Agrobacterium-Aracılı Genetik Dönüşüm, Transgenik Üretim ve Pirinçte Erkek Üreme Gelişimi Çalışmaları Için Uygulaması

Bu çalışma, CRISPR-Cas9 genom düzenleme teknolojisinin nakavt endojen gen OsABCG15'e ve ardından pirinçte istikrarlı bir erkek steril çizgi üretmek için modifiye edilmiş Agrobacteriumaracılı dönüşüm protokolüne kullanımını açıklamaktadır.

Erkek kısırlığı genellikle erkek üreme organları / gametfonksiyonel kusurları ile karakterize melez tohum üretimi için önemli bir tarımsal özelliktir. CRISPR-Cas9 genom düzenleme teknolojisindeki son gelişmeler, belirli bölgelerde ki endojen aday genlerin yüksek düzenleme etkinliği ve zaman kazandıran nakavt mutasyonlarına olanak sağlar. Ayrıca, Pirinç Agrobacteriumaracılı genetik dönüşüm de yaygın birçok kamu ve özel laboratuvarlar tarafından kabul edilmiştir gen modifikasyonu için önemli bir yöntemdir. Bu çalışmada CRISPR-Cas9 genom düzenleme araçlarını uyguladık ve OsABCG15'in japonica çeşitlerinde hedeflenen genom düzenlemesi ile üç erkek steril mutant hattını başarıyla oluşturduk. Biz pirinç hibrid tohum üretimi için genetik emasculation mükemmel bir araç sağlayabilir değiştirilmiş Bir Agrobacteriumaracılı pirinç dönüşüm yöntemi kullanılır. Transgenik bitkiler 2-3 ay içinde elde edilebilir ve homozigot transformantlar PCR amplifikasyon ve Sanger dizilimi kullanılarak genotipleme ile tarandı. Erkek steril homozigot çizginin temel henotik karakterizasyonu pirinç erkek üreme organlarının mikroskobik gözlemi, polen canlılık analizi iyot potasyum iyodür (I₂-KI) ile yapıldı.

Pirinç, özellikle gelişmekte olan ülkelerde en önemli gıda mahsulüdür ve dünya nüfusunun yarısından fazlası için bir temel gıda temsil eder. Genel olarak, pirinç tanesi için talep büyüyor ve 2030 yılına kadar% 50 ve 2050^11,2%100 artırmak için tahmin edilmektedir. Pirinç veriminde gelecekteki iyileştirmeler, pirinci monocotyledonous bitki araştırmaları için mükemmel bir model haline getiren çeşitli moleküler ve genetik kaynaklardan yararlanmak zorunda kalacaktır. Bunlar arasında etkin bir dönüşüm sistemi, gelişmiş moleküler harita ve uzun yıllar boyunca oluşturulmuş olan ifade edilmiş sıra etiketleri^3,,4'üngenel olarak erişilebilir veritabanı bulunmaktadır. Bir strateji ürün verimi artırmak için hibrid tohum üretimi⁵, hangi erkek doğurganlık işlemek için yeteneği olan merkezi bir unsurdur. Tahıl bitkileri erkek doğurganlık moleküler kontrol anlamak hibrid tohum üretimini artırmak ve bitki verimliliğini artırmak için pratik teknikler içine anahtar bilgi çevirmek için yardımcı olabilir^6,7.

Genetik dönüşüm, yabancı genlerin tanıtılmasına veya ekin bitkilerinde endojen genlerin manipülasyonuna olanak sağladığı ve genetiği değiştirilmiş çizgilerin üretilmesiyle sonuçlandığından temel araştırma ve ticari tarım için önemli bir araçtır. Uygun bir dönüşüm protokolü gen regülasyonu nun temel anlaşılması için genetik ve moleküler biyoloji çalışmalarının hızlandırılmasına yardımcı olabilir^8. Bakterilerde genetik dönüşüm doğal olarak gerçekleşir; ancak, bitkilerde, yapay moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak yapılır^9,10. Agrobacterium tumefaciens t-DNA aktararak bitkilerde taç safra hastalığına neden olan bir toprak kaynaklı, Gram-negatif bakteri, onun Ti plazmid bir bölge, bir tip IV salgı sistemi ile bitki hücresine^11,12. Bitkilerde, A. tumefaciens-aracılı dönüşüm gen modifikasyonu için yaygın bir yöntem olarak kabul edilir çünkü konak genom¹³içine T-DNA kararlı ve düşük kopya sayısı entegrasyonu yol açar. Transgenik pirinç ilk olarak 1990'ların ortalarında japonica çeşitleri^14'te Agrobacteriumaracılı gen dönüşümü ile üretildi. Bu protokol kullanılarak 4 aylık bir süre içinde %10-30 oranında dönüşüm verimi ile çeşitli transgenik hatlar elde edilmiştir. Çalışma, başarılı dönüşüm için iki kritik adım olduğunu göstermiştir: biri olgun tohumlardan embriyojenik nasır indüksiyonu ve diğeri de bitkilerde daha yüksek dönüşüm verimliliği sağlayan birlikte ekimi sırasında bakteri kültürüne fenolik bir bileşik olan asetozipon eklenmesidir^14,15. Bu protokol yaygın japonica^16,17,,18,19 yanı sıra indica^{20,21,,22,,23} ve tropikal japonica^24,25gibi diğer çeşitleri küçük değişiklikler ile kullanılmıştır. Nitekim, pirinç dönüşümünü açıklayan makalelerin% 80'den fazla bir araç olarak Agrobacteriumaracılı gen dönüşümü¹³kullanın. Bugüne kadar, birkaç genetik dönüşüm protokolleri nasır indüksiyon¹⁶,^17,,18,19için bir başlangıç malzemesi olarak pirinç tohumu kullanılarak geliştirilmiştir. Ancak, çok az nasır üretimi için eksplandan olarak genç çiçeklenme hakkında bilinmektedir. Genel olarak, fonksiyonel genomik ve mahsul geliştirme çalışmaları için hızlı, tekrarlanabilir ve verimli bir gen dönüşümü ve rejenerasyon protokolü oluşturmak önemlidir.

Son yıllarda, CRISPR-Cas9 teknolojisinin ilerlemesi gen fonksiyonunu anlamak ve bitki ıslahı için tarımsal olarak önemli iyileştirmeler sunmak için hassas bir genom düzenleme mekanizması sonuçlandı^26,27. CRISPR aynı zamanda erkek üreme gelişimi ve hibrid üretimin manipülasyon için önemli bir umut vaat ediyor. Bu çalışmada CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak bir gen nakavt sistemi kullandık ve verimli bir pirinç geni dönüşüm protokolüile birleştirerek genç çiçeklenmeleri eksektif olarak kullandık ve böylece üreme gelişimi için istikrarlı erkek steril çizgileri oluşturduk.

1. sgRNA-CAS9 bitki ekspresyonu vektör konstrüksiyonu ve Agrobacterium-aracılıdönüşüm

1. Yayınlanan literatüre göre pirinç bir erkek steril gen OsABCG15 hedef²⁸.
2. OsABCG15'in ikinci eksonlarında 106-125 bp arasında yer alan hedeflenen site için tasarım sgRNA(Şekil 1).
3. SgRNA oligolarını sentezlemek için T4 polinükleotid kinaz kullanın (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' ve 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGGATGTGCTT').
4. PsR-Cas9 omurga vektörü^29'usindirmek için ensoneklease BbsI kullanın.
5. Üreticiprotokolünden sonra T4 ligase kullanarak doğrusallaştırılmış psgR-Cas9 omurgalı sentezlenmiş sgRNA oligolarını inceleyin.
6. HindIII/EcoRI kullanarak, sgRNA kasetini adım 1.5'ten sindirin ve kararlı dönüşüm için pCAMBIA1300 ikili vektörünün HindIII/EcoRI bölgesine subclone²⁹.
7. Enzim sindirimi ve sıralama ile inşa plazmid onaylayın. Daha sonra, ikili yapıyı Agrobacterium tumefaciens strain EHA105'e dönüştürün ve 28 °C'de 2-3 gün boyunca Kan/Rif seçim plakalarında yetiştirin.

2. Pirinç genetik dönüşümü ve bitki doku kültürü

1. Nasır indüksiyon ve rejenerasyon
   NOT: Nasırı indüklemek için başlangıç malzemesi olarak taze genç pirinç çiçeklerini kullanın (Şekil 2).
   1. 1.6-4.8 mm floret uzunluğu(Şekil 2A)²⁹tarafından belirlenen, meyyoz aşamasında çeltik alan veya yeşil ev genç çiçeklenmeleri toplamak. Pirinç çiçeklenmeleri yaprak kılıf ile kaplı olduğundan emin olun. Her çiçeklenmeyi %70 alkol bezi ile silin ve kesmeden önce kurutun.
   2. Çiçeklenmeyi temiz bir steril tezgaha getirin. Sterilize makasla küçük parçalar halinde kesin (ne kadar küçük olursa o kadar iyi) ve sonra kesimleri NBD2 ortamı içeren bir Petri plakasına aktarın(Şekil 2B, Tablo 1).
   3. Plakayı karanlıkta 26 °C'de yaklaşık 10-14 gün boyunca inkünoslayın ve nasır ı indükler (Şekil 3A).
      NOT: Agrobacterium infiltrasyonu için yeni oluşan nasırı (adım 2.2.7) doğrudan kullanın veya daha fazla nasır elde etmek için taze NBD2 ortamında bir kez daha yenileyin. Nasırı her 8-10 günde bir yeni NBD2 ortamına aktarın.
2. Dönüşüm ve ortak tarım
   1. Dönüşüm için adım 1.6 ikili plazmid içeren A. tumefaciens bakteri kullanın. A. tumefaciens suşlarını YEB ortamda(Tablo 1)%50 gliserol ile -80 °C'de saklayın.
   2. Streak A. tumefaciens bir -80 °C gliserol stokye selektif antibiyotik içeren YEB agar orta(Tablo 1) ve 25-28 °C'de 48-72 saat büyür, koloniler görünmesini sağlamak için.
   3. 50 mL konik steril test tüpünde, aynı seçici antibiyotikleri içeren sıvı YEB ortamının 5 mL'sine seçici antibiyotiklerle YEB plakasından tek bir koloniyi aşılayın. 250 x g,25-28 °C'de bir orbital shaker üzerinde sallayın bakteriler 0.5 OD₆₀₀ kadar büyür. g
   4. 250 mL konik şişede aynı seçici antibiyotiklerle 100 mL YEB ortamına(Tablo 1)1 mL bakteriyel süspansiyon ekleyin ve 250 x g'deorbital shaker üzerinde sallayın, 4 saat boyunca 28 °C'de.
   5. Bakteri toplamak için oda sıcaklığında 10 dakika için 4.000 x g santrifüj. Supernatant atın.
   6. AAM-AS ortamı(Tablo 1)ile bakteriyel peleti yeniden askıya alın ve süspansiyonu OD₆₀₀ = 0.4'e seyreltin.
      NOT: Bakteriyel süspansiyonun mükemmel od verimli dönüşüm için çok önemlidir. Bu nasır üzerinde aşırı bakteri üreme ortadan kaldırılmasında yardımcı olur.
   7. Adım 2.1.3 bir 150 mL steril şişe içine yaklaşık 150 sağlıklı büyüyen açık sarı kırılgan embriyojenik calli toplayın. Steril şişeiçine adım 2.2.6 dan 50-75 mL bakteri hücresi süspansiyon ekleyin ve sonra 10-20 dakika için calli batırmak için bazı 10-25 mL taze AAM-AS orta ekleyin, zaman zaman sallayarak.
   8. Şişeden bakteriyel süspansiyonu dikkatlice dökün ve steril filtre kağıdı #1 veya kağıt mendil kullanarak nasırdan fazla bakteriyel süspansiyonu kurulayın. Daha sonra nbd-AS orta(Tablo 1)ile steril bir filtre kağıdı ile kaplı bir Petri çanak üzerine yerleştirin #1. 25-28 °C'de 3 gün boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın ve bakteriyel aşırı büyüme olup olup olup yok.
3. Dirençli nasır için seçim
   1. 3 günlük birlikte ekimden sonra calli'yi steril filtre kağıdı ile steril bir Petri kabına aktarın.
   2. Temiz bir bankta 2 saat boyunca calli'yi havayla kurutun. Nasırın filtre kağıdına yapışmadığından emin olun.
   3. Calli'yi steril cımbız kullanarak birincil seçim ortamı NBD2'ye (40 mg/L higromisin ve 250 mg/L timentin ile) eşit olarak aktarın (Tablo 1). 25-28 °C karanlıkta 2 hafta boyunca kültür calli.
   4. 2 hafta sonra, calli'yi taze seçim ortamı NBD2 içeren yeni bir plakaya eşit olarak transfer edin (40 mg/L higromisin ve 250 mg/L timentin ile)(Tablo 1). Kültür 25-28 °C karanlıkta başka bir 2 hafta için calli.
4. Nasır farklılaşması
   1. Taze MS Medium'a aktarma (25 mg/L higromisin ve 150 mg/L timentin ile)(Tablo 1). Kültür ışık altında 25-28 °C'de yaklaşık 2 hafta sürer.
   2. Adımı 2.4.1'i bir kez daha tekrarlayın.
   3. Daha fazla sürgün çoğalmak için yeni MS ortamı (10 mg / L higromisin ile) ateş tomurcukları aktarın.
5. Kök indüksiyonu
   1. Yeni sürgünleri 1/2 MS ortamına aktarın(Tablo 1). 25 °C - 28 °C ışık altında kültür. Dönüştürülmüş bitkiler 2 hafta içinde kök üretirler.
   2. 1 hafta sonra, dehidratasyon önlemek için bitki kapsayan tencere temizlemek için bitkiler aktarın.

3. Genotip tanımlama

1. Cetyltrimethyl amonyum bromür (CTAB) yöntemi³¹kullanarak toplam DNA çıkarma için yeni oluşturulan bitkilerden genç yaprakları toplamak.
2. Şablon olarak genomik DNA kullanarak, transgen entegrasyonu ve frekansları doğrulamak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirmek için astar (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCACCGTATT 3' ve Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCGTGTCTTTCA 3' Hipgromisin bölgesinde bulunan) polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirmek için seçin (Şekil 4). Aşağıdaki PCR koşulları: 5 dk için 94 °C; 36 devir (30 s için 94 °C; 30 s için 56 °C; 1 dk için 72 °C); 7 dk için 72 °C. Başarılı PCR reaksiyonları 604 bp amplicon verir.
3. Transformatörlerin genotipini belirlemek için CRISPR hedef bölgelerini çevreleyen genomik bölgeyi özel astarlar (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAACAGTTTCT 3' ve OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTAAAACATTGCTAT 3') kullanarak güçlendirmek için başka bir PCR gerçekleştirin. PCR koşulları adım 3.2 ile aynıdır.
4. Mutasyonları tanımlamak için doğrudan Sanger sıralaması için 3.3 adımdaki PCR parçalarını kullanın.

4. Mutantın temel fenotipini gözlemleyin

1. I₂-KI çözeltisini hazırlayın: 2 g KI 'yi (potasyum iyodür) 10 mL distile suda çözün ve sonra 0,2 g I₂ (resublimed iyot) ekleyin. Karıştırıldıktan sonra, distile su ile 100 mL toplam hacmi getirmek.
2. FAA çözeltisini (%63 susuz etanol, %5 buzul asetik asit, %5 formaldehit ve %27 su) hazırlayın ve kullanmadan önce karıştırın.
3. %0,5 Toluidin mavisi boyama çözeltisini hazırlayın: 0,5 g Toluidin mavisini 100 mL distile suda çözün.
4. Bir dijital kamera ile tüm bitkilergörüntüleme, bitkisel phenotik gözlem gerçekleştirin.
5. Üreme fenotip gözlemyapmak, floret palea ve lemma kaldırın. Bir stereomikroskop altında tüm anthers fotoğraf çekmek.
6. İyot boyama ile polen canlılığını gözlemleyin.
   1. Çiçek anthesis önce olgun pirinç spikelets pick, anthers serbest bırakmak için palea ve lemma kaldırın.
   2. 6 anthers alın ve bir cam slayt üzerine yerleştirin. 1 damla distile su ekleyin, polen tanelerini serbest bırakmak için cımbızla anther'i iyice ezin ve ardından 2-3 damla I₂-KI çözeltisi ekleyin. Kapak la kaplayın.
   3. Düşük büyütme mikroskobu altında gözlemleyin. Polen taneleri boyalı siyah daha güçlü canlılık göstermek, hiçbir renk veya sarı-kahverengi boyalı bodur veya dejenere vardır.
7. Pirinç anther yarı ince bir bölüm gerçekleştirin
   1. Bir FAA çözüm içine farklı gelişim aşamalarında pirinç çiçekleri düzeltin. Malzeme nin toplama şişesinin dibine banına kadar fiksatifin dokulara nüfuz etmesini sağlamak için malzemeleri 4 °C'de (genellikle 15 dk) vakumlayın.
   2. Ertesi gün yeni bir FAA çözümü ile değiştirin. Malzeme dibe battıktan sonra % 70 etanol ile değiştirin ve uzun süreli kullanım için 4 °C'de saklayın.
   3. Etanol farklı degradeleri ile malzeme dehydrate (70%, 80%, 30 dakika için her zaman% 95, 2 saat için% 100 etanol, 2 saat safranin boya biraz içeren% 100 etanol).
      NOT: Daha sonra daha kolay kesit için anterler renk ikinci% 100 etanol içine Safranin boya biraz ekleyin.
   4. Üreticinin talimatını (Malzeme Tablosu) izleyerek gömme gerçekleştirin. Daha sonra, kesitleme den önce 60 °C'de 48 saat fırında pişirin.
   5. Numuneyi bir mikrotom kullanarak 2 μm kalınlığa kadar kesin. Cam slayt üzerine bir damla su ekleyin. Daha sonra, anther blokları içeren ince bölümleri forceps tarafından almak ve slaytlar üzerinde su damla yüzeyine koyun.
   6. Slaytları 50 °C'de su banyosuna yerleştirin ve kayalıkaya sıkıca yapışmasını bekleyin.
   7. 30 dakika boyunca slaytlar leke% 0.5 toluidin mavi çözeltisi kullanın. Daha sonra, su ile durulayın ve duman kaputunda kuru. Nötr ağaç tutkal ile mühür. Yavaşça slayt üzerine bir coverslip yerleştirin ve duman kaputunda kuru.
   8. Örneği mikroskop altında gözlemleyin ve fotoğrafladı.

Burada gösterilmiştir pirinç Agrobacteriumtarafından gelecekteki araştırmalar için bir erkek steril çizgi oluşturmak için gen düzenleme teknolojisinin kullanımıdır-pirinç genetik dönüşüm aracılı. İkili vektör konstrüksiyonu için CRISPR-CAS9 aracılı mutagenez osabg15erkek steril hattını oluşturmak için kullanılmıştır. SgRNA OsU3 organizatörü tarafından tahrik edildi, hSpCas9 ifade kaseti çift 35S organizatörü tarafından tahrik edildi ise, ve orta vektör agrobacteriumiçin tasarlanmış tek bir ikili vektör pCAMBIA1300 monte edildi -pirinç aracılı kararlı dönüşüm. Pirinç CRISPR/Cas9 aracılı mutagenez için kullanılan yapının grafiksel gösterimi Şekil 1A'daverilmiştir.

Şekil 2 ve Şekil 3 pirinç transgen üretiminin tüm prosedürünü temsil ediyor. Genç çiçeklenmeler ekseksiyon olarak seçilmiştir (Şekil 2) ve NBD2 ortamına aşılamadan sonraki 14 gün içinde friable embriyojenik nasır (FEC) indüklenmiştir(Şekil 3A). Embriyojenik calli doğrudan Agrobacteriumaracılı dönüşüm için kullanılmıştır(Şekil 3C) veya daha fazla enfeksiyon için daha fazla calli elde etmek için proliferasyon alt kültür(Şekil 3B). Karanlık koşullarda NBD2-AS ortamüzerinde 48 saat birlikte işlendikten sonra(Şekil 3D),calli ikinci tur seçim ortamına kaydırıldı. 10-14 gün sonra, dönüştürülmüş calli anne calli çevresinde bazı küçük yeni oluşan microcalli gösterdi, dönüştürülmemiş calli rengi kahverengi dönüştü ve sonunda öldü iken(Şekil 3E,F). Daha sonra, sağlıklı ve kremsi renkli calli iki kez rejenerasyon ortamına aktarıldı. Bu aşamada, dönüştürülmüş calli yavaş yavaş yeşil noktalar gösterdi (ateş tomurcukları) (Şekil 3G,H). Bu yeni üretilen yeşil lekeler, sürgün büyümesine izin vermek için rejenerasyon ortamı içeren steril bir plastik şişede kültürlendi(Şekil 3I),ve daha sonra kökleri indüklemek için 1/2 MS ortamına (taze sürgünler olarak) kaydırıldı. Daha sonra, iyi gelişmiş kökleri ile sağlıklı ve güçlü büyüyen sürgünler hasat edildi(Şekil 3J).

Toplamda 21 rejenere fide elde edildi. Higromisin bölgesi için PCR amplifikasyon, 21 kişiden 18'inin ilgili bandı yükseltebileceğini göstererek bu çizgilerin transgenik olduğunu göstermiştir(Şekil 4),ve karşılık gelen dönüşüm sıklığı yaklaşık %85,71 'dir(Tablo 2). Transformantlar, 18 T₀ transgenik bitkiler, sekiz heterozigot hat ve üç homozigot çizgi arasında CRISPR-Cas9 pozitif, karşılık gelen mutasyon frekansları ile %61,11(Şekil 1B, Tablo 2)ile hedef bölgeye yayılan astarlar kullanılarak sgRNA hedef sahasındaki mutasyonları tanımlamak için genotiplenmiştir .

Homozigot nakavt mutantları temel erkek üreme organı gözlemi ile doğrulandı (Şekil 5). Osabcg15 anthers yabani tip(Şekil 5A,D)daha küçük ve soluk ve olgun polen taneleri yoktu(Şekil 5B,E). Osabcg15'teki anther morfolojik defektlerini araştırmak için yabani tipe göre enine kesitmikroskopisi yapıldı. Evre 10'da, yabani tip mikrosporlar yuvarlak şekilli hale geldi ve koyu mavi lekeli exine(Şekil 5C)ile aşılandı. Buna karşılık, osabcg15 mikrosporlar çöktü ve bozulmuş, sadece dejenere mikrospor enkaz anther lokül(Şekil 5F)bulunmaktadır.

Şekil 1: CRISPR/Cas9 sistemi ve OsABCG15'inhedefli mutagenezi için bilgi oluşturma . (A) SgRNA OsU3 organizatörü tarafından tahrik edildi, hSpCas9 ifade kaseti çift 35S organizatörü tarafından tahrik edildi; orta vektör, pilavın Agrobacteriumaracılı kararlı dönüşümü için tasarlanmış tek bir ikili vektörde bir araya getirilmiştir. (B) OsABCG15 geninin ikinci eksonda yer alan dizi (5'-AAGCACATCCTCACAAGGGGAT-3') sgRNA'nın hedef bölgesi olarak seçilmiştir. Japonica cultivar 9522 arka planında CRISPR-Cas9 tarafından üç tip homozigot mutasyon olayı üretildi ve CRISPR-Cas9 indüklenen mutasyon bölgelerinin Sanger sekanslama kromatisleri gösterilmiştir. Hat 9522^osabcg15-1 tek nükleotit (1-nt) 'A' ekleme vardır; hat 9522^osabcg15-2 tek nükleotit (1-nt) 'G' ekleme vardır; ve 9522^osabcg15-3 satırında tek nükleotit (1-nt) 'G' silme vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Nasır ı indükleyen malzemeler. (A) Genç pirinç çiçeklenmeleri, meyozis evresinde. (B) NBD2 ortamında yetişen genç çiçeklenmeler kesilir. Çubuk = 2 cm içinde (A). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Agrobacteriumaracılı dönüşüm ile transgenik çizgilerin üretilmesi prosedürü. (A) Pirinç calli genç çiçeklenme oluşturulan. (B) Calli alt kültürü. (C) A. tumefaciens ile calli kuluçka. (D) A. tumefaciens ile calli birlikte ekimi. (E) Hygromycin varlığında dönüştürülmüş calli ilk seçim döngüsü (40 mg /L). (F) Hygromycin (40 mg/L) varlığında dönüştürülmüş calli'nin ikinci seçim döngüsü. (G) Dönüştürülmüş calli'nin ilk yenilenmesi. (H) Dönüştürülmüş calli ikinci rejenerasyon, kültür plakayeşil çekim noktası dikkat çekti. (I) İndüksiyon kültürünü vur. (J) Kök indüksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Yenilenen pirinç fidelerinin dönüşüm frekanslarının analizi. %1.5 agarose jel elektroforezi sonrası 604 bp parça (1-8, 10-14, 16-20) gösteren amplifiye edilmiş PCR ürünleri transgenik pozitif çizgileri gösterir. Parçadan yoksun çizgiler dönüştürülür (9, 15, 21), vahşi tip (WT) denetimine benzer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Yabani tip (9522) ve mutant 9522^osabcg15-1temel fenotik gözlem . (A) Yabani tip (9522) çiçek ve (D) 9522^osabcg15-1 mutant çiçek lemma ve palea kaldırıldıktan sonra. gl, glume; fi, filament; lo, lodicule; pi, pistil; st, stamen. (B) I₂-YABANI tip (9522) ve (E) 9522^osabcg15-1 hattından olgun polen tanelerinin ki boyama. (C) Yabani tip (9522) ve (F) 9522^osabcg15-1 mutant'ta anther gelişiminin enine kesit gözlemi ile analizi. DMsp, Dejenere mikrosporlar; E, epidermis; En, endotel; Msp, mikrospor; T, tapetum. Çubuklar = 2 mm in (A) ve (D), 100 μm in (B) ve (E), 50 μm in (C) ve (F). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Pirinç dönüşümü için medya kompozisyonları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 2: Crispr-Cas9 tarafından T₀ neslinde üretilen OsABCG15 mutantlarının dönüşüm ve gen düzenleme verimliliği. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Yapay gen erkek steril mutantlar geleneksel rasgele fiziksel, kimyasal veya biyolojik mutagenez tarafından oluşturulur. Bu güçlü teknikler olmasına rağmen, onların rasgele doğa moleküler ıslah ıslahı³²özel iyileştirmeler sunmak için potansiyele sahip modern genomik bilginin büyük miktarda yararlanmak için başarısız olur. CRISPR-Cas9 sistemi,^DNA'yımanipüle etmek ve düzenlemek için basit ve uygun fiyatlı araçları sayesinde bitkilerde yaygın olarak kullanılmaktadır 29^,33; geleneksel mutagenez yöntemlerine göre zaman kazanma potansiyeline sahiptir.

Burada, nasır indüksiyonu için eksplorasyon olarak genç çiçeklenmeleri kullanarak uygun bir Agrobacteriumaracılı dönüşüm sistemi geliştirdik. Transgen yordamında zaman kazanmak için atlanabilecek bazı adımlar vardır. Başlangıç malzemesi olarak genç çiçeklenmelerin kullanılması, tohumlarıekbitkiler olarak kullanmakla karşılaştırıldığında nasır indüksiyonunun genel süresini en aza indirmek için iyi bir seçimdir. Buna ek olarak, hücre farklılaşma ve rejenerasyon kapasitesi genç çiçeklenme elde calli çok güçlüdür. Bu süreçte pirinç calli alt kültürü önlenebilir, hangi sonunda zaman kazandırır yanı sıra bakteriyel ve mantar kontaminasyon riskini azaltır. Ayrıca, timentin karsinin yerine antibiyotik olarak kullanılmıştır, hangi bakterileri inhibe daha etkilidir.

Çalışma ve pirinç erkek üreme gelişimi temel fenotipik gözlem için getirilen protokol bitki üreme biyolojisi ilgilenen lisans ve lisansüstü öğrenciler için yararlıdır. Bu uygun protokol, sonraki araştırma çalışmalarında kullanılmak üzere hızlı ve tekrarlanabilir olmalıdır.

Hiçbiri.

Yazarlar genç pirinç çiçeklenme ve pirinç dokusu kültürü orta yapımında yardım sağlamak için Xiaofei Chen kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31900611) tarafından desteklenmiştir.