 6E) (P = 0,0141, линейная регрессия, за которой последовал тест Вальда).

Рисунок 1: Базовая схема для одного светодиода. (A) Блок-схема, показывающая обзор шагов, необходимых для создания системы светодиодного освещения. (B) Система управления светодиодной подсветкой. (слева) Блок управления для регулирования интенсивности и синхронизации светодиодов. (средний) Планшет на ПК с пользовательским интерфейсом для управления светодиодами. (справа) Черный ящик для монтажа светодиодов и размещения ячеек для оптической стимуляции. (C) Таблица для определения того, требует ли светодиод для цепи высокого или низкого напряжения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Инструкции по пайке компонентов на место. (A) Пример пошаговой инструкции мультфильма по построению схемы. (В,С) Пример инструкции с фотографиями собираемого устройства. (D) Пример инструкций по сборке нескольких цепей одновременно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Виды собранной светодиодной системы управления. (A) Вид сверху снаружи собранной системы. (B) Внутренний вид собранной системы освещения из четырех светодиодов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Инструкции по расплавке при пайки светодиода на радиатор. (A) Светодиодное основание и крупный план темно-красного светодиода. (B) Размещение паяльной пасты на основании светодиода. (C) Изображение паяного светодиода. Красные стрелки указывают на паяльные колодки. По сравнению с серым до пайки (А), после пайки припой выглядит металлическим/блестящим. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Программное обеспечение для управления оптогенетическими экспериментами. (A) Пользовательский интерфейс с двумя светодиодами с большими кнопками для удобного использования с недорогим планшетом. (B) Пользовательский интерфейс с четырьмя светодиодами. Оба интерфейса обеспечивают независимое управление светодиодами. Для пульсации светодиоды могут быть запрограммированы на включение и выключение для определенной ширины импульса и заданной длительности. Пульсация также может иметь задержку запуска и заранее определенное общее время выполнения. (C) Светодиодный контрольный планшет, установленный на инкубаторе клеточных культур. (D) Иллюстрация генной системы PhyB при освещении дальним красным светом. Дальний красный свет удерживает ген в «выключенном» или «темном» состоянии. (E) Иллюстрация генной системы PhyB при освещении красным светом. Красный свет индуцирует экспрессию генов, способствуя взаимодействию между PhyB и PIF3. Это взаимодействие локализует домен активации гена (AD), слитый с PIF3 с промотором UAS, активируя ген-репортер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Ожидаемые результаты использования светодиодной системы для управления PhyB. (A) Плазмида, кодирующая двух гибридных партнеров PhyB+PIF3 (pPK-351), плазмида, кодирующая ферменты синтеза фикоцианобилина (PCB-хромофора) (pPK-352), и репортерная плазмида люциферазы (pPK-202). (B) Хронология экспериментов по индукции света для C–E. (C) Базальных уровней транскрипции (AKA leakiness) с увеличением количества репортерной ДНК. «Протекающие» образцы не трансфицируются pPK-352 (т.е. не реагируют на свет), а освещаются красным или дальним красным светом. Образцы Light Switch (LS) включают все плазмиды переключателя генов света и освещаются красным или дальним красным светом. D) Уровни индукции света в ответ на красный и дальний красный свет. (LS-Far-красный свет - это те же данные в C и D.) (E) Складная индукция люциферазы в клетках, освещенных красным светом/дальним красным светом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить дополнительные рисунки 1-39.

Дополнительный рисунок 1: Схема электронного драйвера для нескольких светодиодов. (A) Принципиальная схема для одной светодиодной системы. (B) Принципиальная схема для четырех светодиодной системы.

Дополнительный рисунок 2: Размещение соединительных соединений цепи. (A) Прикрепите плату печатной платы к рукам помощи. (B) Положение перемычек основной цепи в сквозных отверстиях на рисунке. (C) Схема проводных разъемов, отображающих координаты. Для четырех светодиодных систем нарисуйте линии, разделяющие каждую цепь, как показано на рисунке (черные вертикальные линии). Дополнительный рисунок 31–38 описывает сборку четырех контуров одновременно.

Дополнительный рисунок 3: Пайка проводов на печатной плате. (A) Сгибайте перемычки таким образом, чтобы они непосредственно контактировали с печатной платой и оставались на месте во время пайки. (B) Другой вид изогнутых проводов. (C) Провода после пайки. D) Обрезанные провода на печатной плате. (E) Сморщенная изоляция после нагрева припоем. (F) Перемещение изоляции в положение для покрытия сквозного отверстия заземления (синяя стрелка) (G) Добавление потока к концу провода или клемме.

Дополнительный рисунок 4: Пайка регулятора напряжения на место. (A) Карта координат регулятора напряжения. (B) Размещение регулятора напряжения. (C) Изогнутые провода регулятора напряжения. (D) Клеммы регулятора напряжения после пайки.

Дополнительный рисунок 5: Пайка резистора R1 на место. (A) Карта координат резистора R1 (820Ω). (B) Протягивание резистора с помощью плоскогубцев (C) Вытягивающий резистор близко к печатной плате. (D) Спаянный резистор рядом с печатной платой.

Дополнительный рисунок 6: Пайка транзистора на место. (A) Карта координат и ориентации транзистора. (B) Обратите внимание на ориентацию транзистора; метка в данной модели обращена к регулятору напряжения (LM317T). Дважды проверьте спецификацию транзистора, чтобы убедиться, что «Излучатель», «База» и «Коллектор» находятся в правильных отверстиях. (C) Транзистор с клеммами, согнутыми перед пайкой.

Дополнительный рисунок 7: Пайка проводного разъема для потенциометра на место (плюс резистор 560 Ом для низковольтной цепи). (A) Карта координат разъема провод-провод (плюс R3-560Ω при построении низковольтной цепи, разъем провод-провод помещается в отверстие перед резистором). (B) Гнездовой разъем между проводами. (C) Для облегчения установки резистора и соединителя провода к проводу в сквозное отверстие сгибаются 3–5 нитей плетеного провода. (D) Пряди срезаются проволочными резаками как можно ближе к изоляции. (E) Вставлен красный провод гнездового разъема wire-to-wire через сквозное отверстие a5 (для низковольтной цепи вставка R3 через то же сквозное отверстие). (F) Вид снизу резистора и разъема провод-провод перед пайкой. (G) Изображение припаянного резистора R3, подключенного к земле (F = женский).

Дополнительный рисунок 8: Пайка проводного разъема для потенциометра с землей. (A) Карта координат заземляющего соединения для разъема потенциометра провод-провод. (B) Вид сверху разъема потенциометра «провод-провод» параллельно R3 (F = женский).

Дополнительный рисунок 9: Пайка микроконтроллера и светодиодных разъемов между проводами. (A) Карта координат разъема провод-провод для подключения 2N222A и заземления к микроконтроллеру. (B) Паяный штекерный разъем провод-провод. (C) Вид сверху (B). (D) Карта координат разъема между женскими проводами для подключения входа цепи и заземления к светодиоду. (E) Спаянный женский разъем провод-провод (F = женский, M = мужской).

Дополнительный рисунок 10: Пайка перемычки для цепи питания. (A) Карта координат оранжевой перемычки для подключения блока питания к земле. (B) Оранжевая перемычка, припаянная на месте. (C) Вид с нижней стороны перемычки, припаянной на месте.

Дополнительный рисунок 11: Пайка выключателя питания и разъемов источника питания "провод-провод". (A) Карта координат гнездового разъема провод-провод для подключения выключателя питания. (B) Гнездовой разъем провод-провод припаян на месте. С) Другая точка зрения на пункт (В). (D) Карта координат разъема "провод-провод" для подключения источника питания. (E) Спаянный штекерный разъем провод-провод. (F) Другой взгляд (E) (F = женщина, M = мужчина).

Дополнительный рисунок 12: Подключение блока питания к разъему провод-провод. (A) Немодифицированный блок питания. (B) Отключение проводов питания. (C) Провода питания сняты и с избыточной изоляцией отрезаны. (D) Размещение термоусадочной трубки вокруг проводов питания. Трубки, разделяющие два соединения (красные стрелки) и трубки для удержания разделенных проводов (желтая стрелка). (E) Витые провода, соединяющие блок питания с гнездовым разъемом провод-провод.

Дополнительный рисунок 13: Пайка и изоляция подключения блока питания к разъему провод-провод. (A) Паяное соединение между заземлением блока питания и гнездовым разъемом провод-провод. (B) Паяное соединение между положительной клеммой блока питания и женским разъемом провод-провод. (C) Термоусадочная трубка натянута на паяные отдельные соединения (красная стрелка). (D) Оба соединения питания спаяны и с термообработанной термоусадочной трубкой. (E) Размещение термоусадочной трубки над отдельными соединениями (желтая стрелка). (F) Комплектное питание.

Дополнительный рисунок 14: Пайка выключателя питания с разъемом между проводами. (A) Выключатель питания с зачищенными проводами и термоусадочной трубкой, размещенной над проводами (красные стрелки). (B) Провода, соединяющие переключатель, и штекерный разъем wire-to-wire, скрученные вместе перед пайкой. (C) Размещение термоусадочной трубки над паяными соединениями. (D) Соединения, покрытые термообработанной термоусадочной трубкой. (E) Выключатель питания, собранный с разъемом провод-провод.

Дополнительный рисунок 15: Подключение потенциометра к разъему между проводами. (A) Части потенциометра. (B) Штекерный разъем между проводами, скрученный и изогнутый для зацепа вокруг средней клеммы потенциометра. (C) Штекерный разъем между проводами, закрученный вокруг средней клеммы потенциометра. (D) Паяные проводные соединения. (E) Красная стрелка, указывающая на металлический выступ перед снятием. (F) Потенциометр после снятия металлической вкладки.

Дополнительный рисунок 16: Проводка подключения микроконтроллера. (A) Провода для женских соединителей провода к проводу, снятые и разрезанные в рамках подготовки к обжиму. (B) Размещение обжима на соединителе провод-провод. (C) Обжимка соединителя провод-провод. (D) Обжатый разъем между проводами. (E) Полностью собранное соединение микроконтроллера.

Дополнительный рисунок 17: Пайка проводов и светодиодов на основании светодиода Часть 1. (A) Материалы, необходимые для припаивания светодиода к основанию светодиода. (B) Лужение наконечника зачищенной проволоки. (C) Нанесение флюса на контакт основания светодиода. (D) Добавление припоя к большому паяльному наконечнику для лужения светодиодного основания. (E) Размещение припоя на контакте для нагрева основания светодиода. (F) Светодиодное основание после перетаскивания паяльного наконечника через контакт. (G) Та же процедура на другом контакте.

Дополнительный рисунок 18: Пайка проводов и светодиодов на основании светодиода Часть 2. (A) Луженая проволока, прикрепленная к контакту с помощью заколки для волос. Отметим, что черная проволока припаяна к катоду «С-». (B) Добавление большого количества припоя к паяльному наконечнику. (C) Паяльный наконечник прижимается к проводу, расплавляя припой на основании светодиода и проводе. (D) Удерживая проволоку так, чтобы она оставалась на месте при извлечении паяльника. (E) Удерживая проволоку на месте до тех пор, пока припой не затвердеет.

Дополнительный рисунок 19: Пайка проводов и светодиодов на светодиодное основание Часть 3. (A) Использование острого наконечника для размещения паяльной пасты на основании светодиода для крепления светодиода. (B) Светодиодное основание с паяльной пастой на месте. (C) Размещение светодиода на основании светодиода таким образом, чтобы контакты светодиода и светодиодного основания совпадали.

Дополнительный рисунок 20: Пайка проводов и светодиодов на основании светодиода Часть 4. (A) Черная проволока по-прежнему прикрепляется к контакту заколкой для волос. (В,С) С помощью второй заколки для волос красная проволока удерживается на месте. Отметим, что красная проволока припаяна к аноду «А+». (D) Добавление большого количества припоя к паяльному наконечнику. (E) Паяльный наконечник, прижимающийся к проводу, расплавляющий припой на основании светодиода и проводе, а также паяльную пасту под светодиодом. (F) Горячее охлаждение основания светодиода после пайки. (G) Светодиодное основание с проводами и припаянным светодиодом. (Н,И) Красные стрелки указывают на паяльные колодки. После пайки припой выглядит металлическим/блестящим (по сравнению с серым до пайки (дополнительный рисунок 16D)).

Дополнительный рисунок 21: Подключение светодиодного провода к разъему между проводами. (A) Зачищенные провода и разъем между проводами рядом с термоусадочной трубкой разрезаны пополам (1/8 дюйма и 3/16 дюйма). (B) Размещение термоусадочной трубки над проводами перед пайкой. (C) Провода, скрученные вместе перед пайкой. (D) Припаянное соединение от провода к разъему провод-провод. (E) Как красные, так и черные провода спаяны вместе. (F) Размещение 1/8-дюймовой термоусадочной трубки над паяным соединением. (G) Термоусадочная трубка после усадки с помощью тепловой пушки. (H) Размещение 3/16-дюймовой термоусадочной трубки над меньшей термоусадочной трубкой. (I) Соединение спаяно и герметизировано термоусадочной трубкой.

Дополнительный рисунок 22: Крепление проводов и светодиодов к светодиодному основанию с помощью эпоксидной смолы. (A) Использование деревянного аппликатора для помещения эпоксидной смолы в основание светодиода. Внизу помещается лента, чтобы уловить любую капающую эпоксидную смолу. (B) Эпоксидная смола равномерно распределяется по всей поверхности. (C) Светодиод оставляется на ночь для лечения.

Дополнительный рисунок 23: Установка светодиодов внутри крышки коробки. (A) Светодиод с сенсорной застежкой для удобства монтажа. (B) Светодиоды различного цвета, установленные на внутренней стороне черного ящика с помощью сенсорного крепления. (C) Выемка на крышке черного ящика, сделанная высокоскоростным поворотным инструментом, чтобы освободить место для светодиодного провода. (D) Черный ящик для стимуляции ячеек с сенсорными креплениями для крепления светодиода. (E) Размещение многоскважинной тарелки внутри сенсорного крепежного варианта светодиодной коробки.

Дополнительный рисунок 24: Монтаж светодиодов вне крышки коробки. (A) Отверстие, просверленное в крышке черного ящика с выемкой от высокоскоростного поворотного инструмента, чтобы освободить место для проволоки (красная стрелка). (B) Светодиод помещается в отверстие с проводом в выемке, удерживается на месте с помощью электрической ленты. (C) Еще два куска ленты используются для крепления светодиода. Задняя сторона радиатора подвергается максимальному теплообмену. (D) Пленка конфиденциальности, заклеенная над отверстием, где будет размещен светодиод. Красная стрелка указывает на фильм о конфиденциальности. (E) Черный ящик для стимуляции ячеек со светодиодом, установленным вне коробки, и с пленкой конфиденциальности для рассеивания освещения. (F) Размещение многоскважинной тарелки внутри внешней светодиодной + конфиденциальной пленочной версии светодиодной коробки.

Дополнительный рисунок 25: Сверление отверстий на крышке коробки для выключателя питания и потенциометров. (A) Чертеж САПР с аннотированными размерами крышки коробки. (B) Крышка коробки с отверстиями потенциометра и выключателя питания.

Дополнительный рисунок 26: Подготовка выпускного отверстия провода. (A) Чертеж САПР с аннотированными размерами. (B) Изображение просверленного отверстия с помощью сверла. (C) Сглаживание выпускного отверстия с помощью высокоскоростного поворотного инструмента или подающего инструмента. D) Размещение люверса в выходном отверстии.

Дополнительный рисунок 27: Размещение микроконтроллера и печатной платы в коробке. (A) Держатель микроконтроллера (оранжевый) и держатели печатных плат внутри коробки. (B) Микроконтроллер и печатная плата, закрепленные в коробке.

Дополнительный рисунок 28: Размещение потенциометров и выключателя питания. (A) Вид спереди крышки коробки с выключателем питания и четырьмя POT. (B) Вид спереди крышки коробки с добавленными ручками потенциометра. С) Вид сзади крышки коробки с прикрепленными компонентами.

Дополнительный рисунок 29: Собранная светодиодная система управления. (A) Открытый блок управления с проводами, маркированными принтером этикеток и застегнутыми для организации застежкой-молнией. (B) Коробка после ее полной сборки с маркировкой каждого POT вместе с PIN-кодом.

Дополнительный рисунок 30: Размещение обжатого разъема провод-провод. (A) Изображение обжатых проводных разъемов для четырех светодиодных микроконтроллеров. (B) Размещение обжатого разъема в портах микроконтроллера.

Дополнительный рисунок 31: Размещение проводов перемычек. (A) Печатная плата с обозначенными координатами красных проводов перемычек. (B) Печатная плата с обозначенными координатами желтых проводов перемычек.

Дополнительный рисунок 32: Размещение проводов перемычек. Печатная плата, отображающая координаты желтых проводов перемычек.

Дополнительный рисунок 33: Добавление регуляторов напряжения. Регуляторы напряжения LM317T добавляются в схему с координатами, обозначенными на диаграммах.

Дополнительный рисунок 34: Установка резисторов 820Ω. Резисторы R1 добавляются в схему с их координатами, обозначенными на диаграммах.

Дополнительный рисунок 35: Вставка транзисторов. Транзисторы 2N2222A добавляются в схему с их координатами, обозначенными на диаграммах.

Дополнительный рисунок 36: Вставка женских разъемов и резисторов (опционально) для подключения POT. Провода и резисторы добавляются в схему с их координатами, обозначенными на диаграммах. (A) Вставьте красный провод, а затем резистор R2 (560 Ом) (только для цепи низкого напряжения). (B) Вставьте другой конец резистора в указанное отверстие для грунта. (C) Вставьте черные провода в отмеченные отверстия для подключения к земле. Примечание: R2 (560Ω) параллельен потенциометру.

Дополнительный рисунок 37: Вставка разъемов между проводами для подключения микроконтроллера и источника питания. Провода добавляются в схему с их координатами, обозначенными на диаграммах. А) Вставьте красные провода в указанные отверстия. (B) Вставьте черные провода в отмеченные отверстия.

Дополнительный рисунок 38: Добавление светодиодных разъемов провода к проводу. (A) Женские разъемы между проводами с выделенными красными координатами свинца. (B) Гнездовой разъем провод-провод с выделенными черными координатами провода.

Дополнительный рисунок 39: Создание эксперимента по переключению генов PhyB-PIF3. (A) Пример таблицы мастер-микса, содержащего Renilla для внутреннего контроля. (B) Пример таблицы для настройки смеси ДНК для репортерного анализа двойной люциферазы оптогенетического эксперимента PhyB-PIF3. (C) Пример таблицы для установки трансфекционного реагента PEI и аликвотирования смеси на ячейки (по каплям). (D) Размещение измерителя освещенности для установки яркости светодиода.

Светодиодная система, описанная здесь, использовалась в нашей лаборатории для оптимизации, характеристики и работы с несколькими оптогенетическими инструментами. В Kyriakakis et ^al.4 мы параллельно протестировали множество комбинаций переключателей генов PhyB-PIF. Затем мы использовали эту систему для тестирования импульсов света на разных частотах для измерения кинетики переключателя генов и эффективной интенсивности света. Эта система также использовалась для оптимизации и характеристики двух оптогенетических систем, которые используют синий свет для стимуляции ^5,6. Поскольку только один светодиод должен быть достаточно ярким, чтобы активировать большинство оптогенетических инструментов, покупка системы с большим количеством светодиодов над каждой скважиной не всегда необходима. Эта установка недорогая, надежная, простая в перенастройке и не требует предварительного электрического опыта для соблюдения протокола сборки.

В дополнительных рисунках 31–38 описано, как включить в систему до четырех светодиодов. Хотя это может ограничить некоторые эксперименты, требующие большого количества параллельных условий, можно добавить больше светодиодов, заменив блок питания 9 В, используемый в этом протоколе, на блок питания с более высокой мощностью. Аналогичным образом, несколько светодиодов меньшей мощности могут быть подключены параллельно к каждой цепи. В этой последней схеме некоторые светодиоды не будут контролироваться индивидуально, но это может быть полезно, когда требуется много светодиодов для покрытия большей площади. Однажды ознакомившись с электроникой этой системы, есть много способов ее настроить. Дополнительные стратегии настройки системы включают размещение светодиода дальше или ближе к образцу и освещение через фильтры/диффузоры для однородных условий освещения или для предотвращения нагрева, как показано на дополнительном рисунке 23) и Allen et ^al.5. Еще одной примечательной особенностью нашего светодиодного дизайна является то, что он инкапсулирован в эпоксидную смолу и имеет сенсорную застежку на задней панели; это позволяет надежно разместить светодиод практически в любом месте: в инкубаторах, аквариумах, клетках для животных, стенах и т. Д.

Многие эксперименты, которые используют оптогенетику для контроля генов, сигнальных путей и другой клеточной активности, часто требуют пульсации, охватывают большие временные масштабы или должны выполняться в инкубаторе, поэтому требуют автоматизации или удаленных манипуляций без микроскопа. Эта светодиодная система непрерывно тестировалась в течение нескольких месяцев в увлажненном инкубаторе CO₂ без каких-либо проблем. Кроме того, с обратимыми системами, такими как оптогенетические системы PhyB, экспериментатору может потребоваться запрограммировать специфические графики пульсирующего освещения. В нашей предыдущей работе⁴ мы использовали пульсирующие программы для проверки динамики обратимости переключателя PhyB-PIF3 в клетках млекопитающих через пользовательский интерфейс. Используя методологию, описанную в этой рукописи, программирование пульсирующего протокола легко, обеспечивая гибкость и автономность, необходимые для многих типов оптогенетических экспериментов, в удобной для пользователя форме.

Наиболее важные шаги в построении этой системы включают в себя сборку электрической цепи на плате печатной платы и подключение компонентов, которые подробно описаны в разделе 1 и разделе 2. Важно внимательно следить за каждым шагом в этих разделах и дважды проверять номера точечных отверстий строка за строкой перед пайкой каждого компонента. В разделе 2 объясняется, как настроить компоненты, которые будут подключены к цепи. Чтобы компоненты соединялись в правильной ориентации, особенно важно убедиться, что цвета черного и красного проводов на разъемах провода-провода совпадают. Небольшие оплошности в этих двух разделах, скорее всего, повлияют на функциональность системы. Действительно, первым шагом в устранении неполадок этого метода будет проверка того, что схема была построена правильно и что все соединения на месте. Во-вторых, особое значение имеет проверка качества пайки на наличие незакрепленных соединений и проводов на факельное сжигание проволочных волос, которые могут замыкать цепь. Третьим шагом будет обеспечение правильной работы светодиодов, что можно сделать с помощью блока питания или батареи 1,5 В, подрезав две клеммы светодиода зажимами аллигатора. Другим потенциально важным соображением является предотвращение нагрева (при использовании светодиодов на высокой мощности) или рассеивания света для более широкого распространения освещения. Чтобы решить эти проблемы, светодиоды могут быть установлены снаружи черного ящика с «пленкой конфиденциальности» внутри, как описано на дополнительном рисунке 23 и Allen et ^al.5. Из-за простоты этой системы разобрать ее для проверки, модификации, обновления или ремонта модульных компонентов не составит труда.

Другим критическим фактором для индуцируемых генных систем является рассмотрение того, сколько активации требуется или насколько утечка приемлема для контролируемой биологической системы. Как показано на рисунке 6, они могут варьироваться в зависимости от количества репортерной ДНК. Кроме того, эффективность трансфекции и, следовательно, количество копий репортерных конструкций в каждой ячейке будут различаться. Для некоторых экспериментов может быть выгодно сделать клеточную линию с фиксированным количеством репортерных или PhyB-компонентов генного переключателя и экран для клонов с желаемым диапазоном индуцированной экспрессии, как это обычно делается с системами, индуцируемыми лекарственными средствами. Из-за размера и нестабильности лентивирусной плазмиды pPK-230⁴ мы также сделали нелентивирусные плазмидные версии переключателя PhyB в магистрали PCDNA pPK-351 (Addgene #157921) и pPK-352 (Addgene #157922).

Создавая эту светодиодную систему освещения в соответствии с этим протоколом, пользователи имеют все компоненты, необходимые для выполнения широкого спектра экспериментов по оптогенетике in vitro и in vivo. В сочетании с инструкциями по использованию PhyB-PIF3 в клетках млекопитающих этот протокол позволит неинженерам и биологам гибко и эффективно использовать оптогенетику на основе PhyB в различных контекстах.

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Мы хотели бы поблагодарить Инсяо (Питера) Вана, Цзылян Хуана и Молли Аллен за тестирование различных версий светодиодной системы в процессе ее разработки. Эта работа была поддержана Институтом мозга и разума Кавли в Калифорнийском университете в Сан-Диего и Институтом Солка, Национальным научным фондом через Центр науки информации NSF по гранту CCF-0939370, грант NIH NS060847 и грант NIH R21DC018237.