Kemirgenlerde Kan-Beyin Bariyeri Açıklığı için Yüksek Verimli Görüntü Destekli Stereotaktik Nöronavigasyon ve Odaklanmış Ultrason Sistemi

Kan-beyin bariyeri (BBB) mikrobubble aracılı odaklanmış ultrason (FUS) ile geçici olarak bozulabilir. Burada, ultrason olmayan uzmanlar için erişilebilen modüler bir FUS sistemi kullanarak yüksek verimli BBB açma in vivo için adım adım bir protokol açıklıyoruz.

Kan-beyin bariyeri (BBB) çeşitli beyin hastalıklarının tedavisinde önemli bir engel olmuştur. Sıkı kavşaklarla bağlanan endotel hücreleri, büyük moleküllerin (>500 Da) beyin dokusuna girmesini önleyen fizyolojik bir bariyer oluşturur. Mikrobubble aracılı odaklanmış ultrason (FUS), geçici bir lokal BBB açıklığı sağlamak için kullanılabilir ve daha büyük ilaçların beyin parankimine girmesini sağlar.

Klinik çeviri için büyük ölçekli klinik cihazlara ek olarak, ilaç adaylarının tedavi yanıt değerlendirmesi için preklinik araştırmalar, hedeflenen BBB açılışı için özel küçük hayvan ultrason kurulumları gerektirir. Tercihen, bu sistemler hem yüksek uzamsal hassasiyet hem de entegre kavitasyon izleme ile yüksek verimli iş akışlarına izin verirken, hem ilk yatırım hem de işletme maliyetlerinde uygun maliyetlidir.

Burada, piyasada bulunan bileşenlere dayanan ve yukarıda belirtilen gereksinimleri karşılayan biyolüminesans ve X-ışını güdümlü stereotaktik küçük hayvan FUS sistemini sunuyoruz. Yüksek hacimli klinik öncesi ilaç değerlendirme çalışmalarında tipik olarak karşılaşılan zorlukları kolaylaştıran yüksek derecede otomasyona özel bir vurgu yapıldı. Bu zorluklara örnek olarak, veri tekrarlanabilirliğini sağlamak, grup içi değişkenliği azaltmak, örnek boyutunu azaltmak ve böylece etik gereksinimlere uymak ve gereksiz iş yükünü azaltmak için standardizasyon ihtiyacı gösterilebilir. Önerilen BBB sistemi, glioblastoma multiforme ve yaygın orta çizgi glioma'nın hasta kaynaklı ksenograft modellerinde BBB açılması kolaylaştırılmış ilaç teslim denemeleri kapsamında doğrulanmıştır.

Kan-beyin bariyeri (BBB), beyin parenkimine ilaç verilmesi için önemli bir engeldir. Geliştirilen terapötik ilaçların çoğu fizikokimyasal parametreleri (örneğin, lipofilite, moleküler ağırlık, hidrojen bağı kabul edenleri ve bağışçıları) nedeniyle BBB'yi geçmez veya beyindeki efflux taşıyıcılarına olan yakınlıkları nedeniyle korunmaz^1,2. BBB'yi geçebilen küçük ilaç grubu tipik olarak sadece sınırlı sayıda beyin hastalığında etkili olan küçük lipofilik moleküllerdir^1,2. Sonuç olarak, beyin hastalıklarının çoğunluğu için farmakolojik tedavi seçenekleri sınırlıdır ve yeni ilaç dağıtım stratejileri gereklidir^3,4.

Terapötik ultrason, BBB bozulması (BBBD), nöromodülasyon ve ablasyon⁴,^5,6,7gibi farklı nörolojik uygulamalar için kullanılabilecek yeni bir tekniktir. Kafatasından ekstrakorpozal ultrason yayıcı ile BBB açıklığı elde etmek için odaklanmış ultrason (FUS) mikrobubbles ile birleştirilir. Mikrobubble aracılı FUS, beyin parenkiminde ilaçların biyoyararlanmının artmasına neden olur^5,8,9. Ses dalgalarının varlığında, mikrobubbles transsitoz başlatmayı ve BBB'nin endotel hücreleri arasındaki sıkı kavşakların bozulmasını salınmaya başlar ve daha büyük moleküllerin paraselüler olarak taşınmasını sağlar¹⁰. Önceki çalışmalar akustik emisyonun yoğunluğu ile BBB açılışı üzerindeki biyolojik etki arasındaki korelasyonu doğruladı^11,12,13,14. Fus mikrobubbles ile birlikte zaten kemoterapötik ajan olarak temozolomid veya lipozomal doksokubisin kullanarak glioblastoma tedavisi için klinik çalışmalarda kullanılmıştır, ya da Alzheimer hastalığı ve amyotrofik lateral skleroz tedavisi için^5,9^,15,16.

Ultrason aracılı BBB açılması farmakoterapi için tamamen yeni olasılıklarla sonuçlanmaktan dolayı, seçilen ilaç adaylarının tedavi yanıtını değerlendirmek için klinik çeviri için preklinik araştırmalara ihtiyaç vardır. Bu genellikle, hedeflenen BBB açıklığının yüksek tekrarlanabilirlikle izlenmesi için hem yüksek uzamsal hassasiyete hem de tercihen entegre kavitasyon algılamaya sahip yüksek verimli bir iş akışı gerektirir. Mümkünse, bu sistemlerin çalışma boyutuna göre ölçeklenebilir olması için hem ilk yatırım hem de işletme maliyetlerinde uygun maliyetli olması gerekir. Çoğu preklinik FUS sistemi, görüntü yönlendirme ve tedavi planlaması^{15, 17, 18,19}için MRI ile birleştirilir. MRI tümör anatomisi ve hacmi hakkında detaylı bilgi verse de genellikle eğitimli/yetenekli operatörler tarafından yapılan pahalı bir tekniktir. Buna ek olarak, yüksek çözünürlüklü MRI klinik öncesi tesislerde araştırmacılar için her zaman mevcut olmayabilir ve hayvan başına uzun tarama süreleri gerektirir, bu da onu yüksek verimli farmakolojik çalışmalar için daha az uygun hale getirir. Dikkat çekici olan, nöro-onkoloji alanındaki preklinik araştırmalar için, özellikle infiltratif tümör modelleri için, tümörü görselleştirme ve hedefleme imkanının tedavi başarısı için gerekli olmasıdır²⁰. Şu anda, bu gereksinim sadece MRG veya fotoprotein ile transdüklenmiş tümörler tarafından karşılanır ve fotoprotein substratının yönetimi ile birlikte biyolüminesans görüntüleme (BLI) ile görselleştirmeyi sağlar.

MRI güdümlü FUS sistemleri genellikle transkraniyal uygulamalar için ultrason dalgası yayılımını sağlamak için bir su banyosu kullanır, böylece hayvanın başı kısmen suya batırılır, ''aşağıdan yukarıya'' sistemler^15,17,18. Bu tasarımlar genellikle daha küçük hayvan çalışmalarında iyi çalışsa da, kullanım sırasında hayvan hazırlama süreleri, taşınabilirlik ve gerçekçi bir şekilde korunabilir hijyenik standartlar arasında bir uzlaşmadır. MRI'a alternatif olarak, stereotaktik navigasyon için diğer rehberlik yöntemleri kemirgen anatomik^{atlası 21},^22,23, lazer işaretçi destekli görsel görme²⁴, iğne deliği destekli mekanik tarama cihazı²⁵veya BLI²⁶kullanımını kapsar. Bu tasarımların çoğu, dönüştürücünün hayvanın kafasının üstüne yer konulduğunda, hayvanın doğal bir konumda olduğu "yukarıdan aşağıya" sistemlerdir. ''Yukarıdan aşağıya'' iş akışı,^{22, 25,26} su banyosu veya su dolu koni^21,24'denoluşur. Kapalı bir koninin içinde dönüştürücü kullanmanın yararı, daha kompakt ayak izi, daha kısa kurulum süresi ve tüm iş akışını basitleştiren düz ileri dekontaminasyon olanaklarıdır.

Akustik alanın mikrobubbles ile etkileşimi basınca bağlıdır ve düşük genlikli salınımlardan (kararlı kavitasyon olarak adlandırılır) geçici kabarcık çökmesine (atalet kavitasyonu olarak adlandırılır)^27,28arasında değişir. Ultrason-BBBD'nin başarılı BBBD elde etmek için kararlı kavitasyon eşiğinin çok üzerinde bir akustik basınç gerektirdiği, ancak genellikle vasküler / nöronal hasar²⁹ile ilişkili olan atalet kavitasyon eşiğinin altında olduğu konusunda yerleşik bir fikir birliği vardır. En yaygın izleme ve kontrol şekli, McDannold ve ark.¹²tarafından önerildikçe pasif kavitasyon tespiti (PCD) kullanılarak (geri) dağınık akustik sinyalin analizidir. PCD, kararlı kavitasyon ayırt edici özelliklerinin (harmonikler, subharmonikler ve ultraharmonikler) ve atalet kavitasyon belirteçlerinin (geniş bant yanıtı) gücünün ve görünümünün gerçek zamanlı olarak ölçülebildiği mikrobubble emisyon sinyallerinin Fourier spektrumunun analizine dayanır.

Hassas basınç kontrolü için "herkese uyan bir boyut" PCD analizi, mikrobubble formülasyonunun polidispersitesi (salınım genliği kabarcık çapına güçlü bir şekilde bağlıdır), markalar arasındaki kabarcık kabuğu özelliklerindeki farklılıklar ve frekans ve basınca bağlı olan akustik salınım nedeniyle karmaşıktır^30,31,32. Sonuç olarak, sağlam kavitasyon tespiti ve hatta basıncın geriye dönük geri bildirim kontrolü için tüm bu parametrelerin belirli kombinasyonlarına uyarlanmış ve çeşitli uygulama senaryolarında (küçük hayvan protokolleri üzerinde in vitro deneyden klinik kullanım için PCD'ye kadar) kullanılan birçok farklı PCD algılama protokolü önerilmiştir. Bu çalışma kapsamında kullanılan PCD protokolü doğrudan McDannold ve ark.^12'den türetilmiştir ve atalet kavitasyon tespiti için kararlı kavitasyon ve geniş bant gürültüsünün varlığı için harmonik emisyonu izler.

Beyin parenkimine ilaç dağıtımını artırmak için BBB'nin geçici açılışı için görüntü güdümlü bir nöronavigasyon FUS sistemi geliştirdik. Sistem ticari olarak mevcut bileşenlere dayanmaktadır ve hayvan tesisindeki mevcut görüntüleme tekniklerine bağlı olarak birkaç farklı görüntüleme yöntemine kolayca uyarlanabilir. Yüksek verimli bir iş akışına ihtiyaç aldığımızdan, görüntü yönlendirme ve tedavi planlaması için X-ray ve BLI kullanmayı tercih ettik. Fotoprotein (örneğin luciferaz) ile transdüklenen tümör hücreleri BLI görüntüleme için uygundur²⁰. Fotoprotein substratının verilmesinden sonra tümör hücreleri in vivo olarak izlenebilir ve tümör büyümesi ve yeri belirlenebilir^20,36. BLI düşük maliyetli bir görüntüleme yöntemidir, zamanla tümör büyümesini takip etmeyi sağlar, hızlı tarama sürelerine sahiptir ve MRI^36,37ile ölçülen tümör büyümesi ile iyi ilişkilidir. Kemirgenlerin monte edildiği platformu serbestçe hareket ettirme esnekliği sağlamak için su banyounu dönüştürücüye bağlı su dolu bir koni ile değiştirmeyi seçtik^8,24. Tasarım, (I) küçük hayvan stereotaktik platform (II) fidüsyal belirteçlerinin hem X-ışını hem de optik görüntü uyumluluğu (III) hızlı çıkarılabilir anestezi maskesi ve (IV) entegre sıcaklık düzenlemeli hayvan ısıtma sistemi ile entegrasyonu ile donatılmış çıkarılabilir bir platforma dayanmaktadır. Anestezinin ilk indüksiyonundan sonra, hayvan tüm prosedür sırasında kaldığı platformda hassas bir konuma monte edilir. Sonuç olarak, tüm platform, doğru ve tekrarlanabilir bir konumlandırma ve sürekli anestezi sağlarken, tüm müdahalenin iş akışının tüm istasyonlarından geçer. Kontrol yazılımı, fidücial belirteçlerin otomatik olarak algılanmasını sağlar ve her türlü görüntü ve görüntü modalitesini (örneğin, mikro-CT, X-ışını, BLI ve floresan görüntüleme) stereotaktik platformun referans çerçevesine otomatik olarak kaydeder. Otomatik kalibrasyon prosedürü yardımıyla, ultrason dönüştürücünün odak uzaklığı, girişimsel planlama, akustik teslimat ve takip görüntüleme analizinin otomatik füzyonunu sağlayan tam olarak bilinmektedir. Şekil 1 ve Şekil 2'degösterildiği gibi, bu kurulum özel deneysel iş akışları tasarlamak için yüksek derecede esneklik sağlar ve hayvanın farklı istasyonlarda aralanmış olarak işlenmesine izin verir ve bu da yüksek verimli deneyleri kolaylaştırır. Bu tekniği, yaygın orta çizgi glioma gibi yüksek dereceli glioma fare ksinograftlarında başarılı ilaç teslimatı için kullandık.

Tüm in vivo deneyler Hollanda etik komitesi (lisans izin numarası AVD114002017841) ve Vrije Universiteit Amsterdam, Hollanda Hayvan Refahı Organı tarafından onaylandı. Araştırmacılar, hayvanların rahatsızlığını en aza indirmek için FUS sisteminin temelleri hakkında eğitildi.

1. Odaklanmış ultrason sistemi

NOT: Açıklanan kurulum, piyasada bulunan bileşenlere dayanan dahili bir BBB kesinti sistemidir ve 3D baskılı özel yapım koni ve çıkarılabilir stereotaktik platform içerir. Sistem, mevcut ekipmana ve özel kullanıma göre modifikasyonları kolaylaştıran modüler olarak tasarlanmıştır. Protokol, fare beyninin pontine bölgesinde daha büyük bir alanın sonoporasyonu prosedürünü açıklar. Hedef konumu ayarlayarak beynin farklı bölgeleri hedeflenebilir. Bu çalışmada odak uzaklığı 75 mm, diyafram açıklığı 60 mm ve odak alanı 1,5 x 1,5 x 5 mm (tepe basıncı FWHM) olan 1 MHz mono eleman dönüştürücü kullanılmıştır. Dönüştürücünün odak düzlemi, kulak çubuklarıyla kesişen yatay düzlemde hayvanın kafatasından konumlandırılmıştır.

1. Kemirgenlerde BBB açıklığı için uygun bir dönüştürücü seçin.
   NOT: Mikrobubbles özelliklerine ve kullanılan frekansa bağlı olarak, akustik ayarlar, özellikle mekanik indeks (MI),^13,38.
2. Dönüştürücüsü 3D baskılı koninin içine yerleştirin.
3. Işın yayma yolunun akustik olarak bir araya gelmek için koninin alt ucunda akustik olarak şeffaf bir miler membran takın ve koniyi gazsız suyla doldurun.
4. Dönüştürücünün otomatik dikey konumlandırılmasına izin vererek Şekil 1'de gösterildiği gibi motorlu doğrusal bir aşamaya hayvanın üzerine monte edin.
5. Şekil 1 ve Şekil 2'degösterildiği gibi sıcaklık düzenlemeli ısıtma, ısırık ve kulak çubukları, anestezi ve çok modaliteli fidüsiyal belirteçleri içeren çalışmanın gereksinimlerine göre çıkarılabilir bir stereotaktik platform tasarlayın. Stereotaktik platformun montajı, kirişin altında hayvanın hassas otomatik konumlandırılmasına (< 0,1 mm) izin veren 2D doğrusal bir sahne sisteminden oluşur.
6. Dönüştürücü, şekil 1'de gösterilen bir dönüştürücü, bir fonksiyon üreteci ve bir güç amplifikatöründen oluşan akustik emisyon zincirine bağlayın.
7. İğne hidrofon tarafından tespit edilen kavitasyon verilerinin beyin alanının hassas sonoporasyon hedeflemesine ve toplanmasına izin veren çok modluluk fidüsiyal belirteçleri tespit etmek için bir görüntü işleme boru hattı tasarlayın.
8. Sistemi kalibre edin ve hayvanın stereotaktik platformda dikey konumlandırılmasına karşılık gelen dönüştürücünün odak noktasını belirleyin.

2. Hayvan hazırlığı

NOT: Aşağıdaki protokol fareler için belirtilmiştir, ancak sıçanlar için uyarlanabilir. Bu deneyler için dişi athimik çıplak Foxn1-/- fareler (6-8 haftalık) kullanılmıştır.

1. Hayvanın hayvan tesisinde en az bir hafta iklimlendirmesine izin verin ve hayvanı düzenli olarak tartın.
2. Analjezik tedaviye başlamak için FUS tedavisinden 30 dakika önce deri altı (s.c.) enjeksiyonu ile buprenorfin (0.05 mg/kg) uygulanır.
3. Hayvanı% 3 izofluran, 2 L / dk O₂ ile uyuşturun ve hayvanın derinden uyuşturuldığını doğrulayın. Tüm prosedür sırasında hayvanları uyuşturun ve izofluran konsantrasyonu gerektiği gibi ayarlamak için nefes alma sıklığını ve kalp atış hızını izleyin.
4. Göz kuruluğu önlemek ve olası yaralanmaları önlemek için göz merhemi uygulayın.
5. Başın üstündeki saçları jilet ve depilatör kremle çıkarın ve daha sonra cildin tahrişini önlemek için kalıntıları gidermek için suyla yıkayın.
6. BLI tümör modelleri ile yapılan deneyler için BLI görüntü yönlendirmesi için 150 μL D-luciferin (30 mg/mL) intraperitoneal (i.p.) ile 29 G insülin şırıngını enjekte edin.
7. 26-30 G kuyruk damarı kateter takın ve kateteri ve damarı az miktarda heparin çözeltisi (5 UI/mL) ile yıkayın. Kanın pıhtılaşmasını önlemek için kateteri heparin çözeltisi ile doldurun.
   NOT: Katetere kan reflü olduğunda iyi kateterizasyon görülür. Emboliyi önlemek için kateterdeki hava kabarcıklarından kaçının. Aşırı enjeksiyon basıncını önlemek için kateterin uzunluğunun mümkün olduğunca kısa olduğundan emin olun.
8. Hipotermiyi önlemek için hayvanı sıcaklık düzenlenmiş stereotaktik platforma yerleştirin.
   NOT: Hipotermi, mikrobubbles enjeksiyonunu / dolaşımını ve ilaçların farmakokinetiğini etkileyebilecek kan dolaşımını azaltır³⁹.
9. Kulak çubukları ve bir ısırık çubuğu kullanarak hayvanın başını stereotaktik platformda hareketsiz hale alıp sabitle. Vücudu bir kayışla sabitleyin ve hayvanın kuyruğunu platforma bantleyin.

3. In vivo görüntü destekli odaklanmış ultrason

NOT: Bu protokol için 10 ms süreli ton patlaması darbeli 1 MHz mono-element dönüştürücü, 0,4 MI ve 240 s için 40 döngü ile 1,6 Hz darbe tekrarlama frekansı kullanılmıştır. Protokol, kükürt altıgen (SF₆₎içeren fosfolipidler tarafından zararsız bir gaz olarak stabilize edilen mikrobubbles için optimize edilmiştir, böylece ortalama kabarcık çapı 2,5 μm'dir ve kabarcıkların% 90'ından fazlası 8 μm'den küçüktür.

1. Stereotaktik platformu monte edilmiş hayvanla birlikte görüntüleme modalitesine(örneğin, BLI veya X-ışını) yerleştirin ve hayvanın görüntülerini alın.
2. Transdüserin odak noktasına göre hayvanın konumunu işaretlemek için görüntü işleme ardışık düzeni ile birlikte çok modalite fiducial işaretleyicileri kullanın.
3. Elde edilen X-ışını görüntüsünün üzerine bir beyin anahattı yerleştirerek veya tümörün merkezini belirlemek için BLI görüntülerini kullanarak hedef bölgeyi belirleyin (Şekil 2). Beynin belirli bölümlerinin konumu Paxinos Brain Atlas^40'ta bregma ve lambda kafatası işaretleri referans noktaları olarak kullanılarak belirtilmiştir. Örneğin, pons lambda'dan x=-1.0, y=-0.8 ve z=-4.5'e bulunur.
4. Ultrason jelinin solunuma müdahale etmesini önlemek için hayvanın burun deliklerini ve ağzını yapışkan bantla siper edin.
5. Hayvanın başının üstüne ultrason jeli uygulayın.
6. Hayvanların boynunun derisini geri çekin, iğne hidrofonunun ultrason jeli ile yağlanması ve iğne hidrofonunun oksipital kemiğin doğrudan yakınına yerleştirilmesi.
7. Görüntü işleme ardışık düzeni ve odak noktasını kullanarak dönüştürücüyü doğru konuma getirin.
8. Önceden yapılandırılmış ayarları tüm bağlı cihazlara uygulayın ve ilgilendiğiniz beyin bölgesini hedefleyin.
   NOT: Araştırma sorusuna bağlı olarak, tümör veya beyin bölgeleri Şekil 2'degösterildiği gibi tek bir odak noktası veya hacimsel şekil olarak sonoporated edilebilir.
9. Üretici tarafından açıklandığı gibi mikrobubbles etkinleştirin. Bir bolus 120 μL (5.4 μg) mikrobubbles enjekte edin.
10. Kateterin açıkliğini kontrol etmek için kuyruk damar kateterini salin ile yıkayın.
11. Mikrobubbles enjekte ve insonasyon başlatmak.
12. İğne hidrofon ile mikrobubble kavitasyonunu kaydedin.
13. Sonoporasyondan sonra intravasküler kontrast maddesi veya ilaç uygular. Doz, zamanlama ve planlama çalışmanın ve ilacın amacına bağlıdır.
    NOT: Evans mavisi, BBB açılış^41'ideğerlendirmek için yaygın bir renk ajanıdır.
14. Hayvanı önceden belirlenmiş zaman noktasına kadar veya insancıl uç noktadan önce izleyin.

4. Mikrobubble kavitasyonunun analizi

NOT: Burada, mcDannold ve ark.¹²tarafından önerildiği gibi, 1 MHz frekansta 10 ms'lik bir patlama tonu darbesi ile heyecanlanan ortalama çapı 2,5 μm (8 μm'nin altındaki kabarcıkların% 80'i) olan SF₆-fosfolipid mikrobubbles için in vivo deneyler için uygun olan uygulamalı prosedür açıklanmıştır.

1. Fourier, kaydedilen PCD sinyalini zaman etki alanından frekans etki alanına dönüştürür.
2. Şekil 3'te (2 ve 3 MHz'de yeşil kutu) gösterildiği gibi, 2^nd ve 3^rd harmonik (± 50 kHz) etrafında kararlı kavitasyon algılaması için elde edilen spektral gücü entegre edin.
3. Şekil 3'te (kırmızı kutular) gösterildiği gibi, ataletsel kavitasyon tespiti için spektral gücü, ana frekans, 2 nd^, 3 ^rd harmonik, 1^st ve^{2 nd} ultraharmonik ve ilk alt harmonik (± 150 kHz) arasında entegre edin.
4. Daha önce elde edilen her iki PCD sinyalinin normalleştirilmesi için spektral gücü prensip frekansı (1 MHz ± 50 kHz) etrafında entegre edin.
   NOT: PCD sinyali,₁MHz'deki SF 6 -fosfolipid mikrobubbles in vivo deneyleri için, Şekil 3'tegösterildiği gibi, atalet kavitasyon ayarlarından önce ultraharmonik veya subharmonik görüntülemez.

Açıklanan FUS sistemi (Şekil 1 ve Şekil 2) ve ilişkili iş akışı 100'den fazla hayvanda kullanılmış ve hem sağlıklı hem de tümör taşıyan fareler üzerinde tekrarlanabilir veriler üretilmiştir. Kaydedilen kavitasyona ve mikrobubble bolus enjeksiyonunun en yoğun anında harmoniklerdeki spektral yoğunluğa dayanarak, her frekansın spektral gücü, Protokolün 4. Mikrobubbles ile birlikte 0.4 MI ile akustik protokole (1 MHz, 10 ms darbe süresi) dayanarak, 2^nd ve 3^rd harmoniklerdeki normalleştirilmiş entegre güç spektrumu, Şekil 3'tegözlenen uyarlama frekansının entegre güç spektrumunu normalleştirdi. Bu, mikrobubble enjekte edilmediğinde subharmoniklerin tespit edilmesine veya 0.6 MI uygulandığında atalet kavitasyonunun gözlemlenmesine kıyasla çok hassas ve güvenilir bir kavitasyon tespiti aracı sağladı. Ataletsel kavitasyon durumunda, ultra harmonik ve subharmoniklerin görünümünün yanı sıra 25 dB'ye kadar geniş bantlı bir gürültü zemini tespit edildi. 0.4 ve 0.6'lık bir MI'nin akustik basıncı makroskopik hasara yol vermese de, Şekil 4'tegösterildiği gibi, mikroskobik hasar histolojik olarak 0.6 MI'da kanıtlandı. Basınç genliğinin 0,8 MI'ye kadar daha fazla artması, daha büyük damarların makroskopik beyin kanamasına ve eritrositlerin ekstravazasyonu ile geniş yayılmış doku lizizine neden oldu. Histolojik bulgular, Şekil 3'tegösterildiği gibi pasif kavitasyon sensöründen gelen akustik verilere karşılık geldi Beyin dokusunun ataletsel kavitasyonunun zarar verici özelliklerini doğrulayan. Sonuç olarak, 0.4'lük bir MI,^11'denönce gözlemlendiği gibi atalet kavitasyon rejimine güvenli bir marj sağlarken, çok tekrarlanabilir BBB-açıklığı sağlayan güvenli basınç genliği olarak seçildi.

Pontine bölgesinde BBB'nin açılmasını doğrulamak için intravenöz Evans mavisi enjekte edildi. Evans mavisinin güçlü albümin bağlaması, 66 kDa^42'denbüyük bir moleküle yol açar. Pons ve kısmen serebellum seviyesinde, mikrobubbles olmadan farenin aksine FUS ve mikrobubbles ile muamele edilen farede Evans mavi konjuge albümin ekstravazasyonu gözlenmiştir (Şekil 5). Bu, şirket içi yapı FUS sistemi ve açıklanan protokol ile görüntü destekli stereotaktik navigasyona dayalı olarak ilgi bölgesinin kesin hedeflemesini vurgular.

Şekil 1: Odaklanmış ultrason kurulumu.
(A) Odaklanmış ultrason kurulumu şematik gösterimi. (B) Odaklanmış ultrason kurulumunun resmi. Sistem, otomatik 3D konumlandırma için ikinci bir 2D aşamasında 1D doğrusal bir aşamada yukarıdan aşağıya monte edilmiş bir dönüştürücüden oluşur. Dönüştürücü, sesi hayvanın kafatasına ileten akustik olarak şeffaf bir milar membranla altta kapalı, su dolu bir ışın konisi içinde inşa edilir. Dönüştürücü, sinyal üretimi için rastgele bir dalga biçimi üretecine (AWG) bağlı olan bir güç amplifikatörüne bağlıdır. Kavitasyon tespiti için düşük gürültülü voltaj amplifikatörü ile birlikte çıkarılabilir bir hidrofon kullanılır. Hidrofon oksipital kemiğin hemen yakınına yerleştirilir. Harici hidrofon 2 mm aktif bir yüzeye sahiptir ve akustik olarak ultrason jeli ile birleştirilmiştir. Hem heyecan darbesinin yüksek voltaj sinyali hem de kaydedilen kavitasyon sinyali standart bir 200 MHz osiloskop tarafından dijitalleştirilir ve anında işleme ve gerçek zamanlı kontrol için bir kontrol bilgisayarına (gösterilmez) aktarılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Odaklanmış ultrason iş akışı.
Odaklanmış ultrason sisteminin önerilen iş akışı (A) hayvanın çıkarılabilir bir stereotaktik platformda ilk konumlandırılması ile başlar, akustik kavrama jelinin uygulanmasına dikkat edin (BLI / X-ışını sonrası uygulanır). Hedefleme için aynı anda multimodal görüntüleme yapılabilir. (B) İlk başta X-ışını görüntüleme bir olasılıktır, oysa ilgi çekici bir bölge beynin bir taslağı yardımıyla hedeflenebilir (bu da fare beyin atlası⁴⁰'a atıfta bulunularak kafatasının büyüklüğüne ve duruşuna uyarlanır). (C) Alternatif olarak, hedefleme için X-ışını maksimum yoğunluk projeksiyonu üzerine bindirilen luciferaz transfüzyöz orta çizgi glioma tümörünün BLI görüntüsü uygulanabilir. (D) Daha sonra, stereotaktik platform hem hidrofon hem de dönüştürücü takılı olarak tedavi pozisyonunda hayvanla monte edilir. Dönüştürücü otomatik olarak terapi pozisyonunda sürer ve seçilen yörünge sonrası bolus enjeksiyonunu sonalete eder. Sistem, birden fazla platformun üstte gösterildiği gibi ara çalışmaya izin verdiği yüksek aktarım hızı denemeleri için optimize edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kavitasyon izleme.
(A) 1 MHz'de 0,4 MI'da mikrobubble yönetimi yokluğunda bir in vivo deneyin frekans spektrumu. (B) Gösterilen, mikrobubbles enjeksiyonundan sonra tepe bolusunda karşılık gelen spektrumdur. Mikrobubbles istikrarlı kavitasyon için gösterge olan yüksek harmoniklerin artışına dikkat edin. (C) Mikrobubble enjeksiyonu ile birlikte 0,6'lık daha yüksek bir MI'de gözlenen ilgili spektrum, ataletsel kavitasyonun başlangıcına geçiş bandı içinde, gürültü zemininde 25 dB'ye kadar artışa ve ultraharmonik ve subharmoniklerin ortaya çıkmasına yol açtı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: BBB açılımı ve ilişkili histoloji.
(A)0.4 MI kullanılarak kararlı kavitasyon, hem beyaz ışık makroskopisinde hem de HE lekeli mikroskopide sağlam bir beyin parenkimini kanıtlamıştır. (B) 0.6 MI'dan sonra beyin parinesinin lokal geri dönüşü olmayan doku hasarının ilk belirtileri HE lekeli histolojik verilerde belirgin hale gelmektedir. (C) MI 0.8'in daha da yüksek mekanik basıncı için, makroskopik kanamanın yanı sıra beyin parankiminin geniş yayılmış doku lizisi ve mikro kanamaya bağlı eritrositlerin ekstravazasyonu belirgindir. Beyaz ışık makroskopunda bulunan mavi ton, birlikte enjekte edilen damar içi kontrast ajanı Evans mavisinin BBB açıklığını gösteren ekstravazasyonu için gösterge niteliğindedir (sagittal görünüm için Şekil 5'e bakınız). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: BBB açılışının doğrulanması.
Kararlı kavitasyon rejiminde(B)başarılı BBB açıklığının kontrolüne (A)kıyasla gösterimi , mikrobubbles enjekte edilir. Bu durumda Evans mavisi intravasküler kontrast ajan olarak kullanılmıştır. Evans blue'nun güçlü albümin bağlaması, 66 kDa'dan daha büyük bir moleküle yol açar. Sonuç olarak, Evans mavisi ekstravazasyonun kanıtı, dar kavşakların (kısmi) açılması nedeniyle BBB boyunca parasellüler taşıma için gösterge niteliğindedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışmada, beyin parenkimine daha fazla ilaç verilmesi için geçici BBB bozulması için uygun maliyetli bir görüntü güdümlü FUS sistemi geliştirdik. Sistem büyük ölçüde piyasada bulunan bileşenlerle ve X-ray ve BLI ile birlikte inşa edildi. Önerilen tasarımın modülerliği, yüksek verimli iş akışlarında planlama ve değerlendirme için çeşitli görüntüleme yöntemlerinin kullanılmasına izin verir. Sistem, yüksek çözünürlüklü MRI veya mikro BT gibi daha kapsamlı yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme yöntemleriyle birleştirilebilirken, çalışmanın büyük kısmı için 2D X-ışını ve/veya BLI gibi 2D görüntüleme yöntemleri kullanılır. 2D X-ray ve/veya BLI, hem önemli ölçüde daha uygun maliyetli hem de kısa alım süreleri nedeniyle yüksek hacimli çalışmalar için idealdir. Burada açıklanan dönüştürücü, beynin daha derin bölgelerinde (f sayısı 1.25) daha geniş alanlarda (fare beyni ölçeğinde) BBBD üretmek için çok uygundur. Sistemi pontin bölgesinde yaygın olarak büyüyen tümörler için kullandık^43,44. Bu bölgeler için ponstaki tüm tümör bölgesini kapsayan daha büyük bir hacmin sonopor yapılması gerekir. Modüler sistem, beynin daha supratentorial bölgelerindeki diğer beyin tümörleri türleri için kolayca ayarlanabilir. Dönüştürücü tipine karar vermek için f-sayısını, odak uzaklığını ve frekansını dikkate almalıdır.

Genel tasarım, daha önce önerilen tasarımlara kıyasla iki iyileştirme önermektedir. (I) Terapötik sistemlerin ultrason dalga iletimi için sıklıkla su banyosu kullanılır. Küçük hayvanlarda transkraniyal uygulamalar için bu tür tasarımlar daha büyük ve ters kurulumlarla sonuçlanır, böylece hayvan kısmen^11,22^,25. Bu tasarımlar genellikle daha küçük hayvan çalışmaları kapsamında çok iyi çalışsa da, kurulum süreleri, taşınabilirlik ve kullanım sırasında gerçekçi bir şekilde korunabilir hijyenik standartlar açısından bir uzlaşmadır. Özellikle ikincisi, bağışıklık sistemi baskılanmış hayvanları ve dolayısıyla katı hijyenik standartları kapsayan kapsam çalışmalarında önemli bir öneme sahiptir. Sonuç olarak, daha kompakt bir ayak izi, daha kısa kurulum süresi, kolay arındırma olanakları ve tüm iş akışı sırasında hayvanın doğal konumuna sahip bir sistem tasarlamak için "yukarıdan aşağıya" bir tasarım seçildi. (II) Daha önce açıklanan birkaç tasarımdan farklı olan ikinci tasarım seçimi, akustik dağıtım sisteminin MRI veya mikro-CT^{15 , 17 , 18,}19^,45gibi tıbbi bir görüntüleme sistemine doğrudan entegrasyonunu atlamaktı. Tam entegre sistemler uzunlamasına farmakokinetik çalışmalar veya sınırlı sayıda hayvan üzerinde keşif araştırmaları için ideal olsa da, bu tür kurulumlar önemli ölçüde artan karmaşıklık, yüksek işletme maliyetleri ve eğitimli / yetenekli operatörlere duyulan ihtiyaç nedeniyle genellikle yüksek hacimli farmakolojik çalışmalar için daha az uygundur. Ayrıca, bu tür sistemler genellikle sadece bir görüntüleme yöntemi ile sınırlıdır. Sonuç olarak, Burada önerilen tasarım, çeşitli görüntüleme yöntemleriyle (mikro-CT, küçük hayvan MRI'sı, çeşitli BLI / floresan kameralar, bunlar entegre X-ışını görüntülemeli veya entegre olmayan) uyumlu modüler çıkarılabilir stereotaktik bir platforma dayanır ve ayrıca tüm görüntü verilerinin hem girişimsel planlama hem de BBB sonrası açılış sonrası için ortak bir referans çerçevesinde otomatik olarak füzyon için çok modaliteli fidüksal belirteçler sağlar.

Pratik hususlarla ilgili olarak, prosedürdeki en kritik başarısızlık noktası, mikrobubbles'ın sınırlı ömürleri ve kırılgan doğaları nedeniyle stabilitesidir. Aşağıdaki tartışmanın fosfolipidler tarafından stabilize edilen ve zararsız bir gaz olarak kükürt altıgen (SF₆₎içeren mikrobubbles ile ilgili olduğunu vurgulamak isteriz^46,47, diğer mikrobubble formülasyonları genellikle farklı özellikler gösterecektir.

Mikrobubble enjeksiyonu öncesi zamanlama: Yeniden hidrasyondan sonra piyasada bulunan mikrobubbles'ın reklamı yapılan ömrü 3 ila 4 saat arasındadır. Bu tanısal ultrason uygulamaları için uygun olsa da, tüm bu süre boyunca mikrobubbles sürekli gaz kaybeder ve sonuç olarak ortalama kabarcık çapı 2.5 μm başlangıç ortalama boyutundan sürekli aşağı doğru sürüklenmeye maruz kalır. Ultrason aracılı BBBD gibi terapötik uygulamalar için bu çok daha katı zamanlama zorunlulukları anlamına gelir, çünkü kararlı kavitasyonun salınım genliği (belirli bir frekansta ve basınçta) ve atalet kavitasyonunun başlangıç eşiği de sürekli bir sürüklenmeye maruz kalan doğrudan bir sonuçtur. Deneyimlerimize göre, mikrobubbles'ın önceki raporlara benzer şekilde tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için rehidrasyondan sonraki 30 dakika içinde en iyi şekilde kullanıldığını gözlemledik⁴⁸.

Mikrobubble enjeksiyonundan sonra zamanlama: Daha büyük primatlarda, piyasada bulunan SF₆-fosfolipid mikrobubbles yaklaşık 6 dakikalık bir kan plazma eliminasyonu yarı ömrü gösterir ve uygulanan gazın% 80'inden fazlası sadece 11 dakika^48'densonra akciğerler aracılığıyla solunur. Fareler ve sıçanlar gibi küçük memelilerde, bu tür mikrobubbles in vivo'nun kan plazma eliminasyonu yarı ömrü, daha yüksek kalp hızı nedeniyle 90-120 saniye ile önemli ölçüde daha kısadır²⁰. Sonuç olarak, mikrobubble konsantrasyonunun bolus enjeksiyonundan hemen sonra hızlı dinamiği ve kabarcıkların sürekli gaz hacmi kaybı ile birlikte hızlı sonraki plazma eliminasyonu, enjeksiyon sonrası 3-4 dakika içinde tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için sonication / enjeksiyon protokolüne katı zamanlama gereksinimleri getirmektedir. Daha uzun prosedürler veya daha geniş BBBD hacimleri tercihen mikrobubbles sürekli bir uygulama gerektirir. Bununla birlikte, böyle bir yaklaşım hem şırınddaki hem de besleme sistemindeki kabarcıkların yüzdürülme gücü ile karmaşıktır ve ayrıca gerekli infüzyon tüpü tarafından önemli ölçüde artmış bir ölü hacmi sunar. Deneyimlerimize göre, toplam enjeksiyon hacmini 2 ila 3 küçük alt doza bölmenin daha basit çözümü sağlam ve tekrarlanabilir sonuçlar sağladı.

Ek olarak, mikrobubbles çok basınca duyarlıdır ve enjeksiyon sırasında yüksek hidrostatik basınçlar bu nedenle önerilmez. Mikrobubbles plastik bir tüp içine transfer veya bir şırınga ile mikrobubbles çizmek için büyük iğneler (>19 G) tavsiye edilir⁴⁹. Farelerde i.v. enjeksiyon için 26-30 G iğne önerilir; çünkü daha büyük iğnelerin kuyruk damarına yerleştirilmesi daha zordur. Hidrostatik basınç bu iğne ile daha düşük olduğu için 26 G iğne önerilir. Bununla birlikte, zor venöz erişim durumunda 30 G iğne önerilir.

Farenin kafatası, odak noktasındaki basınç genliğini önemli ölçüde düşüren basınç genliğinin önemli bir zayıflatıcısıdır. Zayıflama, dönüştürücünün sıklığına ve ultrason dalgasının yayıldırıldır ettiği ortamın yoğunluğuna göre belirlenir. Kemik gibi daha yüksek ultrason frekansları ve yüksek doku yoğunlukları yüksek zayıflama ile sonuçlanır. Basınç genliği kısmen kemik tarafından emilir ve bazı basınç genliği yansıma ve saçılma ile kaybolur⁵⁰. Deneylerimizde fare kadavralarında 1 MHz'deki zayıflamanın 14,5 ± 1,3 dB/cm olduğunu ve ortalama kafatası kalınlığının 21^,50 'den önce gösterildiği gibi^0,9mm olduğunu belirledik. Mikrobubbles stabil kavitasyon ve atalet kavitasyon sırasında farklı akustik emisyonları yansıtır çünkü kavitasyon izleme şiddetle tavsiye edilir. Geniş bant emisyonu, atalet kavitasyonu için ayrı bir akustik emisyondur¹². Gerçek zamanlı izleme, doku hasarını önlemek için atalet kavitasyonunu tespit etmeyi ve basınç genliğini buna göre düşürmeyi mümkün kılar.

Önceki raporlar anestezi tipinin elde edilen BBB geçirgenliği üzerindeki etkisini açıklamıştır^11,31. izofluran bazlı anestezi için, anestezinin başlatılmasından kısa bir süre sonra, serebral kan akışının hafif bir şekilde azalmasıyla ilişkili bir vazodilasyon meydana gelir. Ayrıca, özellikle sıcaklık stabilizasyonu olmadığında, uzun süre anestezi, kalp atış hızının düşmesine yol açar. Her iki faktör de potansiyel olarak hem mikrobubbles hem de birlikte uygulanan ilaçların serebral konsantrasyonunun daha büyük bir varyansına yol açabileceğinden, tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için sıkı bir anestezi protokolü önerilir⁵¹. Constantinides ve ark.⁵¹tarafından tavsiye edildiği gibi, 35 ila 45 dakika boyunca 2 L / dk oksijende% 1.5 v / v izofluran ile anestezi sorunlu değildi. Mikrobubbles spesifik türü ile birlikte bu gaz karışımının sorunlu^olduğunugösteren McDannold ve ark. Alternatif olarak, hayvanlar bilinen hiçbir vazoaktif etkisi olmayan ketamin / ksilazin karışımı ile uyuşturulabilir⁵³.

Özetle, burada açıklanan görüntüleme güdümlü BBB açma tekniği, önerilen iş akışının verimliliğini gösteren yüksek hacimli preklinik ilaç değerlendirme çalışmaları için kullanılmıştır. Sistem böylece yüksek otomasyon derecesi nedeniyle kısa bir eğitimden sonra teknik olmayan personel tarafından çalıştırılabilir. Bu, kurulumun basitliği ile birlikte, deneysel tekrarlanabilirliği, grup içi değişkenliği azaltan ve böylece gerekli numune boyutunu azaltmaya izin veren yüksek derecede standardizasyona neden oldu.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu proje KWF-STW (Çocukluk Diffuse Intrinsic Pontine Glioma ve Yüksek Dereceli Glioma'da Sonoporation ile İlaç Teslimatı) tarafından finanse edildi. Ilya Skachkov ve Charles Mougenot'a sistemin gelişimindeki katkıları için teşekkür ederiz.