Dupla injeção direta de sangue na Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnóide

Descrevemos neste protocolo um modelo de rato de hemorragia subaracnóide padronizada (SAH) por uma dupla injeção de sangue total autólogo na cisterna magna. O alto grau de padronização do procedimento de dupla injeção representa um modelo médio-agudo de HAS com relativa segurança em relação à mortalidade.

Entre os derrames, a hemorragia subaracnóide (HAS) consecutiva à ruptura de um aneurisma arterial cerebral representa de 5 a 9%, mas é responsável por cerca de 30% da mortalidade total relacionada ao acidente vascular cerebral com uma morbidade importante em termos de desfecho neurológico. Um vasospasmo cerebral atrasado (CVS) pode ocorrer na maioria das vezes em associação com uma isquemia cerebral retardada. Diferentes modelos animais de HAS estão sendo usados agora, incluindo perfuração endovascular e injeção direta de sangue na cisterna magna ou mesmo na cisterna pré-técnica, cada uma apresentando vantagens e desvantagens distintas. Neste artigo, é apresentado um modelo de rato padronizado de SAH por dupla injeção direta de volumes determinados de sangue total autólogo na cisterna magna. Resumidamente, os camundongos foram pesados e, em seguida, anestesiados pela inalação de isoflurano. Em seguida, o animal foi colocado em posição reclinável em um cobertor aquecido mantendo uma temperatura retal de 37 °C e posicionado em uma estrutura estereotática com uma curva cervical de cerca de 30°. Uma vez no lugar, a ponta de uma micropipette de vidro alongada preenchida com o sangue arterial homólogo retirado da artéria carótida de outro rato da mesma idade e gênero (C57Bl/6J) foi posicionada em um ângulo reto em contato com a membrana atlanto-occipital por meio de um micromanipulador. Em seguida, 60 μL de sangue foi injetado na cisterna magna seguido por uma inclinação de 30° para baixo do animal por 2 minutos. A segunda infusão de 30 μL de sangue na cisterna magna foi realizada 24 h após a primeira. O acompanhamento individual de cada animal é realizado diariamente (avaliação cuidadosa do peso e bem-estar). Este procedimento permite uma distribuição previsível e altamente reprodutível do sangue, provavelmente acompanhada de elevação da pressão intracraniana que pode ser imitada por uma injeção equivalente de um fluido cerebral cerebral artificial (CSF), e representa um modelo agudo a leve de HAS induzindo baixa mortalidade.

A hemorragia subaracnóide (HAS) é responsável por até 5% de todos os casos de AVC e constitui uma patologia relativamente comum com incidência de 7,2 a 9 pacientes por 100.000 por ano, com uma taxa de mortalidade de 20%-60% dependendo do estudo^1,,2,,3. Na fase aguda, a mortalidade é atribuível à gravidade do sangramento, reejamento, vasospasmo cerebral (CVS) e/ou complicações médicas⁴. Nos sobreviventes, a lesão cerebral precoce (EBI) está associada à extensão parêncima da hemorragia e aumento abrupto da pressão intracraniana, o que pode resultar em isquemia cerebral primária⁵ e morte imediata em cerca de 10%-15% dos casos⁶. Após o estágio inicial "agudo" da HAS, o prognóstico depende da ocorrência de isquemia cerebral "secundária" ou retardada (DCI), detectada em quase 40% dos pacientes por tomografia computadorizada cerebral, e em até 80% dos pacientes após ressonância magnética (RM)^7,,8. Além do CVV ocorrer entre 4 a 21 dias após a ruptura do aneurisma na maioria dos pacientes com HAS, o DCI⁹ pode resultar de lesões cerebrais difusas multifatoriais secundárias à formação de microtrombose, perfusão cerebral reduzida, neuroinflamação e depressão de disseminação cortical (DSC)^{10,,11,,12,,13}. Isso afeta 30% dos sobreviventes da HAS e impacta funções cognitivas, incluindo memória visual, memória verbal, tempo de reação e funções executivas, visuosespaciais e linguísticas¹⁴ prejudicando a vida diária¹⁵. As terapias padrão atuais para prevenir cvs e/ou os desfechos cognitivos ruins em pacientes com HAS baseiam-se no bloqueio da sinalização e vasoconstrição de Ca²⁺ usando inibidores do canal Ca²⁺ como Nimodipina. No entanto, ensaios clínicos mais recentes voltados à vasoconstrição revelaram dissociação entre o desfecho neurológico do paciente e a prevenção do CVS¹⁶, sugerindo mecanismos fisiodicos mais complexos envolvidos nas consequências do SAH a longo prazo. Portanto, há uma necessidade médica de maior compreensão do número de eventos patológicos que acompanham a HAS e o desenvolvimento de modelos animais válidos e padronizados para testar intervenções terapêuticas originais.

A ruptura de um aneurisma intracraniano principalmente responsável pela HAS em humanos é provavelmente difícil de imitar em modelos animais pré-clínicos. Atualmente, a ruptura do aneurisma e a situação de HAS podem ser testadas provisoriamente pela perfuração da artéria cerebral média (modelo de punção endovascular) responsável por disfunções cvs e sensitivasmotoras em camundongos^17,18. Devido à falta de qualquer possível controle sobre o aparecimento do sangramento e a difusão de sangue neste modelo, outros métodos foram desenvolvidos em roedores para gerar modelos SAH sem ruptura endovascular. Mais precisamente, consistem na administração direta do sangue arterial no espaço subaracnóide através de uma única ou dupla injeção na cisterna magna¹⁹ ou uma única injeção na cisterna pré-chiasmática²⁰. A principal vantagem desses modelos de camundongos sem ruptura endovascular é a possibilidade de dominar reproduzivelmente o procedimento cirúrgico e a qualidade e quantidade da amostra de sangue injetada. Outra vantagem desse modelo sobre o modelo por perfuração endovascular, em particular, é a preservação do bem-estar geral do animal. Na verdade, esta cirurgia é menos invasiva e tecnicamente menos desafiadora do que a necessária para gerar uma ruptura da parede carótida. Neste último modelo, o animal deve ser entubado e mecanicamente ventilado, enquanto um monofilamento é inserido na artéria carótida externa, e avançado na artéria carótida interna. Isso provavelmente leva a isquemia transitória devido à obstrução da embarcação pelo caminho do fio. Consequentemente, a co-morbidade (estado moribundo, dor importante e morte) associada à cirurgia é menos importante no modelo de dupla injeção em comparação com o modelo de perfuração endovascular. Além de ser um SAH mais consistente, o método de dupla injeção direta cumpre o bem-estar animal em pesquisa e testes (tempo reduzido sob anestesia, dor por interrupção tecidual na cirurgia e angústia) e leva a um número total mínimo de animais utilizados para o estudo do protocolo e treinamento de pessoal.

Além disso, isso permite a implementação do mesmo protocolo para camundongos transgênicos, levando a uma compreensão patológica otimizada da HAS e à possibilidade de testes comparativos de potenciais compostos terapêuticos. Aqui, apresentamos um modelo de rato padronizado de hemorragia subaracnóide (SAH) por uma dupla injeção diária consecutiva de sangue arterial autólogo na cisterna magna em camundongos C57Bl/6J masculinos de 6-8 semanas de idade. A principal vantagem deste modelo é o controle do volume sanguíneo em comparação com o modelo de perfuração endovascular, e o reforço do evento sanguíneo sem um aumento drástico da pressão intracraniana²¹. Recentemente, a dupla injeção direta de sangue na cisterna magna foi bem descrita sobre as questões experimentais e fisiopatológicas em camundongos. De fato, recentemente demonstramos CVS de grandes artérias cerebrais (basilar (BA), média (MCA) e artérias cerebrais anteriores (ACA), deposição de fibrina cerebrovascular e apoptose celular do dia 3 (D3) a 10 (D10), defeitos de circulação do fluido cefalorraquidiano paravascular acompanhado de alterações sensitivas motoras e funções cognitivas em camundongos, 10 dias pós-SAH neste modelo²². Assim, torna este modelo dominado, validado e caracterizado para eventos de curto prazo e duradouros pós-SAH. Deve ser idealmente adequado para a identificação prospectiva de novas metas e para estudos sobre estratégias terapêuticas potentes e eficientes contra complicações associadas à HAS.

Todos os procedimentos foram realizados sob a supervisão de H. Castel, de acordo com o Comitê de Ética francês e as diretrizes da Diretiva do Parlamento Europeu 2010/63/UE e do Conselho para a Proteção dos Animais Utilizados para Fins Científicos. Este projeto foi aprovado pelo CENOMEXA local e pelos comitês nacionais de ética em pesquisa e testes em animais. Os camundongos C57Bl/6J Rj masculinos (Janvier), com idade entre 8 e 12 semanas, foram alojados sob condições ambientais padrão controladas: 22 °C ± 1 °C, 12 horas/12 horas de ciclo claro/escuro e água e alimentos disponíveis ad libitum.

1. Configuração da cirurgia SAH e preparação para injeção

1. Antes do início da cirurgia, puxe um número adequado de capilares de vidro usando um puxador de micropipette. A pipeta de injeção deve apresentar um diâmetro interno de 0,86 mm e diâmetro externo de 1,5 mm.
2. Prepare o fluido cerebrospinal artificial (aCSF) para a condição falsa.
   1. Prepare uma solução com 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 1,3 mM MgCl_2,10 mM de glicose, 26,2 mM NaHCO₃ em H₂O, pH 7.4.
   2. Gás aCSF com 95% O₂ e 5% CO₂ por 15 min, e depois adicionar 2,5 mM CaCl₂.
   3. Esterilize o aCSF oxigenado com um aparelho de filtro de 0,22 μm. A solução aCSF pode ser estável por 3-4 semanas a 4 °C. Se a contaminação (solução ficar nublada) ou uma formação de depósito tiver aparecido, descarte e faça aCSF fresco.
3. Coleta de sangue de um doador de rato homólogo
   1. Isole a artéria carótida ao longo da traqueia e colete a quantidade máxima de sangue por punção da artéria carótida.
   2. Na prática, coloque o rato em uma câmara de anestesia e carregue a câmara com 5% de isoflurane até que o animal perca a consciência.
   3. Verifique a falta de reflexos fixando um dos dois membros posteriores para permitir a configuração do procedimento experimental cirúrgico.
   4. Cubra uma seringa de 1 mL com uma solução de heparina usando uma agulha de 26 G (sódio heparina). Isso evitará a coagulação sanguínea durante os próximos passos.
   5. Instale o animal posicionado em decúbito dorsal com pernas separadas, e o nariz em uma máscara de anestesia (manutenção da anestesia com isoflurane de 2 a 2,5%).
   6. Isole a artéria carótida ao longo da traqueia dissecando o músculo omomóide longitudinalmente. Uma vez isolada a artéria, insira a agulha em direção ao coração com a ajuda do gancho de microdisscção e fórceps e colete o máximo de sangue através da punção da artéria carótida (60 μL é necessário por rato SAH).
   7. Sacrifique o rato doador anestesiado imediatamente após a coleta de sangue usando luxação cervical.

2. Preparação animal (8-10-week-week-old C57BL/6J machos) preparação

1. Pesar cada mouse precisamente usando um equilíbrio eletrônico. No presente estudo, os camundongos teriam peso corporal na faixa de 20 a 25 gramas pouco antes da cirurgia.
2. Como explicado anteriormente (ver etapas 1.3.2 e 1.3.3), induzir anestesia de camundongos a serem operados.
3. Raspe o pescoço e o espaço entre as orelhas com um cortador elétrico adequado.
4. Instale o animal posicionado em decúbito ventral com pernas separadas e o nariz em uma máscara de anestesia (manutenção de anestesia com isoflurane de 2 e 2,5%) em um quadro estereotático.
5. Verifique se o rato está dormindo e que sua cabeça está devidamente bloqueada.
6. Injete subcutâneamente 100 μL de buprenorfina (0,1 mg/kg) com uma agulha de 26 G na parte inferior das costas, para evitar dor após o despertar.
7. Evite os olhos secos usando gel líquido protetor e mantenha uma temperatura intraretal de 37 °C usando uma manta elétrica autorregulada.
8. Trate a área posterior raspada do pescoço com uma solução antisséptica (povidone-iodo ou clorexidina usando uma estrada de algodão estéril).
9. Pré-esterilizar todos os instrumentos que toquem a pele preparada/tecido subcutâneo (aquecimento a 200 °C por 2 horas) e manuseie asepticamente.

3. Indução sah

1. No primeiro dia (D-1)
   1. Corte uma incisão de 1 cm com uma tesoura fina no pescoço posterior, seguida pela separação dos músculos ao longo da linha média para acessar a cisterna magna.
   2. Corte a ponta da pipeta de vidro vazia com uma tesoura fina. Em seguida, adapte-se a uma seringa conectada a um conector flexível de silicone.
   3. Transfira 60 μL de sangue ou aCSF (para condição SAH ou sham, respectivamente) em um tubo de 0,5 mL usando uma micropipette de precisão.
   4. Suge para dentro da pipeta de vidro os 60 μL de sangue para a condição SAH ou 60 μL de aCSF para a condição falsa.
   5. Para injeção, instale a pipeta no quadro estereotático usando um anel ou aderência azul e leve lentamente a ponta da pipeta para a membrana na interface com a cisterna magna.
   6. Insira lentamente a ponta da pipeta através da membrana atlanto-occipital na cisterna magna, usando um micro-manipulador do quadro estereotático.
   7. Conecte a pipeta previamente preenchida com sangue ou aCSF à seringa pronta para indução de pressão.
   8. Injete pressionando o êmbolo a uma taxa baixa em torno de 10 μL/min, para evitar pressão intracraniana aguda.
   9. Durante a injeção, monitore de perto a taxa respiratória e a temperatura retal.
   10. No final da injeção, retire cuidadosamente a pipeta através do micromutor e certifique-se visualmente de que não há vazamento durante a retirada.
   11. Alcance hemostasia usando um hemostat absorvível e execute duas suturas com fio de sutura trançado não absorvível.
   12. Imediatamente após a cirurgia, isole e posicione o rato em decúbito de declínio e cubra-o com um cobertor de sobrevivência em uma caixa aberta durante a recuperação.
2. Segundo dia de indução (D0)
   1. Após 24 horas, induza anestesia (ver passos 1.3.2 e 1.3.3). Injete subcutâneamente 100 μL de buprenorfina novamente (0,1 mg/kg) e evite olhos secos usando gel líquido protetor (ver passos 2.7 e 2.8).
   2. Instale o animal no quadro estereotático como no dia anterior.
   3. Remova cuidadosamente as suturas com microscisores.
   4. Prepare a membrana atlanto-occipital como antes e aplique preparação antisséptica na área raspada do pescoço com uma vara de algodão estéril.
   5. Injete 30 μL de sangue ou aCSF a uma taxa baixa (ver passos 3.1.2 a 3.1.8). Monitore a taxa respiratória e a temperatura retal.
   6. No final da injeção, retire cuidadosamente a pipeta e controle a ausência de vazamento de sangue durante a retirada.
   7. Alcance hemostasia e execute duas suturas com fio de sutura absorvível trançado.

4. Acompanhamento pós-operatório e fim do experimento

1. Imediatamente após a cirurgia, isole e posicione o rato em decúbito de declínio com um cobertor de sobrevivência nas costas em uma caixa aberta durante a recuperação.
2. Pesar e observar cuidadosamente diariamente o comportamento de cada rato até o sacrifício (por exemplo, D7 pós-cirurgia).
3. Entre os pontos finais humanos, uma perda significativa de peso (>15% do peso) é notada clássicamente. Uma postura "curvada para trás", movimentos lentos, prostração, vocalizações anormais de dor e/ou comportamento agressivo significativo também são sinais importantes de sofrimento animal. Se algum desses sinais ou uma combinação de sinais aparecer, o monitoramento do animal é reforçado poucas horas após sua aparência. Se o bem-estar do animal piorar ou não melhorar dentro de 48 horas, será considerado que um nível de sofrimento intolerável é atingido, e a eutanásia é realizada.
4. No momento da escolha, sacrificar camundongos anestesiados por decapitação, e colher cérebros para novas análises.
5. Realizar eutanásia (decapitação) após anestesia isoflurane (5%).

Cronograma experimental, procedimento, acompanhamento e mortalidade
Figura 1A e Figura 1B resumem o protocolo modelo SAH por dupla injeção intracisternal de sangue. Resumidamente, no primeiro dia de indução sah (D-1), 60 μL de sangue retirado de um rato homólogo ou 60 μL de fluido cerebrospinal artificial (aCSF) foram injetados na cisterna magna em condições SAH ou falsas, respectivamente. No dia seguinte (D0), 30 μL de sangue retirado de um rato homólogo ou 30 μL de aCSF foram injetados na cisterna magna em condições SAH ou Sham, respectivamente. Vinte e quatro horas após a cirurgia, a matança de camundongos e a análise cerebral permitiram observar a distribuição de sangue nos espaços paravasculares, conforme ilustrado na Figura 1C. Como um indicador sensível para o bem-estar geral de D1 para sacrifício, o peso corporal foi avaliado diariamente do D1 para D8 e mostrou uma significativa redução do ganho de peso corporal na HAS em comparação com animais falsos de D1 para D8 (Figura 1D),sugerindo um processo de recuperação de longa duração e eventos patológicos prolongados pós-SAH. A mortalidade pós-operatória foi de 26,7% na D7, com a maioria dos animais morrendo em D1 ou D4 após a cirurgia(Figura 1D). A perfusão transcárrica da tinta indiana em D5 possibilitou a observação do CVS macroscópico como ilustrado na Figura 1C.

Vasospasmo cerebral após SAH
Como mostrado por El Amki et al.²², CVS da artéria basilar (BA), artéria cerebral média (MCA) e artéria cerebral anterior (ACA) estiveram presentes no modelo SAH por dupla injeção intracisternal de sangue em ACA, MCA ou BA de D3 a D10 pós-cirurgia. Brevemente(Figura 2A), após sacrifício e decapitação do rato, os cérebros foram colhidos e pós-fixados em 4% de paraformaldeído (PFA), e depois congelados a -80 °C, antes de serem fatiados em fatias transversais de 20 μm usando um criostat. Foi realizada coloração de hematoxilina e eosina para BA (0,40 mm interaural; bregma -3,40 mm), MCA (interaural 2,58 mm; bregma -1,22 mm) e ACA (interaural 4,90 mm; bregma 1,10 mm) para permitir a identificação do CVS através da aquisição sistemática de imagens de fatias coloridas usando uma câmera montada em microscópio. Para avaliar a ausência ou a presença de CVS macroscópico, calculou-se a razão de espessura da área de lúmen/parede para cada artéria manchada. Quanto menor é a razão, mais grave é o CVS. Assim, ocorreu um CVS na BA em cérebros SAH comparados com cérebros de camundongos falsos(Figura 2B), mas também em outras grandes artérias cerebrais (MCA, ACA, dados não mostrados²²).

Disfunções sensitivasmotoras após a SAH
A medição de déficits motores específicos, bem descrita neste modelo SAH por El Amki et al.²² e Clavier et al.^23,pode ser considerada como um principal critério de avaliação do resultado para testar metas terapêuticas específicas que regulam esses efeitos associados à SAH a longo prazo. Resumidamente(Figura 3A), na D6 pós-cirurgia, cada rato foi avaliado no teste de campo aberto por 10 minutos. Por meio da versão 4.99 do software ANY-maze, foram registradas as distâncias cobertas e o número de criação e inclinação. Vinte e quatro horas após o teste de campo aberto, cada rato participou de três sessões sucessivas do teste de caminhada do feixe envolvendo, após um período de habituação do dispositivo, a medição do tempo total de caminhada, o tempo para chegar à plataforma e o número de viagens. Os resultados foram expressos como uma média de três sessões. Como mostrado por El Amki et al.²², as disfunções sensitivasmotoras avaliadas pelo teste de caminhada do feixe na D10 pós-cirurgia mostraram-se presentes no modelo SAH (Figura 3B). Na D9, a atividade espontânea dos camundongos avaliada pelo teste de campo aberto durante 10 minutos, também foi significativamente afetada pela HAS detectada pela distância cruzada e pela atividade vertical em comparação com a condição falsa(Figura 3C).

Figura 1. Desenho experimental, procedimento cirúrgico, distribuição sanguínea, vasospasmo macroscópico, peso corporal e mortalidade após a HAS. (A) Diagrama esquemático mostrando o desenho experimental deste protocolo. D-1 e D0 representam os dias de cirurgia com uma dupla injeção de 60 e 30 μL de aCSF (Sham) ou sangue (SAH) na cisterna magna, respectivamente. De D1 a D8, os camundongos eram observados diariamente e pesados. Na D1, os cérebros foram colhidos para observar a distribuição sanguínea em espaços paravasculares(C). O D6 e o D7 foram escolhidos como janela de tempo otimizada para análises comportamentais, incluindo testes de campo aberto e caminhada de feixe. Na D8, foram amostrados cérebros para avaliação do CVS, como mostrado macroscopicamente em (C). (B) Procedimento cirúrgico de injeção de sangue na cisterna magna. O sangue foi coletado da artéria carótida de um rato homólogo. Após a preparação e instalação animal em quadro estereotático, uma incisão de nuca foi realizada no pescoço posterior, os músculos posteriores foram separados, e então os músculos subjacentes foram dissecados para abrir um acesso à membrana vascularizada delimitando a cisterna magna. A pipeta foi inserida na cisterna magna antes da injeção de sangue. (C) Ilustração da distribuição sanguínea em espaços paravasculares vinte e quatro horas após a cirurgia e de CVS macroscópico após perfusão transcártrica de tinta indiana cinco dias após a cirurgia em SAH em comparação com a condição de Sham. (D) Evolução do peso de D-1 para D8 pós-cirurgia em camundongos Sham (n=10) e SAH C57Bl/6J (n=15). Os camundongos SAH apresentaram uma diminuição no percentual de ganho de peso corporal de D1 para D8 em comparação com os camundongos falsos (p<0,01). ANOVA com o teste pós-hoc da Bonferroni para múltiplos testes de comparação. Curva de sobrevivência após cirurgia em camundongos sham (n=10) e SAH C57Bl/6J (n=15). Os dados foram expressos como curvas de Kaplan Meier. Os camundongos SAH apresentaram uma mortalidade mais importante na pós-cirurgia D7 em comparação com camundongos falsos (p<0,05). Teste de Mantel-Cox. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Design experimental para análise de vasospasmo cerebral e curso de tempo de vasospasmo cerebral na artéria basilar após SAH. (A) Diagrama esquemático mostrando o desenho experimental do protocolo para quantificação cvs. Após a fixação por 4% de PFA, cérebros congelados foram fatiados em série usando um criostat em fatias transversais de 20 μm em lâminas de vidro revestidas de gelatina. A coloração de hematoxilina e eosina (H&E) foi realizada a partir de fatias cerebrais com ACA, MCA e BA. Microfotografias foram adquiridas usando uma câmera montada em microscópio a uma ampliação de 200x. A área de lúmen e a espessura da parede do vaso foram quantificadas usando ImageJ por um método simples cego. (B) Curso de tempo de CVS na BA após SAH. Microfotografias representativas da coloração de H&E mostrando morfologia BA (área de lúmen e espessura da parede) em fatias cerebrais sham e SAH em D7 pós-SAH. Histogramas de quantificação da relação de espessura da área de lúmen/parede mostrando CVS na BA de D3 a D10 pós-cirurgia (*, p<0,05). Os dados foram expressos como média ± SEM. n=6/condição. ANOVA com o teste pós-hoc da Bonferroni para múltiplas comparações. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Projeto experimental para análise comportamental de déficits de motores de longo prazo após a SAH. (A) Diagrama esquemático mostrando o desenho experimental do protocolo de análise comportamental após a SAH. Resumidamente, na D6 pós-cirurgia, o comportamento de atividade motora dos camundongos foi avaliado por um teste de campo aberto por 10 minutos, no qual foi registrado a distância coberta e o número de criação e inclinação. Após um período de descanso de 24 horas, o comportamento motor de camundongos foi avaliado pelo teste de caminhada do feixe, no qual o tempo de caminhada, o tempo de caminhada, o tempo para chegar à plataforma e o número de viagens foram registrados. (B) De El Amki et al.²²: No teste de caminhada do feixe, os ratos SAH apresentaram aumento do número de viagens em comparação com os controles em D7 (**, p<0,01), D10 (***, p<0,001) e D14 (*, p<0,05) e com ratos falsos em D10 (*, p<0,05). (C) De El Amki et al.²²: Os camundongos SAH apresentaram uma distância reduzida cruzada (*, p < 0,05) e atividade vertical em comparação com os ratos Sham em D9 (*, p< 0,01). ANOVA seguido pelo teste de múltiplas comparações de Sidak. Os dados foram expressos como média ± SEM. n=10-12/condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Apesar da intensidade da pesquisa no campo da HAS e do desenvolvimento de estratégias terapêuticas como opções de tratamento endovascular e farmacológico aumentando nos últimos vinte anos, a mortalidade permanece elevada na primeira semana de internação hospitalar e atinge cerca de 50% nos 6 meses^{seguintes 24,25}. Este modelo pré-clínico atual por injeção dupla diária de sangue arterial homólogo na cisterna magna tem sido reconhecido por sua validade e sua associação com uma baixa taxa de mortalidade. De fato, entre os modelos de roedores SAH, uma ampla gama de taxas de mortalidade foi relatada: 0-16% mortalidade com injeção de sangue único em cisterna magn^{26,27,28,29,,30,31,32,33,34,35}, 10-33% de mortalidade com injeção de sangue em cister pré-chiasmático^{20,,27,,3 6,37}, 16-66% mortalidade no modelo por perfuração endovascular^{38,39,40,41,,42,43,44,45} e 0-43% com o modelo por dupla injeção de sangue na cisterna magna^{34,,35,,46,,47,,48}. A baixa taxa de mortalidade no modelo (9% ou 27%, dependendo da idade dos camundongos) pode resultar da fraca quantidade de sangue injetado, da duração lenta da injeção e da inclinação do animal evitando a pressão localizada no tronco cerebral, em comparação com outros modelos de dupla injeção. Em pacientes com HAS, a janela de ocorrência de CVS é classicamente detectada em D4-D10 pós-hemorragia. No entanto, nos animais, o tempo de início e a duração do CVS são menos estudados e podem variar entre os modelos de HSA, provavelmente dependendo de protocolos experimentais e espécies animais²¹.

Nesse contexto, o modelo aqui se assemelha à fisiopatologia clínica sah em termos de CVS associado à SAH. Em geral, no modelo de perfuração endovascular, o CVS ocorre no MCA e BA após 1 hora em ratos⁴⁰ e após 3 dias em camundongos¹⁷. No modelo por injeção de sangue em cisterna pré-diplomática, a ocorrência de CVS foi mostrada entre dois⁴⁹ e oito dias³⁷ em ratos. No modelo de dupla injeção em cisterna magna em ratos, cvs desenvolve entre 10 minutos²⁹ e 3 dias³¹. Somos os primeiros a descrever cinéticas de aparecimento de CVS em um modelo de camundongos de SAH por dupla injeção, estabelecendo CVS nas principais artérias cerebrais (ACA, MCA e BA) desde 3 dias e sendo sustentado até o 10º dia pós-SAH²², próximo ao que é observado em pacientes com HAS. Este último modelo poderia ser definido como um modelo qualificado de HAS, severo o suficiente sem mortalidade, permitindo a investigação de mecanismos e terapêuticas voltadas para CVS.

No entanto, este modelo SAH do mouse também pode apresentar alguns limites. O primeiro ponto é a falta de ruptura da parede do vaso, como possivelmente reproduzido no modelo SAH induzido pela colagem, através da destruição/digestão do vaso sanguíneo basal lamina⁵⁰. Quanto à ocorrência de CVS macroscópico, a redução do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) em alguns territórios cerebrais não está sistematicamente correlacionada com o desfecho neurológico, portanto, a CBF deve ser avaliada neste modelo proposto de HAS. Estudos anteriores de ratos usando Laser Doppler Flowmetry em um modelo SAH de dupla injeção demonstraram a redução aguda da CBF para 30-52% da linha de base após a primeira injeção, com um retorno à linha de base após 2 a 3 dias após a injeção^51,52,53. De acordo, foi demonstrado pela Ressonância Magnética uma redução da CBF de 33-50% na D3 e de 27-44% na D5 após a indução da SAH nos modelos de dupla injeção de rato^54,55. A dupla injeção na cisterna magna permite uma distribuição previsível de sangue ao longo do espaço subaracnóide, resultando especialmente em coágulos sanguíneos ao redor da circulação posterior, mas pode introduzir variações nos parâmetros fisiológicos. Para evitar que a pressão intracraniana (ICP) aumente com o volume de sangue injetado entrando no canal espinhal, ambos levando a prejuízos funcionais^56,poderia ser feita a escolha de remover um volume equivalente de fluido cefalorraquidiano, como feito anteriormente em outros modelos^30,51. No modelo aqui, os camundongos falsos receberam um volume equivalente de aCSF ou naCl fisiológico de 0,9%, dependendo do experimento, obviamente levando a um aumento da ICP. Assim, um aumento agudo da ICP resulta em um aumento de 18 mmHg para 120 mmHg^27,48,53 na única injeção de sangue no modelo cisterna magna, de 46 a 107 mmHg^27,37,49 no modelo de injeção de sangue cisterna pré-estesmática, e de 27 a 110 mmHg ^{39,,40,,53,,57,58} no modelo de perfuração endovascular. Em contraste, a injeção dupla de sangue na cisterna magna foi associada a um aumento menor da ICP de 60 para 67 mmHg^48,53. Além disso, a ação de remoção do CSF também alteraria a ICP e modificaria a CSF. No modelo SAH aqui, a decisão foi não remover O CSF antes da injeção de sangue, mas acompanhar a cirurgia por um procedimento que consiste em tirar a cabeça do animal a partir de 30°. O objetivo é atenuar a ICP permitindo a distribuição sanguínea na circulação anterior, um passo importante e necessário para imitar a fisiopatologia humana sah. Em pacientes com HAS, detecta-se um aumento acentuado da ICP e está associado a uma isquemia cerebral global transitória⁵⁹, provavelmente contribuindo para um comprometimento sustentado da autoregulação e perda precoce de células neuronais⁶⁰. No entanto, após o primeiro evento pós-SAH, uma drenagem ventricular externa precoce é frequentemente adotada para pacientes com HAS preocupados, para evitar inchaço cerebral e hidrocefalia⁶¹. Aqui, o modelo SAH de dupla injeção pode não ser grave no primeiro evento de sangramento para provocar as consequências dependentes da ICP observadas em pacientes, mas provavelmente reproduzir uma ICP sustentada e leve melhorada por dias pós-SAH.

Além disso, outro parâmetro descontrolado no modelo SAH aqui foram as variações potenciais da pressão arterial média (MABP) induzidas pelo procedimento de injeção sanguínea excessivamente rápido²⁷. De fato, o MABP normalmente sobe agudamente após a HAS experimental para preservar a pressão da perfusão cerebral e, posteriormente, cai para a linha de base. No modelo SAH aqui, injetamos sangue ou aCSF (~ 10 μL/min) a uma taxa baixa para evitar essas variações de MABP. Em relação aos eventos neurobiológicos neste modelo que imitam os observados em humanos, mostramos anteriormente que o modelo de injeção dupla de sangue de SAH induz CVS de longa duração, formação de microtrombose e dano cerebral cerebral, incluindo defeito em difusão paravascular potencial do dia 3 ao dia 10 pós-SAH²². No entanto, dados recentes descrevendo que o CSD está envolvido no DCI¹³ associado à SAH apoiam fortemente a busca desse tipo de investigações no modelo de mouse de dupla injeção. Isso deve permitir avanços científicos sobre o impacto benéfico de novas terapias voltadas para o CSD.

Para concluir, o modelo de dupla injeção de sangue arterial inteiro na cisterna magna é um modelo dominado que permite uma maneira fácil de imitar a fisiopatologia humana sah, incluindo CVS, microtrombose, inflamação vascular, déficits neurológicos e taxa de mortalidade. Representa um modelo validado para testar novas abordagens terapêuticas para tratar a morbi-mortalidade associada à SAH.

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecemos à plataforma PRIMACEN (Universidade Normandie Rouen, França) pelos equipamentos de imagem e ao Sr. Arnaud Arabo, à Sra. Julie Maucotel e à Sra. Martine Dubois, pela moradia e cuidado com animais. Agradecemos à Sra. Celeste Nicola por emprestar sua voz ao vídeo do protocolo. Este trabalho foi apoiado pelo programa de maturação da Normandia Seinari, Fondation AVC sob a égide da FRM, Normandie Rouen University e Inserm. A Região da Normandia e a União Europeia (projeto 3R). A Europa se envolve na Normandia com o Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (ERDF).