Subaraknoid Kanama Modeli olarak Cisterna Magna içine Kan Çift Doğrudan Enjeksiyon

Bu protokolde, otolog tam kandan cisterna magna'ya çift enjeksiyon la standart laştırılmış subaraknoid kanama (SAH) fare modeli tanımlanmıştır. Çift enjeksiyon prosedürünün yüksek standardizasyon derecesi mortalite ile ilgili göreceli güvenlik ile SAH bir orta-akut modeli temsil eder.

İnmeler arasında, serebral arteriyel anevrizma rüptürüne ardışık subaraknoid kanama (SAH) %5-9'u temsil eder, ancak total inmeye bağlı mortalitenin yaklaşık %30'undan sorumludur ve nörolojik sonuç açısından önemli bir morbidite vardır. Gecikmiş serebral vazospazm (CVS) en sık gecikmiş serebral iskemi ile ilişkili olarak ortaya çıkabilir. SAH'ın farklı hayvan modelleri artık her biri farklı avantajlar ve dezavantajlar sergileyen sarnıç magna sına endovasküler perforasyon ve doğrudan kan enjeksiyonu da dahil olmak üzere kullanılmaktadır. Bu makalede, sisterna magna içine otolog tam kan belirlenen hacimleri çift doğrudan enjeksiyon ile SAH standartlaştırılmış bir fare modeli sunulmaktadır. Kısaca, fareler tartıldı ve daha sonra isofluran inhalasyon tarafından anestezi edildi. Daha sonra, hayvan 37 °C'lik rektal sıcaklığı koruyan ısıtılmış bir battaniyenin üzerine yaslanmış bir konuma yerleştirildi ve yaklaşık 30°'lik servikal bükümile stereotaktik bir çerçeve içinde konumlandırıldı. Bir kez yerine, aynı yaş ve cinsiyet (C57Bl/6J) başka bir farenin karotis arter alınan homolog arter kanı ile dolu uzun bir cam mikropipet ucu bir mikromanipülatör ile atlanto-oksipital membran ile temas dik açıyla konumlandırılmış. Daha sonra 60 μL kan sarnıç magna enjekte edildi ve ardından hayvanın 30° aşağı doğru 2 dakika eğik bir şekilde eğik bir şekilde yatırıldı. Cisterna magna'ya 30°L kan nakli ilkinden 24 saat sonra yapıldı. Her hayvanın bireysel takibi günlük olarak yapılır (ağırlık ve esenliğin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi). Bu prosedür kan öngörülebilir ve yüksek oranda tekrarlanabilir dağılım sağlar, büyük olasılıkla bir yapay serebral spinal sıvı eşdeğer enjeksiyon ile taklit edilebilir intrakranial basınç yüksekliği eşlik (BOS), ve düşük mortalite indükleyen SAH hafif modeli akut temsil eder.

Subaraknoid kanama (SAH) tüm inme olgularının %5'ini oluşturur ve yılda 100.000 hastabaşına 7.2 ila 9 hasta insidansı ile nispeten yaygın bir patoloji oluşturur ve çalışmaya bağlı olarak %20-60 oranında mortalite oranı^1,2,3. Akut fazda mortalite kanama, rekanama, serebral vazospazm (CVS) ve/veya tıbbi komplikasyonların şiddetine bağlanabilir^4. Hayatta kalanlarda, erken beyin hasarı (EBI) kanama nın parenkimal uzantısı ve intrakraniyal basınçan ani artış ile ilişkilidir, hangi primer serebral iskemi neden olabilir⁵ ve vakaların yaklaşık% 10-15 acil ölüm⁶. SAH'ın ilk "akut" evresinden sonra prognoz, serebral bilgisayarlı tomografi ile hastaların yaklaşık %40'ında ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) 7^7,8'densonra hastaların yaklaşık %40'ında saptanan "sekonder" veya gecikmiş serebral iskeminin (DCI) oluşumuna bağlıdır. SAH hastalarının çoğunda anevrizma rüptüründen 4 ila 21 gün sonra meydana gelen CVS'ye ek olarak, DCI⁹ mikrotromboz oluşumuna sekonder multifaktöriyel diffüz beyin lezyonları, azaltılmış serebral perfüzyon, nöroinflamasyon ve kortikal yayılan depresyon (CSD)^10,11,12,13. Bu SAH kurtulanların% 30 etkiler ve görsel bellek de dahil olmak üzere bilişsel fonksiyonları etkiler, sözel bellek, tepki süresi, ve yürütme, visuospatial ve dil fonksiyonları¹⁴ günlük yaşamı bozan¹⁵. SAH hastalarında CVS ve/veya kötü bilişsel sonuçları önlemek için mevcut standart tedaviler Nimodipine olarak Ca^{2 +} kanal inhibitörleri kullanılarak Ca^{2 +} sinyal ve vazokonstriksiyon tıkanıklığı dayanmaktadır. Ancak vazokonstriksiyonu hedefleyen daha yeni klinik çalışmalarda hastanın nörolojik sonucu ile CVS^16'nınönlenmesi arasında ayrışma saptandı ve SAH-uzun vadeli sonuçlara bağlı daha karmaşık patofizyolojik mekanizmalar ortaya çıktı. Bu nedenle, SAH'ye eşlik eden patolojik olayların sayısının ve orijinal terapötik müdahaleleri test etmek için geçerli ve standartlaştırılmış hayvan modellerinin geliştirilmesinin daha iyi anlaşılması için tıbbi bir ihtiyaç vardır.

İntrakranial anevrizmanın daha çok insanlarda SAH'dan sorumlu olması klinik öncesi hayvan modellerinde taklit etmek zordur. Şu anda, anevrizma rüptürü ve SAH durum geçici orta serebral arter perforasyonu tarafından test edilebilir (endovasküler delinme modeli) farelerde CVS ve sensitivomotor disfonksiyonlar sorumlu^17,18. Kanama başlangıcı üzerinde olası bir kontrol olmaması ve bu modelde kan difüzyonu nedeniyle, kemirgenlerde endovasküler rüptür olmaksızın SAH modelleri üretmek için başka yöntemler geliştirilmiştir. Daha doğrusu, onlar magna sarnıç¹⁹ veya prechiasmatic sarnıç içine tek bir çift enjeksiyon veya prechiasmatic sarnıç içine tek bir çift enjeksiyon yoluyla subaraknoid uzaya arteriyel kan doğrudan uygulanması oluşur²⁰. Endovasküler rüptürü olmayan bu fare modellerinin en büyük avantajı, cerrahi işlemde ve enjekte edilen kan örneğinin kalitesi ve miktarında tekrarlanabilir bir şekilde ustalaşma imkanıdır. Özellikle endovasküler perforasyon ile model üzerinde bu modelin bir diğer avantajı hayvanın genel refahıkorunmasıdır. Nitekim olarak, Bu ameliyat daha az invaziv ve teknik olarak daha az bir karotis duvar rüptürü oluşturmak için gerekli daha zor. Bu son modelde, hayvan entübe ve mekanik havalandırılmalıdır, bir monofilament dış karotis arter eklenir iken, ve internal karotis arter içine gelişmiş. Bu muhtemelen tel yolu tarafından damar tıkanıklığı nedeniyle geçici iskemi yol açar. Sonuç olarak, cerrahi ile ilişkili ko-morbidite (moribund durum, önemli ağrı ve ölüm) endovasküler perforasyon modeli ile karşılaştırıldığında çift enjeksiyon modelinde daha az önemlidir. Daha tutarlı bir SAH olmasının yanı sıra, çift direkt enjeksiyon yöntemi araştırma ve test (anestezi altında azaltılmış zaman, cerrahi doku bozulması ve sıkıntı ağrı) hayvan refahı ile uyumludur ve protokol çalışması ve personel eğitimi için kullanılan hayvanların en az toplam sayıda yol açar.

Ayrıca, bu transgenik fareler için aynı protokolün uygulanmasına olanak sağlar, SAH optimize patolojik anlayış ve potansiyel terapötik bileşiklerin karşılaştırmalı test imkanı yol. Burada, 6-8 haftalık erkek C57Bl/6J farelerde sarnıc magna içine otolog arteriyel kan çift ardışık enjeksiyon uyal bir subaraknoid kanama (SAH) standart bir fare modeli salıyoruz. Bu modelin en büyük avantajı endovasküler perforasyon modeli ile karşılaştırıldığında kanama hacminin kontrolü, ve intrakraniyal basınç ciddi bir artış olmadan kanama olayının takviye²¹. Son zamanlarda, sarnıç magna içine kan çift doğrudan enjeksiyon iyi farelerde deneysel ve fizyopatolojik konularda tarif edilmiştir. Nitekim, son zamanlarda büyük serebral arterlerin CVS gösterdi (basilar (BA), orta (MCA) ve anterior (ACA) serebral arterler), serebrovasküler fibrin birikimi ve hücre apoptoz gün 3 (D3) için 10 (D10), paravasküler serebrospinal sıvı dolaşım kusurları farelerde değiştirilmiş sensitivomotor ve bilişsel fonksiyonlar eşliğinde, 10 gün sonra-SAH^2AH. Böylece, bu model hakim yapar, doğrulanmış ve kısa vadeli ve uzun süreli olaylar için karakterize post-SAH. Yeni hedeflerin prospektif belirlenmesi ve SAH ile ilişkili komplikasyonlara karşı güçlü ve etkili tedavi stratejileri üzerine çalışmalar için ideal olmalıdır.

Tüm prosedürler, Fransız Etik Komitesi ve 2010/63/AB Avrupa Parlamentosu Direktifi ve Bilimsel Amaçlariçin Kullanılan Hayvanları Koruma Konseyi yönergeleri uyarınca H. Castel gözetiminde gerçekleştirilmiştir. Bu proje yerel CENOMEXA ve hayvan araştırma ve test ulusal etik komiteleri tarafından onaylanmıştır. Erkek C57Bl/6J Rj fareler (Janvier), 8-12 haftalık, kontrollü standart çevre koşulları altında barındırıldı: 22 °C ± 1 °C, 12 saat/12 saat ışık/karanlık döngüsü, ve su ve gıda mevcut reklam libitum.

1. SAH cerrahisinin kurulumu ve enjeksiyon aparatı

1. Ameliyat başlamadan önce, bir micropipeette puller kullanarak cam kılcal yeterli sayıda çekin. Enjeksiyon pipeti 0,86 mm iç çapı ve 1,5 mm dış çapı göstermelidir.
2. Sahte durum için yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) hazırlayın.
   1. 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 1,3 mM MgCl₂, 10 mM glukoz, 26,2 mM NaHCO₃ H₂O, pH 7.4 ile bir çözelti hazırlayın.
   2. Gaz aCSF ile 95% O₂ ve 5% CO₂ 15 dakika için, ve sonra 2.5 mM CaCl₂ekleyin.
   3. Oksijenli aCSF'yi 0,22 m filtre cihazıyla sterilize edin. aCSF çözeltisi 4 °C'de 3-4 hafta stabil olabilir. Kontaminasyon (çözelti bulutlu hale geliyorsa) veya bir mevduat oluşumu ortaya çıktıysa, atın ve taze aCSF yapın.
3. Homolog fare donöründen kan toplanması
   1. Trakea boyunca karotis arter izole ve karotis arter delinmesi ile kan maksimum miktarda toplamak.
   2. Uygulamada fareyi bir anestezi odasına yerleştirin ve hayvan bilincini kaybedene kadar odayı %5 izofluran ile yükleyin.
   3. Cerrahi deneysel prosedürün ayarını sağlamak için iki arka ekstremiteden birini kenetleyerek reflekslerin eksikliğini kontrol edin.
   4. 26 G iğne (heparin sodyum) kullanarak heparin çözeltisi ile 1 mL şırınga katlayın. Bu sonraki adımlar sırasında kan pıhtılaşmasını önleyecektir.
   5. Dorsal dekübitusa yerleştirilen hayvanı bacakları ayrı, burnu ise anestezi maskesine (anestezi bakımı %2-2,5 izofluran ile) yerleştirin.
   6. Omohyoid kas uzunlamasına keserek trakea boyunca karotis arter izole. Arter izole edildikten sonra, mikrodissecting kanca ve forceps yardımıyla kalbe doğru iğne takın ve karotis arter delinmesi yoluyla kan maksimum toplamak (60 μL SAH fare başına gereklidir).
   7. Servikal çıkığı kullanarak kan alındıktan hemen sonra anestezili donör fareyi kurban edin.

2. Hayvan (8-10 haftalık C57BL/6J erkek fareler) hazırlanması

1. Her fareyi tam olarak elektronik bir denge kullanarak tartın. Mevcut çalışmada, fareler ameliyattan hemen önce 20 ila 25 gram aralığında vücut ağırlığı olurdu.
2. Daha önce açıklandığı gibi (bkz. 1.3.2 ve 1.3.3) farelerin anestezisini ameliyat etmek için teşvik edin.
3. Uygun bir elektrikli makas ile boyun ve kulaklar arasındaki boşluğu tıraş.
4. Ventral dekübitusta konumlandırılmış hayvanı bacakları ayrı ve burnu bir anestezi maskesine (anestezi bakımı 2 ve %2,5 izofluranile) stereotaktik bir çerçeveye yerleştirin.
5. Farenin uyuduğunu ve kafasının düzgün bir şekilde tıkanıp tıkandığını kontrol edin.
6. Subkutan olarak 100 μL buprenorfin (0.1 mg/kg) alt sırtta 26 G iğne ile enjekte, uyanış sonrası ağrı önlemek için.
7. Koruyucu sıvı jel kullanarak kuru gözleri önleyin ve otomatik düzenlenmiş elektrikli battaniye kullanarak 37 °C'lik bir intrarektal sıcaklığı koruyun.
8. Bir antiseptik çözelti (povison-iyot veya klorheksidin steril pamuk yol kullanarak) ile posterior boyun traş alanı tedavi.
9. Hazırlanan deri/deri altı dokusuna dokunan tüm aletleri önceden sterilize edin (200 °C'ye 2 saat ısıtın) ve aseptik olarak tevkolun.

3. SAH indüksiyonu

1. İlk gün (D-1)
   1. Arka boyunda ince makas ile 1 cm'lik bir kesi kesin, ardından sarnıç magna erişmek için orta hat boyunca kasların ayrılması.
   2. Boş cam pipetin ucunu ince makasla kesin. Daha sonra, esnek silikon konektöre bağlı bir şırıngaya uyum sağlar.
   3. Hassas bir mikropipet kullanarak 0,5 mL'lik bir tüpe 60 μL kan veya aCSF (sırasıyla SAH veya sahte durum için) aktarın.
   4. SAH durumu için 60 μL veya sahte durum için 60 μL aCSF kan cam pipet içine suck.
   5. Enjeksiyon için pipeti stereotaktik çerçeveye bir halka veya mavi raptiye kullanarak takın ve pipet ucunu sarnıç magna ile arayüzdeki membrana yavaşça getirin.
   6. Pipet ucunu stereotaktik çerçevenin mikro manipülatörü kullanarak, pipet ucunu atlanto-oksipital membrandan sarnıc magna'ya yavaşça yerleştirin.
   7. Daha önce kan veya aCSF ile doldurulmuş pipeti basınç indüksiyonuna hazır şırıngaya bağlayın.
   8. Akut intrakraniyal basıncı önlemek için pistonu 10 μL/dk civarında düşük bir hızda bastırarak enjekte edin.
   9. Enjeksiyon sırasında solunum hızını ve rektal sıcaklığı yakından takip edin.
   10. Enjeksiyonun sonunda, mikro manipülatör aracılığıyla pipeti dikkatlice çıkarın ve geri çekilme sırasında sızıntı olmadığından görsel olarak emin olun.
   11. Emilebilir bir hemostat kullanarak hemostaz elde ve örgülü olmayan emdirilebilir dikiş iplik ile iki dikiş çalıştırın.
   12. Ameliyattan hemen sonra fareyi reddet dekübitine yerleştirin ve iyileşme süresince açık bir kutuda bir sağkalım battaniyesi ile kapatın.
2. İndüksiyonun ikinci günü (D0)
   1. 24 saat sonra anestezi yitirin (bkz. 1.3.2 ve 1.3.3). Subkutan olarak tekrar buprenorfin 100 μL enjekte (0.1 mg/kg) ve koruyucu sıvı jel kullanarak kuru gözleri önlemek (bkz. adım 2.7 ve 2.8).
   2. Hayvanı bir gün önce olduğu gibi stereotaktik çerçeveye töyorum.
   3. Dikkatle mikroscissors ile dikişleri çıkarın.
   4. Atlanto-oksipital membranı önceden olduğu gibi hazırlayın ve boynun tıraşlı bölgesine steril bir pamuk çubukla antiseptik preparat uygulayın.
   5. Düşük oranda 30 μL kan veya aCSF enjekte edin (bkz. 3.1.2 ila 3.1.8. adımlar). Solunum hızını ve rektal sıcaklığı izleyin.
   6. Enjeksiyon sonunda, dikkatle pipet çıkarmak ve çekilme sırasında kan sızıntısı yokluğunu kontrol edin.
   7. Hemostaz elde ve örgülü emilebilir dikiş iplik ile iki dikiş çalıştırın.

4. Ameliyat sonrası takip ve deney sonu

1. Ameliyattan hemen sonra, kurtarma sırasında sırtında bir sağkalım battaniyesi ile fareyi reddedici dekübite yerleştirin.
2. Kurban edilinceye kadar her farenin günlük davranışını dikkatlice tartacak ve gözlemleyin (örn. ameliyat sonrası D7).
3. İnsancıl uç noktalar arasında, önemli bir kilo kaybı (>15% ağırlık) klasik fark edilir. Bir "kambur geri" duruş, yavaş hareketler, prostration, ağrı ve / veya önemli agresif davranış anormal vokalizasyonda da hayvan acı önemli belirtileri vardır. Bu belirtilerden herhangi biri veya bir dizi işaret ortaya çıkarsa, hayvanın izlenmesi göründükten sonraki saatlerde takviye edilir. Eğer hayvanın refahı 48 saat içinde kötüleşir sayılsa ya da iyileşmezse, dayanılmaz bir acı seviyesine ulaşıldığı ve ötenazi nin yapıldığı düşünülecektir.
4. Seçim sırasında, decapitation tarafından anestezi fareler kurban, ve daha fazla analiz için beyin hasat.
5. Isofluran anestezisi (%5) sonrası ötanazi (decapitation) yapın.

Deneysel zaman çizelgesi, prosedür, takip ve mortalite
Şekil 1A ve Şekil 1B, SAH model protokolünü çift intrasisternal kan enjeksiyonu ile özetler. Kısaca, SAH indüksiyonunun ilk gününde (D-1), homolog bir fareden çekilen 60 μL kan veya 60 μL yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) sırasıyla SAH veya şam koşullarında sarnıç magna içine enjekte edildi. Ertesi gün (D0), homolog bir fareden çekilen 30 μL kan veya 30 μL aCSF sırasıyla SAH veya Sham koşullarında sarnıç magnasına enjekte edildi. Ameliyattan 24 saat sonra fare öldürme ve beyin analizi şekil 1C'degösterildiği gibi paravasküler boşluklara kan dağılımını gözlemlememize izin verilmiştir. D1'den fedakarlığa kadar genel refah için hassas bir gösterge olarak, vücut ağırlığı her gün D1'den D8'e değerlendirildi ve SAH'da D1'den D8'e(Şekil 1D)kadar olan sahte hayvanlarla karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaltılmış vücut ağırlığı artışı görüldü ve bu da uzun süreli bir iyileşme süreci ve SAH sonrası uzun süreli patolojik olaylar alabildi. Ameliyat sonrası mortalite D7'de %26.7 idi ve çoğu hayvan ameliyat sonrası D1 veya D4'te ölüyordu(Şekil 1D). D5'te Hint mürekvitlerinin transkardiyal perfüzyonu Şekil 1C'degösterildiği gibi makroskopik CVS gözlemini sağlamıştır.

SAH sonrası serebral vazospazm
El Amki ve ark.²²tarafından gösterildiği gibi, baziler arter CVS (BA), orta serebral arter (MCA) ve anterior serebral arter (ACA) SAH modelinde d3'ten D10'a kadar d3'ten D10'a kadar çift kan enjeksiyonu ile mevcuttu. Kısaca(Şekil 2A),fare kurban ve kafa kesme den sonra, beyinler hasat edildi ve sonra sabit 4% paraformaldehit (PFA), ve sonra -80 °C dondurulmuş, bir kriyostat kullanılarak 20 μm transversal dilimler halinde dilimlenmiş önce. Hematoksilin ve eozin boyama BA (interaural 0.40 mm; bregma -3.40 mm), MCA (interaural 2.58 mm; bregma -1.22 mm) ve ACA (interaural 4.90 mm; bregma 1.10 mm) için mikroskopa monte li kamera kullanılarak renkli dilimlerin sistematik görüntü edinimi yoluyla CVS tanımlamasına olanak sağlamak amacıyla yapıldı. Makroskopik CVS'nin yokluğunu veya varlığını değerlendirmek için her lekeli arter için lümen alanı/duvar kalınlığı oranı hesaplandı. Düşük oran, daha ciddi CVS olduğunu. Böylece, bir CVS Ba SAH beyinlerinde sahte fare beyinleri ile karşılaştırıldığında oluştu (Şekil 2B) ama aynı zamanda diğer büyük serebral arterlerde (MCA, ACA, veri gösterilmez²²).

SAH sonrası sensitivomotor disfonksiyonlar
El Amki ve ark.²² ve Clavier et al.²³tarafından bu SAH modelinde iyi tanımlanmış olan belirli motor açıklarının ölçümü, bu SAH ile ilişkili uzun vadeli etkileri düzenleyen spesifik terapötik hedefleri test etmek için sonucun ana değerlendirme kriteri olarak düşünülebilir. Kısaca(Şekil 3A), Ameliyat sonrası D6'da her fare açık alan testinde 10 dakika değerlendirildi. ANY-labirent yazılım sürümü 4.99 sayesinde, mesafe ve yetiştirme ve eğilme sayısı kaplı kaydedildi. Açık alan testinden 24 saat sonra, her fare, bir cihaz alışma döneminden sonra, toplam yürüme süresinin ölçülmesini, platforma ulaşma süresini ve yolculuk sayısını içeren ışın yürüyüş testinin art arda üç seansına katıldı. Sonuçlar üç seans ortalaması olarak ifade edildi. El Amki ve ark.²²tarafından gösterildiği gibi, D10 ameliyat sonrası ışın yürüyüş testi ile değerlendirilen sensitivomotor disfonksiyonlar SAH modelinde mevcut olduğu gösterilmiştir (Şekil 3B). D9'da, açık alan testi ile 10 dakika boyunca değerlendirilen farelerin spontan aktivitesi, çapraz distance ve sahte durumla karşılaştırıldığında dikey aktivite ile saptandığında SAH'den önemli ölçüde etkilenmiştir(Şekil 3C).

Şekil 1. Deneysel tasarım, cerrahi işlem, kan dağılımı, makroskopik vazospazm, vücut ağırlığı ve SAH sonrası mortalite. (A) Bu protokolün deneysel tasarımını gösteren şematik diyagram. D-1 ve D0, sarnıca magna'ya sırasıyla 60 ve 30 μL'lik çift enjeksiyonlu aCSF (Sham) veya kan (SAH) ile ameliyat günlerini temsil eder. D1'den D8'e kadar fareler her gün gözlemlendi ve tartıldı. D1'de beyinler paravasküler boşluklara(C)kan dağılımını gözlemlemek için hasat edildi. D6 ve D7, açık alan ve ışın yürüyüşü testleri de dahil olmak üzere davranışsal analizler için optimize edilmiş zaman penceresi olarak seçilmiştir. D8'de,(C)makroskopik olarak gösterildiği gibi, cvs değerlendirmek için beyin ler örneklenmiştir. (B) Sarnıç magna içine kan enjeksiyonu cerrahi prosedür. Kan homolog bir farenin karotis arterinden toplandı. Hayvan hazırlığı ve stereotaktik çerçeve üzerine kurulumdan sonra arka boyunda ense kesisi yapıldı, arka kaslar ayrıldı ve altta yatan kaslar keserek sarnıktan magna'yı sınırlayan vaskülarize membrana erişim etüdü başladı. Pipet, kan enjeksiyonundan önce sarnıç magna'ya yerleştirildi. (C) SAH'da ameliyattan beş gün sonra Hint mürekbinin transkardiyal perfüzyonundan sonra ameliyattan yirmi dört saat sonra paravasküler alanlara kan dağılımının ve makroskopik CVS'nin Şam durumuna göre çizimi. (D) Şam 'da ameliyat sonrası D-1'den D8'e ve SAH C57Bl/6J (n=15) farelerde ağırlık evrimi. SAH fareler, sahte farelere göre D1'den D8'e vücut ağırlığı kazanma yüzdesinde azalma gösterdi (p<0.01). Birden fazla karşılaştırma testleri için Bonferroni sonrası hoc testi ile ANOVA. Sham (n=10) ve SAH C57Bl/6J (n=15) farelerde ameliyat sonrası sağkalım eğrisi. Veriler Kaplan Meier eğrileri olarak ifade edildi. SAH fareleri d7 ameliyat sonrası sahte farelere göre daha önemli bir mortalite gösterdi (p<0.05). Mantel-Cox testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. SAH sonrası baziler arterde serebral vazospazm analizi ve serebral vazospazmın zaman seyri için deneysel tasarım. (A) CVS nicelleştirme protokolünün deneysel tasarımını gösteren şematik diyagram. %4 PFA ile fiksasyon sonrası, dondurulmuş beyinler jelatin kaplı cam kaydıraklar üzerinde 20 μm transversal dilimler halinde bir kriyostat kullanılarak seri olarak dilimlenmiştir. Hematoksilin ve Eozin (H&E) boyama aca, MCA ve BA taşıyan beyin dilimlerinden yapıldı. Mikrofotoğraflar 200x büyütme de mikroskop monte kamera kullanılarak elde edildi. Lümen alanı ve damar duvar kalınlığı ImageJ kullanılarak basit bir kör yöntemle ölçüldü. (B) SAH sonrası BA CVS zaman ders. D7 post-SAH'da şam ve SAH beyin dilimlerinde BA morfolojisini (lümen alanı ve duvar kalınlığı) gösteren H&E boyamanın temsili mikrofotoğrafları. D3'ten D10'a kadar OLAN BA'da CVS'yi gösteren lümen alan/duvar kalınlığı oranının sayısal histogramları (*, p<0.05). Veriler ortalama ± SEM. n=6/condition olarak ifade edildi. Birden fazla karşılaştırma için Bonferroni sonrası hoc testi ile ANOVA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. SAH sonrası uzun vadeli sensitivomotor açıklarının davranışsal analizi için deneysel tasarım. (A) SAH sonrası davranış analizi protokolünün deneysel tasarımını gösteren şematik diyagram. Kısaca, D6 ameliyat sonrası, farelerin motor aktivite davranışları açık alan testi ile 10 dakika boyunca değerlendirildi, hangi mesafe kapalı ve yetiştirme ve eğilme sayısı kaydedildi. 24 saat dinlenme süresinden sonra farelerin duyarlılık davranışı, yürüme süresi, platforma ulaşma süresi ve yolculuk sayısının kaydedildiği ışın yürüyüş testi ile değerlendirildi. (B) El Amki ve ark.^22:Işın yürüyüş testinde, SAH fareleri D7 (**, p<0.01), D10 (***, p<0.001) ve D14 (*, p<0.05) ve D10'da (**, p<0.05) ve şam farelerle yapılan kontrollere kıyasla daha fazla seyahat sayısı gösterdi. (C) El Amki ve ark.^22:SAH fareleri, D9'daki Şam farelerine göre (*, p < 0,05) ve dikey aktivitenin azaldığını göstermiştir (*, p< 0.01). ANOVA Sidak'ın çoklu karşılaştırma testi izledi. Veriler ortalama ± SEM. n=10-12/condition olarak ifade edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

SAH alanında araştırma yoğunluğu ve son yirmi yıl içinde artan endovasküler ve farmakolojik tedavi seçenekleri gibi terapötik stratejilerin geliştirilmesine rağmen, mortalite hastaneye giriş ilk haftasında yüksek kalır ve aşağıdaki 6 ay içinde yaklaşık% 50 ulaşır^24,25. Sarnıç magna içine homolog arteriyel kan günlük çift enjeksiyon ile bu akım preklinik modeli geçerliliği ve düşük mortalite oranı ile ilişkisi için kabul edilmiştir. Nitekim, SAH kemirgen modelleri arasında, mortalite oranları geniş bir yelpazede bildirilmiştir: 0-16% mortalite tek kan enjeksiyonu ile sarnıç magn^{26,27,28,29,30,31,32,33,34,35}, 10-33% prechiasmatic cister içine kan enjeksiyonu ile mortalite^20,27,3^6,37, 16-66% endovasküler perforasyon ile modelde mortalite³⁸,^{39,40,41,42,43,44,45} ve 0-43% modeli ile çift kan enjeksiyonu ile cisterna magna^34,35,46,^47,,,48. Modeldeki düşük mortalite oranı (farelerin yaşına bağlı olarak %9 veya %27) enjekte edilen kanın zayıf miktarı, enjeksiyonun yavaş süresi ve diğer çift enjeksiyon modellerine göre beyninde lokalize basınçtan kaçınan hayvanın eğilmesi sonucu ortaya çıkabilir. SAH hastalarında, CVS oluşum penceresi klasik d4-D10 kanama sonrası tespit edilir. Ancak, hayvanlarda, başlangıç süresi ve CVS süresi daha az çalışılır ve HSA modelleri arasında değişebilir, muhtemelen deneysel protokoller ve hayvan türlerine bağlı olarak²¹.

Bu bağlamda buradaki model SAH ile ilişkili CVS açısından klinik SAH fizyopatolojisini andırmaktadır. Genel olarak, endovasküler perforasyon modelinde, CVS sıçanlarda 1 saat sonra MCA ve BA oluşur⁴⁰ ve farelerde 3 gün sonra¹⁷. Preşiasmatik sarnıç içine kan enjeksiyonu ile modelde, CVS oluşumu iki arasında gösterilmiştir⁴⁹ ve sekiz gün^{arasında 37} sıçanlarda. Sıçanlarda sarnıç magna içine çift enjeksiyon modelinde, CVS 10 dakika²⁹ ve 3 gün³¹arasında gelişir. Biz çift enjeksiyon ile SAH bir fare modelinde CVS görünümünü kinetik tanımlamak için ilk, ana serebral arterlerde CVS kurulması (ACA, MCA ve BA) 3 günden bu yana ve 10 gün sonrası SAH²²kadar sürdürülmektedir , SAH hastalarında gözlenen ne yakın. Bu son model SAH yetenekli bir model olarak tanımlanabilir, mortalite olmadan yeterince şiddetli, cvs hedefleyen mekanizmaları ve terapötik lerin araştırılmasına izin.

Ancak, bu fare SAH modeli de bazı sınırlar sunabilir. İlk nokta damar duvarı rüptürü eksikliği, muhtemelen kollajenaz kaynaklı SAH modelinde çoğaltılabilir, yıkım yoluyla / kan damarı bazal lamina sindirim⁵⁰. Makroskopik CVS oluşumu gelince, bazı beyin bölgelerinde azaltılmış serebral kan akımı (CBF) sistematik nörolojik sonuç ile ilişkili değildir, bu nedenle CBF SAH bu önerilen modelde değerlendirilmelidir. Çift enjeksiyon bir SAH modelinde Lazer Doppler Flowmetry kullanarak önceki sıçan çalışmaları ilk enjeksiyondan sonra bazal dan% 30-52 CBF akut azalma gösterdi, 2 ila 3 gün sonra taban çizgisine bir dönüş ile enjeksiyon sonrası^51,52,53. Anlaşma olarak, sıçan çift enjeksiyon modellerinde SAH indüksiyon sonra D3 ve 27-44% 33-50% CBF bir azalma gösterilmiştir^54,55. Sarnıç magna içine çift enjeksiyon subaraknoid alan boyunca kan öngörülebilir bir dağıtım sağlar, arka dolaşım etrafında kan pıhtıları özellikle sonuçlanan, ama fizyolojik parametrelerde varyasyonlar tanıtmak olabilir. Intrakranial basınç önlemek için (ICP) omurilik kanalına giren enjekte edilen kan hacmi ile yükselen önlemek için, her ikisi de şaşırtıcı fonksiyonel bozukluklara yol^{açan 56}, beyin omurilik sıvısı eşdeğer bir hacim kaldırmak için seçim yapılabilir, daha önce diğer modellerde yapıldığı gibi^30,51. Buradaki modelde, sahte fareler deneye bağlı olarak aCSF veya fizyolojik %0.9 NaCl'nin eşdeğer hacmini aldı ve bu da iCP'nin yükselmesine yol açtı. Böylece, Cisterna magna modelinde tek kan enjeksiyonunda ICP'nin akut artışı 18 mmHg'den 120 mmHg^27,,48,53'e yükselmesi ile sonuçlanır, 46 ila 107 mmHg^27,,37,49 prechiasmatic sarnıç kan enjeksiyon modeli, ve 27 ila 110 mmHg ^{39,40,53,57,58} endovasküler perforasyon modeli. Buna karşılık, sarnıç magna içine çift kan enjeksiyonu 60 den 67 mmHg^48,,53daha küçük bir ICP artış ile ilişkili ydi. Ayrıca, BOS kaldırma eylemi de ICP değiştirmek ve BOS değiştirmek. Buradaki SAH modelinde, karar kan enjeksiyonundan önce BOS'un çıkarılmaması, hayvan ın kafasını 30°'den kabüreden oluşan bir işlemle ameliyata eşlik etmekti. Amaç, insan SAH fizyopatolojisini taklit etmek için önemli ve gerekli bir adım olan anterior dolaşıma kan dağılımını sağlayarak ICP'yi zayıflatmaktır. SAH hastalarında, ICP keskin bir artış tespit edilir ve geçici bir küresel serebral iskemi ile ilişkili⁵⁹, büyük olasılıkla otoregülasyon ve erken nöronal hücre kaybı sürekli bir bozulma katkıda⁶⁰. Ancak, ilk olay sonrası SAH, erken bir eksternal ventriküler drenaj genellikle ilgili SAH hastalar için kabul edilir, beyin şişmesi ve hidrosefali önlemek için⁶¹. Burada, çift enjeksiyon SAH modeli hastalarda gözlenen ICP bağımlı sonuçları kışkırtmak için ilk kanama olay şiddetli olmayabilir, ama büyük olasılıkla gün sonrası SAH için sürekli ve hafif gelişmiş ICP çoğaltmak.

Buna ek olarak, SAH modelinde başka bir kontrolsüz parametre burada ortalama arteriyel kan basıncı potansiyel varyasyonları oldu (MABP) aşırı hızlı kan enjeksiyon prosedürü tarafından indüklenen²⁷. Nitekim, MABP genellikle akut deneysel SAH sonra serebral perfüzyon basıncı korumak için yükselir ve bundan sonra, taban çizgisine düşer. Buradaki SAH modelinde, bu MABP varyasyonlarını önlemek için düşük oranda kan veya aCSF (~ 10 μL/dk) enjekte ettik. Bu modelde insanlarda gözlenenleri taklit eden nörobiyolojik olaylarla ilgili olarak, daha önce SAH'ın çift kan enjeksiyon modelinin uzun ömürlü CVS, mikrotromboz oluşumu ve serebral beyin hasarına²²neden olduğunu gösterdik. Ancak, CSD'nin SAH ile ilişkili DCI^13'te yer aldığını açıklayan son veriler, çift enjeksiyonun fare modelinde bu tür araştırmaların takibini güçlü bir şekilde desteklemez. Bu, CSD'yi hedefleyen yeni tedavilerin yararlı etkisi konusunda bilimsel atılımlar sağlamalıdır.

Sonuç olarak, sarnıç magna içine tüm arteriyel kan çift enjeksiyon modeli CVS, mikrotromboz, vasküler inflamasyon, nörolojik açıkları ve mortalite oranı da dahil olmak üzere insan SAH fizyopatoloji taklit etmek için kolay bir yol sağlayan bir ustalık modelidir. SAH ilişkili morbi-mortalite tedavisinde yeni terapötik yaklaşımları test etmek için doğrulanmış bir modeli temsil eder.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Biz primacen platformu (Normandie Rouen Üniversitesi, Fransa) görüntüleme ekipmanları ve Bay Arnaud Arabo, Bayan Julie Maucotel ve Bayan Martine Dubois, hayvan konut ve bakım için teşekkür ederiz. Bayan Celeste Nicola'ya protokolün videoya kayd1sına sesini ödünç ettiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Seinari Normandiya olgunlaşma programı, Fondation AVC tarafından FRM, Normandie Rouen Üniversitesi ve Inserm himayesinde desteklenmiştir. Normandiya Bölgesi ve Avrupa Birliği (3R projesi). Avrupa, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (ERDF) ile Normandiya'ya katılıyor.