Costruire un sistema di illuminazione semplice e versatile per esperimenti optogenetici

Questo protocollo descrive come eseguire esperimenti optogenetici per controllare l'espressione genica con luce rossa e rossa lontana utilizzando PhyB e PIF3. Sono incluse istruzioni dettagliate per la costruzione di un sistema di illuminazione semplice e flessibile, che consente il controllo dell'espressione genica o di altre optogenetiche con un computer.

Il controllo dei processi biologici utilizzando la luce ha aumentato l'accuratezza e la velocità con cui i ricercatori possono manipolare molti processi biologici. Il controllo ottico consente una capacità senza precedenti di sezionare la funzione e ha il potenziale per consentire nuove terapie genetiche. Tuttavia, gli esperimenti optogenetici richiedono adeguate fonti di luce con controllo spaziale, temporale o di intensità, spesso un collo di bottiglia per i ricercatori. Qui descriviamo in dettaglio come costruire un sistema di illuminazione a LED versatile e a basso costo che sia facilmente personalizzabile per diversi strumenti optogenetici disponibili. Questo sistema è configurabile per il controllo manuale o computerizzato con intensità LED regolabile. Forniamo una guida passo-passo illustrata per costruire il circuito, renderlo controllato dal computer e costruire i LED. Per facilitare l'assemblaggio di questo dispositivo, discutiamo anche alcune tecniche di saldatura di base e spieghiamo i circuiti utilizzati per controllare i LED. Utilizzando la nostra interfaccia utente open source, gli utenti possono automatizzare la temporizzazione precisa e il pulsare della luce su un personal computer (PC) o un tablet economico. Questa automazione rende il sistema utile per gli esperimenti che utilizzano i LED per controllare geni, percorsi di segnalazione e altre attività cellulari che si estendono su ampie scale temporali. Per questo protocollo, non è richiesta alcuna esperienza preliminare in elettronica per costruire tutte le parti necessarie o per utilizzare il sistema di illuminazione per eseguire esperimenti optogenetici.

Gli strumenti optogenetici stanno diventando onnipresenti e nuove tecnologie vengono costantemente sviluppate per controllare otticamente i processi biologici come l'espressione genica, la segnalazione cellulare e molti altri ^1,2,3. La capacità di controllare i processi cellulari con la luce consente una cinetica rapida, uno stretto controllo spaziale e una regolazione dose-dipendente che può essere controllata dall'intensità della luce e dal tempo di esposizione. Per utilizzare questi strumenti, è necessario un dispositivo per controllare questi parametri. Abbiamo recentemente sviluppato un interruttore genico geneticamente codificato PhyB-PIF3 per i mammiferi che attiva e disattiva in modo reversibile i geni utilizzando luce rossa / rossa lontana, rispettivamente⁴. Questo sistema è stato testato in diverse linee cellulari di mammiferi e ha permesso l'induzione senza precedenti dell'espressione genica anche con quantità molto piccole di luce, compresi impulsi di luce. I ricercatori che desiderano utilizzare l'interruttore PhyB e strumenti simili ^5,6 richiedono frequentemente informazioni sui metodi per controllare l'intensità e la durata dell'illuminazione. Pertanto, abbiamo sviluppato questo protocollo con istruzioni passo-passo per consentire una più ampia adozione di questi strumenti per l'optogenetica.

Prima dell'uso diffuso dei LED, le sorgenti luminose a banda larga con filtri venivano utilizzate per studiare proteine sensibili alla luce come i fitocromi⁷. Recentemente, alcuni sistemi di illuminazione a LED sono stati pubblicati insieme agli strumenti optogenetici 8,9,10,11,12, ma tali protocolli possono richiedere una significativa esperienza in elettronica / software, richiedere attrezzature specializzate (ad esempio, stampanti 3D^, macchine da taglio laser o fotomaschere) o non fornire le istruzioni passo-passo che alcuni ricercatori dovrebbero implementare per le loro esigenze di ricerca. Mentre il controllo indipendente dei singoli pozzetti in una piastra multipozzetto può essere utile, spesso non è necessario quando i ricercatori hanno solo bisogno di confrontare diversi campioni in luce chiara e scura o luce rossa rispetto alla luce rossa lontana. Inoltre, molti sistemi commerciali esistenti sono costosi, con capacità di personalizzazione limitate. Tuttavia, i LED descritti in questo protocollo sono economici, luminosi e possono essere montati in molti modi; Pertanto, possono essere utilizzati per illuminare diversi tipi di campioni. Con il protocollo e il software fornito, i LED che vanno dall'ultravioletto (UV) al NIR possono essere utilizzati e controllati con software per eseguire esperimenti optogenetici utilizzando UVR8 13,14, Dronpa 15,16, domini LOV 17,18, Step Function Opsins ^19,20, CRY2 21,22, PhyB 4,23,24 ^,25, fitocromi batterici^26,27,28,29 e altri sistemi sensibili alla luce ^30,31,32.

Questo protocollo costituisce un tutorial per l'assemblaggio dei circuiti e di altro hardware necessario per controllare diversi parametri per la stimolazione della luce, nonché gli strumenti molecolari / cellulari per eseguire un esperimento optogenetico. Inoltre, riportiamo plasmidi ottimizzati da Kyriakakis et ^al.4 che sono più piccoli e più stabili per la clonazione. Attraverso questo protocollo, i biologi senza esperienza in elettronica e ottica possono costruire sistemi di illuminazione flessibili e robusti. In modo graduale, mostriamo come costruire sistemi LED, rimuovendo il collo di bottiglia tecnico per l'adozione più ampia di strumenti optogenetici. Questo sistema può essere facilmente utilizzato nella maggior parte degli incubatori per colture cellulari, anche se non contengono porte a filo. Ad esempio, abbiamo mantenuto il sistema LED in un incubatore a CO₂ umidificato ininterrottamente per più di 6 mesi senza alcun calo delle prestazioni. Spieghiamo anche come collegare il sistema LED a un computer e interfacciarlo con il software open source che forniamo su GitHub (https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces). La costruzione di un sistema utilizzando questo protocollo fornisce ai ricercatori le conoscenze di base per eseguire il debug di potenziali problemi, sostituire parti e migliorare/estendere le funzionalità.

Panoramica del sistema

La costruzione del sistema di illuminazione comporta (1) la costruzione del circuito elettronico, (2) la costruzione delle periferiche (cavo di alimentazione, interruttore di alimentazione, ecc.), (3) la costruzione dei LED, (4) l'assemblaggio di tutti questi componenti e (5) l'installazione del software per controllare i LED con un'interfaccia utente (Figura 1A). Una volta completato, il sistema di illuminazione può controllare fino a quattro LED in modo indipendente con un'interfaccia utente (Figura 1B). L'interfaccia utente consente a ciascun LED di lampeggiare a intervalli di tempo specificati e di spegnersi dopo un tempo specificato. C'è anche un ritardo di avvio per iniziare i programmi di illuminazione in un momento specificato. I potenziometri (POT) regolano l'intensità di ciascun LED in modo indipendente o possono essere utilizzati per il controllo manuale dei LED senza un computer. I fili ai LED possono essere di qualsiasi lunghezza personalizzata, consentendo loro di essere facilmente collocati in un incubatore o in uno spazio di laboratorio. Grazie all'elevata potenza di questi LED, possono essere utilizzati per illuminare una vasta area con un singolo LED a distanza.

Descrizione del driver LED

Per alimentare e controllare l'intensità dei LED, questo protocollo passerà attraverso passaggi per costruire un "driver LED". Ogni LED ha una gamma di tensioni in cui opera (Figura 1C). Durante il funzionamento, la tensione di uscita del regolatore, che controlla l'intensità della luce, può essere regolata da un potenziometro. Il POT varia la resistenza, regolando la tensione/luminosità di uscita. La sintonizzazione con un POT da 1 kΩ (1 kilo-ohm) fornisce quello che chiamiamo il "circuito ad alta tensione" e ha un intervallo da 1,35 V a 2,9 V. Poiché 2,9 V è troppo alto per il funzionamento dei LED a bassa tensione (Figura 1C), mostriamo una singola modifica (Resistore 3 o "R3" Figura supplementare 1A) che limita la portata per abbinare i LED a bassa tensione. R3 serve a ridurre la tensione massima applicata ai LED a 1,85 V (assemblaggio dettagliato nella Figura supplementare 8) quando in parallelo con il potenziometro. Utilizzando la tensione per controllare la luminosità anziché la corrente, il sistema è più flessibile per i LED con diverse tensioni operative. La Figura 1C contiene un elenco dei LED ad alta e bassa tensione per guidare la selezione ottimale del circuito. Questo design mantiene la tensione minima abbastanza bassa in modo che il LED sia completamente spento quando il potenziometro è spento e non consente alla tensione di superare la tensione operativa tipica del LED. Per l'optogenetica PhyB, utilizziamo LED rosso intenso e rosso lontano, che utilizzano il circuito a bassa tensione.

Descrizione del sistema di controllo del computer a LED

Il sistema di illuminazione a LED può essere utilizzato per un'illuminazione costante senza un computer o un microcontrollore. Tuttavia, per i programmi pulsanti e per il controllo della temporizzazione dei singoli LED, è necessario installare un microcontrollore. Per utilizzare un microcontrollore per controllare i LED, è necessario un transistor per collegare il microcontrollore al circuito. Questo transistor rileva la tensione dal microcontrollore e passa dall'essere conduttivo o isolante. Per controllare "on" e "off", usiamo quello che viene chiamato un "transistor di tipo a commutazione NPN" (2N2222) come shunt controllabile attraverso R2 (Figura supplementare 1A). Quando la tensione del microcontrollore viene applicata alla base del transistor, il transistor diventa conduttivo e abbassa la tensione del LED, spegnendo il LED. Pertanto, gli stati di accensione e spegnimento del LED e del transistor sono controllati direttamente dal microcontrollore, che è controllato dal software installato sul PC.

Per realizzare il sistema di illuminazione, sono necessari i seguenti passaggi: Costruire il circuito elettrico; costruire l'alimentatore, l'interruttore di alimentazione manuale, i POT e la connessione del microcontrollore; costruire i LED; ospitare una scatola nera per adattarsi al sistema di illuminazione; collegare tutti i cablaggi e i dispositivi; installare il software di controllo LED, stimolare le cellule con la luce; Misurare l'espressione genica utilizzando un doppio test di luciferasi.

1. Costruisci il circuito elettrico

NOTA: il protocollo per la creazione di un singolo circuito per un LED disponibile è descritto qui. Le istruzioni per espandere questo fino a quattro LED sono incluse nelle informazioni supplementari.

1. Accendere l'assorbitore di fumo e il saldatore. Aggiungere acqua alla spugna, avere la saldatura a portata di mano.
   ATTENZIONE: Assicurarsi di prendere precauzioni di sicurezza per rimuovere il fumo e prevenire ustioni.
2. Iniziare a saldare i componenti del circuito stampato sul circuito stampato (scheda PCB) nell'ordine indicato nei pannelli supplementari.
   NOTA: Utilizzare una piccola quantità di saldatura sulla punta del saldatore per riscaldare prima il metallo del componente e la scheda PCB e fondere la saldatura aggiuntiva direttamente sui componenti; Il flusso può aiutare molto.
3. Fili e componenti dei ponticelli di saldatura (figura supplementare 2 e figura supplementare 3).
   1. Per i fili del ponticello (il cablaggio isolato che collega due punti sul circuito stampato), utilizzare due pezzi di fili arancioni [7,6 mm (0,3 pollici)] e gialli [12 mm (0,4 pollici)] dal kit ponticello.
   2. Agganciare la scheda PCB alle "mani d'aiuto" e inserire i fili del ponticello nei seguenti fori, piegare i terminali di 45 gradi e aggiungere flusso (Figura 2, Figura supplementare 2 e Figura supplementare 3): a1 e a3 → massa (-) (arancione), alimentatore → a7 (+) #7 (giallo), d2 → d6 (giallo).
   3. Saldare e quindi tagliare la parte posteriore dei fili.
   4. Inserire il regolatore di tensione LM317T nei seguenti fori, piegare i pin e aggiungere flusso (Figura 2 e Figura 4 supplementare): Adj → e5, V_out → e6, V_in → e7.
   5. Saldare prima i terminali sinistro e destro, tagliarli, quindi saldare e tagliare il terminale centrale.
   6. Per impostare l'intervallo di bassa tensione del circuito, inserire un resistore da 820 Ω fino in fondo nei fori stenopeici, saldare e tagliare c2 → c5 (Figura 2 e Figura 5 supplementare).
   7. Per abilitare il controllo LED da parte del microcontrollore, inserire il transistor in b3–b5 (Figura 2 e Figura 6 supplementare): Collettore → b3, Base → b4, Emettitore → b5.
      NOTA: Prestare attenzione all'orientamento del transistor da inserire correttamente; controllare le specifiche per trovare la designazione del collettore, della base e dell'emettitore.
4. Saldare i connettori wire-to-wire per POT, LED, microcontroller e fonte di alimentazione.
   NOTA: prestare attenzione al colore dei fili dei connettori wire-to-wire e se si utilizza un connettore wire-to-wire femmina o maschio.
   1. Determinare se è necessario un circuito "bassa tensione" o "alta tensione" per il LED desiderato (Figura 1C).
      NOTA: se il LED è presente nell'elenco "bassa tensione", è necessario un resistore in parallelo con il POT.
   2. Per il circuito "bassa tensione" o "alta tensione", posizionare il filo da un connettore femmina filo-filo attraverso il foro a5 (figura supplementare 7). Non saldare ancora in posizione se si fa il circuito a bassa tensione.
      NOTA: Ruotare le estremità del filo nudo in modo che i piccoli peli di filo non si sfaldino. Se il filo sembra troppo spesso per spingere attraverso il foro stenopeico senza sfilacciarsi, tagliare 2-6 fili e poi torcerli di nuovo insieme (Figura supplementare 7B-D).
   3. Se si crea il circuito "alta tensione", andare al punto 1.4.5. Se si crea il circuito "bassa tensione", spingere un resistore da 560 Ω attraverso lo stesso foro (a5) e saldare con il cavo del connettore filo-filo.
   4. Collegare l'altra estremità del resistore alla massa (Figura supplementare 7G).
   5. Inserire l'altra estremità del connettore femmina filo-filo saldato in un foro a5 che lo collega a terra e saldarlo (Figura supplementare 8A,B).
   6. Per la connessione del microcontrollore, inserire un'estremità di un connettore wire-to-wire maschio nel foro a4 e l'altra in un foro collegato a terra (Figura supplementare 9A–C).
   7. Per il collegamento LED, inserire un'estremità di un connettore femmina filo-filo nel foro a2 e l'altra estremità in un foro collegato a terra (Figura supplementare 9D,E).

2. Costruire alimentatore, interruttore di alimentazione manuale, POT e connessione a microcontroller

1. Costruisci l'alimentatore.
   1. Saldare un ponticello arancione [7,6 mm (0,3 pollici)] da a29 a terra (Figura supplementare 10).
   2. Saldare un connettore femmina filo-filo da a30 all'alimentatore (+) (Figura supplementare 11A–C).
   3. Saldare un connettore wire-to-wire maschio da c29 a c30 (figura supplementare 11D–F).
   4. Tagliare il connettore da un cavo di alimentazione, esporre i fili e rimuoverli (Figura supplementare 12A–C).
   5. Aggiungere il flusso ai fili prima della saldatura utilizzando una penna di flusso (Figura supplementare 3G).
   6. Posizionare un tubo termoretraibile da 3,18 mm (1/8 di pollice) attorno a un connettore filo-filo maschio e un pezzo più spesso da 4,76 mm (3/16 di pollice) sul cavo di alimentazione (Figura supplementare 12D).
   7. Ruotare i fili dall'alimentatore e dal connettore filo-filo maschio insieme e saldarli (Figura supplementare 12E, 13A,B).
   8. Posizionare il tubo termoretraibile di diametro più piccolo di 3,18 mm (1/8 di pollice) sopra le connessioni e restringerle con una pistola termica (Figura supplementare 13C,D).
   9. Posizionare un tubo termoretraibile di diametro maggiore di 4,76 mm (3/16 di pollice) sul tubo termoretraibile più piccolo di 3,18 mm (1/8 di pollice) e riscaldare nuovamente (Figura supplementare 13E,F).
2. Costruire l'interruttore di alimentazione manuale.
   1. Posizionare il tubo termoretraibile di 3,18 mm (1/8 di pollice) sui fili dell'interruttore (figura supplementare 14A).
   2. Ruotare e saldare i fili di un connettore maschio filo-filo (figura supplementare 14B,C).
   3. Posizionare il tubo termoretraibile di 3,18 mm (1/8 di pollice) sulle sezioni saldate e restringere con una pistola termica (figura supplementare 14D,E).
3. Collegare il connettore wire-to-wire maschio al POT.
   1. Avvolgere il filo nero del connettore filo-filo attorno al terminale centrale del POT (figura supplementare 15B).
   2. Ruotare saldamente il filo avvolto attorno al terminale e saldarlo (figura supplementare 15C).
      NOTA: piccole pinze di precisione possono aiutare a fare una torsione stretta.
   3. Ripetere l'operazione con il collegamento del filo rosso al terminale, come nella figura supplementare 15D.
   4. Utilizzare una pinza per rompere la linguetta metallica vicino alla freccia rossa (Figura supplementare 15E,F).
4. Creare la connessione del microcontroller (necessaria solo per i LED controllati dal computer).
   1. Se si crea un driver LED per più di un LED, tagliare i fili neri da tutti i connettori filo-filo femmina tranne uno (Figura supplementare 16A).
   2. Crimpare le estremità dei connettori filo-filo, come mostrato (Figura supplementare 16B–D).
   3. Spingere le estremità crimpate attraverso il connettore rettangolare (figura supplementare 16E).

3. Costruisci i LED

1. Strisciare le estremità del filo (~ 5 mm) e applicare il flusso usando una penna di flusso come nella figura supplementare 3G.
   NOTA: Per saldare in modo efficiente i fili sulla base LED, è necessario aggiungere flusso ai contatti sulla base LED e sui fili.
2. Stregare il filo riscaldando il filo dal basso e aggiungendo saldatura dall'alto (figura supplementare 17B).
3. Utilizzare la penna flux per posizionare il flusso sul contatto superficiale della base LED (Figura supplementare 17C).
4. Posizionare una generosa quantità di saldatura su una punta di saldatura grande (~4-5 mm) (Figura supplementare 17D), utilizzarla per riscaldare la base del LED al contatto (Figura supplementare 17E). Dopo alcuni secondi, trascinare la saldatura sul contatto (Figura supplementare 17F). Ripetere i passaggi 3.3-3.4 sull'altro contatto (Figura supplementare 17G).
   ATTENZIONE: La base del LED può diventare molto calda durante la saldatura. Posizionare la base del LED su una superficie che non si sciolga o brucia.
5. Agganciare il filo nero al contatto "C+" (catodo) usando i fermagli per capelli (figura supplementare 18A).
6. Posizionare una generosa quantità di saldatura sulla punta di saldatura grande (Figura supplementare 18B) e premerla sul filo fino a quando la saldatura sulla base LED non si scioglie (Figura supplementare 18C). Tenere premuto il filo (figura supplementare 18D) e rimuovere il saldatore tenendo il filo in posizione (figura supplementare 18E).
7. Posizionare una piccola quantità di pasta saldante sui pad per le connessioni LED (Figura supplementare 19A,B) e posizionare il LED sopra i pad usando una pinza (Figura supplementare 19C).
   NOTA: se il posizionamento è un po 'fuori, va bene; Andrà in posizione una volta che la pasta saldante si scioglie.
8. Tenere il filo rosso sul "A+" (anodo) e agganciarlo con un fermaglio per capelli (Figura supplementare 20A-C).
9. Posizionare una generosa quantità di saldatura sulla punta di saldatura grande (Figura supplementare 20D) e premerla sul filo fino a quando la saldatura sulla base del LED e la pasta saldante sotto il LED si fondono (Figura supplementare 20E).
   NOTA: Dopo che la pasta saldante si scioglie, il colore diventa argento (Figura supplementare 20H,I).
10. Scegli la lunghezza del filo necessaria per la configurazione desiderata. Rimuovere i fili LED e un connettore maschio filo-filo (Figura supplementare 21A), quindi aggiungere il flusso come nella Figura supplementare 3G.
11. Posizionare il tubo termoretraibile sopra i fili. Utilizzare un tubo termoretraibile da 3,18 mm (1/8 di pollice) sui connettori filo-filo e un tubo termoretraibile da 4,76 mm (3/16 di pollice) sul filo (Figura supplementare 21B).
12. Agganciare il connettore filo-filo con una "mano d'aiuto" e ruotare l'estremità del connettore con il filo (Figura supplementare 21C) e saldarli. Ripetere l'operazione con l'altro filo (figura supplementare 21D,E).
13. Posizionare i tubi termoretraibili da 3,18 mm (1/8 di pollice) sopra la saldatura e il restringimento (Figura supplementare 21F-G).
14. Posizionare il tubo termoretraibile da 4,76 mm (3/16 di pollice) sopra il tubo termoretraibile da 3,18 mm (1/8 di pollice) e il tubo termorestringente (Figura supplementare 21H-I).
15. Agganciare i fili LED alle "mani d'aiuto" con del nastro adesivo sotto di esso (Figura supplementare 22A).
16. Mescolare resina epossidica secondo le istruzioni del produttore e distribuire sulla parte superiore del LED saldato (Figura supplementare 22B). Lasciare durante la notte per curare.
17. Se si monta utilizzando una chiusura touch, tagliare un piccolo pezzo della chiusura tattile (Figura supplementare 23A) e premerlo contro il retro del LED per 30 secondi.
18. Utilizzare un utensile rotante ad alta velocità per fare una tacca sul coperchio di una scatola nera (Figura supplementare 23C-E).
19. Costruisci un montaggio per un singolo LED attraverso una pellicola per la privacy.
    1. Utilizzando la punta a vanga, praticare un foro di 1,75 cm (11/16 pollici) attraverso la parte superiore di una scatola nera dove verrà posizionato il LED (Figura supplementare 24A).
    2. Utilizzando un utensile rotante ad alta velocità, fare una tacca su un lato del foro per fare spazio al filo LED, come mostrato nella figura supplementare 24A.
    3. Tagliare un pezzo di pellicola per la privacy (25-30 mm) e del nastro adesivo all'interno della scatola nera che copre il foro attraverso il quale il LED si illuminerà (Figura supplementare 24A).
    4. Posizionare il LED all'esterno della scatola nera sulla parte superiore del foro con pellicola per la privacy e nastro adesivo in posizione con nastro isolante (Figura supplementare 24B-E).

4. Posizionare una scatola nera per adattarsi al sistema di illuminazione

1. Per un sistema a quattro LED, praticare quattro fori da 0,83 cm (21/64 pollici) sul coperchio a 3,81 cm (1,5 pollici) di distanza nel punto in cui verranno fissati i potenziometri (Figura supplementare 25).
2. Utilizzando uno strumento rotante ad alta velocità, tagliare un foro rettangolare di 1,19 cm x 1,90 cm (0,47 pollici x 0,75 pollici) nell'angolo in alto a sinistra (Figura supplementare 25).
3. Utilizzando la punta a vanga, praticare un foro di 1,75 cm (11/16 pollici) sulla scatola nera (Figura supplementare 26).
4. Limare i fori e inserire il gommino nel foro praticato (figura supplementare 26).
5. Per i LED controllati dal computer, carta vetrata l'area in cui il microcontrollore sarà incollato in una scatola nera, nonché il lato inferiore del supporto del microcontrollore.
6. Fissare il microcontrollore sul supporto prima di fissare il supporto nella scatola nera e quindi posizionarli con resina epossidica (Figura supplementare 27A).
7. Utilizzare carta vetrata per carteggiare il fondo di due clip e l'area in una scatola nera in cui verrà posizionato il circuito e fissare le clip all'interno della scatola nera con la resina epossidica (Figura supplementare 27A).
8. Fissare la scheda PCB nelle clip (Figura supplementare 27B).
9. Spingere l'interruttore di alimentazione attraverso il foro quadrato nel coperchio realizzato nella figura supplementare 25 e inserirlo in posizione (figura supplementare 28A).
10. Spingere i POT attraverso i fori sul coperchio, avvitare in posizione (Figura supplementare 28A) e posizionare la manopola sul POT (Figura supplementare 28B).

5. Collegare tutti i cablaggi e i dispositivi

1. Etichettare i connettori filo-filo (ad esempio, LED, POT, COM) (figura supplementare 29A).
2. Collegare i connettori crimpati realizzati al punto 2.4 (figura supplementare 16) al connettore maschio filo-filo tra i due connettori femmina (POT e LED) (figure supplementari 7A e S37).
3. Collegare le estremità crimpate al microcontrollore (figura supplementare 30).
4. Estrarre il cavo USB attraverso il gommino e collegarlo al microcontrollore.
5. Tirare i fili per i LED attraverso l'occhiello e collegarli al connettore femmina filo-filo a sinistra della connessione del microcontrollore (figure supplementari 9D e 38).
6. Tirare il filo per l'alimentatore attraverso il gommino e collegarlo al connettore wire-to-wire maschio sul lato destro della scheda PCB (Figura supplementare 11D).
7. Collegare il connettore wire-to-wire maschio dall'interruttore di alimentazione al connettore wire-to-wire femmina a destra della scheda PCB (Figura supplementare 11A).
8. Collegare i connettori wire-to-wire maschio dai POT sul coperchio ai connettori femmina wire-to-wire sulla scheda PCB (figure supplementari 8 e 36).
   NOTA: non accendere il circuito senza i potenziometri collegati.

6. Installare il software di controllo LED

NOTA: vedere le istruzioni dettagliate per l'installazione del software nel file supplementare su Github. https://github.com/BreakLiquid/LED-Control-User-Interfaces

1. Scarica e installa il software per la programmazione del microcontrollore
2. Scaricare e installare il gestore pacchetti.
3. Programmare il microcontrollore.
4. Scaricare e installare il motore di runtime.
5. Scarica l'interfaccia utente.

7. Stimola le cellule con la luce

1. Transfettare le cellule HEK293.
   1. Piastra HEK293 celle a 100k celle per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti.
   2. Utilizzare la tabella di esempio per calcolare i volumi di terreno senza siero, polietilenimina (PEI) e DNA (figura supplementare 39) e trasfettare utilizzando il protocollo del produttore.
2. Stimolare le cellule con la luce.
   NOTA: Le cellule devono essere tenute al buio dopo la trasfezione o maneggiate utilizzando una fonte di luce che non eccita il sistema optogenetico.
   1. Decidi quale tipo di stimolazione verrà utilizzata sulle cellule (luce continua, intensità pulsante, ecc.).
   2. Con i POT spenti (in senso antiorario), accendere l'alimentatore a LED.
   3. Posizionare un esposimetro all'interno della scatola nera dove verranno posizionate le celle e posizionare il coperchio con il LED sopra il misuratore. Regolare l'intensità della luce secondo necessità.
   4. Se si utilizza il computer per controllare i LED, aprire il software dell'interfaccia utente.
   5. Programmare l'interfaccia utente (Figura 5A,B).
      1. Nel pannello in alto a sinistra, selezionare la porta COM per il microcontrollore e fare clic su Connetti.
      2. Utilizzare i pannelli a destra per programmare ogni LED. Per la luce continua, selezionare qualsiasi momento tranne zero in "Time On" e impostare il "Time Off" su zero.
      3. Nel pannello in basso a destra, programma il controllo di temporizzazione principale.
         1. Per ritardare l'illuminazione, selezionate un ritardo iniziale (HH:MM).
         2. Per spegnere tutti i LED dopo un periodo di tempo designato, selezionare un tempo di esecuzione (HH:MM).
         3. Avviare il programma di illuminazione facendo clic sul pulsante Esegui (Figura 5A).

8. Misurare l'espressione genica utilizzando un doppio test della luciferasi

1. Preparare il reagente della luciferasi miscelando 10 mL di tampone luciferasi con il reagente della luciferasi e l'aliquota in provette da 1 mL da conservare a -80 °C per un massimo di 1 anno.
2. Preparare il tampone di lisi 5x in 1x per 100 μL per N + 2 pozzetti. ad esempio, per 30 campioni, 30 x 20 μL di tampone di lisi 5X e 30 x 80 μL di MQ H₂O.
3. Preparare la soluzione di substrato di Renilla: 20 μL di substrato di Renilla per 1 mL di tampone Renilla (questa quantità è adatta per 10 test).
4. Rimuovere le cellule dall'incubatore, aspirare il fluido, aggiungere 100 μL di tampone di lisi 1x per pozzetto e posizionarlo su uno shaker a 100 RPM per 15 minuti.
5. Introdurre a -20 °C per almeno 1 h.
6. Aggiungere 100 μL di reagente della luciferasi per campione in un pozzetto di una piastra bianca da 96 pozzetti.
7. Impostare il lettore di piastre per la luminescenza. Utilizzando il modulo luminometro del lettore di piastre, impostare l'integrazione per 1 s.
8. Aggiungere lisati scongelati in pozzetti sotto il reagente della luciferasi. Utilizzando una pipetta multicanale, mescolare 20 μL di campione nel reagente della luciferasi e misurare immediatamente la luminescenza.
9. Dopo il plateau delle letture, aggiungere 100 μL di soluzione di substrato Renilla e scansionare nuovamente.
10. Dividere il segnale Luciferasi per il segnale Renilla per tenere conto dell'efficienza della trasfezione.
11. Confrontare i segnali di luciferasi normalizzati per l'efficienza della trasfezione (ad esempio, confrontare il segnale da campioni illuminati a luce rossa e campioni illuminati a luce rossa lontana).

Una volta assemblato il circuito di alimentazione, l'alimentatore, l'interruttore di alimentazione, i POT e un LED (fino alla figura supplementare 21), il circuito può essere testato. Con tutti i POT in posizione, il POT controllerà l'intensità del LED. Una volta completato l'assemblaggio fino alla figura supplementare 29, il sistema può essere utilizzato manualmente per l'optogenetica o altre applicazioni. L'intera alimentazione del sistema può essere controllata manualmente con l'interruttore di alimentazione. L'intensità di ciascun LED può essere controllata in modo indipendente utilizzando il POT collegato a ciascun circuito.

Dopo aver installato il software e programmato il microcontrollore, l'interfaccia utente può comunicare con il microcontrollore. Con l'interfaccia utente, i LED possono essere controllati temporalmente in diversi modi: (1) ogni LED può essere programmato per rimanere acceso per un tempo specificato, (2) ogni LED può essere programmato per pulsare, (3) un ritardo di avvio globale (ad esempio, quando si trasfetta e illumina la luce 24 ore dopo) può essere programmato (Figura 6B), (4) il tempo totale per l'esecuzione del programma dopo il ritardo. Esistono due interfacce utente, una con pulsanti più grandi che possono controllare due LED alla volta e un'altra che può controllare quattro LED (Figura 5A,B). L'interfaccia utente a due LED è ottimizzata per i tablet ed è sufficiente per controllare LED rossi e rossi per molti esperimenti.

Per esperimenti più grandi, la seconda interfaccia utente può essere utilizzata per controllare fino a quattro LED. Quando si induce l'espressione genica, il risultato atteso dipende da diversi parametri. Questi includono il tempo di induzione, i livelli di induzione (ad esempio, la quantità di luce o farmaco) e il numero di copie del costrutto inducibile nella cellula. Per mostrare questo, abbiamo trasfettato l'interruttore del gene PhyB insieme a diverse quantità di DNA reporter (pPK-202) (0,5%, 1%, 2%, 4% e 8% del DNA trasfettato) (Figura 6A) e illuminato come mostrato in Figura 6B. Nei campioni contenenti PhyB, ma nessun plasmide per produrre ficocianobilina (PCB-cromoforo) (cioè non responsivo alla luce), l'espressione genica della luciferasi/perdita aumenta con la quantità di DNA reporter (Figura 6C) (Far-red P < 0.0001, Regressione lineare seguita da un test di Wald), (Red P < 0.0001, Regressione lineare seguita da un test di Wald). Inoltre, quando l'intero interruttore del gene PhyB, incluso il plasmide che produce il cromoforo PCB (cellule sensibili alla luce), sono illuminati per la luce rossa lontana, l'espressione della Luciferasi aumenta anche con l'aumentare delle quantità di costrutto reporter nel mix di trasfezione (Figura 6C, D) (Far-red light P < 0.0001, Regressione lineare seguita da un test di Wald). Allo stesso modo, quando le cellule sensibili alla luce sono illuminate con luce rossa, l'espressione della luciferasi aumenta anche con l'aumento della quantità di reporter (P < 0,0001, regressione lineare seguita da un test di Wald). Confrontando i livelli di induzione delle cellule trattate con luce rossa con le cellule trattate con luce rossa, abbiamo riscontrato una piccola diminuzione dell'attivazione del fold con l'aumentare della quantità di reporter (Figura 6E) (P = 0,0141, regressione lineare seguita da un test di Wald).

Figura 1: Un circuito di base per un singolo LED. (A) Un diagramma di flusso che mostra una panoramica delle fasi necessarie per costruire il sistema di illuminazione a LED. (B) Il sistema di controllo dell'illuminazione a LED. (a sinistra) Scatola di controllo per la regolazione dell'intensità e della temporizzazione dei LED. (al centro) Un tablet PC con interfaccia utente per il controllo dei LED. (destra) Una scatola nera per il montaggio di LED e il posizionamento di celle per la stimolazione ottica. (C) Tabella per determinare se il LED richiede un circuito ad alta o bassa tensione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Istruzioni per la saldatura dei componenti in posizione. (A) Un esempio delle istruzioni passo-passo del cartone animato per la costruzione del circuito. (B,C) Istruzioni di esempio con immagini del dispositivo da assemblare. (D) Esempio di istruzioni per l'assemblaggio simultaneo di più circuiti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Viste di un sistema di controllo LED assemblato. (A) Una vista esterna dall'alto del sistema assemblato. (B) Una vista dall'interno di un sistema di illuminazione a quattro LED assemblato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Istruzioni per la rifusione della saldatura del LED sul dissipatore di calore. (A) La base del LED e un primo piano di un LED rosso intenso. (B) Posizionamento della pasta saldante sulla base del LED. (C) Immagine del LED saldato. Le frecce rosse indicano i pad di saldatura. Rispetto al grigio prima della saldatura (A), dopo la saldatura, la saldatura appare metallica / lucida. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Software per il controllo degli esperimenti optogenetici (A) Un'interfaccia utente a due LED con pulsanti di grandi dimensioni per un facile utilizzo con un tablet economico. (b) Un'interfaccia utente a quattro LED. Entrambe le interfacce consentono un controllo LED indipendente. Per il flashing, i LED possono essere programmati per accendersi e spegnersi per specifiche larghezze di impulso e durate specificate. Il pulsare può anche avere un ritardo di avvio e un tempo di esecuzione totale predeterminato. (C) La tavoletta di controllo LED montata su un incubatore di colture cellulari. (D) Illustrazione del sistema genico PhyB quando illuminato con luce rossa lontana. La luce rossa lontana mantiene il gene nello stato "spento" o "scuro". (E) Illustrazione del sistema genico PhyB quando illuminato con luce rossa. La luce rossa induce l'espressione genica promuovendo l'interazione tra PhyB e PIF3. Questa interazione localizza il dominio di attivazione genica (AD) fuso a PIF3 al promotore UAS, attivando il gene reporter. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Risultati attesi utilizzando il sistema LED per controllare PhyB. (A) Un plasmide che codifica per partner a due ibridi PhyB+PIF3 (pPK-351), un plasmide che codifica per enzimi di sintesi della ficocianobilina (PCB-cromoforo) (pPK-352) e un plasmide reporter di Luciferasi (pPK-202). (B) Cronologia degli esperimenti di induzione della luce per C-E. (C) Livelli di trascrizione basale (perdita AKA) con quantità crescenti di DNA reporter. I campioni "leak" non sono trasfettati con pPK-352 (cioè non rispondono alla luce), ma sono illuminati con luce rossa o rossa lontana. I campioni di Light Switch (LS) includono tutti i plasmidi con interruttore genico della luce e sono illuminati con luce rossa o rossa. (D) Livelli di induzione della luce in risposta alla luce rossa e rossa lontana. (LS-Far-red light è lo stesso dato in C e D.) (E) Induzione della luciferasi in cellule illuminate con luce rossa/luce rossa lontana. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

 Clicca qui per scaricare le figure supplementari 1-39.

Figura supplementare 1: Circuito driver elettronico per più LED. (A) Lo schema elettrico di un singolo sistema LED. (B) Lo schema elettrico di un sistema a quattro LED.

Figura supplementare 2: Posizionamento delle interconnessioni del circuito. (A) Aggancia la scheda PCB alle tue mani che aiutano. (B) Posizione dei ponticelli del circuito principale nei fori passanti nell'immagine. (C) Schema dei connettori a filo che mappano le coordinate. Per i quattro sistemi LED, disegnare linee che dividono ciascun circuito come mostrato (linee verticali nere). La figura supplementare 31-38 descrive l'assemblaggio di quattro circuiti contemporaneamente.

Figura supplementare 3: Saldatura dei fili sul PCB. (A) Piegare i ponticelli in modo che entrino in contatto diretto con il PCB e rimangano in posizione durante la saldatura. (B) Un'altra vista dei fili piegati. (C) Fili dopo la saldatura. (D) Fili tagliati sul PCB. (E) Isolamento rimpicciolito dopo riscaldamento con saldatura. (F) Spostamento dell'isolamento in posizione per coprire il foro passante del terreno (freccia blu) (G) Aggiunta di flusso a un'estremità o a un terminale del filo.

Figura supplementare 4: Saldatura del regolatore di tensione in posizione. (A) Mappa delle coordinate del regolatore di tensione. (B) Posizionamento del regolatore di tensione. (C) Conduttori regolatori di tensione piegati. (D) Morsetti regolatori di tensione dopo la saldatura.

Figura supplementare 5: Saldatura del resistore R1 in posizione. (A) Mappa delle coordinate del resistore R1 (820Ω). (B) Tirare il resistore attraverso il cavo usando una pinza (C) Il resistore tirato vicino al PCB. (D) Il resistore saldato vicino al PCB.

Figura 6 supplementare: Saldatura del transistor in posizione. (A) Mappa delle coordinate e dell'orientamento del transistor. (B) Notare l'orientamento del transistor; l'etichetta in questo modello è rivolta verso il regolatore di tensione (LM317T). Ricontrollare le specifiche del transistor per assicurarsi che "Emettitore", "Base" e "Collettore" siano nei fori corretti. (C) Il transistor con i terminali piegati prima della saldatura.

Figura 7 supplementare: Saldatura del connettore filo-filo per il potenziometro in posizione (più un resistore da 560Ω per il circuito a bassa tensione). (A) Mappa delle coordinate del connettore filo-filo (più l'R3-560Ω se si costruisce il circuito a bassa tensione, il connettore filo-filo è posto nel foro prima del resistore). (B) Un connettore femmina filo-filo. (C) Per facilitare il montaggio del resistore e del connettore filo-filo nel foro passante, vengono piegati 3-5 fili del filo intrecciato. (D) I trefoli siano tagliati con tronchesi il più vicino possibile all'isolamento. (E) Inserito il filo rosso di un connettore femmina filo-filo attraverso il foro passante a5 (per il circuito a bassa tensione inserire R3 attraverso lo stesso foro passante). (F) Vista sul lato inferiore del resistore e del connettore filo-filo prima della saldatura. (G) Immagine del resistore R3 saldato collegato alla massa (F = Femmina).

Figura supplementare 8: Saldatura a terra del connettore filo-filo per il potenziometro. (A) Mappa delle coordinate della connessione di terra per il connettore wire-to-wire del potenziometro. (B) Vista dall'alto del connettore wire-to-wire del potenziometro in parallelo con R3 (F = femmina).

Figura supplementare 9: Saldatura del microcontrollore e dei connettori wire-to-wire LED. (A) Mappa delle coordinate del connettore wire-to-wire per collegare il 2N222A e la massa al microcontrollore. (B) Connettore filo-filo maschio saldato. (C) Vista dall'alto di (B). (D) Mappa delle coordinate del connettore femmina filo-filo per collegare l'ingresso del circuito e la massa al LED. (E) Connettore wire-to-wire femmina saldato (F = femmina, M = maschio).

Figura supplementare 10: Saldatura del ponticello per il circuito di alimentazione. (A) Mappa delle coordinate del ponticello arancione per collegare l'alimentazione elettrica a terra. (B) Il ponticello arancione saldato sul posto. (C) La vista inferiore del ponticello saldata in posizione.

Figura supplementare 11: Saldatura dell'interruttore di alimentazione e dei connettori wire-to-wire della fonte di alimentazione. (A) Mappa delle coordinate del connettore femmina filo-filo per il collegamento dell'interruttore di alimentazione. (B) Il connettore femmina filo-filo saldato in posizione. (C) Un'altra visione di (B). (D) Mappa delle coordinate del connettore maschio filo-filo per il collegamento della fonte di alimentazione. (E) Connettore filo-filo maschio saldato. (F) Un'altra visione di (E) (F = Femmina, M = Maschio).

Figura supplementare 12: Collegamento dell'alimentatore a un connettore wire-to-wire maschio. (A) L'alimentazione elettrica non modificata. (B) Interruzione dei cavi di alimentazione. (C) I fili di alimentazione sono stati rimossi e con l'isolamento in eccesso tagliati. (D) Posizionamento del tubo termoretraibile attorno ai cavi di alimentazione. Tubo che separa le due connessioni (frecce rosse) e tubo per contenere i fili separati (freccia gialla). (E) Fili intrecciati che collegano l'alimentatore al connettore femmina filo-filo.

Figura supplementare 13: Saldatura e isolamento del collegamento di alimentazione a un connettore filo-filo maschio. (A) Il collegamento saldato tra la massa dell'alimentatore e un connettore femmina filo-filo. (B) Il collegamento saldato tra il terminale positivo dell'alimentatore e un connettore femmina filo-filo. (C) Tubo termoretraibile tirato sopra i singoli collegamenti saldati (freccia rossa). (D) Entrambi i collegamenti di alimentazione sono saldati e con tubo termoretraibile trattato termicamente. (E) Posizionamento del tubo termoretraibile su singoli collegamenti (freccia gialla). (F) Alimentazione completata.

Figura supplementare 14: Saldatura dell'interruttore di alimentazione a un connettore wire-to-wire maschio. (A) Interruttore di alimentazione con fili stracciati e tubo termoretraibile posto sopra i fili (frecce rosse). (B) Fili che collegano l'interruttore e il connettore maschio filo-filo attorcigliati insieme prima della saldatura. (C) Posizionare il tubo termoretraibile sopra i collegamenti saldati. (D) Collegamenti coperti con il tubo termoretraibile trattato termicamente. (E) Un interruttore di alimentazione assemblato con un connettore wire-to-wire maschio.

Figura supplementare 15: Cablaggio di un potenziometro a un connettore maschio filo-filo. (A) Le parti potenziometriche. (B) Un connettore maschio filo-filo attorcigliato e piegato per agganciarsi attorno al terminale centrale del potenziometro. (C) Un connettore maschio filo-filo attorcigliato attorno al terminale centrale del potenziometro. (D) Connessioni wire-to-wire saldate. (E) Freccia rossa che punta alla linguetta metallica prima della rimozione. (F) Il potenziometro dopo la rimozione della linguetta metallica.

Figura supplementare 16: Cablaggio della connessione del microcontrollore. (A) Fili per connettori femmina da filo a filo smontati e tagliati in preparazione per la crimpatura. (B) Posizionamento della crimpare sul connettore filo-filo. (C) Crimping del connettore filo-filo. (D) Connettore filo-filo crimpato. (E) Connessione a microcontrollore completamente assemblata.

Figura supplementare 17: Saldatura di fili e LED sulla base del LED Parte 1. (A) Materiali necessari per saldare il LED alla base del LED. (B) Stagnolare la punta del filo strappato. (C) Applicazione del flusso sul contatto della base LED. (D) Aggiunta di saldatura alla grande punta di saldatura per stagnare la base del LED. (E) Posizionamento della saldatura sul contatto per riscaldare la base del LED. (F) La base del LED dopo aver trascinato la punta di saldatura attraverso il contatto. (G) La stessa procedura per l'altro contatto.

Figura supplementare 18: Saldatura di fili e LED sulla base del LED Parte 2. (A) Un filo stagnato agganciato al contatto usando un fermaglio per capelli. Si noti che il filo nero è saldato al catodo "C-". (B) Aggiunta di una generosa quantità di saldatura alla punta di saldatura. (C) La punta di saldatura che preme sul filo, fondendo la saldatura sulla base del LED e sul filo. (D) Tenere premuto il filo in modo che rimanga in posizione quando il saldatore viene rimosso. (E) Tenere il filo in posizione fino a quando la saldatura non si indurisce.

Figura supplementare 19: Saldatura di fili e LED sulla base del LED Parte 3. (A) Utilizzare una punta affilata per posizionare la pasta saldante sulla base del LED per il montaggio del LED. (B) La base LED con la pasta saldante in posizione. (C) Posizionamento del LED sulla base del LED in modo tale che i contatti del LED e della base del LED corrispondano.

Figura supplementare 20: Saldatura di fili e LED sulla base del LED Parte 4. (A) Il filo nero ancora agganciato al contatto dal fermaglio per capelli. (B,C) Usando un secondo fermaglio per capelli, il filo rosso viene tenuto in posizione. Si noti che il filo rosso è saldato all'anodo "A +". (D) Aggiunta di una generosa quantità di saldatura alla punta di saldatura. (E) La punta di saldatura che preme verso il basso sul filo, fondendo la saldatura sulla base del LED e sul filo, nonché la pasta saldante sotto il LED. (F) La base LED calda si raffredda dopo la saldatura. (G) La base del LED con i fili e il LED saldati. (H,I) Le frecce rosse indicano i pad di saldatura. Dopo la saldatura, la saldatura appare metallica/lucida (rispetto al grigio prima della saldatura (Figura supplementare 16D)).

Figura supplementare 21: Collegamento del filo LED a un connettore filo-filo maschio. (A) Fili strappati e connettore maschio filo-filo accanto al tubo termoretraibile tagliato a metà (1/8 di pollice e 3/16 di pollice). (B) Posizionamento del tubo termoretraibile sui fili prima della saldatura. (C) Fili intrecciati tra loro prima della saldatura. (D) La connessione saldata dal filo al connettore filo-filo. (E) Entrambi i fili rosso e nero saldati insieme. (F) Posizionamento del tubo termoretraibile da 1/8 di pollice sopra la connessione saldata. (G) Il tubo termoretraibile dopo il restringimento con la pistola termica. (H) Posizionamento del tubo termoretraibile da 3/16 di pollice sopra il tubo termoretraibile più piccolo. (I) Il collegamento saldato e sigillato con il tubo termoretraibile.

Figura supplementare 22: Fissaggio dei fili e dei LED alla base del LED mediante resina epossidica. (A) Utilizzo di un applicatore di legno per posizionare la resina epossidica nella base del LED. Un nastro è posto sotto per catturare eventuali resine epossidiche gocciolanti. (B) La resina epossidica è distribuita uniformemente su tutta la superficie. (C) Il LED viene lasciato polimerizzare durante la notte.

Figura supplementare 23: Montaggio dei LED all'interno del coperchio di una scatola. (A) Un LED con un elemento di fissaggio tattile fissato per un facile montaggio. (B) LED di colore diverso montati all'interno di una scatola nera utilizzando una chiusura a sfioramento. (C) Una tacca sul coperchio della scatola nera realizzata da uno strumento rotante ad alta velocità per fare spazio al filo LED. (D) Una scatola nera per stimolare le celle con elementi di fissaggio tattili per il montaggio del LED. (E) Posizionamento di un piatto multipozzetto all'interno della versione touch fastener della scatola LED.

Figura supplementare 24: Montaggio dei LED all'esterno del coperchio di una scatola. (A) Praticare un foro nel coperchio della scatola nera con una tacca dell'utensile rotante ad alta velocità per fare spazio al filo (freccia rossa). (B) LED inserito nel foro con il filo nella tacca, tenuto in posizione con nastro isolante. (C) Altri due pezzi di nastro vengono utilizzati per fissare il LED. Il retro del dissipatore di calore è esposto per massimizzare lo scambio di calore. (D) Pellicola per la privacy registrata sul foro in cui verrà posizionato il LED. La freccia rossa indica il filmato sulla privacy. (E) Una scatola nera per stimolare le celle con un LED montato all'esterno della scatola e con pellicola privacy per diffondere l'illuminazione. (F) Posizionamento di una parabola multipozzetto all'interno della versione LED + pellicola privacy esterna della scatola LED.

Figura supplementare 25: Fori di perforazione sul coperchio della scatola per l'interruttore di alimentazione e i potenziometri. (A) Un disegno CAD con le dimensioni annotate del coperchio della scatola. (B) Il coperchio della scatola con i fori del potenziometro e dell'interruttore di alimentazione.

Figura supplementare 26: Preparazione del foro di uscita del filo. (A) Un disegno CAD con quote annotate. (B) Immagine del foro praticato con la punta del trapano. (C) Levigatura del foro di uscita con utensile rotante ad alta velocità o utensile di limatura. (D) Posizionamento del passante nel foro di uscita.

Figura supplementare 27: Posizionamento del microcontrollore e del PCB nella scatola. (A) Il supporto del microcontrollore (arancione) e i supporti PCB all'interno della confezione. (B) Il microcontrollore e il PCB fissati nella scatola.

Figura supplementare 28: Posizionamento dei potenziometri e dell'interruttore di alimentazione. (A) Vista frontale di un coperchio della scatola con un interruttore di alimentazione e quattro POT. (B) Vista frontale del coperchio della scatola con l'aggiunta di manopole del potenziometro. (C) Una vista posteriore del coperchio della scatola con i componenti collegati.

Figura supplementare 29: Il sistema di controllo a LED assemblato. (A) Una scatola di controllo aperta con i fili etichettati con una stampante di etichette e legati con cerniera per l'organizzazione. (B) La scatola una volta completamente assemblata con ogni POT etichettato insieme al PIN.

Figura supplementare 30: Posizionamento del connettore filo-filo crimpato. (A) Immagine dei connettori wire-to-wire crimpati per un sistema a quattro microcontrollori LED. (B) Posizionamento del connettore crimpato nelle porte del microcontrollore.

Figura supplementare 31: Posizionamento dei fili dei ponticelli. (A) Un circuito stampato con le coordinate dei fili rossi del ponticello etichettati. (B) Un circuito stampato con le coordinate dei fili dei ponticelli gialli etichettati.

Figura supplementare 32: Posizionamento dei fili dei ponticelli. Un circuito stampato che visualizza le coordinate dei fili gialli del ponticello.

Figura supplementare 33: Aggiunta dei regolatori di tensione. I regolatori di tensione LM317T vengono aggiunti al circuito con le loro coordinate etichettate negli schemi.

Figura supplementare 34: Inserimento dei resistori 820Ω. I resistori R1 vengono aggiunti al circuito con le loro coordinate etichettate negli schemi.

Figura supplementare 35: Inserimento dei transistor. I transistor 2N2222A vengono aggiunti al circuito con le loro coordinate etichettate negli schemi.

Figura supplementare 36: Inserimento dei connettori femmina wire-to-wire e dei resistori (opzionale) per la connessione POT. I fili e le resistenze vengono aggiunti al circuito con le loro coordinate etichettate negli schemi. (A) Inserire il filo rosso, seguito dal resistore R2 (560Ω) (solo per il circuito a bassa tensione). (B) Inserire l'altra estremità del resistore nel foro di massa indicato. (C) Inserire i fili neri nei fori contrassegnati per collegarli a terra. Nota: R2 (560Ω) è parallelo al potenziometro.

Figura supplementare 37: Inserimento di connettori wire-to-wire maschio per il collegamento del microcontrollore e l'alimentazione. I fili vengono aggiunti al circuito con le loro coordinate etichettate negli schemi. (A) Inserire i fili rossi nei fori indicati. (B) Inserire i fili neri nei fori contrassegnati.

Figura supplementare 38: Aggiunta di connettori LED wire-to-wire. (A) Connettori femmina wire-to-wire con le coordinate rosse del piombo evidenziate. (B) Connettore femmina filo-filo con le coordinate del piombo nero evidenziate.

Figura supplementare 39: Impostazione di un esperimento di commutazione del gene PhyB-PIF3. (A) Una tabella di esempio di master mix contenente Renilla per il controllo interno. (B) Una tabella di esempio per impostare la miscela di DNA per un saggio reporter a doppia luciferasi di un esperimento optogenetico PhyB-PIF3. (C) Una tabella di esempio per impostare il reagente di trasfezione PEI e aliquotare la miscela sulle cellule (goccia a goccia). (D) Posizionamento dell'esposimetro per l'impostazione della luminosità del LED.

Il sistema LED qui descritto è stato utilizzato nel nostro laboratorio per ottimizzare, caratterizzare e lavorare con diversi strumenti optogenetici . In Kyriakakis et ^al.4, abbiamo testato molte combinazioni di interruttori del gene PhyB-PIF in parallelo. Abbiamo quindi usato questo sistema per testare impulsi di luce a frequenze diverse per misurare la cinetica dell'interruttore genico e l'effettiva intensità della luce. Questo sistema è stato utilizzato anche per ottimizzare e caratterizzare due sistemi optogenetici che utilizzano la luce blu per la stimolazione ^5,6. Poiché solo un LED doveva essere abbastanza luminoso da attivare la maggior parte degli strumenti optogenetici non è sempre necessario acquistare un sistema con un gran numero di LED su ciascun pozzetto. Questa configurazione è economica, affidabile, facile da riconfigurare e non richiede alcuna esperienza elettrica precedente per seguire il protocollo di assemblaggio.

Nelle figure supplementari 31–38, descriviamo come incorporare fino a quattro LED nel sistema. Mentre questo può limitare alcuni esperimenti che richiedono un gran numero di condizioni parallele, più LED possono essere aggiunti sostituendo l'alimentatore a 9 Volt utilizzato in questo protocollo con uno di potenza superiore. Allo stesso modo, diversi LED a bassa potenza possono essere collegati in parallelo a ciascun circuito. In quest'ultima disposizione, alcuni LED non saranno controllati individualmente, ma questo può essere utile quando sono necessari molti LED per coprire un'area più ampia. Una volta acquisita familiarità con l'elettronica di questo sistema, ci sono molti modi per personalizzarlo. Ulteriori strategie per la personalizzazione del sistema includono il posizionamento del LED più lontano o più vicino al campione e l'illuminazione attraverso filtri / diffusori per condizioni di illuminazione omogenee o per prevenire il riscaldamento come in (Figura supplementare 23) e Allen et ^al.5. Un'altra caratteristica notevole del nostro design a LED è che è incapsulato in resina epossidica e ha una chiusura touch sul retro; ciò consente al LED di essere posizionato in modo sicuro e semplice praticamente ovunque: in incubatori, vasche per pesci, gabbie per animali, pareti, ecc.

Molti esperimenti che utilizzano l'optogenetica per controllare i geni, le vie di segnalazione e altre attività cellulari spesso richiedono pulsazioni, si estendono su grandi scale temporali o devono essere eseguiti in un incubatore, quindi richiedono automazione o manipolazione remota senza microscopio. Questo sistema LED è stato testato ininterrottamente per diversi mesi all'interno di un incubatore a CO₂ umidificato senza problemi. Inoltre, con sistemi reversibili come i sistemi optogenetici PhyB, lo sperimentatore potrebbe aver bisogno di programmare programmi di illuminazione pulsante specifici. Nel nostro precedente lavoro⁴, abbiamo utilizzato programmi di pulsazione per testare la dinamica di reversibilità di uno switch PhyB-PIF3 in cellule di mammifero attraverso l'interfaccia utente. Utilizzando la metodologia descritta in questo manoscritto, la programmazione di un protocollo pulsato è facile, fornendo la flessibilità e l'autonomia necessarie per molti tipi di esperimenti optogenetici in modo user-friendly.

I passaggi più critici nella costruzione di questo sistema includono la messa insieme del circuito elettrico sulla scheda PCB e il collegamento dei componenti, che sono dettagliati nella sezione 1 e nella sezione 2. È essenziale seguire attentamente ogni passaggio in queste sezioni e ricontrollare i numeri stenopeici riga per riga prima di saldare ogni componente. La sezione 2 spiega come impostare i componenti che saranno collegati al circuito. Affinché i componenti si colleghino con l'orientamento corretto, è particolarmente importante assicurarsi che i colori dei fili nero e rosso sui connettori filo-filo corrispondano. Piccole sviste in queste due sezioni molto probabilmente influenzeranno la funzionalità del sistema. In effetti, il primo passo nella risoluzione dei problemi di questo metodo sarà verificare che il circuito sia stato costruito correttamente e che tutte le connessioni siano a posto. In secondo luogo, è di particolare importanza controllare la qualità di saldatura per le connessioni allentate e i fili per i peli di filo svasati che potrebbero cortocircuitare il circuito. Un terzo passo sarebbe quello di assicurarsi che i LED funzionino correttamente, cosa che può essere fatta utilizzando un alimentatore o una batteria da 1,5 V tagliando i due terminali del LED con clip a coccodrillo. Un'altra considerazione potenzialmente critica è quella di prevenire il riscaldamento (quando si utilizzano i LED ad alta potenza) o la diffusione della luce per un'illuminazione più ampia. Per rispondere a queste considerazioni, i LED possono essere montati all'esterno di una scatola nera con "pellicola per la privacy" all'interno, come descritto nella Figura supplementare 23 e Allen et ^al.5. A causa della semplicità di questo sistema, smontarlo per verificare, modificare, aggiornare o riparare componenti modulari non è difficile.

Un altro fattore critico per i sistemi genici inducibili è considerare quanta attivazione è richiesta o quanta perdita è accettabile per il sistema biologico controllato. Come mostrato nella Figura 6, questi possono variare con la quantità di DNA del reporter. Inoltre, l'efficienza di trasfezione e, quindi, il numero di copie dei costrutti del reporter in ogni cella varierà. Può essere vantaggioso per alcuni esperimenti creare una linea cellulare con una quantità fissa di componenti reporter o PhyB gene-switch e selezionare cloni con l'intervallo desiderato di espressione indotta, come viene comunemente fatto con i sistemi inducibili da farmaci. A causa delle dimensioni e dell'instabilità del plasmide lentivirale pPK-230⁴, abbiamo anche realizzato versioni plasmidiche non lentivirali dello switch PhyB nella dorsale pcDNA pPK-351 (Addgene #157921) e pPK-352 (Addgene #157922).

Costruendo questo sistema di illuminazione a LED seguendo questo protocollo, gli utenti hanno tutti i componenti necessari per eseguire una vasta gamma di esperimenti di optogenetica in vitro e in vivo. In combinazione con le istruzioni per l'uso di PhyB-PIF3 nelle cellule di mammifero, questo protocollo consentirà ai non ingegneri e ai biologi di, in modo flessibile ed efficace, utilizzare l'optogenetica basata su PhyB in una varietà di contesti.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Vorremmo ringraziare Yingxiao (Peter) Wang, Ziliang Huang e Molly Allen per aver testato diverse versioni del sistema LED mentre era in fase di sviluppo. Questo lavoro è stato supportato dal Kavli Institute for Brain and Mind della UC San Diego e dal Salk Institute, National Science Foundation attraverso il NSF Center for Science of Information sotto Grant CCF-0939370, NIH Grant NS060847 e NIH Grant R21DC018237.