双直接注射血液到西斯特纳麦格作为苏巴拉奇内德出血的模型

我们在该协议中描述了一个标准化的亚巴纳内出血 （SAH） 小鼠模型，通过双注射自体全血到 cisterna 磁石。双注射程序高度标准化，代表了在死亡率方面相对安全性的SAH中急性模型。

在中风中，继脑动脉动脉瘤破裂的亚拉氏出血（SAH）占5-9%，但占总中风相关死亡率的30%左右，在神经结果方面具有重要的发病率。延迟脑血管痉血 （CVS） 可能最常见的发生与延迟脑缺血有关。SAH的不同动物模型正在被使用，包括血管内穿孔和直接注射血液到西斯特纳磁石，甚至前三体蓄水池，每个都表现出明显的优缺点。本文通过双直接注射确定量的自体全血进入西斯特纳磁石，提出了SAH的标准化小鼠模型。简单地说，小鼠被称重，然后通过吸入异氟兰麻醉。然后，动物被放置在加热毯子的倾斜位置，保持37°C的直肠温度，并放置在一个立体教学框架与宫颈弯曲约30°。一旦到位，一个拉长的玻璃微管的尖端充满了同源动脉血从另一个相同年龄和性别的小鼠动脉（C57Bl/6J）的同位素动脉通过微气器与亚特兰托-腹膜接触的直角。然后将60μL的血液注射到西斯特纳磁石中，然后动物向下倾斜2分钟。第二次输液30μL的血液到西斯特纳磁石后24小时进行第一次。每天对每只动物进行个体随从（仔细评估体重和健康）。这个程序允许血液的可预测和高度可重复的分布，可能伴随着颅内压力升高，可以通过人工脑脊髓液（CSF）的等效注射来模拟，并代表SAH诱导低死亡率的急性至轻度模型。

苏巴拉奇内出血（SAH）占所有中风病例的5%，是一种相对常见的病理学，每年每10万人发生7.2至9例患者，死亡率为20%-60%，取决于研究^{1、2、3。,31,}在急性期，死亡率归因于出血、再出血、脑血管痉血症（CVS）和/或医疗并发症^{的严重程度。}在幸存者中，早期脑损伤（EBI）与出血的颅骨延长和颅内压力的突然增加有关，这可能导致原发性脑缺血⁵和直接死亡约10%-15%的^病例6。SAH的初始"急性"阶段后，预后取决于"继发性"或延迟性脑缺血（DCI）的发生，近40%的患者通过脑计算机断层扫描检测，在磁共振成像^{（MRI）7、8,}后的患者中检测到高达^80%。除了大多数SAH患者动脉瘤破裂后4至21天发生的CVS外，DCI⁹可能由多因素扩散性脑损伤继发性到微膜形成、脑灌注减少、神经炎和皮质扩散抑郁症^{（CSD）10、11、12、13,11,12,等引起}。这影响30%的SAH幸存者，并影响认知功能，包括视觉记忆，语言记忆，反应时间，执行，视觉空间和语言功能¹⁴损害日常生活^15。目前的标准疗法，以防止CVS和/或SAH患者的认知结果差是基于^{Ca 2+}信号和血管收缩的阻塞，使用^{Ca 2+}通道抑制剂作为尼莫地平。然而，最近针对血管收缩的临床试验显示，患者的神经学结果与CVS¹⁶的预防分离，表明在SAH长期后果中涉及更复杂的病理生理机制。因此，医学上需要更好地了解伴随 SAH 的病理事件的数量，并开发有效和标准化的动物模型来测试原始治疗干预措施。

在临床前动物模型中，对人中SAH负有主要责任的颅内动脉瘤的破裂可能难以模仿。目前，动脉瘤破裂和SAH情况可以初步测试中脑动脉穿孔负责CVS和敏感运动功能障碍的小鼠^{17，18。17,}由于该模型中对出血的发作和血液扩散缺乏任何可能的控制，啮齿动物已经开发出其他方法，以生成SAH模型，而不会血管内破裂。更确切地说，它们包括通过单注射或双注射到磁石^{cisterna 19}或一次注射到前基亚体蓄水池²⁰中，将动脉血直接注入到亚巴纳空间。这些小鼠模型没有血管内破裂的主要优点是有可能重复掌握外科手术和注射血液样本的质量和数量。与模型的血管内穿孔，该模型的另一个优势是保护动物的一般福祉。事实上，这种手术的侵入性较小，技术上也不像产生卡罗蒂墙破裂所需的那样具有挑战性。在最后的模型中，动物必须插管和机械通风，而单丝插入外部胡萝卜动脉，并先进的内部胡萝卜动脉。这可能导致暂时性缺血，由于血管阻塞的电线路径。因此，与血管穿孔模型相比，与手术相关的共病（死亡状态、重要疼痛和死亡）在双注射模型中不太重要。除了是一个更一致的SAH，双直注射法在研究和测试中符合动物福利（麻醉下的时间减少，手术中组织中断和痛苦造成的疼痛），并导致用于协议研究和人员培训的动物总数最少。

此外，这允许对转基因小鼠实施相同的协议，从而对SAH的病理理解得到优化，并有可能对潜在的治疗化合物进行对比测试。在这里，我们提出了一个标准化的小鼠模型的亚巴奇诺德出血（SAH）通过每天双连续注射自体动脉血到西斯特纳磁石在6-8周大的雄性C57Bl/6J小鼠。与血管穿孔模型相比，该模型的主要优点是控制出血量，在不急剧增加颅内压力的情况下加强出血^事件。最近，在小鼠的实验和生理问题上，对双直接注射血液进行了很好描述。事实上，我们最近展示了大脑动脉（巴西拉（BA），中间（MCA）和前（ACA）脑动脉，脑血管纤维蛋白沉积和细胞凋亡从第3天（D3）到10（D10），前血管脑脊液的循环缺陷伴随着改变的敏感运动和认知功能在小鼠，10天后SAH在这个^模型22。因此，它使该模型掌握，验证和特征的短期和长期事件后SAH。它应该非常适合前瞻性识别新靶点和研究针对SAH相关并发症的有效和高效的治疗策略。

所有程序都是根据法国道德委员会和欧洲议会第2010/63/EU号指令和用于科学目的的动物保护理事会的准则，在H.Castel的监督下进行的。该项目得到了当地CENOMEXA和国家动物研究和测试伦理委员会的批准。雄性 C57Bl/6J Rj 小鼠（Janvier），年龄为 8 至 12 周，在受控标准环境条件下安置:22 °C ± 1 °C，12 小时/12 小时光/暗循环，水和食物可用广告。

1. SAH 手术的设置和注射准备

1. 在手术开始前，使用微管拉拔器拉足够的玻璃毛细管。喷射移液器内径为 0.86 mm，外径为 1.5 mm。
2. 准备人工脑脊液（aCSF）的假情况。
   1. 准备一个溶液与119 mM NaCl， 2.5 mM KCl， 1 mM NaH₂PO_4，1.3 mM MgCl_2，10 mM 葡萄糖， 26.2 mM NaHCO₃ 在 H₂O， pH 7.4.
   2. 气体 ACSF 与 95% O₂ 和 5% CO₂ 15 分钟， 然后添加 2.5 mM CaCl₂.
   3. 使用 0.22 μm 过滤器装置对含氧 aCSF 进行灭菌。aCSF 解决方案在 4 °C 下可稳定 3-4 周。 如果污染（溶液变得浑浊）或沉积形成出现，丢弃并制造新鲜的 aCSF。
3. 从同源小鼠供血者那里收集血液
   1. 沿着气管隔离胡萝卜动脉，通过穿刺心肌动脉收集最大量的血液。
   2. 在实践中，将鼠标放入麻醉室，并加载5%异氟的腔室，直到动物失去知觉。
   3. 通过夹紧两个后肢之一来检查缺乏反射，以便进行手术实验手术。
   4. 使用 26 G 针头（肝素钠）将 1 mL 注射器涂覆与肝素溶液。这将防止血液凝固在下一步。
   5. 将动物定位在腿部分开的底片中，将鼻子安装在麻醉面罩中（麻醉维护与 2 至 2.5% 异氟）。
   6. 通过纵向解剖肌肽肌肉，沿着气管隔离胡萝卜动脉。动脉分离后，借助微分离钩和钳子将针头插入心脏，通过穿刺胡萝卜动脉（每只 SAH 鼠标需要 60 μL）来收集最大血液。
   7. 使用宫颈脱位在采集血液后立即牺牲麻醉的供体小鼠。

2. 动物（8-10周大C57BL/6J雄性小鼠）制剂

1. 使用电子天平精确称重每只鼠标。在目前的研究中，小鼠的体重在手术前的20至25克范围内。
2. 如前所述（参见步骤1.3.2和1.3.3），诱导小鼠麻醉手术。
3. 用合适的电动剪子剃颈和耳朵之间的空间。
4. 将动物定位在腹体，双腿分开，鼻子在麻醉面罩（麻醉维护与2和2.5%等氟兰）的立体定向框架上。
5. 检查鼠标是否正在睡觉，他的头是否被正确挡住。
6. 皮下注射100μL的丁丙诺啡（0.1毫克/千克）与26G针在下背部，以避免觉醒后疼痛。
7. 使用保护性液体凝胶防止眼睛干涩，并使用自动调节的电热毯保持 37°C 的直肠内温度。
8. 使用防腐溶液（使用无菌棉路处理氯己丁或氯己丁）治疗后颈剃光区域。
9. 预消毒所有接触准备好的皮肤/皮下组织（加热至200°C2小时）的仪器，并无菌处理。

3. SAH 感应

1. 第一天 （D-1）
   1. 在后颈部用细剪刀切割一个 1 厘米的切口，然后沿中线分离肌肉以进入 cisterna 磁石。
   2. 用薄剪刀切开空玻璃移液器的尖端。然后，适应连接到柔性硅胶连接器的注射器。
   3. 使用精密微管在 0.5 mL 管中转移 60 μL 的血液或 aCSF（分别用于 SAH 或假情况）。
   4. 吸入玻璃移液器 60 μL 的血液为 SAH 条件或 60 μL 的 aCSF 为假情况。
   5. 对于注射，使用环或蓝钉将移液器安装在立体定向框架上，然后缓慢地将移液器尖端带到与 cisterna 磁格器接口的膜上。
   6. 使用立体定向框架的微操纵器，缓慢地将移液器尖端通过亚特兰托-腹膜插入西斯特纳磁石中。
   7. 将以前充满血液或 ACSF 的移液器连接到准备压力感应的注射器。
   8. 通过按柱塞以10微升/分钟左右的低速进行注射，以避免急性颅内压力。
   9. 注射期间，密切监测呼吸速率和直肠温度。
   10. 在喷射结束时，通过微型操纵器小心地脱下移液器，直观地确保在取款过程中没有泄漏。
   11. 使用可吸收的海莫斯特实现下半管，并运行两个缝合线与编织不可吸收的缝合线。
   12. 手术后，立即分离并定位小鼠，并在恢复期间用活毯盖住它。
2. 上岗第二天 （D0）
   1. 24小时后，诱导麻醉（见步骤1.3.2和1.3.3）。皮下再次注射100μL的丁丙诺啡（0.1毫克/千克），并使用保护性液体凝胶防止干眼（见步骤2.7和2.8）。
   2. 将动物安装到立体声框架上，就像前一天一样。
   3. 用微切口小心地取出缝合线。
   4. 准备亚特兰托-腹膜一如前，并应用防腐剂准备在颈部剃光区域与无菌棉棒。
   5. 以低速率注射30μL的血液或ACF（见步骤3.1.2至3.1.8）。监测呼吸速率和直肠温度。
   6. 注射结束时，小心地脱下移液器，控制抽血过程中无血漏。
   7. 实现吸水，并运行两个缝合线与编织的可吸收缝合线。

4. 术后随从和实验结束

1. 手术后，立即分离和定位小鼠在下降的十二分，在恢复过程中，其背部有一个活体毯。
2. 称重并每天仔细观察每只小鼠的行为，直到牺牲（例如，手术后的 D7）。
3. 在人道的终点中，显著的体重减轻（体重的15%）是经典地注意到的。"驼背"姿势、动作缓慢、畸形、伤害和/或明显攻击性行为的异常发声也是动物遭受痛苦的重要迹象。如果出现这些迹象或迹象的组合，在动物出现后数小时内加强对动物的监测。如果动物的福利在48小时内恶化或没有改善，将被视为达到无法忍受的痛苦程度，并实施安乐死。
4. 在选择的时候，通过斩首来牺牲麻醉小鼠，并收集大脑作进一步分析。
5. 在异氟麻醉（5%）后实施安乐死（斩首）。

实验时间表、程序、随从和死亡率
图 1A 和图 1B 通过双针注射血液来总结 SAH 模型协议。简言之，在SAH诱导（D-1）的第一天，从同源小鼠中抽出的60μL血液或60μL的人工脑脊液（aCSF）分别注射到SAH或假条件下的西斯特纳磁石中。第二天（D0），从同源小鼠中抽出的30μL或30μL的ACSF分别注射到SAH或Sham条件下的西斯特纳磁石中。手术后24小时，老鼠死亡和大脑分析允许观察血液分布到副血管空间，如图 1C所示。作为从D1到牺牲的一般福利的敏感指标，体重每天从D1到D8进行评估，显示SAH的体重比假动物D1到D8（图1D）明显减轻，这表明在SAH后，一个持久的恢复过程和长时间的病理事件。D7的术后死亡率为26.7%，大多数动物在手术后死于D1或D4（图1D）。D5时印度油墨的转液使宏观CVS的观察得以进行，如图 1C所示。

SAH 后脑血管痉血
如 El Amki 等人²²所示，从 D3 到 D10 手术后，在 SAH 模型中存在罗勒动脉 （BA）、中脑动脉 （MCA） 和前脑动脉 （ACA） 的 CVS。简言之（图2A），在老鼠牺牲和斩首后，大脑被收获后固定在4%的半甲醛（PFA），然后在-80°C下冷冻，然后用低温统计器切成20μm的横向切片。对BA（间膜0.40毫米）进行了血氧素和eosin染色; 布雷格玛 -3.40 毫米），MCA（间膜 2.58 毫米;啤酒 -1.22 毫米）和 ACA（间向 4.90 毫米;布雷格玛 1.10 毫米），通过使用显微镜安装的彩色切片图像采集，使 CVS 识别。为了评估宏观CVS的缺失或存在，计算了每个染色动脉的流明面积/壁厚比。比率越低，CVS 越严重。因此，与假老鼠大脑相比，BA中出现CVS，其他大脑动脉Figure 2B（MCA，ACA，数据^{未显示22）。}

SAH 后感性运动功能障碍
El Amki等人22和Clavier^等人在SAH模型中很好地描述了特定运动缺陷^的测量，可以被认为是检验这些SAH相关长期影响的特定治疗指标的主要结果评估标准。简言之（图3A），在D6手术后，每只小鼠在开放场测试中被评估10分钟。通过 ANY-maze 软件版本 4.99，记录了覆盖的距离以及饲养和倾斜的数量。开放现场测试24小时后，每只小鼠连续参加三次光束行走测试，涉及设备习惯期后，测量总行走时间、到达平台的时间和行程次数。结果表示为三届会议的均值。如 El Amki 等人²²所示，D10 手术后光束行走测试评估的敏感运动功能障碍在 SAH 模型中存在（图 3B）。在D9，通过开放场测试评估的小鼠的自发活动在10分钟内，也受到SAH的显著影响，通过跨越的距离和垂直活动与假条件相比检测到（图3C）。

图1。实验设计、外科手术、血液分布、大血管膜、体重和SAH后死亡率。 （A） 显示此协议的实验设计的示意图。D-1 和 D0 表示手术日，分别将 60 和 30 μL 的 aCSF（Sham）或血液 （SAH） 注射到 cisterna 磁格器中。从D1到D8，每天观察和称量小鼠。在D1，大脑被收获，以观察血液分布到准血管空间（C）。D6 和 D7 被选为行为分析（包括开放场和光束行走测试）的优化时间窗口。在D8，对大脑进行采样以评估CVS，如（C）中的宏观所示。（B） 将血液注射到西斯特纳磁石的外科手术。血液是从同源小鼠的胡萝卜动脉中采集的。在立体定向架上进行动物准备和安装后，在后颈部进行尿布切口，分离后侧肌肉，然后解剖底层肌肉，打开血管化膜的通道，以分隔西斯特纳磁石。移液器在血液注射前插入西斯特纳磁石中。（C） 与SAH的情况相比，手术后24小时血液分布到副血管空间，在SAH手术后五天印度墨水的转心灌注后，对大体CVS进行图示。（D） 在 Sham （n=10） 和 SAH C57Bl/6J （n=15） 小鼠中，从 D-1 到 D8 手术后的体重演变。与假小鼠相比，SAH小鼠的体重增加百分比从D1减到D8（p<0.01）。ANOVA 与邦费罗尼的后期测试进行多次比较测试。假 （n=10） 和 SAH C57Bl/6J （n=15） 小鼠手术后的生存曲线。数据表示为卡普兰迈尔曲线。与假小鼠相比，SAH小鼠在D7手术后的死亡率更为重要（p<0.05）。曼特尔-考克斯测试。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2.SAH后巴西动脉脑血管痉西姆分析的实验设计及脑血管痉变的时间过程。（A） 显示CVS量化协议实验设计的示意图.在固定后4%PFA后，冷冻大脑使用低温恒温器连续切成明胶涂层玻璃幻灯片上的20μm横向切片。从带有 ACA、MCA 和 BA 的大脑切片中进行赤氧素和 Eosin （H&E） 染色。微摄影是使用显微镜安装的相机以200倍的放大倍率获得的。使用简单的盲法对流明面积和容器壁厚进行量化。（B） SAH 后在 BA 的 CVS 时间课程。H&E 染色的代表性微照片，在 D7 后 SAH 中显示 BA 形态（流明面积和壁厚）在假和 SAH 脑片中。流明面积/壁厚比的定量直方图显示BA中的CVS从D3到D10手术后（*，p<0.05）。数据表示为均值 = SEM. n=6/条件。ANOVA 与邦费罗尼的后期测试进行多次比较。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3.SAH 后长期敏感运动缺陷行为分析的实验设计。 （A） 显示SAH后行为分析协议的实验设计的示意图。简言之，在D6手术后，通过10分钟的开放场测试评估小鼠的运动活动行为，其中覆盖了距离和饲养和倾斜的数量。经过24小时休息后，通过光束行走测试评估小鼠的感官运动行为，其中记录了行走时间、到达平台的时间和行程次数。（B） 从El Amki^等人22:在光束行走测试中，SAH小鼠与D7（**，p<0.01）、D10（***、p<001）和D14（*，p<0.05）和假小鼠（*，p<0.05）和假老鼠的对数相比，增加了行程次数。（C） 来自El Amki^等人22:SAH小鼠在D9（*，p< 0.01）中，与Sham小鼠相比，交叉距离（*，p< 0.01）的交叉距离和垂直活动减少。ANOVA 之后是西达克的多重比较测试。数据表示为均值 = SEM. n=10-12/条件。 请单击此处查看此图的较大版本。

尽管过去二十年来，SAH领域的研究强度加大，以及血管内和药理治疗方案等治疗策略的发展不断增加，但住院第一周的死亡率仍然很高，在^24、25,年的6个月中达到^约50%。. 这种目前的临床前模型，每天双注射同源动脉血到西斯特纳磁石已被确认为其有效性和与低死亡率的关系。事实上，在SAH啮齿动物模型中， 已报告死亡率范围很广:0-16%死亡率，单次注射到cisterna magn 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、10-33%死亡率，将血液注射到前血学^{,3527,28,29,30,31,32,33,3426,}cister 20、27、3^{20,27,6、,37}、 16-66% 的死亡率在模型内血管穿孔^{38，,39，,40，,41，,42，,43，,44， 45,45}和 0-43% 与模型通过双血注入到 cisterna 磁格^{34，,35，,46，,47，,48.}与其他双注射模型相比，模型中的低死亡率（9%或27%，取决于小鼠的年龄）可因注射的血液量弱、注射时间过长以及动物避免对脑干施加局部压力而倾斜。在 SAH 患者中，CVS 的发生窗口在 D4-D10 出血后被经典地检测到。然而，在动物中，CVS的发病时间和持续时间较少，可能因HSA模型而异，可能取决于实验方案以及^{动物物种21。}

在此上下文中，此处的模型类似于临床 SAH 物理病理学，与 SAH 相关的 CVS。一般来说，在血管内穿孔模型中，CVS发生在MBA和BA后1小时大鼠⁴⁰ 和3天后在小鼠^17。在通过血液注射到前血型蓄水池的模型中，CVS的发生率在大鼠的两^个49 天和8^天37 之间显示。在大鼠双注射到西斯特纳磁石的模型中，CVS在10分钟^29到 3天^{31之间发展}。我们是第一个描述CVS的外观在小鼠模型SAH通过双重注射，建立CVS在主脑动脉（ACA，MCA和BA）自3天，并持续到第10天后SAH^22，接近在SAH患者观察到。这最后一个模型可以定义为SAH的熟练模型，严重到足以不死亡，允许调查针对CVS的机制和治疗。

但是，此鼠标 SAH 模型也可能存在一些限制。第一点是缺乏血管壁破裂，可能重现在胶原酶诱导的SAH模型，通过破坏/消化血管基底层^50。对于宏观CVS的发生，一些脑区脑血流量减少（CBF）与神经结果没有系统相关，因此应在SAH的这一拟议模型中对CBF进行评估。以往在SAH双注射模型中使用激光多普勒流测量仪的大鼠研究表明，CBF急性从第一次注射后基线下降至30-52%，注射后2至3天后返回基线51，52，53。^51,52,53一致地，MRI在大鼠双注射模型54、55中SAH诱导后，D3和D5的CBF减少^{33-50%，D5减少27-44%。,55}双重注射到西斯特纳磁石允许沿着亚巴纳空间的可预测的血液分布，特别是导致血液凝块周围的后循环，但可以引入生理参数的变化。为了避免颅内压力（ICP）随着注射血液进入脊柱管的体积而上升，两者都导致^{功能障碍56，}可以像之前在其他^{模型30、51,51}中那样选择去除等量的脑脊液。根据实验，假老鼠获得相当于ACSF或0.9%的生理0.9%NaCl，这显然导致ICP的上升。因此，ICP 的急性增加导致从 120 mmHg 到 120 mmHg^{27、,48、53}的单次注射 cisterna 磁格器模型中的血液， 从46至107 mmHg^{27，37，49,37,49}在前基脑蓄水池血液注射模式，从27至110毫米汞柱39，40，53，57，58在血管穿孔模型。 ^{39,40,53,57,58}相比之下，双血注射到西斯特纳磁石与较小的ICP增加从60到67毫米汞柱^{48，53。,53}此外，删除CSF的行动也将改变比较方案并修改CSF。在 SAH 模型中，决定不在血液注射前取出 CSF，而是通过从 30° 中将动物头部从 30° 中打高的过程伴随手术。其目的是通过允许血液分配到前循环来减轻ICP，这是模仿人类SAH物理病理学的重要和必要的步骤。在SAH患者中，ICP的急剧上升被检测，并与瞬态全球脑缺血⁵⁹相关，可能促成自动调节和早期神经元细胞丧失^{的持续损伤60。}然而，在SAH后的第一个事件后，一个早期的外部心室排水往往采取有关SAH患者，以避免脑肿胀和脑积^水61。在这里，双注射SAH模型在第一次出血事件中可能并不严重，以引起患者观察到的ICP依赖性后果，但很可能在SAH后几天重现持续和轻度增强的ICP。

此外，SAH模型中另一个不受控制的参数是过度快速的输血程序²⁷引起的平均动脉血压（MABP）的潜在变化。事实上，MABP通常在实验SAH后急性上升，以保持脑灌注压力，之后，下降到基线。在 SAH 模型中，我们以较低的速率注射血液或 aCSF（± 10 μL/min），以避免这些 MABP 变异。关于该模型中与人类观察到的模拟神经生物学事件，我们先前表明，SAH的双血注射模型诱导持久的CVS、微细胞形成和脑脑损伤，包括从SAH²²后第3天到第10天潜在的副血管扩散缺陷。然而，最近的数据描述，CSD参与SAH相关的DCI¹³ 强烈支持在双注射的小鼠模型中进行这种类型的调查。这应能就针对CSD的新疗法的有益影响进行科学突破。

总之，将全动脉血双注入西斯特纳磁石的模型是一个掌握的模型，它允许一种简单的方法来模仿人类SAH物理病理学，包括CVS、微血栓、血管炎症、神经缺陷和死亡率。它代表了一个经过验证的模型，用于测试治疗SAH相关疾病死亡的新治疗方法。

作者没有什么可透露的。

我们感谢PRIMACEN平台（法国诺曼底鲁昂大学）的成像设备，感谢阿诺德·阿拉博先生、朱莉·莫科特尔夫人和马丁·杜布瓦夫人的动物住房和护理。我们感谢塞莱斯特·尼古拉夫人为协议的录像提供她的声音。这项工作得到了塞纳里·诺曼底成熟计划、FRM、诺曼底鲁昂大学和因塞姆赞助。诺曼底地区和欧盟（3R项目）。欧洲与欧洲区域发展基金（ERDF）一起参与诺曼底。