Doble inyección directa de sangre en la Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnoidea

Describimos en este protocolo un modelo estandarizado de hemorragia subaracnoidea (SAH) mediante una doble inyección de sangre entera autóloga en la cisterna magna. El alto grado de estandarización del procedimiento de doble inyección representa un modelo de media a aguda de SAH con relativa seguridad con respecto a la mortalidad.

Entre los accidentes cerebrovasculares, la hemorragia subaracnoidea (HS) consecutiva a la ruptura de un aneurisma arterial cerebral representa 5-9%, pero es responsable de alrededor del 30% de la mortalidad total relacionada con el accidente cerebrovascular con una morbilidad importante en términos de desenlace neurológico. Un vasoespasmo cerebral retrasado (CVS) puede ocurrir con mayor frecuencia en asociación con una isquemia cerebral retrasada. Se están utilizando diferentes modelos animales de SAH, incluyendo perforación endovascular e inyección directa de sangre en la cisterna magna o incluso en la cisterna prequismática, cada una de las que presenta ventajas y desventajas distintas. En este artículo, se presenta un modelo de ratón estandarizado de SAH mediante la inyección directa doble de volúmenes determinados de sangre entera autóloga en la cisterna magna. Brevemente, los ratones fueron pesados y luego anestesiados por inhalación de isoflurano. A continuación, el animal se colocó en una posición reclinable sobre una manta calentada manteniendo una temperatura rectal de 37 oC y se colocó en un marco estereotáctico con una curva cervical de unos 30o. Una vez en su lugar, la punta de una micropipeta de vidrio alargada llena con la sangre arterial homóloga extraída de la arteria carótida de otro ratón de la misma edad y sexo (C57Bl/6J) se posicionó en un ángulo recto en contacto con la membrana atlanto-occipital por medio de un micromaniprulador. Luego se inyectaron 60 l de sangre en la cisterna magna seguida de una inclinación descendente de 30o del animal durante 2 minutos. La segunda perfusión de sangre de 30oL en la cisterna magna se realizó 24 h después de la primera. El seguimiento individual de cada animal se lleva a cabo diariamente (evaluación cuidadosa del peso y el bienestar). Este procedimiento permite una distribución predecible y altamente reproducible de la sangre, probablemente acompañada de una elevación de la presión intracraneal que puede ser imitada por una inyección equivalente de un líquido cefalorraquídeo artificial (CSF), y representa un modelo agudo a leve de SAH que induce la baja mortalidad.

La hemorragia subaracnoidea (SAH) representa hasta el 5% de todos los casos de accidente cerebrovascular y constituye una patología relativamente común con una incidencia de 7,2 a 9 pacientes por cada 100.000 por año, con una tasa de mortalidad del 20%-60% dependiendo del estudio^1,,2,,3. En la fase aguda, la mortalidad es atribuible a la gravedad del sangrado, sangrado, vasoespasmo cerebral (CVS) y/o complicaciones médicas⁴. En los sobrevivientes, la lesión cerebral temprana (EBI) se asocia con la extensión parénquima de la hemorragia y el aumento abrupto de la presión intracraneal, que puede resultar en isquemia cerebral primaria⁵ y la muerte inmediata en aproximadamente 10%-15% de los casos⁶. Después de la etapa inicial "aguda" de la SAH, el pronóstico depende de la aparición de isquemia cerebral "secundaria" o retardada (DCI), detectada en casi el 40% de los pacientes por tomografía computarizada cerebral, y en hasta el 80% de los pacientes después de la resonancia magnética (RM)^7,,8. Además del CVS que ocurre entre 4 y 21 días después de la ruptura del aneurisma en la mayoría de los pacientes con SAH, DCI⁹ puede ser el resultado de lesiones cerebrales difusas multifactoriales secundarias a la formación de microtrombosis, reducción de la perfusión cerebral, neuroinflamación y depresión de propagación cortical (CSD)^10,11,12,13. Esto afecta al 30% de los sobrevivientes de SAH e impacta las funciones cognitivas incluyendo memoria visual, memoria verbal, tiempo de reacción, y funciones ejecutivas, visuospatiales y del lenguaje¹⁴ deteriorando la vida diaria¹⁵. Las terapias estándar actuales para prevenir el CVS y/o los malos resultados cognitivos en pacientes con SAH se basan en el bloqueo de la señalización y vasoconstricción de Ca²⁺ mediante el uso de inhibidores del canal Ca²⁺ como nimodipina. Sin embargo, ensayos clínicos más recientes dirigidos a vasoconstricción revelaron disociación entre el resultado neurológico del paciente y la prevención del CVS^16,lo que sugiere mecanismos fisiopatológicos más complejos implicados en las consecuencias a largo plazo de la SAH. Por lo tanto, existe una necesidad médica de una mayor comprensión del número de eventos patológicos que acompañan a la SAH y el desarrollo de modelos animales válidos y estandarizados para probar las intervenciones terapéuticas originales.

La ruptura de un aneurisma intracraneal mayormente responsable de la SAH en humanos es probablemente difícil de imitar en modelos animales preclínicos. Actualmente, la ruptura del aneurisma y la situación de la SAH se pueden probar tentativamente mediante la perforación de la arteria cerebral media (modelo de punción endovascular) responsable de CVS y disfunciones sensitivomotoras en ratones^17,,18. Debido a la falta de un posible control sobre la aparición del sangrado y la difusión de la sangre en este modelo, se han desarrollado otros métodos en roedores para generar modelos SAH sin ruptura endovascular. Más precisamente, consisten en la administración directa de sangre arterial en el espacio subaracnoideo a través de una inyección única o doble en las cisternas magna¹⁹ o una sola inyección en la cisterna prequismática²⁰. La principal ventaja de estos modelos de ratón sin ruptura endovascular es la posibilidad de dominar reproduciblemente el procedimiento quirúrgico y la calidad y cantidad de la muestra de sangre inyectada. Otra ventaja de este modelo sobre el modelo mediante perforación endovascular en particular es la preservación del bienestar general del animal. De hecho, esta cirugía es menos invasiva y técnicamente menos difícil que la necesaria para generar una ruptura de la pared carótida. En este último modelo, el animal tiene que ser intubado y ventilado mecánicamente, mientras que un monofilamento se inserta en la arteria carótida externa, y avanza en la arteria carótida interna. Esto probablemente conduce a isquemia transitoria debido a la obstrucción del vaso por la trayectoria del alambre. En consecuencia, la comorbilidad (estado moribundo, dolor importante y muerte) asociada con la cirugía es menos importante en el modelo de doble inyección en comparación con el modelo de perforación endovascular. Además de ser un SAH más consistente, el método de inyección directa doble cumple con el bienestar animal en la investigación y las pruebas (tiempo reducido bajo anestesia, dolor por alteración del tejido en la cirugía y angustia) y conduce a un número total mínimo de animales utilizados para el estudio del protocolo y la formación del personal.

Además, esto permite la implementación del mismo protocolo a ratones transgénicos, lo que conduce a una comprensión patológica optimizada de la SAH y la posibilidad de pruebas comparativas de posibles compuestos terapéuticos. Aquí, presentamos un modelo de ratón estandarizado de hemorragia subaracnoidea (SAH) por una doble inyección diaria consecutiva de sangre arterial autóloga en la cisterna magna en ratones C57Bl/6J machos de 6-8 semanas de edad. La principal ventaja de este modelo es el control del volumen de sangrado en comparación con el modelo de perforación endovascular, y el refuerzo del evento de sangrado sin un aumento drástico de la presión intracraneal²¹. Recientemente, la doble inyección directa de sangre en la cisterna magna ha sido bien descrita en los problemas experimentales y fisiopatológicos en ratones. De hecho, recientemente demostramos CVS de grandes arterias cerebrales (basilar (BA), medias (MCA) y arterias cerebrales anteriores (ACA), deposición cerebrovascular de fibrina y apoptosis celular desde el día 3 (D3) hasta 10 (D10), defectos de circulación del líquido cefalorraquídeo paravascular acompañados de alteraciones de las funciones sensitivomotoras y cognitivas en ratones, 10 días después de SAH en este modelo²². Por lo tanto, hace que este modelo dominado, validado y caracterizado para eventos a corto y duradero plazo después de SAH. Debe ser ideal para la identificación prospectiva de nuevas dianas y para estudios sobre estrategias terapéuticas potentes y eficientes contra complicaciones asociadas a la SAH.

Todos los procedimientos se llevaron a cabo bajo la supervisión de H. Castel de conformidad con el Comité ético francés y las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y el Consejo para la Protección de los Animales Utilizados con Fines Científicos. Este proyecto fue aprobado por el CENOMEXA local y los comités éticos nacionales de investigación y pruebas de animales. Los ratones macho c57Bl/6J Rj (Janvier), de 8 a 12 semanas, se alojaron en condiciones ambientales estándar controladas: 22 oC a 1 oC, 12 horas/12 horas de ciclo de luz/oscuridad, y agua y alimentos disponibles ad libitum.

1. Configuración de la cirugía SAH y preparación para la inyección

1. Antes del comienzo de la cirugía, tire de un número adecuado de capilares de vidrio mediante el uso de un tirador de micropipeta. La pipeta de inyección debe presentar un diámetro interior de 0,86 mm y un diámetro exterior de 1,5 mm.
2. Preparar el líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) para la afección falsa.
   1. Preparar una solución con 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH₂PO₄, 1,3 mM MgCl₂, 10 mM de glucosa, 26,2 mM NaHCO₃ en H₂O, pH 7,4.
   2. Gas aCSF con 95% O₂ y 5% CO₂ durante 15 min, y luego añadir 2,5 mM CaCl₂.
   3. Esterilice el aCSF oxigenado con un aparato de filtro de 0,22 m. La solución de aCSF puede ser estable durante 3-4 semanas a 4 oC. Si ha aparecido contaminación (solución turbia) o una formación de depósitos, deseche y haga aCSF fresco.
3. Recolección de sangre de un donante homólogo de ratón
   1. Aísle la arteria carótida a lo largo de la tráquea y recoja la cantidad máxima de sangre mediante punción de la arteria carótida.
   2. En la práctica, coloque el ratón en una cámara de anestesia y cargue la cámara con 5% de isoflurano hasta que el animal pierda el conocimiento.
   3. Compruebe la falta de reflejos sujetando una de las dos extremidades posteriores para permitir el ajuste del procedimiento quirúrgico experimental.
   4. Recubrir una jeringa de 1 ml con una solución de heparina utilizando una aguja de 26 G (heparina sódica). Esto evitará la coagulación de la sangre durante los siguientes pasos.
   5. Instalar el animal posicionado en decúbito dorsal con las piernas separadas, y la nariz en una mascarilla de anestesia (mantenimiento de la anestesia con 2 a 2.5% isoflurano).
   6. Aísle la arteria carótida a lo largo de la tráquea diseccionando el músculo omohioides longitudinalmente. Una vez aislada la arteria, inserte la aguja hacia el corazón con la ayuda del gancho y los fórceps microdissecantes y recoja el máximo de sangre a través de una punción de la arteria carótida (se necesita 60 l por ratón SAH).
   7. Sacrificar el ratón donante anestesiado inmediatamente después de la recolección de sangre mediante el uso de la luxación cervical.

2. Animal (8-10 semanas de edad C57BL/6J ratones macho) preparación

1. Pese cada ratón con precisión utilizando una balanza electrónica. En el estudio actual, ratones tendrían peso corporal dentro del rango de 20 Para 25 gramos justo antes de la cirugía.
2. Como se explicó anteriormente (ver pasos 1.3.2 y 1.3.3), inducir anestesia de ratones a ser operados.
3. Afeitar el cuello y el espacio entre las orejas con un clipper eléctrico adecuado.
4. Instalar el animal posicionado en decúbito ventral con las piernas separadas y la nariz en una mascarilla de anestesia (mantenimiento de anestesia con 2 y 2.5% isoflurano) en un marco estereotáctico.
5. Compruebe que el ratón está durmiendo y que su cabeza está correctamente bloqueada.
6. Inyectar por vía subcutánea 100 ml de buprenorfina (0,1 mg/kg) con una aguja de 26 G en la parte inferior de la espalda, para evitar el dolor después del despertar.
7. Evitar la sequedad de los ojos mediante el uso de gel líquido protector y mantener una temperatura intrarectal de 37 oC mediante el uso de una manta eléctrica autorregulada.
8. Tratar la zona afeitada del cuello posterior con una solución antiséptica (povidona-yodo o clorhexidina mediante el uso de una carretera de algodón estéril).
9. Pre-esterilizar todos los instrumentos que tocan la piel preparada / tejido subcutáneo (calentamiento a 200 oC durante 2 horas) y manejar asépticamente.

3. Inducción de SAH

1. El primer día (D-1)
   1. Cortar una incisión de 1 cm con tijeras delgadas en el cuello posterior, seguido de la separación de los músculos a lo largo de la línea media para acceder a la cisterna magna.
   2. Corte la punta de la pipeta de vidrio vacía con tijeras delgadas. A continuación, adáptese a una jeringa conectada a un conector de silicona flexible.
   3. Transfiera 60 l de sangre o aCSF (para SAH o condición falsa, respectivamente) en un tubo de 0,5 ml utilizando una micropipeta de precisión.
   4. Succionar en la pipeta de vidrio los 60 l de sangre para la condición SAH o 60 l de aCSF para la condición falsa.
   5. Por inyección, instale la pipeta en el marco estereotáctico utilizando un anillo o una tachuela azul y lentamente lleve la punta de la pipeta a la membrana en la interfaz con la cisterna magna.
   6. Inserte lentamente la punta de la pipeta a través de la membrana atlanto-occipital en la cisterna magna, utilizando un micro-manipulador del marco estereotáctico.
   7. Conecte la pipeta previamente llena de sangre o aCSF a la jeringa lista para la inducción de presión.
   8. Inyectar presionando el émbolo a una velocidad baja de alrededor de 10 l/min, para evitar la presión intracraneal aguda.
   9. Durante la inyección, controle de cerca la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal.
   10. Al final de la inyección, retire cuidadosamente la pipeta a través del micromantenador y asegúrese visualmente de que no haya fugas durante la extracción.
   11. Alcanza la hemostasia usando una hemostat absorbible y ejecuta dos suturas con hilo suturante trenzado no absorbible.
   12. Inmediatamente después de la cirugía, aísle y coloque el ratón en declive decubito y cúbralo con una manta de supervivencia en una caja abierta durante la recuperación.
2. Segundo día de inducción (D0)
   1. Después de 24 horas, induzca la anestesia (ver pasos 1.3.2 y 1.3.3). Inyectar de nuevo 100 ml de buprenorfina por vía subcutánea (0,1 mg/kg) y prevenir la sequedad de los ojos mediante el uso de gel líquido protector (ver pasos 2.7 y 2.8).
   2. Instale el animal en el marco estereotáctico como el día anterior.
   3. Retire cuidadosamente las suturas con microscisores.
   4. Preparar la membrana atlanto-occipital como antes y aplicar la preparación antiséptica en la zona afeitada del cuello con una varilla de algodón estéril.
   5. Inyectar 30 l de sangre o aCSF a una velocidad baja (ver pasos 3.1.2 a 3.1.8). Controlar la frecuencia respiratoria y la temperatura rectal.
   6. Al final de la inyección, quite cuidadosamente la pipeta y controle la ausencia de fuga de sangre durante la retirada.
   7. Lograr hemostasis y ejecutar dos suturas con hilo de sutura absorbible trenzado.

4. Seguimiento postoperatorio y final del experimento

1. Inmediatamente después de la cirugía, aísle y coloque el ratón en declive decúbito con una manta de supervivencia en su espalda en una caja abierta durante la recuperación.
2. Pesar y observar cuidadosamente diariamente el comportamiento de cada ratón hasta el sacrificio (por ejemplo, D7 post-cirugía).
3. Entre los puntos finales humanos, una pérdida de peso significativa (>15% del peso) se nota clásicamente. Una postura "encorvada hacia atrás", movimientos lentos, postración, vocalizaciones anormales de dolor y/o comportamiento agresivo significativo también son signos importantes de sufrimiento animal. Si aparece alguno de estos signos o una combinación de signos, el control del animal se refuerza a las pocas horas de su aparición. Si el bienestar del animal empeora o no mejora en 48 horas, se considerará que se alcanza un nivel de sufrimiento intolerable, y se lleva a cabo la eutanasia.
4. En el momento de la elección, sacrificar ratones anestesiados por decapitación, y cosechar cerebros para análisis posteriores.
5. Realizar eutanasia (decapitación) después de la anestesia isoflurano (5%).

Cronología experimental, procedimiento, seguimiento y mortalidad
La Figura 1A y la Figura 1B resumen el protocolo modelo SAH mediante inyección de sangre de doble intracisterna. Brevemente, el primer día de inducción de SAH (D-1), se inyectaron 60 l de sangre retirada de un ratón homólogo o 60 l de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) en la cisterna magna en SAH o en condiciones falsas, respectivamente. Al día siguiente (D0), se inyectaron 30 l de sangre retirada de un ratón homólogo o 30 l de aCSF en la cisterna magna en condiciones de SAH o Sham, respectivamente. Veinticuatro horas después de la cirugía, la matanza de ratones y el análisis cerebral permitieron observar la distribución de la sangre en los espacios paravasculares como se ilustra en la Figura 1C. Como indicador sensible para el bienestar general de D1 para el sacrificio, el peso corporal se evaluó diariamente de la D1 a la D8 y mostró una reducción significativa del aumento de peso corporal en SAH en comparación con los animales falsos de D1 a D8(Figura 1D),lo que sugiere un proceso de recuperación de larga duración y eventos patológicos prolongados después de la SAH. La mortalidad postoperatoria fue del 26,7% en D7, con la mayoría de los animales que murieron en D1 o D4 después de la cirugía(Figura 1D). La perfusión transcardial de tinta india en D5 permitió la observación de CVS macroscópicos como se ilustra en la Figura 1C.

Vasospasmo cerebral después de SAH
Como se muestra en El Amki et al.²², CVS de la arteria basilar (BA), arteria cerebral media (MCA) y arteria cerebral anterior (ACA) estaba presente en el modelo SAH por inyección de sangre de doble intracisterna en ACA, MCA o BA de D3 a D10 después de la cirugía. Brevemente(Figura 2A), después del sacrificio y la decapitación del ratón, los cerebros fueron cosechados y postfirmizados en 4% de paraformaldehído (PFA), y luego congelados a -80 oC, antes de ser cortados en rodajas transversales de 20 m usando un criostato. Se realizó tinción de hematoxilina y eosina para BA (interaural 0,40 mm; bregma -3,40 mm), MCA (interaural 2,58 mm; bregma -1,22 mm) y ACA (interaural 4,90 mm; bregma 1,10 mm) para permitir la identificación cvS mediante la adquisición sistemática de imágenes de rodajas coloreadas mediante el uso de una cámara montada en microscopio. Con el fin de evaluar la ausencia o la presencia de CVS macroscópico, se calculó la relación área de lumen/espesor de la pared para cada arteria teñida. Cuanto menor es la relación, más grave es el CVS. Por lo tanto, un CVS ocurrió en BA en cerebros SAH en comparación con cerebros de ratón falsos (Figura 2B) pero también en otras arterias cerebrales grandes (MCA, ACA, datos no mostrados²²).

Disfunciones sensitivomotoras después de SAH
La medición de los déficits motores específicos, bien descrito en este modelo de SAH por El Amki et al.²² y Clavier et al.²³, puede considerarse como un criterio de evaluación principal del resultado para probar objetivos terapéuticos específicos que regulan estos efectos a largo plazo asociados a la SAH. Brevemente(Figura 3A), en D6 post-cirugía, cada ratón fue evaluado en la prueba de campo abierto durante 10 minutos. Mediante la versión 4.99 del software ANY-maze, se registró la distancia recorrida y el número de crías e inclinaciones. Veinticuatro horas después de la prueba de campo abierto, cada ratón participó en tres sesiones sucesivas de la prueba de marcha de haz que implica, después de un período de habituación del dispositivo, la medición del tiempo total de caminata, el tiempo para llegar a la plataforma y el número de viajes. Los resultados se expresaron como una media de tres sesiones. Como se muestra en El Amki et al.²², se demostró que las disfunciones sensitivomotoras evaluadas por la prueba de marcha del haz en D10 después de la cirugía estaban presentes en el modelo SAH (Figura 3B). En D9, la actividad espontánea de ratones evaluada por la prueba de campo abierto durante 10 minutos, también se vio significativamente afectada por SAH como se detectó por la distancia atravesada y la actividad vertical en comparación con la condición falsa (Figura 3C).

Figura 1. Diseño experimental, procedimiento quirúrgico, distribución sanguínea, vasoespasmo macroscópico, peso corporal y mortalidad después de SAH. (A) Diagrama esquemático que muestra el diseño experimental de este protocolo. D-1 y D0 representan los días de la cirugía con una doble inyección de 60 y 30 l de aCSF (Sham) o sangre (SAH) en la cisterna magna, respectivamente. De D1 a D8, los ratones fueron observados y pesados diariamente. En D1, se cosecharon cerebros para observar la distribución de la sangre en espacios paravasculares(C). El D6 y el D7 fueron elegidos como ventana de tiempo optimizada para análisis de comportamiento, incluyendo pruebas de campo abierto y de marcha de vigas. En D8, los cerebros fueron muestreados para evaluar el CVS, como se muestra macroscópicamente en (C). (B) Procedimiento quirúrgico de inyección de sangre en la cisterna magna. Se recogió sangre de la arteria carótida de un ratón homólogo. Después de la preparación e instalación de animales en el marco estereotáctico, se llevó a cabo una incisión de la nuca posterior, los músculos posteriores se separaron, y luego los músculos subyacentes fueron diseccionados para abrir un acceso a la membrana vascularizada que delimita la cisterna magna. La pipeta se insertó en la cisterna magna antes de la inyección de sangre. (C) Ilustración de la distribución de la sangre en espacios paravasculares veinticuatro horas después de la cirugía y de CVS macroscópico después de la perfusión transcardial de tinta india cinco días después de la cirugía en SAH en comparación con la condición de Sham. (D) Evolución del peso de D-1 a D8 post-cirugía en ratones Sham (n-10) y SAH C57Bl/6J (n-15). Los ratones SAH mostraron una disminución en el porcentaje de aumento de peso corporal de D1 a D8 en comparación con los ratones falsos (p<0.01). ANOVA con la prueba post hoc de Bonferroni para múltiples pruebas de comparación. Curva de supervivencia después de la cirugía en ratones falsos (n-10) y SAH C57Bl/6J (n-15). Los datos se expresaron como curvas De Kaplan Meier. Los ratones SAH mostraron una mortalidad más importante en D7 después de la cirugía en comparación con ratones falsos (p<0.05). Prueba Mantel-Cox. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Diseño experimental para análisis de vasoespasmo cerebral y curso de tiempo de vasoespasmo cerebral en la arteria basilar después de SAH. (A) Diagrama esquemático que muestra el diseño experimental del protocolo para la cuantificación CVS. Después de la post-fijación por 4%PFA, los cerebros congelados fueron cortados en serie usando un criostato en rodajas transversales de 20 m en portaobjetos de vidrio recubiertos de gelatina. La tinción de hematoxilina y eosina (H&E) se realizó a partir de rebanadas cerebrales que llevan ACA, MCA y BA. Las microfotografías se adquirieron utilizando una cámara montada en un microscopio con un aumento de 200x. El área de lumen y el espesor de la pared del recipiente se cuantificaron utilizando ImageJ mediante un método ciego simple. (B) Curso de tiempo de CVS en BA después de SAH. Microfotografías representativas de la tinción de H&E que muestran morfología de BA (área de lumen y espesor de la pared) en rodajas cerebrales falsas y SAH en D7 post-SAH. Histogramas de cuantificación de la relación área de lumen/espesor de pared que muestran CVS en el BA de D3 a D10 después de la cirugía (*, p<0.05). Los datos se expresaron como medias: SEM. n.6/condición. ANOVA con la prueba post hoc de Bonferroni para múltiples comparaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Diseño experimental para el análisis conductual de déficits sensitivomotores a largo plazo después de SAH. (A) Diagrama esquemático que muestra el diseño experimental del protocolo de análisis conductual después de SAH. Brevemente, en D6 después de la cirugía, el comportamiento de la actividad motora de los ratones se evaluó mediante una prueba de campo abierto durante 10 minutos, en la que se registró la distancia cubierta y el número de cría e inclinación. Después de un período de descanso de 24 horas, el comportamiento sensitivomotor de los ratones fue evaluado por la prueba de marcha de la viga, en la que se registró el tiempo de caminata, el tiempo para llegar a la plataforma y el número de viajes. (B) De El Amki et al.²²: En la prueba de caminar haz, los ratones SAH mostraron un mayor número de viajes en comparación con los controles en D7 (**, p<0.01), D10 (***, p<0.001) y D14 (*, p<0.05) y con ratones falsos en D10 (*, p<0.05). (C) De El Amki et al.²²: Los ratones SAH mostraron una distancia reducida cruzada (*, p < 0.05) y actividad vertical en comparación con los ratones Sham en D9 (*, p< 0.01). ANOVA seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Sidak. Los datos se expresaron como medias: SEM. n.o 10-12/condición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

A pesar de la intensidad de la investigación en el campo de la SAH y el desarrollo de estrategias terapéuticas como opciones de tratamiento endovascular y farmacológico que aumentan en los últimos veinte años, la mortalidad sigue siendo alta en la primera semana de ingreso hospitalario y alcanza alrededor del 50% durante los siguientes 6 meses^24,,25.. Este modelo preclínico actual mediante doble inyección diaria de sangre arterial homóloga en las cisternas magna ha sido reconocido por su validez y su asociación con una baja tasa de mortalidad. De hecho, entre los modelos de roedores SAH, se ha notificado una amplia gama de tasas de mortalidad: 0-16% de mortalidad con inyección única en sangre única en cisterna magn^{26,27,28,29,30,31,32,33,34,35}, 10-33% de mortalidad con inyección de sangre en cisterna prequismática^20,27,36,37, 16-66% mortalidad en el modelo por perforación endovascular^{38,39,40,41,42,43,44,45} y 0-43% con el modelo por inyección de sangre doble en cisterna magna^{34,35,46,47,48}. La baja tasa de mortalidad en el modelo (9% o 27%, dependiendo de la edad de los ratones) puede ser el resultado de la cantidad débil de sangre inyectada, la duración lenta de la inyección, y la inclinación del animal evitando la presión localizada sobre el tronco encefásico, en comparación con otros modelos de doble inyección. En pacientes con SAH, la ventana de aparición de CVS se detecta clásicamente en D4-D10 después de la hemorragia. Sin embargo, en los animales, el tiempo de inicio y la duración del CVS son menos estudiados y pueden variar entre los modelos de HSA, probablemente dependiendo de los protocolos experimentales y las especies animales²¹.

En este contexto, el modelo aquí se asemeja a la fisiopatología clínica de SAH en términos de CVS asociado a SAH. En general, en el modelo de perforación endovascular, CVS se produce en el MCA y BA después de 1 hora en ratas⁴⁰ y después de 3 días en ratones¹⁷. En el modelo por inyección de sangre en cisterna prequismática, la ocurrencia de CVS se mostró entre dos⁴⁹ y ocho días³⁷ en ratas. En el modelo de doble inyección en cisterna magna en ratas, CVS se desarrolla entre 10 minutos²⁹ y 3 días^31. Somos los primeros en describir la cinética de la apariencia de CVS en un modelo de ratón de SAH mediante doble inyección, estableciendo CVS en las principales arterias cerebrales (ACA, MCA y BA) desde 3 días y siendo sostenidos hasta el día 10 post-SAH^22,cerca de lo que se observa en pacientes con SAH. Este último modelo podría definirse como un modelo experto de SAH, lo suficientemente severo sin mortalidad, permitiendo la investigación de mecanismos y terapias dirigidas al CVS.

Sin embargo, este modelo SAH del ratón también puede presentar algunos límites. El primer punto es la falta de ruptura de la pared del vaso, como posiblemente se reproduce en el modelo SAH inducido por la colagenasa, a través de la destrucción/digestión de lamina basal del vaso sanguíneo⁵⁰. En cuanto a la aparición de CVS macroscópico, el flujo sanguíneo cerebral reducido (CBF) en algunos territorios cerebrales no se correlaciona sistemáticamente con el resultado neurológico, por lo que la CBF debe evaluarse en este modelo propuesto de SAH. Estudios previos de ratas con Laser Doppler Flowmetry en un modelo SAH de doble inyección demostraron la disminución aguda de CBF a 30–52% desde el inicio después de la primera inyección, con un retorno al valor basal después de 2 a 3 días después de la inyección^51,,52,,53. De acuerdo, se ha demostrado por RMN una disminución de CBF de 33-50% en D3 y 27-44% en D5 después de la inducción de SAH en los modelos de doble inyección de rata^54,,55. La doble inyección en la cisterna magna permite una distribución predecible de la sangre a lo largo del espacio subaracnoideo, resultando especialmente en coágulos de sangre alrededor de la circulación posterior, pero puede introducir variaciones en los parámetros fisiológicos. Para evitar que la presión intracraneal (ICP) aumente con el volumen de sangre inyectada que entra en el canal espinal, lo que llevó a deterioros funcionales confusos^56,se podría elegir eliminar un volumen equivalente de líquido cefalorraquídeo, como se hizo anteriormente en otros modelos^30,,51. En el modelo aquí, los ratones falsos recibieron un volumen equivalente de aCSF o Fisiológico 0.9% NaCl, dependiendo del experimento, obviamente conducendo a un aumento de ICP. Por lo tanto, un aumento agudo del ICP da lugar a un aumento de 18 mmHg a 120 mmHg^27,48,53 en la única inyección de sangre en el modelo cisterna magna, de 46 a 107 mmHg^27,37,49 en el modelo de inyección de sangre de cisterna prequismática, y de 27 a 110 mmHg ^{39,40,53,57,58} en el modelo de perforación endovascular. Por el contrario, la doble inyección de sangre en cisterna magna se asoció con un aumento más pequeño del ICP de 60 a 67 mmHg^48,,53. Además, la acción de eliminar el CSF también alteraría el ICP y modificaría el CSF. En el modelo SAH aquí, la decisión fue no extirpar el CSF antes de la inyección de sangre, sino acompañar la cirugía mediante un procedimiento consistente en lahilación de la cabeza del animal a partir de 30o. El objetivo es atenuar el ICP permitiendo la distribución de la sangre en la circulación anterior, un paso importante y necesario para imitar la fisiopatología humana de SAH. En pacientes con SAH, se detecta un fuerte aumento del ICP y se asocia con una isquemia cerebral global transitoria^59,que probablemente contribuye a un deterioro sostenido de la autorregulación y la pérdida temprana de células neuronales^60. Sin embargo, después del primer evento después de la SAH, a menudo se adopta un drenaje ventricular externo temprano para los pacientes con SAH preocupados, para evitar la hinchazón cerebral y la hidrocefalia^61. Aquí, el modelo de SAH de doble inyección puede no ser grave en el primer evento de sangrado para provocar las consecuencias dependientes del ICP observadas en los pacientes, pero es probable que reproduzca un ICP mejorado sostenido y leve durante días después de la SAH.

Además, otro parámetro incontrolado en el modelo SAH aquí fueron las variaciones potenciales de la presión arterial media (MABP) inducida por el procedimiento de inyección de sangre excesivamente rápido²⁷. De hecho, la MABP normalmente aumenta agudamente después de la SAH experimental para preservar la presión de perfusión cerebral y, a partir de entonces, cae al nivel basal. En el modelo SAH aquí, inyectamos sangre o aCSF (a 10 l/min) a una velocidad baja para evitar estas variaciones de MABP. En cuanto a los eventos neurobiológicos en este modelo que imitan los observados en humanos, anteriormente mostramos que el modelo de inyección de sangre doble de SAH induce CVS de larga duración, formación de microtrombosis y daño cerebral cerebral incluyendo defectos en la difusión paravascular potencial desde el día 3 hasta el día 10 post-SAH²². Sin embargo, datos recientes que describen que el DCR está involucrado en DCI¹³ asociado a SAH apoyan firmemente la búsqueda de este tipo de investigaciones en el modelo de ratón de doble inyección. Esto debería permitir avances científicos sobre el impacto beneficioso de las nuevas terapias dirigidas al DCR.

Para concluir, el modelo de doble inyección de sangre arterial entera en la cisterna magna es un modelo dominado que permite una manera fácil de imitar la fisiopatología humana SAH incluyendo CVS, microtrombosis, inflamación vascular, déficits neurológicos y tasa de mortalidad. Representa un modelo validado para probar nuevos enfoques terapéuticos para tratar la morbi-mortalidad asociada a la SAH.

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecemos a la plataforma PRIMACEN (Universidad de Normandie Rouen, Francia) por su equipo de imagen y al Sr. Arnaud Arabo, a la Sra. Julie Maucotel y a la Sra. Martine Dubois, por su alojamiento y cuidado de los animales. Agradecemos a la señora Celeste Nicola por prestar su voz a la grabación del protocolo. Este trabajo fue apoyado por el programa de maduración seinari Normandía, La Fundación AVC bajo la égida de la FRM, la Universidad Normandie Rouen y el Inserm. La Región de Normandía y la Unión Europea (proyecto 3R). Europa participa en Normandía con el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER).