Este protocolo descreve como realizar experimentos optogenéticos para controlar a expressão gênica com luz vermelha e vermelha distante usando PhyB e PIF3. Estão incluídas instruções passo-a-passo para a construção de um sistema de iluminação simples e flexível, que permite o controle da expressão gênica ou outra optogenética com um computador.

O controle de processos biológicos usando a luz aumentou a precisão e a velocidade com que os pesquisadores podem manipular muitos processos biológicos. O controle óptico permite uma capacidade sem precedentes de dissecar a função e tem o potencial de permitir novas terapias genéticas. No entanto, experimentos optogenéticos requerem fontes de luz adequadas com controle espacial, temporal ou de intensidade, muitas vezes um gargalo para os pesquisadores. Aqui detalhamos como construir um sistema de iluminação LED versátil e de baixo custo que seja facilmente personalizável para diferentes ferramentas optogenéticas disponíveis. Este sistema é configurável para controle manual ou de computador com intensidade LED ajustável. Fornecemos um guia passo-a-passo ilustrado para a construção do circuito, tornando-o controlado por computador e construindo os LEDs. Para facilitar a montagem deste dispositivo, também discutimos algumas técnicas básicas de solda e explicamos os circuitos usados para controlar os LEDs. Usando nossa interface de usuário de código aberto, os usuários podem automatizar o tempo preciso e o pulsar da luz em um computador pessoal (PC) ou em um tablet barato. Essa automação torna o sistema útil para experimentos que usam LEDs para controlar genes, vias de sinalização e outras atividades celulares que abrangem grandes escalas de tempo. Para este protocolo, nenhum conhecimento prévio em eletrônica é necessário para construir todas as peças necessárias ou usar o sistema de iluminação para realizar experimentos optogenéticos.

As ferramentas optogenéticas estão se tornando onipresentes e novas tecnologias estão sendo constantemente desenvolvidas para controlar opticamente processos biológicos, como expressão gênica, sinalização celular e muitos outros ^1,2,3. A capacidade de controlar os processos celulares com luz permite cinética rápida, controle espacial rígido e regulação dependente da dose que pode ser controlada pela intensidade da luz e pelo tempo de exposição. Para usar essas ferramentas, é necessário um dispositivo para controlar esses parâmetros. Recentemente, desenvolvemos um interruptor genético de mamíferos PhyB-PIF3 geneticamente codificado que ativa e desativa reversivelmente genes usando luz vermelha/vermelho-distante, respectivamente⁴. Este sistema foi testado em várias linhagens celulares de mamíferos e permitiu a indução incomparável da expressão gênica, mesmo com quantidades muito pequenas de luz, incluindo pulsos de luz. Pesquisadores que desejam utilizar o interruptor PhyB e ferramentas similares ^5,6 frequentemente solicitam informações sobre métodos para controlar a intensidade e a duração da iluminação. Portanto, desenvolvemos este protocolo com instruções passo-a-passo para permitir uma adoção mais ampla dessas ferramentas para a optogenética.

Antes do uso generalizado de LEDs, fontes de luz de banda larga com filtros eram usadas para estudar proteínas responsivas à luz, como os fitocromos⁷. Recentemente, alguns sistemas de iluminação LED foram publicados juntamente com ferramentas optogenéticas ^8,9,10,11,12, mas esses protocolos podem exigir conhecimentos significativos em eletrônica / software, exigir equipamentos especializados (por exemplo, impressoras 3D^, máquinas de corte a laser ou fotomáscaras) ou não fornecer as instruções passo a passo que alguns pesquisadores precisariam implantar para suas necessidades de pesquisa. Embora o controle independente de poços individuais em uma placa de vários poços possa ser útil, muitas vezes é desnecessário quando os pesquisadores só precisam comparar várias amostras diferentes em luz clara e escura ou vermelha versus luz vermelha distante. Além disso, muitos sistemas comerciais existentes são caros, com capacidade de personalização limitada. No entanto, os LEDs descritos neste protocolo são econômicos, brilhantes e podem ser montados de várias maneiras; portanto, eles podem ser usados para iluminar vários tipos diferentes de amostras. Com o protocolo e o software fornecidos, LEDs que vão desde ultravioleta (UV) até NIR podem ser utilizados e controlados com software para realizar experimentos optogenéticos utilizando UVR8 13,14, Dronpa 15,16, domínios LOV 17,18, opsinas de função de passo ^19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ^,25, fitocromos bacterianos^26,27,28,29 e outros sistemas responsivos à luz ^30,31,32.

Este protocolo constitui um tutorial para a montagem dos circuitos e outros hardwares necessários para controlar diferentes parâmetros para a estimulação da luz, bem como as ferramentas moleculares / celulares para executar um experimento optogenético. Além disso, relatamos plasmídeos otimizados de Kyriakakis et ^al.4 que são menores e mais estáveis para clonagem. Através deste protocolo, biólogos sem experiência em eletrônica e óptica podem construir sistemas de iluminação que são flexíveis e robustos. De forma passo a passo, mostramos como construir sistemas LED, removendo o gargalo técnico para a adoção mais ampla de ferramentas optogenéticas. Este sistema pode ser facilmente utilizado na maioria das incubadoras de cultura celular, mesmo que não contenham portas de arame. Por exemplo, mantivemos o sistema LED em uma incubadora de CO₂ umidificada continuamente por mais de 6 meses, sem diminuição no desempenho. Também explicamos como conectar o sistema LED a um computador e interagi-lo com o software de código aberto que fornecemos no GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). A construção de um sistema usando esse protocolo fornece aos pesquisadores o conhecimento básico para depurar possíveis problemas, substituir peças e melhorar/estender funcionalidades.

Visão geral do sistema

A construção do sistema de iluminação envolve (1) a construção do circuito eletrônico, (2) a construção dos periféricos (cabo da fonte de alimentação, interruptor de alimentação, etc.), (3) a construção dos LEDs, (4) a montagem de todos esses componentes e (5) a instalação do software para controlar os LEDs com uma interface de usuário (Figura 1A). Uma vez concluído, o sistema de iluminação pode controlar até quatro LEDs de forma independente com uma interface de usuário (Figura 1B). A interface do usuário permite que cada LED pulse em intervalos de tempo especificados e se desligue após um tempo especificado. Há também um atraso de início para iniciar programas de iluminação em um horário especificado. Os potenciômetros (POTs) regulam a intensidade de cada LED de forma independente ou podem ser usados para controle manual de LED sem um computador. Os fios para os LEDs podem ter qualquer comprimento personalizado, permitindo que eles sejam facilmente colocados em uma incubadora ou espaço de laboratório. Devido à alta potência desses LEDs, eles podem ser usados para iluminar uma grande área com um único LED à distância.

Descrição do driver LED

Para alimentar e controlar a intensidade dos LEDs, este protocolo passará por etapas para construir um "driver LED". Cada LED tem uma faixa de tensões em que opera (Figura 1C). Durante a operação, a tensão de saída do regulador, que controla a intensidade da luz, pode ser ajustada por um potenciômetro. O POT varia a resistência, ajustando a tensão/brilho de saída. A sintonia com um POT de 1kΩ (1 quilo-ohm) dá o que chamamos de "circuito de alta tensão" e tem uma faixa de 1,35 V a 2,9 V. Como 2,9 V é muito alto para operar os LEDs de baixa tensão (Figura 1C), mostramos uma única modificação (Resistor 3 ou "R3" Figura 1A Suplementar) que limita a faixa para corresponder aos LEDs de baixa tensão. O R3 serve para diminuir a tensão máxima aplicada aos LEDs para 1,85 V (montagem detalhada na Figura Suplementar 8) quando em paralelo com o potenciômetro. Ao usar tensão para controlar o brilho em vez de corrente, o sistema é mais flexível para LEDs com diferentes tensões de operação. A Figura 1C contém uma lista dos LEDs de alta e baixa tensão para orientar a seleção ideal do circuito. Este projeto mantém a tensão mínima baixa o suficiente para que o LED esteja completamente desligado quando o potenciômetro estiver desligado e não permita que a tensão ultrapasse a tensão de operação típica do LED. Para a optogenética PhyB, usamos LEDs vermelhos profundos e vermelhos distantes, que usam o circuito de baixa tensão.

Descrição do sistema de controle do computador LED

O sistema de iluminação LED pode ser usado para iluminação constante sem um computador ou microcontrolador. No entanto, para programas pulsantes e para controlar o tempo de LED individual, um microcontrolador deve ser instalado. Para usar um microcontrolador para controlar os LEDs, é necessário um transistor para conectar o microcontrolador ao circuito. Este transistor detecta a tensão do microcontrolador e os interruptores de serem condutores ou isolantes. Para controlar o "on" e o "off", usamos o que é chamado de "transistor do tipo de comutação NPN" (2N2222) como um shunt controlável através do R2 (Figura 1A Suplementar). Quando a tensão do microcontrolador é aplicada à base do transistor, o transistor torna-se condutor e torna a tensão do LED baixa, desligando o LED. Assim, os estados de LED e transistor ligado e desligado são diretamente controlados pelo microcontrolador, que é controlado pelo software instalado no PC.

Para fazer o sistema de iluminação, são necessárias as seguintes etapas: Construir o circuito elétrico; construir a fonte de alimentação, o interruptor de alimentação manual, os POTs e a conexão do microcontrolador; construir os LEDs; acomodar uma caixa preta para caber no sistema de iluminação; conectar toda a fiação e dispositivos; instalar o software de controle LED, estimular as células com luz; medir a expressão gênica usando um ensaio de luciferase dupla.

1. Construa o circuito elétrico

NOTA: O protocolo para a construção de um único circuito para um LED disponível é descrito aqui. Instruções para expandir isso até quatro LEDs estão incluídas nas informações suplementares.

1. Ligue o absorvedor de fumaça e o ferro de solda. Adicione água à esponja de limpeza, tenha a solda à mão.
   CUIDADO: Certifique-se de tomar precauções de segurança para remover a fumaça e evitar queimaduras.
2. Comece a soldar os componentes do circuito para a placa de circuito impresso (placa PCB) na ordem mostrada nos painéis suplementares.
   NOTA: Use uma pequena quantidade de solda na ponta de ferro de solda para aquecer o metal do componente e da placa PCB primeiro e derreter a solda adicional diretamente nos componentes; O fluxo pode ajudar muito.
3. Fios e componentes do jumper de solda (Figura 2 Suplementar e Figura 3 Suplementar).
   1. Para os fios de jumper (a fiação isolada que conecta dois pontos na placa de circuito), use dois pedaços de fios laranja [7,6 mm (0,3 polegada)] e amarelo [12 mm (0,4 polegada)] do kit de jumper.
   2. Prender a placa PCB nas "mãos que ajudam" e inserir os fios do jumper nos seguintes orifícios, dobrar os terminais 45 graus e adicionar fluxo (Figura 2, Figura 2 Suplementar e Figura Suplementar 3): a1 e a3 → terra (-) (laranja), a7 → fonte de alimentação (+) #7 (amarelo), d2 → d6 (amarelo).
   3. Solda e depois corte a parte de trás dos fios.
   4. Insira o regulador de tensão LM317T nos seguintes orifícios, dobre os pinos e adicione o fluxo (Figura 2 e Figura 4 Suplementar): Adj → e5, V_{para fora} → e6, V_na → e7.
   5. Solde os terminais esquerdo e direito primeiro, corte-os, depois solde e corte o terminal médio.
   6. Para definir a faixa de baixa tensão do circuito, insira um resistor de 820 Ω até os orifícios, solda e corte c2 → c5 (Figura 2 e Figura 5 Suplementar).
   7. Para ativar o controle de LED pelo microcontrolador, insira o transistor em b3–b5 (Figura 2 e Figura 6 Suplementar): Coletor → b3, Base → b4, Emissor → b5.
      NOTA: Esteja ciente da orientação do transistor para inserir corretamente; verifique as especificações para localizar a designação Coletor, Base e Emissor.
4. Solde os conectores fio a fio para o POT, LED, microcontrolador e fonte de alimentação.
   NOTA: Preste atenção à cor dos fios dos conectores fio a fio e se está usando um conector fio a fio fêmea ou macho.
   1. Determine se um circuito de "baixa tensão" ou um circuito de "alta tensão" é necessário para o LED desejado (Figura 1C).
      NOTA: Se o LED estiver na lista de "baixa tensão", é necessário um resistor em paralelo com o POT.
   2. Para o circuito de "baixa tensão" ou "alta tensão", coloque o fio de um conector fêmea fio a fio através do orifício a5 (Figura 7 Suplementar). Não solde no lugar ainda se estiver fazendo o circuito de baixa tensão.
      NOTA: Torça as extremidades do fio desencapado para que os pequenos pelos de arame não se lasquem. Se o fio parecer muito grosso para empurrar através do orifício sem desgaste, corte de 2 a 6 fios e torça-os novamente (Figura suplementar 7B-D).
   3. Se estiver a fazer o circuito de "alta tensão", avance para o passo 1.4.5. Se estiver fazendo o circuito de "baixa tensão", empurre um resistor de 560Ω através do mesmo orifício (a5) e solda com o cabo de conector fio a fio.
   4. Conecte a outra extremidade do resistor ao aterramento (Figura 7G suplementar).
   5. Insira a outra extremidade do conector fêmea fio-a-fio soldado em um orifício a5 conectando-o ao solo e solde-o (Figura suplementar 8A,B).
   6. Para a conexão do microcontrolador, insira uma extremidade de um conector macho fio a fio no orifício a4 e a outra em um orifício conectado ao aterramento (Figura suplementar 9A–C).
   7. Para a conexão LED, insira uma extremidade de um conector fêmea fio a fio no orifício a2 e a outra extremidade em um orifício conectado ao aterramento (Figura suplementar 9D,E).

2. Construa a fonte de alimentação, o interruptor de alimentação manual, os POTs e a conexão do microcontrolador

1. Construa a fonte de alimentação.
   1. Solde um jumper laranja [7,6 mm (0,3 polegada)] de a29 até o solo (Figura suplementar 10).
   2. Solde um conector fêmea fio a fio do a30 para a fonte de alimentação (+) (Figura suplementar 11A–C).
   3. Solde um conector macho fio a fio de c29 a c30 (Figura suplementar 11D–F).
   4. Corte o conector de um cabo da fonte de alimentação, exponha os fios e retire-os (Figura 12A a C suplementar).
   5. Adicione fluxo aos fios antes da solda usando uma caneta de fluxo (Figura 3G suplementar).
   6. Coloque um tubo de encolhimento de 3,18 mm (1/8 polegada) em torno de um conector macho fio a fio e uma peça mais grossa de 4,76 mm (3/16 polegadas) sobre o fio da fonte de alimentação (Figura 12D suplementar).
   7. Torça os fios da fonte de alimentação e do conector macho fio a fio juntos e solda (Figura suplementar 12E, 13A,B).
   8. Coloque o tubo de encolhimento de diâmetro menor 3,18 mm (1/8 polegada) sobre as conexões e encolha com uma pistola de calor (Figura suplementar 13C,D).
   9. Coloque um tubo de encolhimento de diâmetro maior de 4,76 mm (3/16 polegadas) sobre o tubo de encolhimento menor de 3,18 mm (1/8 de polegada) e aqueça novamente (Figura suplementar 13E,F).
2. Construa o interruptor de alimentação manual.
   1. Coloque o tubo de encolhimento 3,18 mm (1/8 polegada) sobre os fios do interruptor (Figura 14A suplementar).
   2. Torça e solde os fios de um conector macho fio a fio (Figura suplementar 14B,C).
   3. Coloque o tubo de encolhimento 3,18 mm (1/8 polegada) sobre seções soldadas e encolha com uma pistola de calor (Figura suplementar 14D,E).
3. Conecte o conector macho fio a fio ao POT.
   1. Enrole o fio preto do conector fio a fio ao redor do terminal central do POT (Figura 15B suplementar).
   2. Torça o fio que está firmemente enrolado ao redor do terminal e solde-o (Figura 15C suplementar).
      NOTA: Alicates de precisão pequenos podem ajudar a fazer uma torção apertada.
   3. Repita com a conexão de fio vermelho ao terminal, como na Figura 15D Suplementar.
   4. Use um alicate para quebrar a aba de metal perto da seta vermelha (Figura suplementar 15E,F).
4. Construa a conexão do microcontrolador (necessária apenas para LEDs controlados por computador).
   1. Se estiver criando um driver de LED para mais de um LED, corte os fios pretos de todos os conectores fio a fio fêmea, exceto um (Figura 16A suplementar).
   2. Crimpagem as extremidades dos conectores fio a fio, conforme mostrado (Figura suplementar 16B–D).
   3. Empurre as extremidades frisadas através do conector retangular (Figura 16E suplementar).

3. Construa os LEDs

1. Retire as extremidades do fio (~5 mm) e aplique o fluxo usando uma caneta de fluxo como na Figura Suplementar 3G.
   NOTA: Para soldar eficientemente os fios na base do LED, o fluxo deve ser adicionado aos contatos na base do LED e aos fios.
2. Estanhe o fio aquecendo-o por baixo e adicionando solda a partir do topo (Figura 17B suplementar).
3. Use a caneta de fluxo para colocar o fluxo no contato superficial da base do LED (Figura 17C suplementar).
4. Coloque uma quantidade generosa de solda em uma grande ponta de solda (~4–5 mm) (Figura 17D Suplementar), use-a para aquecer a base do LED no contato (Figura 17E Suplementar). Após alguns segundos, arraste a solda pelo contato (Figura 17F suplementar). Repita as etapas 3.3–3.4 no outro contato (Figura 17G Suplementar).
   CUIDADO: A base de LED pode ficar muito quente durante a solda. Coloque a base de LED em uma superfície que não derreta ou queime.
5. Prender o fio preto no contato "C+" (o cátodo) usando os grampos de cabelo (Figura 18A Suplementar).
6. Coloque uma quantidade generosa de solda na grande ponta de solda (Figura suplementar 18B) e pressione-a para baixo no fio até que a solda na base do LED derreta (Figura suplementar 18C). Mantenha pressionado o fio (Figura 18D Suplementar) e remova o ferro de solda enquanto mantém o fio no lugar (Figura 18E Suplementar).
7. Coloque uma pequena quantidade de pasta de solda nas almofadas para as conexões LED (Figura suplementar 19A,B) e coloque o LED sobre as almofadas usando pinças (Figura 19C suplementar).
   NOTA: Se o posicionamento estiver um pouco desligado, está tudo bem; ele entrará no lugar uma vez que a pasta de solda derreter.
8. Segure o fio vermelho no "A+" (ânodo) e prenda-o com um grampo de cabelo (Figura suplementar 20A–C).
9. Coloque uma quantidade generosa de solda na grande ponta de solda (Figura suplementar 20D) e pressione-a para baixo no fio até que a solda na base do LED e a pasta de solda sob o LED derretam (Figura suplementar 20E).
   NOTA: Depois que a pasta de solda derrete, a cor se torna prata (Figura suplementar 20H,I).
10. Escolha o comprimento do fio necessário para a configuração desejada. Retire os fios de LED e um conector macho fio a fio (Figura 21A Suplementar) e adicione o fluxo como na Figura 3G Suplementar.
11. Coloque o tubo de encolhimento sobre os fios. Use um tubo de encolhimento de 3,18 mm (1/8 polegada) sobre os conectores fio a fio e um tubo de encolhimento de 4,76 mm (3/16 polegadas) sobre o fio (Figura suplementar 21B).
12. Prenda o conector fio a fio com um "mãos que ajudam" e torça a extremidade do conector com o fio (Figura 21C suplementar) e solde-os. Repita com o outro fio (Figura suplementar 21D,E).
13. Coloque os tubos de encolhimento de 3,18 mm (1/8 polegada) sobre a solda e encolha (Figura suplementar 21F–G).
14. Coloque o tubo de encolhimento de 4,76 mm (3/16 polegadas) sobre o tubo de encolhimento de 3,18 mm (1/8 polegada) e encolha (Figura suplementar 21H–I).
15. Fixe os fios de LED das "mãos que ajudam" com fita adesiva sob ele (Figura 22A suplementar).
16. Misture o epóxi de acordo com as instruções do fabricante e espalhe sobre a parte superior do LED soldado (Figura suplementar 22B). Deixe a noite para curar.
17. Se a montagem for feita usando um fixador de toque, corte um pequeno pedaço do fixador de toque (Figura 23A suplementar) e pressione-o contra a parte de trás do LED por 30 s.
18. Use uma ferramenta rotativa de alta velocidade para fazer um entalhe na tampa de uma caixa preta (Figura suplementar 23C–E).
19. Construa uma montagem para um único LED através de uma película de privacidade.
    1. Usando a broca de pá, faça um furo de 1,75 cm (11/16 polegadas) através da parte superior de uma caixa preta onde o LED será colocado (Figura 24A Suplementar).
    2. Usando uma ferramenta rotativa de alta velocidade, faça um entalhe em um lado do orifício para abrir espaço para o fio de LED, conforme mostrado na Figura 24A Suplementar.
    3. Corte um pedaço de película de privacidade (25–30 mm) e fita adesiva no interior da caixa preta que cobre o orifício através do qual o LED acenderá (Figura 24A Suplementar).
    4. Coloque o LED fora da caixa preta em cima do orifício com filme de privacidade e fita adesiva no lugar com fita adesiva (Figura suplementar 24B–E).

4. Acomodar uma caixa preta para caber no sistema de iluminação

1. Para um sistema de quatro LEDs, faça quatro furos de 0,83 cm (21/64 polegadas) na tampa a 3,81 cm (1,5 polegada) de distância onde os potenciômetros serão anexados (Figura Suplementar 25).
2. Usando uma ferramenta rotativa de alta velocidade, corte um orifício retangular de 1,19 cm x 1,90 cm (0,47 polegadas x 0,75 polegadas) no canto superior esquerdo (Figura 25 Suplementar).
3. Usando a broca de pá, faça um furo de 1,75 cm (11/16 polegadas) na caixa preta (Figura 26 Suplementar).
4. Arquive os furos e insira o grommet no furo perfurado (Figura 26 Suplementar).
5. Para os LEDs controlados por computador, lixa a área onde o microcontrolador será colado em uma caixa preta, bem como o lado inferior do suporte do microcontrolador.
6. Encaixe o microcontrolador no suporte antes de prendê-lo na caixa preta e, em seguida, coloque-o no lugar (Figura 27A suplementar).
7. Use lixa para lixar o fundo de dois clipes e a área em uma caixa preta onde o circuito será colocado e prenda os clipes dentro da caixa preta com o epóxi (Figura 27A Suplementar).
8. Prenda a placa PCB em clipes (Figura 27B suplementar).
9. Empurre o interruptor de alimentação através do orifício quadrado na tampa feita na Figura 25 Suplementar e encaixe-o no lugar (Figura 28A Suplementar).
10. Empurre os POTs através dos orifícios da tampa, parafuse no lugar (Figura 28A Suplementar) e coloque o botão no POT (Figura 28B Suplementar).

5. Conecte toda a fiação e dispositivos

1. Rotule os conectores fio a fio (por exemplo, LED, POT, COM) (Figura 29A suplementar).
2. Conecte os conectores frisados fabricados na etapa 2.4 (Figura 16 Suplementar) ao conector macho fio a fio entre os dois conectores fêmeas (POT e LED) (Figuras Suplementares 7A e S37).
3. Conecte as extremidades frisadas ao microcontrolador (Figura 30 suplementar).
4. Puxe o cabo USB através do grommet e conecte-o ao microcontrolador.
5. Puxe os fios para os LEDs através do grommet e conecte-se ao conector fêmea fio a fio à esquerda da conexão do microcontrolador (Figuras Suplementares 9D e 38).
6. Puxe o fio da fonte de alimentação através do grommet e conecte-o ao conector macho fio a fio no lado direito da placa PCB (Figura 11D suplementar).
7. Conecte o conector macho fio a fio do interruptor de alimentação ao conector fêmea fio a fio à direita da placa PCB (Figura 11A suplementar).
8. Conecte os conectores machos fio a fio dos POTs na tampa aos conectores fêmeas fio a fio na placa PCB (Figuras suplementares 8 e 36).
   NOTA: Não ligue o circuito sem os potenciómetros ligados.

6. Instale o software de controle LED

NOTA: Consulte as instruções detalhadas de instalação de software no arquivo suplementar no Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces

1. Baixe e instale o software para programar o microcontrolador
2. Baixe e instale o gerenciador de pacotes.
3. Programe o microcontrolador.
4. Baixe e instale o mecanismo de tempo de execução.
5. Baixe a interface do usuário.

7. Estimule as células com luz

1. Transfecte células HEK293.
   1. Células de placa HEK293 a 100k células por poço em uma placa de 24 poços.
   2. Use a tabela de exemplo para calcular os meios livres de soro, Polietilenimina (PEI) e volumes de DNA (Figura Suplementar 39) e transfect usando o protocolo do fabricante.
2. Estimulando as células com luz.
   NOTA: As células devem ser mantidas no escuro após a transfecção ou manuseadas usando uma fonte de luz que não excite o sistema optogenético.
   1. Decida que tipo de estimulação será usada nas células (luz contínua, intensidade pulsante, etc.).
   2. Com os POTs desligados (no sentido anti-horário), ligue a fonte de alimentação LED.
   3. Coloque um medidor de luz dentro da caixa preta onde as células serão colocadas e coloque a tampa com o LED sobre o medidor. Ajuste a intensidade da luz conforme necessário.
   4. Se estiver usando o computador para controlar os LEDs, abra o software de interface do usuário.
   5. Programe a interface do usuário (Figura 5A,B).
      1. No painel superior esquerdo, selecione a porta COM para o microcontrolador e clique em Conectar.
      2. Use os painéis à direita para programar cada LED. Para luz contínua, selecione qualquer momento, exceto para zero no "Time On" e defina o "Time Off" como zero.
      3. No painel inferior direito, programe o controle de temporização principal.
         1. Para atrasar a iluminação, selecione um atraso de início (HH:MM).
         2. Para desligar todos os LEDs após um tempo designado, selecione um tempo de execução (HH:MM).
         3. Inicie o programa de iluminação clicando no botão Executar (Figura 5A).

8. Medir a expressão gênica usando um ensaio de luciferase dupla

1. Preparar o reagente de luciferase misturando 10 ml de tampão de luciferase com o reagente de luciferase e alíquota em tubos de 1 ml para serem armazenados a -80 °C durante um período máximo de 1 ano.
2. Prepare o tampão de lise 5x em 1x para 100 μL para N + 2 poços. por exemplo, para 30 amostras, 30 x 20 μL de buffer de lise 5X e 30 x 80 μL de MQ H₂O.
3. Preparar solução de substrato Renilla: 20 μL de substrato Renilla para 1 mL de tampão Renilla (esta quantidade é adequada para 10 ensaios).
4. Remova as células da incubadora, aspirar o meio, adicionar 100 μL de 1x tampão de lise por poço e colocá-lo em um agitador a 100 RPM por 15 min.
5. Colocar em -20 °C durante, pelo menos, 1 h.
6. Adicionar 100 μL de reagente de luciferase por amostra a um poço de uma placa branca de 96 poços.
7. Configure o leitor de placas para luminescência. Usando o módulo de luminômetro do leitor de placas, defina a integração para 1 s.
8. Adicione lisados descongelados em poços abaixo do reagente luciferase. Usando uma pipeta multicanal, misture 20 μL de amostra no reagente de luciferase e meça a luminescência imediatamente.
9. Após o platô de leituras, adicionar 100 μL de solução de substrato de Renilla e digitalizar novamente.
10. Divida o sinal Luciferase pelo sinal Renilla para levar em conta a eficiência da transfecção.
11. Compare os sinais de luciferase normalizados para a eficiência da transfecção (por exemplo, compare o sinal de amostras iluminadas por luz vermelha e luz vermelha distante).

Uma vez que o circuito de alimentação, a fonte de alimentação, o interruptor de alimentação, os POTs e um LED são montados (até a Figura 21 Suplementar), o circuito pode ser testado. Com todos os POTs no lugar, o POT controlará a intensidade do LED. Uma vez concluída a montagem até a Figura 29 Suplementar, o sistema pode ser usado manualmente para optogenética ou outras aplicações. Toda a energia do sistema pode ser controlada manualmente com o interruptor de alimentação. A intensidade de cada LED pode ser controlada independentemente usando o POT conectado a cada circuito.

Depois de instalar o software e programar o microcontrolador, a interface do usuário pode se comunicar com o microcontrolador. Com a interface do usuário, os LEDs podem ser controlados temporalmente de várias maneiras: (1) cada LED pode ser programado para permanecer aceso por um tempo especificado, (2) cada LED pode ser programado para pulsar, (3) um atraso global de início (por exemplo, ao transfeccionar e acender luz 24 horas depois) pode ser programado (Figura 6B), (4) o tempo total para o programa ser executado após o atraso. Existem duas interfaces de usuário, uma com botões maiores que podem controlar dois LEDs de cada vez e outra que pode controlar quatro LEDs (Figura 5A,B). A interface de usuário de dois LEDs é otimizada para tablets e é suficiente para controlar LEDs vermelhos e vermelhos distantes para muitos experimentos.

Para experimentos maiores, a segunda interface do usuário pode ser usada para controlar até quatro LEDs. Ao induzir a expressão gênica, o resultado esperado depende de vários parâmetros. Estes incluem tempo de indução, níveis de indução (por exemplo, quantidade de luz ou droga) e número de cópia da construção induzível na célula. Para mostrar isso, transfectamos o interruptor do gene PhyB juntamente com diferentes quantidades de DNA repórter (pPK-202) (0,5%, 1%, 2%, 4% e 8% do DNA transfectado) (Figura 6A) e iluminados como mostrado na Figura 6B. Em amostras contendo PhyB, mas sem plasmídeo para produzir ficocianobilina (PCB-cromóforo) (ou seja, sem resposta à luz), a expressão/vazamento do gene luciferase aumenta com a quantidade de DNA do repórter (Figura 6C) (P vermelho distante < 0,0001, Regressão linear seguida de um teste de Wald), (P vermelho < 0,0001, Regressão linear seguida de um teste de Wald). Além disso, quando todo o interruptor do gene PhyB, incluindo o plasmídeo produtor de cromóforo PCB (células sensíveis à luz), são iluminados para luz vermelha distante, a expressão da Luciferase também aumenta com o aumento das quantidades de construção do repórter na mistura de transfecção (Figura 6C,D) (Luz vermelha Far-P < 0,0001, Regressão linear seguida por um teste de Wald). Da mesma forma, quando as células sensíveis à luz são iluminadas com luz vermelha, a expressão de luciferase também aumenta com o aumento da quantidade de repórteres (P < 0,0001, regressão linear seguida de um teste de Wald). Ao comparar os níveis de indução das células tratadas com luz vermelha com as células tratadas com luz vermelha distante, encontramos uma pequena diminuição na ativação da dobra com o aumento da quantidade de repórteres (Figura 6E) (P = 0,0141, Regressão linear seguida de um teste de Wald).

Figura 1: Um circuito básico para um único LED. (A) Um fluxograma mostrando uma visão geral das etapas necessárias para construir o sistema de iluminação LED. (B) O sistema de controle de iluminação LED. (esquerda) Caixa de controle para regular a intensidade e o tempo do LED. (meio) Um tablet PC executando interface de usuário para controlar LEDs. (direita) Uma caixa preta para montagem de LEDs e colocação de células para estimulação óptica. (C) Tabela para determinar se o LED requer um circuito de alta ou baixa tensão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Instruções para soldar os componentes no lugar. (A) Um exemplo das instruções passo a passo dos desenhos animados para a construção do circuito. (B,C) Instruções de exemplo com imagens do dispositivo que está sendo montado. (D) Exemplos de instruções para a montagem de vários circuitos simultaneamente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Vistas de um sistema de controle de LED montado. (A) Uma vista externa superior do sistema montado. (B) Uma visão interna de um sistema de iluminação LED montado de quatro LED. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Instruções para refluxo de solda do LED no dissipador de calor. (A) A base do LED e um close up de um LED vermelho profundo. (B) Colocação de pasta de solda na base do LED. (C) Imagem do LED soldado. Setas vermelhas apontam para almofadas de solda. Em comparação com o cinza antes da solda (A), após a solda, a solda parece metálica / brilhante. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Software para controle de experimentos optogenéticos. (A) Uma interface de usuário de dois LEDs com botões grandes para facilitar o uso com um tablet barato. (B) Uma interface de usuário de quatro LEDs. Ambas as interfaces permitem um controle LED independente. Para pulsação, os LEDs podem ser programados para ligar e desligar para larguras de pulso específicas e durações especificadas. A pulsação também pode ter um atraso de início e um tempo de execução total predeterminado. (C) O comprimido de controle LED montado em uma incubadora de cultura de células. (D) Ilustração do sistema do gene PhyB quando iluminado com luz vermelha distante. A luz vermelha distante mantém o gene no estado "desligado" ou "escuro". (E) Ilustração do sistema do gene PhyB quando iluminado com luz vermelha. A luz vermelha induz a expressão gênica, promovendo a interação entre PhyB e PIF3. Essa interação localiza o domínio de ativação gênica (DA) fundido ao PIF3 ao promotor do UAS, ativando o gene repórter. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Resultados esperados usando o sistema LED para controlar o PhyB. (A) Um plasmídeo que codifica parceiros híbridos duplos PhyB+PIF3 (pPK-351), um plasmídeo que codifica as enzimas de síntese de ficocanobilina (PCB-cromóforo) (pPK-352) e um plasmídeo repórter da Luciferase (pPK-202). (B) Linha do tempo de experimentos de indução de luz para C-E. (C) Níveis de transcrição basal (vazamentos AKA) com quantidades crescentes de DNA repórter. As amostras de "vazamento" não são transfectadas com pPK-352 (ou seja, não respondem à luz), mas são iluminadas com luz vermelha ou vermelha distante. As amostras de interruptor de luz (LS) incluem todos os plasmídeos de interruptor de genes de luz e são iluminadas com luz vermelha ou vermelha distante. (D) Níveis de indução de luz em resposta à luz vermelha e vermelha distante. (LS-Far-luz vermelha é os mesmos dados em C e D.) (E) Indução de dobra de luciferase em células iluminadas com luz vermelha/luz vermelha distante. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

 Clique aqui para baixar as Figuras Suplementares 1-39.

Figura 1 suplementar: Circuito de driver eletrônico para vários LEDs. (A) O diagrama de circuito para um único sistema LED. (B) O diagrama de circuito para um sistema de quatro LEDs.

Figura 2 suplementar: Colocação das interligações do circuito. (A) Fixe a placa PCB nas mãos amigas. (B) Posição dos saltadores do circuito principal nos orifícios da imagem. (C) Diagrama de conectores de fio mapeando as coordenadas. Para os quatro sistemas LED, desenhe linhas dividindo cada circuito como mostrado (linhas verticais pretas). A Figura Suplementar 31–38 descreve a montagem de quatro circuitos simultaneamente.

Figura 3 suplementar: Soldar os fios no PCB. (A) Dobre os jumpers para que eles façam contato direto com o PCB e permaneçam no lugar durante a soldagem. (B) Outra visão dos fios dobrados. (C) Fios após solda. (D) Fios aparados no PCB. (E) Isolamento encolhido após aquecimento com solda. (F) Mover o isolamento para a posição de cobrir o solo através do orifício (seta azul) (G) Adição de fluxo a uma extremidade ou terminal de fio.

Figura 4 suplementar: Soldar o regulador de tensão no lugar. (A) Mapa das coordenadas do regulador de tensão. (B) Colocação do regulador de tensão. (C) Cabos reguladores de tensão curvados. (D) Terminais reguladores de tensão após solda.

Figura 5 suplementar: Soldar o resistor R1 no lugar. (A) Mapa das coordenadas do resistor R1 (820Ω). (B) Puxar o resistor através do condutor usando alicate (C) O resistor puxado perto do PCB. (D) O resistor soldado próximo ao PCB.

Figura 6 suplementar: Soldar o transistor no lugar. (A) Mapa das coordenadas e orientação do transistor. (B) Observe a orientação do transistor; a etiqueta neste modelo está voltada para o regulador de tensão (LM317T). Verifique novamente a especificação do transistor para se certificar de que o "Emissor", "Base" e "Coletor" estão nos orifícios corretos. (C) O transistor com os terminais dobrados antes da soldadura.

Figura 7 suplementar: Soldar o conector fio a fio do potenciômetro no lugar (mais um resistor de 560Ω para o circuito de baixa tensão). (A) Mapa das coordenadas do conector fio-a-fio (mais o R3-560Ω se construir o circuito de baixa tensão, o conector fio-a-fio é colocado no orifício antes do resistor). (B) Um conector fêmea fio-a-fio. (C) Para facilitar a montagem do resistor e do conector fio a fio no orifício, 3 a 5 fios do fio trançado são dobrados. (D) Os fios são cortados com cortadores de arame o mais próximo possível do isolamento. (E) Inserido fio vermelho de um conector fêmea fio-a-fio através do orifício a5 (para o circuito de baixa tensão, insira R3 através do mesmo através do orifício). (F) Vista inferior do resistor e do conector fio a fio antes da solda. (G) Imagem do resistor R3 soldado conectado ao solo (F = Fêmea).

Figura 8 suplementar: Soldar o conector fio a fio do potenciômetro até o aterramento. (A) Mapa das coordenadas da ligação à terra para o conector fio-a-fio do potenciómetro. (B) Vista superior do conector fio-a-fio do potenciômetro em paralelo com R3 (F = Fêmea).

Figura 9 suplementar: Soldar o microcontrolador e os conectores fio a fio LED. (A) Mapa das coordenadas do conector fio-a-fio para ligar o 2N222A e o aterramento ao microcontrolador. (B) Conector macho fio a fio soldado. (C) Vista superior de (B). (D) Mapa das coordenadas do conector fêmea fio-a-fio para conectar a entrada do circuito e o aterramento ao LED. (E) Conector fio-a-fio fêmea soldado (F = Fêmea, M = Macho).

Figura 10 suplementar: Soldar o jumper do circuito da fonte de alimentação. (A) Mapa das coordenadas do jumper laranja para conectar a fonte de alimentação ao solo. (B) O jumper laranja soldado no lugar. (C) A vista inferior do jumper soldado no lugar.

Figura 11 suplementar: Soldar o interruptor de alimentação e os conectores fio a fio da fonte de alimentação. (A) Mapa das coordenadas do conector fêmea fio-a-fio para conectar o interruptor de alimentação. (B) O conector fêmea fio-a-fio soldado no lugar. (C) Outra visão de (B). (D) Mapa das coordenadas do conector macho fio-a-fio para conectar a fonte de energia. (E) Conector macho fio a fio soldado. (F) Outra visão de (E) (F = Feminino, M = Masculino).

Figura 12 suplementar: Conectando a fonte de alimentação a um conector macho fio a fio. (A) A fonte de alimentação não modificada. (B) Cortar os fios da fonte de alimentação. (C) Os fios da fonte de alimentação despojados e com excesso de isolamento cortados. (D) Colocação de tubo de encolhimento em torno de fios de fonte de alimentação. Tubulação separando as duas conexões (setas vermelhas) e tubulação para segurar os fios separados (seta amarela). (E) Fios trançados que ligam a fonte de alimentação ao conector fêmea fio-a-fio.

Figura 13 suplementar: Soldar e isolar a conexão da fonte de alimentação a um conector macho fio a fio. (A) A conexão soldada entre o aterramento da fonte de alimentação e um conector fêmea fio a fio. (B) A conexão soldada entre o terminal positivo da fonte de alimentação e um conector fêmea fio a fio. (C) Tubo de encolhimento puxado sobre as conexões individuais soldadas (seta vermelha). (D) Ambas as conexões da fonte de alimentação soldadas e com tubo de encolhimento tratado termicamente. (E) Colocação do tubo de encolhimento sobre conexões individuais (seta amarela). (F) Fonte de alimentação concluída.

Figura 14 suplementar: Soldar o interruptor de alimentação para um conector macho fio a fio. (A) Interruptor de alimentação com fios despojados e tubo de encolhimento colocado sobre os fios (setas vermelhas). (B) Fios que ligam o interruptor e o conector macho fio-a-fio torcidos antes da soldadura. (C) Colocar o tubo de encolhimento sobre as conexões soldadas. (D) Conexões cobertas com o tubo de encolhimento tratado termicamente. (E) Um interruptor de alimentação montado com um conector macho fio a fio.

Figura 15 suplementar: Fiação de um potenciômetro a um conector macho fio a fio. (A) As partes do potenciômetro. (B) Um conector macho fio a fio torcido e dobrado para prender em torno do terminal médio do potenciômetro. (C) Um conector macho fio a fio torcido em torno do terminal médio do potenciômetro. (D) Conexões fio a fio soldadas. (E) Seta vermelha apontando para a aba de metal antes da remoção. (F) O potenciómetro após a remoção da aba metálica.

Figura 16 suplementar: Fiação da conexão do microcontrolador. (A) Fios para conectores fêmeas fio a fio retirados e cortados em preparação para crimpagem. (B) Colocação da crimpagem no conector fio-a-fio. (C) Crimpagem do conector fio-a-fio. (D) Conector fio a fio frisado. (E) Conexão de microcontrolador totalmente montada.

Figura 17 suplementar: Fios de solda e LED na base do LED Parte 1. (A) Materiais necessários para soldar o LED à base do LED. (B) Estanhar a ponta do fio despojado. (C) Aplicação de fluxo no contato da base do LED. (D) Adicionar solda à grande ponta de solda para estanhar a base do LED. (E) Colocação de solda no contato para aquecer a base do LED. (F) A base do LED depois de arrastar a ponta de solda através do contato. (G) O mesmo procedimento no outro contato.

Figura 18 suplementar: Fios de solda e LED na base do LED Parte 2. (A) Um fio estanhado preso ao contato usando um grampo de cabelo. Note que o fio preto é soldado ao cátodo "C-". (B) Adição de uma quantidade generosa de solda à ponta de solda. (C) A ponta de solda pressionando o fio, derretendo a solda na base do LED e no fio. (D) Segurar o fio de modo que ele permaneça colocado quando o ferro de solda for removido. (E) Manter o fio no lugar até que a solda endureça.

Figura 19 suplementar: Soldar fios e LED na base do LED Parte 3. (A) Usando uma ponta afiada para colocar pasta de solda na base do LED para montar o LED. (B) A base do diodo emissor de luz com a pasta de solda no lugar. (C) Colocação do LED na base do LED de modo a que os contactos do LED e da base do LED correspondam.

Figura 20 suplementar: Soldar fios e LED na base do LED Parte 4. (A) O fio preto ainda preso ao contato pelo grampo de cabelo. (B,C) Usando um segundo grampo de cabelo, o fio vermelho é mantido no lugar. Observe que o fio vermelho é soldado ao ânodo "A+". (D) Adição de uma quantidade generosa de solda à ponta de solda. (E) A ponta de solda pressionando o fio, derretendo a solda na base do LED e no fio, bem como a pasta de solda sob o LED. (F) O arrefecimento da base LED quente após a soldadura. (G) A base do diodo emissor de luz com os fios e o diodo emissor de luz soldados. (H,I) Setas vermelhas apontam para almofadas de solda. Após a soldadura, a solda parece metálica/brilhante (em comparação com o cinza antes da solda (Figura suplementar 16D)).

Figura 21 suplementar: Conectando o fio LED a um conector macho fio a fio. (A) Fios despojados e conector macho fio-a-fio ao lado do tubo de encolhimento cortado ao meio (1/8 de polegada e 3/16 de polegada). (B) Encolher a colocação do tubo sobre os fios antes de soldar. (C) Fios torcidos antes da solda. (D) A conexão soldada do fio ao conector fio a fio. (E) Ambos os fios vermelhos e pretos soldados juntos. (F) Colocação do tubo de encolhimento de 1/8 de polegada sobre a conexão soldada. (G) O tubo de encolhimento após o encolhimento com a pistola de calor. (H) Colocação do tubo de encolhimento de 3/16 polegadas sobre o tubo de encolhimento menor. (I) A conexão soldada e selada com o tubo de encolhimento.

Figura 22 suplementar: Fixação dos fios e LEDs à base do LED usando epóxi. (A) Usando um aplicador de madeira para colocar epóxi na base do LED. Uma fita é colocada abaixo para capturar qualquer epóxi pingando. (B) O epóxi é distribuído uniformemente por toda a superfície. (C) O LED é deixado durante a noite para curar.

Figura 23 suplementar: Montagem de LEDs dentro de uma tampa de caixa. (A) Um LED com uma peça de fixação por toque anexada para fácil montagem. (B) LEDs de cores diferentes montados no interior de uma caixa preta usando um fixador de toque. (C) Um entalhe na tampa da caixa preta feito por uma ferramenta rotativa de alta velocidade para abrir espaço para o fio LED. (D) Uma caixa preta para estimular as células com fixadores de toque para montagem do LED. (E) Colocação de um prato multipoço dentro da versão de fixação por toque da caixa LED.

Figura 24 suplementar: Montagem de LEDs fora de uma tampa de caixa. (A) Furo perfurado na tampa da caixa preta com um entalhe da ferramenta rotativa de alta velocidade para abrir espaço para o fio (seta vermelha). (B) LED colocado no orifício com o fio no entalhe, mantido no lugar com fita adesiva. (C) Mais dois pedaços de fita são usados para fixar o LED. A parte traseira do dissipador de calor é exposta para maximizar a troca de calor. (D) Película de privacidade colada sobre o orifício onde o LED será colocado. A seta vermelha aponta para o filme de privacidade. (E) Uma caixa preta para estimular as células com um LED montado fora da caixa e com filme de privacidade para difundir a iluminação. (F) Colocação de um prato multipoço dentro da versão externa LED + filme de privacidade da caixa LED.

Figura 25 suplementar: Furos de perfuração na tampa da caixa para o interruptor de alimentação e potenciômetros. (A) Um desenho CAD com dimensões anotadas da tampa da caixa. (B) A tampa da caixa com o potenciômetro e os orifícios do interruptor de energia.

Figura 26 suplementar: Preparação do orifício de saída do fio. (A) Um desenho CAD com dimensões anotadas. (B) Imagem do furo perfurado com a broca. (C) Alisamento do orifício de saída com ferramenta rotativa de alta velocidade ou ferramenta de arquivamento. (D) Colocação de grommet no orifício de saída.

Figura 27 suplementar: Colocação do microcontrolador e do PCB na caixa. (A) O suporte do microcontrolador (laranja) e os suportes de PCB dentro da caixa. (B) O microcontrolador e o PCB fixados na caixa.

Figura 28 suplementar: Colocação dos potenciómetros e do interruptor de alimentação. (A) Uma vista frontal de uma tampa de caixa com um interruptor de energia e quatro POTs. (B) Uma vista frontal da tampa da caixa com botões de potenciômetro adicionados. (C) Uma visão traseira da tampa da caixa com os componentes anexados.

Figura 29 suplementar: O sistema de controle de LED montado. (A) Uma caixa de controle aberta com os fios rotulados com uma impressora de etiquetas e zip amarrado para organização. (B) A caixa uma vez que esteja totalmente montada com cada POT rotulado junto com o PIN.

Figura 30 suplementar: Colocação do conector fio a fio frisado. (A) Imagem dos conectores fio a fio frisados para um sistema de quatro microcontroladores LED. (B) Colocação do conector frisado nas portas do microcontrolador.

Figura 31 suplementar: Colocação dos fios do jumper. (A) Uma placa de circuito com as coordenadas dos fios de jumper vermelhos rotulados. (B) Uma placa de circuito com as coordenadas dos fios de jumper amarelos rotulados.

Figura 32 suplementar: Colocação dos fios do jumper. Uma placa de circuito exibindo as coordenadas dos fios de jumper amarelos.

Figura 33 suplementar: Adição dos reguladores de tensão. Os reguladores de tensão LM317T são adicionados ao circuito com suas coordenadas rotuladas nos diagramas.

Figura 34 suplementar: Inserção dos resistores 820Ω. Os resistores R1 são adicionados ao circuito com suas coordenadas rotuladas nos diagramas.

Figura 35 suplementar: Inserção dos transistores. Os transistores 2N2222A são adicionados ao circuito com suas coordenadas rotuladas nos diagramas.

Figura 36 suplementar: Inserção dos conectores e resistores fêmeas fio a fio (opcional) para a conexão POT. Os fios e resistores são adicionados ao circuito com suas coordenadas rotuladas nos diagramas. (A) Insira o fio vermelho, seguido do resistor R2 (560Ω) (apenas para o circuito de baixa tensão). (B) Inserir a outra extremidade do resistor no orifício de terra indicado. (C) Insira os fios pretos nos orifícios marcados para se conectar ao solo. Nota: R2 (560Ω) é paralelo ao potenciômetro.

Figura 37 suplementar: Inserção de conectores machos fio a fio para a conexão do microcontrolador e a fonte de alimentação. Os fios são adicionados ao circuito com suas coordenadas rotuladas nos diagramas. (A) Insira os fios vermelhos nos orifícios indicados. (B) Insira os fios pretos nos orifícios marcados.

Figura 38 suplementar: Adicionando conectores LED fio a fio. (A) Conectores fêmeas fio-a-fio com as coordenadas vermelhas do cabo destacadas. (B) Conector fêmea fio-a-fio com as coordenadas pretas do cabo destacadas.

Figura 39 suplementar: Configurando um experimento de troca de gene PhyB-PIF3. (A) Uma tabela de exemplo de um master mix contendo Renilla para o controle interno. (B) Uma tabela de exemplo para configurar a mistura de DNA para um ensaio de repórter de Luciferase Dupla de um experimento optogenético PhyB-PIF3. (C) Um quadro de exemplo para a configuração do reagente de transfecção PEI e a alíquota da mistura em células (dropwise). (D) Colocação do medidor de luz para definir o brilho do LED.

O sistema LED descrito aqui foi usado em nosso laboratório para otimizar, caracterizar e trabalhar com várias ferramentas optogenéticas. Em Kyriakakis et ^al.4, testamos muitas combinações de switches do gene PhyB-PIF em paralelo. Em seguida, usamos esse sistema para testar pulsos de luz em diferentes frequências para medir a cinética do interruptor genético e a intensidade efetiva da luz. Esse sistema também foi utilizado para otimizar e caracterizar dois sistemas optogenéticos que utilizam luz azul para estimulação ^5,6. Como apenas um LED precisava ser brilhante o suficiente para ativar a maioria das ferramentas optogenéticas, comprar um sistema com um grande número de LEDs sobre cada poço nem sempre é necessário. Essa configuração é barata, confiável, fácil de reconfigurar e não requer conhecimento prévio em eletricidade para seguir o protocolo de montagem.

Nas Figuras Suplementares suplementares 31–38, descrevemos como incorporar até quatro LEDs no sistema. Embora isso possa limitar alguns experimentos que exigem um grande número de condições paralelas, mais LEDs podem ser adicionados substituindo a fonte de alimentação de 9 Volts usada neste protocolo por uma de maior potência. Da mesma forma, vários LEDs de menor potência podem ser conectados em paralelo a cada circuito. Neste último arranjo, alguns LEDs não serão controlados individualmente, mas isso pode ser útil quando muitos LEDs são necessários para cobrir uma área maior. Uma vez familiarizado com a eletrônica deste sistema, existem muitas maneiras de personalizá-lo. Estratégias adicionais para personalizar o sistema incluem colocar o LED mais longe ou mais perto da amostra e iluminar através de filtros/difusores para condições de iluminação homogêneas ou para evitar o aquecimento, como em (Figura Suplementar 23) e Allen et ^al.5. Outra característica notável do nosso design LED é que ele é encapsulado em epóxi e tem um fixador de toque na parte de trás; isso permite que o LED seja colocado com segurança com facilidade praticamente em qualquer lugar: em incubadoras, tanques de peixes, gaiolas de animais, paredes, etc.

Muitos experimentos que usam optogenética para controlar genes, vias de sinalização e outras atividades celulares geralmente exigem pulsação, abrangem grandes escalas de tempo ou precisam ser realizados em uma incubadora, exigindo automatização ou manipulação remota sem um microscópio. Este sistema LED foi testado continuamente por vários meses dentro de uma incubadora de CO₂ umidificada sem problemas. Além disso, com sistemas reversíveis, como os sistemas optogenéticos PhyB, o experimentador pode precisar programar cronogramas de iluminação pulsante específicos. Em nosso trabalho anterior⁴, usamos programas pulsantes para testar a dinâmica de reversibilidade de um switch PhyB-PIF3 em células de mamíferos através da interface do usuário. Usando a metodologia descrita neste manuscrito, programar um protocolo pulsante é fácil, proporcionando a flexibilidade e autonomia necessárias para muitos tipos de experimentos optogenéticos de maneira amigável.

As etapas mais críticas na construção deste sistema incluem a montagem do circuito elétrico na placa PCB e a conexão dos componentes, que são detalhados nas seções 1 e 2. É essencial seguir cuidadosamente cada passo nessas seções e verificar novamente os números do pinhole linha por linha antes de soldar cada componente. A seção 2 explica como configurar os componentes que serão conectados ao circuito. Para que os componentes se conectem na orientação correta, é particularmente importante garantir que as cores dos fios preto e vermelho nos conectores fio a fio correspondam. Pequenos descuidos nessas duas seções provavelmente afetarão a funcionalidade do sistema. De fato, o primeiro passo na solução de problemas desse método será verificar se o circuito foi construído corretamente e se todas as conexões estão no lugar. Em segundo lugar, verificar a qualidade da solda para conexões soltas e os fios para queimar pelos de arame que podem estar em curto-circuito é de particular importância. Um terceiro passo seria garantir que os LEDs estejam funcionando corretamente, o que pode ser feito usando uma fonte de alimentação ou uma bateria de 1,5 V, cortando os dois terminais do LED com clipes de jacaré. Outra consideração potencialmente crítica é evitar o aquecimento (ao usar os LEDs em alta potência) ou difundir a luz para uma iluminação mais ampla. Para abordar essas considerações, os LEDs podem ser montados fora de uma caixa preta com "filme de privacidade" no interior, conforme descrito na Figura Suplementar 23 e Allen et ^al.5. Devido à simplicidade deste sistema, desmontá-lo para verificar, modificar, atualizar ou reparar componentes modulares não é difícil.

Outro fator crítico para sistemas genéticos induzíveis é considerar quanta ativação é necessária ou quanto vazamento é aceitável para o sistema biológico que está sendo controlado. Como mostrado na Figura 6, estes podem variar com a quantidade de DNA do repórter. Além disso, a eficiência da transfecção e, portanto, o número de cópias das construções do repórter em cada célula variam. Pode ser vantajoso para alguns experimentos fazer uma linhagem celular com uma quantidade fixa de componentes de interruptor de genes Repórter ou PhyB e rastrear clones com a faixa desejada de expressão induzida, como é comumente feito com sistemas induzíveis de drogas. Devido ao tamanho e instabilidade do plasmídeo lentiviral pPK-230⁴, também fizemos versões plasmídicas não lentivirais do interruptor PhyB na espinha dorsal do pcDNA pPK-351 (Addgene #157921) e pPK-352 (Addgene #157922).

Ao construir este sistema de iluminação LED seguindo este protocolo, os usuários têm todos os componentes necessários para realizar uma ampla gama de experimentos de optogenética in vitro e in vivo. Combinado com as instruções para o uso de PhyB-PIF3 em células de mamíferos, este protocolo permitirá que não-engenheiros e biólogos usem, de forma flexível e eficaz, optogenética baseada em PhyB em uma variedade de contextos.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Gostaríamos de agradecer a Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang e Molly Allen por testarem diferentes versões do sistema LED à medida que ele estava sendo desenvolvido. Este trabalho foi apoiado pelo Kavli Institute for Brain and Mind da UC San Diego e pelo Salk Institute, National Science Foundation através do NSF Center for Science of Information sob o Grant CCF-0939370, NIH Grant NS060847 e NIH Grant R21DC018237.