A عالية الإنتاجية صورة موجهة الخلايا العصبية المجسمة ونظام الموجات فوق الصوتية مركزة لفتح حاجز الدم في الدماغ القوارض

يمكن تعطيل حاجز الدم في الدماغ (BBB) مؤقتا باستخدام الموجات فوق الصوتية المركزة بوساطة الميكروببل (FUS). هنا، نقوم بوصف بروتوكول خطوة بخطوة لفتح BBB عالي الإنتاجية في الجسم الحي باستخدام نظام FUS نمطي يمكن للخبراء غير الموجات فوق الصوتية الوصول إليه.

حاجز الدم في الدماغ (BBB) كان عقبة رئيسية لعلاج أمراض الدماغ المختلفة. تشكل الخلايا البطانية، المتصلة بتقاطعات ضيقة، حاجزا فسيولوجيا يمنع الجزيئات الكبيرة (>500 دا) من دخول أنسجة الدماغ. يمكن استخدام الموجات فوق الصوتية المركزة بوساطة Microbubble (FUS) للحث على فتح BBB محلي عابر ، مما يسمح للأدوية الأكبر بدخول بارنشيما الدماغ.

بالإضافة إلى الأجهزة السريرية واسعة النطاق للترجمة السريرية ، تتطلب الأبحاث قبل السريرية لتقييم استجابة العلاج للمرشحين للأدوية أجهزة الموجات فوق الصوتية الحيوانية الصغيرة المخصصة لفتح BBB المستهدف. ويفضل أن تسمح هذه النظم بسير عمل عالي الإنتاجية بدقة مكانية عالية ورصد متكامل للتجاويف، مع الاستمرار في فعاليته من حيث التكلفة في كل من الاستثمار الأولي وتكاليف التشغيل.

هنا، نقدم الإضاءة الحيوية والأشعة السينية الموجهة نظام FUS الحيوانات الصغيرة المجسمة التي تقوم على المكونات المتاحة تجاريا ويفي بالمتطلبات المذكورة أعلاه. وقد تم التركيز بشكل خاص على درجة عالية من التشغيل الآلي مما يسهل التحديات التي تواجه عادة في دراسات تقييم الأدوية قبل السريرية الكبيرة الحجم. ومن الأمثلة على هذه التحديات الحاجة إلى التوحيد القياسي لضمان إعادة إنتاج البيانات، والحد من التباين داخل المجموعة، وتقليل حجم العينة، وبالتالي الامتثال للمتطلبات الأخلاقية، وخفض عبء العمل غير الضروري. وقد تم التحقق من صحة نظام BBB المقترح في نطاق فتح BBB تسهيل تجارب تسليم الأدوية على نماذج xenograft المشتقة من المريض من الورم الأرومي الدبقي المتعدد الأشكال والورم الدبقي المنتشر.

حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو عقبة رئيسية لتسليم المخدرات في الدماغ parenchyma. معظم الأدوية العلاجية التي تم تطويرها لا تعبر BBB بسبب المعلمات الفيزيائية الكيميائية (على سبيل المثال ، الليبوفيليك ، الوزن الجزيئي ، متقبلي سندات الهيدروجين والمتبرعين) أو لا يتم الاحتفاظ بها بسبب تقاربها مع ناقلات efflux في الدماغ^1،2. مجموعة صغيرة من الأدوية التي يمكن أن تعبر BBB وعادة ما تكون جزيئات الدهون الصغيرة، والتي هي فعالة فقط في عدد محدود من أمراض الدماغ^1،2. ونتيجة لذلك ، بالنسبة لغالبية أمراض الدماغ ، تكون خيارات العلاج الدوائي محدودة وهناك حاجة إلى استراتيجيات جديدة لتوصيل الأدوية^3و4.

الموجات فوق الصوتية العلاجية هي تقنية ناشئة يمكن استخدامها لتطبيقات عصبية مختلفة مثل اضطراب BBB (BBBD) ، والتحوير العصبي ، والاجتثاث^4،5،6،7. من أجل تحقيق فتح BBB مع باعث الموجات فوق الصوتية خارج الجسم من خلال الجمجمة ، يتم الجمع بين الموجات فوق الصوتية المركزة (FUS) مع الفقاعات الدقيقة. Microbubble بوساطة FUS النتائج في زيادة التوافر البيولوجي للأدوية في الدماغ parenchyma^5,8,9. في وجود موجات صوتية ، تبدأ الفقاعات الدقيقة في التذبذب لبدء التحول الخلوي وتعطيل التقاطعات الضيقة بين الخلايا البطانية ل BBB ، مما يتيح النقل شبه الخلوي للجزيئات الأكبر^10. أكدت الدراسات السابقة العلاقة بين كثافة الانبعاثات الصوتية والتأثير البيولوجي على فتح BBB^{11و12و13و14}. وقد تم بالفعل استخدام FUS بالاشتراك مع microbubbles في التجارب السريرية لعلاج الورم الأرومي الدبقي باستخدام تيموزولوميد أو دوكسوروبيسين الليبوسومال كعامل العلاج الكيميائي، أو لعلاج مرض الزهايمر والتصلب الجانبي الضموري^5،9،15،16.

منذ الموجات فوق الصوتية بوساطة BBB فتح النتائج في إمكانيات جديدة تماما للعلاج الدوائي، وهناك حاجة إلى البحوث قبل السريرية للترجمة السريرية لتقييم استجابة العلاج من المرشحين المخدرات مختارة. وهذا يتطلب عادة سير عمل عالي الإنتاجية بدقة مكانية عالية ويفضل أن يكون اكتشافا متكاملا للتجويف لرصد فتحة BBB المستهدفة مع إمكانية إعادة إنتاج عالية. وإذا أمكن، يجب أن تكون هذه النظم فعالة من حيث التكلفة في كل من الاستثمار الأولي وتكاليف التشغيل لكي تكون قابلة للتوسع وفقا لحجم الدراسة. يتم الجمع بين معظم أنظمة FUS قبل السريرية مع التصوير بالرنين المغناطيسي لتوجيه الصور وتخطيط العلاج^{15و17و18و19}. على الرغم من أن التصوير بالرنين المغناطيسي يعطي معلومات مفصلة عن تشريح الورم وحجمه ، إلا أنه تقنية مكلفة ، والتي يتم إجراؤها بشكل عام من قبل المشغلين المدربين / المهرة. بالإضافة إلى ذلك، قد لا يكون التصوير بالرنين المغناطيسي عالي الدقة متاحا دائما للباحثين في المرافق قبل السريرية ويتطلب أوقات مسح طويلة لكل حيوان، مما يجعله أقل ملاءمة للدراسات الدوائية عالية الإنتاجية. الجدير بالذكر أنه بالنسبة للبحوث ما قبل السريرية في مجال الأورام العصبية ، ولا سيما نماذج الأورام المتسللة ، فإن إمكانية تصور الورم واستهدافه أمر ضروري لنجاح العلاج^20. حاليا، يتم استيفاء هذا الشرط فقط عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي أو عن طريق الأورام التي يتم تحويلها مع فوتوبروتين، وتمكين التصور مع التصوير الإضاءة الحيوية (BLI) في تركيبة مع إدارة الركيزة فوتوبروتين.

غالبا ما تستخدم أنظمة FUS الموجهة بالرنين المغناطيسي حماما مائيا لضمان انتشار الموجات فوق الصوتية للتطبيقات عبر الجمجمة ، حيث يتم غمر رأس الحيوان جزئيا في الماء ، ما يسمى بأنظمة "من أسفل إلى أعلى"^15و17و18. في حين أن هذه التصاميم تعمل بشكل جيد بشكل عام في الدراسات الحيوانية الصغيرة ، إلا أنها حل وسط بين أوقات إعداد الحيوانات وقابلية النقل والمعايير الصحية القابلة للحفاظ عليها واقعيا أثناء الاستخدام. كبديل للتصوير بالرنين المغناطيسي، طرق التوجيه الأخرى للملاحة المجسمة تشمل استخدام أطلس تشريحي القوارض^21،22،23، مؤشر ليزر ساعد الرؤية البصرية²⁴، جهاز المسح الميكانيكي بمساعدة الثقب²⁵، أو BLI²⁶. معظم هذه التصاميم هي أنظمة "من أعلى إلى أسفل" يتم فيها وضع المحول فوق رأس الحيوان ، مع وجود الحيوان في وضع طبيعي. يتكون سير عمل ''من أعلى إلى أسفل' إما من حمام مائي^22،25،26 أو مخروط مملوء بالمياه^21،24. الفائدة من استخدام محول داخل مخروط مغلق هو بصمة أكثر إحكاما، وأقصر وقت الإعداد وإمكانيات إزالة التلوث على التوالي إلى الأمام تبسيط سير العمل بأكمله.

التفاعل بين المجال الصوتي مع microbubbles يعتمد على الضغط ويتراوح من التذبذبات منخفضة السعة (يشار إليها باسم التجويف مستقرة) لانهيار فقاعة عابرة (يشار إليها باسم التجويف القصور الذاتي)^27،28. هناك إجماع راسخ على أن الموجات فوق الصوتية BBBD يتطلب ضغطا صوتيا أعلى بكثير من عتبة التجويف المستقرة لتحقيق BBBD ناجح ، ولكن تحت عتبة التجويف القصور الذاتي ، والتي ترتبط بشكل عام بتلف الأوعية الدموية / الخلايا العصبية²⁹. الشكل الأكثر شيوعا للرصد والتحكم هو تحليل الإشارة الصوتية المتناثرة (الخلفية) باستخدام الكشف عن التجويف السلبي (PCD) ، كما اقترح McDannold^{وآخرون.} يعتمد PCD على تحليل أطياف فورييه لإشارات انبعاث الفقاعات الدقيقة ، والتي يمكن فيها قياس قوة ومظهر السمات المميزة المستقرة للتجاويف (التوافقيات ، و subharmonics ، و ultraharmonics) وعلامات التجويف القصور الذاتي (استجابة النطاق العريض) في الوقت الفعلي.

"مقاس واحد يناسب الجميع" PCD تحليل للتحكم الدقيق في الضغط معقد بسبب تعدد أضلاع صياغة microbubble (سعة التذبذب يعتمد بقوة على قطر الفقاعة) ، والاختلافات في خصائص قذيفة فقاعة بين العلامات التجارية ، والتذبذب الصوتي ، والذي يعتمد بقوة على التردد والضغط^30،31،32. ونتيجة لذلك، تم اقتراح العديد من بروتوكولات الكشف عن ثنائي الفينيل متعدد الكلور المختلفة، والتي تم تكييفها مع مجموعات معينة من كل هذه المعلمات واستخدمت في سيناريوهات تطبيق مختلفة (تتراوح بين التجارب في المختبر على بروتوكولات الحيوانات الصغيرة لPCD للاستخدام السريري) للكشف عن التجويف قوية وحتى للسيطرة على ردود الفعل بأثر رجعي من الضغط^{11،14،30،31،32،33،34،35}. 10- ويستمد بروتوكول ثنائي الفينيل متعدد الكلور المستخدم في نطاق هذه الدراسة مباشرة من McDannold et al.^12، ويرصد الانبعاثات التوافقية لوجود التجويف المستقر وضوضاء النطاق العريض للكشف عن التجويف القصور الذاتي.

لقد طورنا نظام FUS للخلايا العصبية الموجهة بالصور لفتح عابر ل BBB لزيادة تسليم الدواء إلى بارنشيما الدماغ. ويستند النظام إلى المكونات المتاحة تجاريا ويمكن تكييفه بسهولة مع عدة طرائق تصوير مختلفة، اعتمادا على تقنيات التصوير المتاحة في المرفق الحيواني. نظرا لأننا نحتاج إلى سير عمل عالي الإنتاجية ، فقد اخترنا استخدام الأشعة السينية وBLI لتوجيه الصور وتخطيط العلاج. الخلايا السرطانية التي يتم تحويلها باستخدام بروتين ضوئي (على سبيل المثال، لوسيفيراز) مناسبة لتصوير BLI²⁰. بعد إدارة الركيزة فوتوبروتين, يمكن رصد الخلايا السرطانية في الجسم الحي ونمو الورم ويمكن تحديد موقع^20,36. BLI هو وسيلة تصوير منخفضة التكلفة ، فإنه يمكن من متابعة نمو الورم مع مرور الوقت ، ولديه أوقات مسح سريع ويرتبط بشكل جيد مع نمو الورم مقاسا بالرنين المغناطيسي^36،37. لقد اخترنا استبدال حمام الماء بمخروط مملوء بالماء متصل بالمحول لتمكين المرونة من تحريك المنصة التي يتم تركيب القوارض عليها بحرية^8،24. ويستند التصميم على منصة قابلة للفصل مجهزة بدمج (I) منصة مجسمة للحيوانات الصغيرة (II) علامات fiducial مع كل من الأشعة السينية وتوافق الصور البصرية (III) قناع التخدير السريع القابل للفصل ، و (IV) نظام تسخين الحيوانات المتكامل المنظم لدرجة الحرارة. بعد التعريفي الأولي للتخدير ، يتم تركيب الحيوان في وضع دقيق على المنصة حيث يبقى أثناء الإجراء بأكمله. وبالتالي ، فإن المنصة بأكملها تمر بجميع محطات سير العمل للتدخل بأكمله ، مع الحفاظ على تحديد موقع دقيق وقابل للاستنساخ وتخدير مستدام. يسمح برنامج التحكم بالكشف التلقائي للعلامات الفقهية ويسجل تلقائيا جميع أنواع الصور وطرائق الصورة (أي التصوير المقطعي الدقيق والأشعة السينية والتصوير ببلي والتصوير الفلوري) في إطار مرجعي للمنصة المجسمة. بمساعدة إجراء المعايرة التلقائية ، يعرف الطول البؤري لمحول الموجات فوق الصوتية بدقة داخله ، مما يتيح الانصهار التلقائي للتخطيط التدخلي والتسليم الصوتي وتحليل التصوير المتابعة. كما هو مبين في الشكل 1 والشكل 2، يوفر هذا الإعداد درجة عالية من المرونة لتصميم سير عمل تجريبي مخصص ويسمح بالتعامل مع الحيوان في محطات مختلفة ، مما يسهل بدوره التجارب عالية الإنتاجية. لقد استخدمنا هذه التقنية لتسليم المخدرات الناجحة في xenografts الماوس من الورم الدبقي عالية الجودة مثل الورم الدبقي خط الوسط المنتشر.

تمت الموافقة على جميع التجارب في الجسم الحي من قبل اللجنة الأخلاقية الهولندية (رقم ترخيص AVD114002017841) وهيئة رعاية الحيوان في جامعة فريجي أمستردام، هولندا. تم تدريب المحققين على أساسيات نظام FUS من أجل تقليل الانزعاج من الحيوانات.

1. نظام الموجات فوق الصوتية المركزة

ملاحظة: الإعداد الموصوف هو نظام تعطيل BBB مضمن مبني استنادا إلى المكونات المتاحة تجاريا ويتضمن مخروطا مصنوعا خصيصا مطبوعا ثلاثي الأبعاد ومنصة مجسمة قابلة للفصل. تم تصميم النظام وحدات، مما يسهل التعديلات وفقا للمعدات المتاحة والاستخدام المحدد. يصف البروتوكول إجراء سونوبوبينيشن لمنطقة أكبر في منطقة بونتين في دماغ الفأر. من خلال ضبط الموقع المستهدف، يمكن استهداف أجزاء مختلفة من الدماغ. في هذه الدراسة تم استخدام محول أحادي العنصر 1 ميغاهرتز بطول بؤري يبلغ 75 مم وفتحة 60 مم ومنطقة بؤرية 1.5 × 1.5 × 5 مم (FWHM لضغط الذروة). يتم وضع الطائرة المحورية للمحول من خلال الجمجمة للحيوان في المستوى الأفقي المتقاطع مع قضبان الأذن.

1. حدد محول مناسب لفتح BBB في القوارض.
   ملاحظة: استنادا إلى خصائص microbubbles والتردد المستخدم، والإعدادات الصوتية، ولا سيما مؤشر الميكانيكية (MI)، عرضة للتغيير^13،38.
2. ضع المحول في المخروط المطبوع ثلاثي الأبعاد.
3. توظيف غشاء مايلر شفاف صوتيا في الطرف السفلي من المخروط لتحقيق اقتران صوتي لمسار انتشار شعاع، وملء المخروط مع الماء degassed.
4. جبل محول فوق الحيوان على مرحلة خطية الآلية كما هو مبين في الشكل 1 السماح لتحديد المواقع العمودي التلقائي للمحول.
5. تصميم منصة مجسمة قابلة للفصل على أساس متطلبات الدراسة ، والتي تشمل التدفئة المنظمة لدرجة الحرارة ، وقضبان العض والأذن ، والتخدير وعلامات fiducial متعددة الطرائق ، كما هو موضح في الشكل 1 والشكل 2. تركيب منصة مجسمة يتكون من نظام المرحلة الخطية 2D، والذي يسمح تحديد المواقع التلقائي الدقيق (< 0.1 ملم) من الحيوان تحت شعاع.
6. توصيل محول لسلسلة الانبعاثات الصوتية هو مبين في الشكل 1 تتكون من محول، مولد وظيفة ومكبر للصوت السلطة.
7. ابتكر خط أنابيب لمعالجة الصور للكشف عن العلامات الانشطارية متعددة الطرائق التي تسمح باستهداف دقيق لصهر منطقة الدماغ ذات الاهتمام وجمع بيانات التجويف التي يكتشفها الهيدروفون بالإبرة.
8. معايرة النظام وتحديد نقطة التركيز للمحول في المراسلات إلى تحديد المواقع الرأسية للحيوان على المنصة المجسمة.

2. إعداد الحيوان

ملاحظة: يتم تحديد البروتوكول التالي للفئران ولكن يمكن تكييفه للفئران. لهذه التجارب تم استخدام الفئران العارية الأنثوية Athymic Foxn1-/- (6-8 أسبوع من العمر).

1. السماح للحيوان بالتأقلم لمدة أسبوع واحد على الأقل في منشأة الحيوان ووزن الحيوان بانتظام.
2. إعطاء البوبرينورفين (0.05 ملغ / كغ) عن طريق الحقن تحت الجلد (ق.c.) 30 دقيقة قبل العلاج FUS لبدء العلاج المسكن.
3. تخدير الحيوان مع 3٪ isoflurane، 2 L/min O₂ والتحقق من أن الحيوان هو تخدير عميق. الحفاظ على تخدير الحيوانات خلال العملية برمتها ورصد وتيرة التنفس ومعدل ضربات القلب لضبط تركيز ايزوفلوران على النحو المطلوب.
4. تطبيق مرهم العين لمنع جفاف العينين وتجنب الإصابة المحتملة.
5. إزالة الشعر على الجزء العلوي من الرأس مع شفرة الحلاقة وكريم إزالة الشعر وغسل بعد ذلك بالماء لإزالة أي بقايا لتجنب تهيج في الجلد.
6. للتجارب مع نماذج الورم BLI, حقن 150 ميكرولتر من D-لوسيفيرين (30 ملغ / مل) داخل الصفاق (أي p.) مع حقنة الأنسولين 29 G لتوجيه صورة BLI.
7. أدخل قسطرة وريد ذيل 26-30 G وامسح القسطرة والوريد بحجم صغير من محلول الهيبارين (5 واجهة مستخدم / مل). ملء القسطرة مع محلول الهيبارين لتجنب تخثر الدم.
   ملاحظة: يتم رؤية قسطرة جيدة عندما يكون هناك ارتداد الدم في القسطرة. تجنب فقاعات الهواء في القسطرة لمنع الجمبولي. لتجنب الضغط المفرط للحقن، تأكد من أن طول القسطرة قصير قدر الإمكان.
8. ضع الحيوان على منصة مجسمة منظمة لدرجة الحرارة لتجنب انخفاض حرارة الجسم.
   ملاحظة: انخفاض حرارة الجسم يقلل من الدورة الدموية، والتي يمكن أن تؤثر على حقن / تداول الفقاعات الدقيقة والمستحضرات الدوائية للأدوية³⁹.
9. شل وإصلاح رأس الحيوان على منصة مجسمة باستخدام قضبان الأذن وشريط لدغة. تثبيت الجسم مع حزام والشريط ذيل الحيوان إلى المنصة.

3. في الجسم الحي صورة موجهة الموجات فوق الصوتية المركزة

ملاحظة: لهذا البروتوكول، استخدم محول أحادي العنصر 1 ميغاهرتز مع نبضة انفجار نغمي لمدة 10 مللي ثانية، وتردد تكرار نبضي قدره 1.6 هرتز مع 40 دورة لمدة 240 ثانية. تم تحسين البروتوكول للفقاعات الدقيقة التي استقرت بواسطة فوسفوليبيدات تحتوي على سداسي فلوريد الكبريت (SF₆₎كغاز غير ضار ، حيث يبلغ متوسط قطر الفقاعة 2.5 ميكرومتر وأكثر من 90٪ من الفقاعات أصغر من 8 ميكرومتر.

1. ضع المنصة المجسمة مع الحيوان المركب في طريقة التصوير (على سبيل المثال، BLI أو الأشعة السينية) واخذ صورة (صور) الحيوان.
2. استخدم العلامات الفقهية متعددة الطرائق مع خط أنابيب معالجة الصور لوضع علامة على موضع الحيوان وفقا لنقطة التركيز للمحول.
3. تحديد المنطقة المستهدفة عن طريق وضع مخطط الدماغ على صورة الأشعة السينية المكتسبة أو باستخدام صور BLI لتحديد مركز الورم(الشكل 2). يتم تحديد موضع أجزاء محددة من الدماغ في أطلس الدماغ Paxinos⁴⁰ باستخدام علامات الجمجمة bregma ولامدا كنقاط مرجعية. على سبيل المثال يقع pons x = - 1.0 ، ص = - 0.8 و ض = - 4.5 من lambda.
4. درع الخياشيم الحيوان والفم مع شريط لاصق لمنع هلام الموجات فوق الصوتية التدخل في التنفس.
5. تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية على رأس الحيوان.
6. تراجع الجلد من رقبة الحيوانات، تليين هيدروفون إبرة مع هلام الموجات فوق الصوتية ووضع هيدروفون إبرة في المنطقة المجاورة مباشرة من العظام القذالي.
7. توجيه محول إلى الموضع الصحيح باستخدام خط أنابيب معالجة الصور ونقطة التركيز.
8. تطبيق الإعدادات التي تم تكوينها مسبقا على جميع الأجهزة المرفقة واستهداف منطقة الدماغ من الفائدة.
   ملاحظة: اعتمادا على السؤال البحثي، يمكن أن يكون الورم أو مناطق الدماغ سونوبوسيتي كنقطة محورية واحدة أو شكل الحجمي، كما هو مبين في الشكل 2.
9. تنشيط الفقاعات الصغيرة كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. حقن بولوس واحد من 120 ميكرولتر (5.4 ميكروغرام) من الفقاعات الدقيقة.
10. قم بغسل قسطرة الوريد الذيل بالمحلول الملحي للتحقق من فتح القسطرة.
11. حقن الفقاعات الدقيقة وبدء الرنانة.
12. سجل التجويف microbubble مع هيدروفون إبرة.
13. إعطاء عامل تباين داخل الأوعية الدموية أو دواء بعد الصهر. الجرعة والتوقيت والتخطيط تعتمد على الغرض من الدراسة والمخدرات.
    ملاحظة: ايفانز الأزرق هو عامل اللون المشترك لتقييم BBB فتح⁴¹.
14. مراقبة الحيوان حتى نقطة زمنية محددة سلفا أو قبل نقطة النهاية الإنسانية.

4. تحليل التجويف الفقاعات الدقيقة

ملاحظة: هنا يتم وصف الإجراء المطبق، وهو مناسب للتجارب في الجسم الحي لSF₆-phospholipid microbubbles مع متوسط قطر 2.5 ميكرومتر (80٪ من الفقاعات تحت 8 ميكرومتر) متحمس مع نبض انفجار لهجة من 10مدة مللي ثانية على تردد 1 ميغاهرتز، كما اقترح أصلا من قبل McDannold وآخرون.

1. فورييه تحويل إشارة PCD المسجلة من المجال الزمني إلى مجال التردد.
2. دمج القوة الطيفية الناتجة للكشف عن التجويف مستقرة حول التوافقي^{2 nd} و 3^rd (± 50 كيلوهرتز)، كما هو مبين في الشكل 3 (مربع أخضر في 2 و 3 ميغاهرتز).
3. دمج القوة الطيفية للكشف عن التجويف القصور الذاتي، بين التردد الرئيسي، و2^nd، 3^rd التوافقي، و1^st و² ultraharmonic وأول شبه التوافقي (± 150 كيلوهرتز)، كما هو مبين في الشكل 3 (مربعات حمراء).
4. دمج القوة الطيفية حول التردد المبدئي (1 ميغاهرتز ± 50 كيلوهرتز) لتطبيع كل من إشارات PCD التي تم الحصول عليها سابقا.
   ملاحظة: إشارة PCD، لSF 6-phospholipid microbubbles في تجارب الجسم الحي في 1 ميغاهرتز، لا يعرض ultraharmonics أو subharmonics قبل مجموعات التجويف القصور الذاتي في، كما هو مبين في الشكل 3.

وقد استخدم نظام FUS الموصوف(الشكل 1 والشكل 2)وسير العمل المرتبط به في أكثر من 100 وأنتج بيانات قابلة للاستنساخ على الفئران السليمة والورم الحاملة. واستنادا إلى التجويف المسجل والكثافة الطيفية في التوافقيات في لحظة الذروة لحقن البولوس الميكروبابل، يمكن حساب القوة الطيفية لكل تردد باستخدام تحليل فورييه على النحو المبين في الخطوة 4 من البروتوكول. استنادا إلى البروتوكول الصوتي (1 ميغاهرتز، 10 مللي ثانية مدة النبض) مع MI من 0.4 في تركيبة مع microbubbles، الطيف الطاقة المتكاملة تطبيع في التوافقيات^{2 nd} و 3^rd تطبيع الطيف قوة متكاملة من تردد الإثارة لوحظ في الشكل 3. وقد وفر ذلك وسيلة حساسة وموثوقة للغاية للكشف عن التجويف المستقر، بالمقارنة مع عدم الكشف عن الحيوانات دون الصوتية عندما لم يتم حقن أي فقاعات صغيرة أو مراقبة التجويف القصور الذاتي عند تطبيق MI من 0.6. في حالة التجويف القصور الذاتي ، تم الكشف عن زيادة أرضية الضوضاء ذات النطاق العريض التي تصل إلى 25 ديسيبل بالإضافة إلى مظهر التوافقيات الفائقة و subharmonics. على الرغم من أن الضغط الصوتي ل MI من 0.4 و 0.6 لم يسفر عن أي ضرر بالمنظار ، إلا أنه تم إثبات تلف مجهري في MI من 0.6 ، كما هو موضح في الشكل 4. أدت زيادة أخرى في اتساع الضغط تصل إلى MI من 0.8 في نزيف الدماغ العياني من الأوعية الكبيرة وتحلل الأنسجة واسعة الانتشار مع البذخ من الكريات الحمراء. تطابقت النتائج النسيجية مع البيانات الصوتية من مستشعر التجويف السلبي ، كما هو موضح في الشكل 3، مما يؤكد الخصائص الضارة لتجويف القصور الذاتي لأنسجة الدماغ. ونتيجة لذلك، تم اختيار MI من 0.4 كسعة الضغط الآمن التي وفرت فتح BBB قابلة للاستنساخ للغاية، مع توفير هامش آمن لنظام التجويف القصور الذاتي، كما لوحظ قبل¹¹.

تم حقن الأزرق ايفانز الوريد للتحقق من صحة افتتاح BBB في منطقة بونتين. قوية الألبومين ملزمة من ايفانز الأزرق يؤدي إلى جزيء كبير من أكثر من 66 kDa⁴². على مستوى المهور وجزئيا المخيخ ، لوحظ البذخ من ايفانز الأزرق المقترنة الألبومين في الماوس تعامل مع FUS وmicrobubbles على النقيض من الماوس دون microbubbles (الشكل 5). وهذا يؤكد الاستهداف الدقيق للمنطقة ذات الاهتمام القائم على الملاحة المجسمة الموجهة بالصور مع نظام FUS الداخلي والبروتوكول الموصوف.

الشكل 1: إعداد الموجات فوق الصوتية المركزة.
(أ) تمثيل تخطيطي لإعداد الموجات فوق الصوتية المركزة. (ب) صورة لإعداد الموجات فوق الصوتية المركزة. يتكون النظام من محول محمول من أعلى إلى أسفل على مرحلة خطية 1D على مرحلة ثانية 2D لتحديد المواقع 3D التلقائي. تم بناء محول في مخروط شعاع مملوءة بالماء، مغلقة في الجزء السفلي مع غشاء مايلر شفافة صوتيا، الذي يجري الصوت إلى الجمجمة من الحيوان. يتصل المحول بمضخم طاقة، والذي يتصل بدوره بمولد شكل موجي عشوائي (AWG) لتوليد الإشارات. للكشف عن التجويف يتم استخدام الهيدروفون القابل للفصل مع مكبر للصوت منخفض الضوضاء الجهد. يتم وضع الهيدروفون في المنطقة المجاورة مباشرة للعظم القذالي. الهيدروفون الخارجي لديه سطح نشط 2 ملم ويقترن صوتيا مع هلام الموجات فوق الصوتية. يتم رقمنة كل من إشارة الجهد العالي لنبض الإثارة وكذلك إشارة التجويف المسجلة بواسطة منظار الذبذبة القياسي MHz 200 ونقلها إلى كمبيوتر التحكم (غير الموضح) للمعالجة على الطاير والتحكم في الوقت الحقيقي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: سير عمل الموجات فوق الصوتية المركزة.
سير العمل المقترح لنظام الموجات فوق الصوتية المركزة يبدأ مع (أ) تحديد المواقع الأولية للحيوان على منصة مجسمة للانفصال ، لاحظ تطبيق هلام الاقتران الصوتي (تطبيق آخر BLI / الأشعة السينية). في وقت واحد يمكن إجراء التصوير متعدد الوسائط لاستهداف. (ب)في أول تصوير بالأشعة السينية هو احتمال، في حين يمكن استهداف منطقة ذات أهمية بمساعدة مخطط للدماغ (والذي بدوره يشار إلى أطلس دماغ الماوس^40،تتكيف مع حجم وموقف الجمجمة). (ج)بدلا من ذلك، يمكن تطبيق صورة BLI لورم جليوما متوسط الإصابة منتشر مصاب باللوسيفراز مضافا على إسقاط الحد الأقصى للكثافة بالأشعة السينية للاستهداف. (د) في وقت لاحق، يتم تركيب منصة مجسمة مع الحيوان في موقف العلاج مع كل من الهيدروفون والمحول المرفقة. محول يدفع تلقائيا في موقف العلاج و sonicates المسار المختار بعد حقن بولس. تم تحسين النظام للتجارب عالية الإنتاجية ، حيث تسمح المنصات المتعددة بالعمل المتشابك ، كما هو موضح في الأعلى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: رصد التجويف.
(أ)الطيف الترددي لتجربة في الجسم الحي في غياب الإدارة microbubble في MI من 0.4 في 1 ميغاهرتز. (ب) هو الطيف المقابل في ذروة bolus بعد حقن microbubbles. لاحظ زيادة التوافقيات العليا ، وهو ما يدل على التجويف المستقر للفقاعات الدقيقة. (ج)الطيف المقابل لوحظ في أعلى MI من 0.6 بالاشتراك مع حقن microbubble، ضمن النطاق الانتقال إلى بداية التجويف القصور الذاتي، مما يؤدي إلى زيادة في الكلمة الضوضاء تصل إلى 25 ديسيبل وظهور ultraharmonics و subharmonics. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: فتح BBB وما يرتبط بها من الأنسجة.
(أ)التجويف مستقرة باستخدام MI من 0.4 يدل على parenchyma الدماغ سليمة في كل من المجهر الضوء الأبيض وانه المجهر الملون. (ب)بعد MI من 0.6 العلامات الأولى من تلف الأنسجة المحلية لا رجعة فيه من parenchyma الدماغ أصبح واضحا في البيانات النسيجية HE الملون. (ج)للضغط الميكانيكي أعلى من MI 0.8، نزيف العيان هو واضح وكذلك تحلل الأنسجة واسعة الانتشار من parenchyma الدماغ والبذخ من الكريات الحمراء بسبب نزيف صغير. اللون الأزرق في تنظير الضوء الأبيض يدل على البذخ من عامل التباين داخل الأوعية الدموية المشتركة ايفانز الأزرق مما يدل على فتح BBB (انظر الشكل 5 للحصول على عرض القوس). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التحقق من فتح BBB.
مظاهرة من فتح BBB ناجحة في نظام التجويف مستقرة(ب)مقارنة مع السيطرة (A)، لا حقن microbubbles. في هذه الحالة تم استخدام ايفانز الأزرق كعامل تباين داخل الأوعية الدموية. قوية الألبومين ملزمة من ايفانز الأزرق يؤدي إلى جزيء كبير من أكثر من 66 كيلودا. ونتيجة لذلك، فإن الأدلة على البذخ الأزرق إيفانز يدل على النقل شبه الخلوي عبر BBB بسبب فتح (جزئي) للتقاطعات الضيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في هذه الدراسة، وضعنا صورة فعالة من حيث التكلفة موجهة نظام FUS لتعطيل BBB عابرة لزيادة تسليم المخدرات في الدماغ parenchyma. وقد بني هذا النظام إلى حد كبير بمكونات متاحة تجاريا وبالتزامن مع الأشعة السينية وبلي. وتسمح الوحدات النمطية للتصميم المقترح باستخدام عدة طرائق تصوير للتخطيط والتقييم في مهام سير العمل عالية الإنتاجية. ويمكن الجمع بين النظام وطرائق التصوير ثلاثي الأبعاد الأكثر شمولا وعالية الاستبانة، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي عالي الدقة أو التصوير المقطعي الدقيق، في حين يتم استخدام معظم طرائق التصوير ثلاثي الأبعاد للدراسة مثل الأشعة السينية 2D و/أو BLI. الأشعة السينية 2D و / أو BLI على حد سواء أكثر فعالية من حيث التكلفة ، فضلا عن مثالية للدراسات ذات الحجم الكبير نظرا لأوقات اقتناء قصيرة كل منهما. محول الموصوفة هنا هو مناسبة تماما لإنتاج BBBD في مناطق أكبر (على مقياس دماغ الماوس) في أجزاء أعمق من الدماغ (و عدد 1.25). لقد استخدمنا نظام الأورام المتنامية منتشر في منطقة بونتين^43،44. لهذه المناطق حجم أكبر يحتاج إلى سونوبوتيونات التي تشمل منطقة الورم بأكملها في المهور. يمكن بسهولة تعديل النظام المعياري لأنواع أخرى من أورام الدماغ في أجزاء أكثر فوق tortorial من الدماغ. 10- ومن أجل البت في نوع المحول، ينبغي أن يراعي الرقم F والطول البؤري والتردد.

يقترح التصميم إجمالية بذلك اثنان تحسينات يقارن إلى تصاميم سابقا يقترح. (I) وكثيرا ما يستخدم حمام مائي لنقل الموجات فوق الصوتية من النظم العلاجية. لتطبيقات عبر الجمجمة في الحيوانات الصغيرة هذا النوع من النتائج تصميم في الاجهزة أكبر ومعكوس، حيث يتم غمر الحيوان جزئيا^11،22،25. في حين أن هذه التصاميم تعمل بشكل جيد للغاية بشكل عام في نطاق الدراسات الحيوانية الأصغر ، إلا أنها حل وسط فيما يتعلق بأوقات الإعداد وقابلية النقل والمعايير الصحية القابلة للحفاظ عليها واقعيا أثناء الاستخدام. وتكاد هذه الأخيرة، على وجه الخصوص، أهمية كبيرة في دراسات النطاق التي تشمل الحيوانات التي لا تتوفر فيها المناعة، وبالتالي المعايير الصحية الصارمة. ونتيجة لذلك ، من أجل تصميم نظام مع بصمة أكثر إحكاما ، ووقت إعداد أقصر ، وإمكانيات سهلة لإزالة التلوث وموقع طبيعي للحيوان خلال سير العمل بأكمله ، تم اختيار تصميم "من أعلى إلى أسفل". (II) كان خيار التصميم الثاني الذي يختلف عن العديد من التصاميم الموصوفة سابقا هو حذف التكامل المباشر لنظام التسليم الصوتي في نظام التصوير الطبي مثل التصوير بالرنين المغناطيسي أو التصوير المقطعي الدقيق^{15و17و18و19و45}. في حين أن الأنظمة المتكاملة تماما مثالية للدراسات الدوائية الطولية أو الأبحاث الاستكشافية على عدد محدود من الحيوانات ، فإن هذه الأجهزة عادة ما تكون أقل ملاءمة للدراسات الدوائية عالية الحجم بسبب التعقيد المتزايد بشكل كبير ، وارتفاع تكاليف التشغيل والحاجة إلى المشغلين المدربين / المهرة. وعلاوة على ذلك، تقتصر هذه النظم عموما على طريقة تصوير واحدة فقط. ونتيجة لذلك، يعتمد التصميم المقترح هنا على منصة مجسمة قابلة للفصل، والتي تتوافق مع العديد من طرائق التصوير (التصوير المقطعي الدقيق، والتصوير بالرنين المغناطيسي الحيواني الصغير، ومجموعة متنوعة من كاميرات BLI/fluorescence، وهذه مع أو بدون التصوير بالأشعة السينية المتكاملة) وتوفر أيضا علامات فقهية متعددة الطرائق للاندماج التلقائي لجميع بيانات الصور في إطار مرجعي مشترك لكل من التخطيط التدخلي وفتح BBB بعد المتابعة.

وفيما يتعلق بالاعتبارات العملية، فإن أهم نقطة فشل في الإجراء هي استقرار الفقاعات الصغيرة بسبب عمرها المحدود وطبيعتها الهشة. ونود أن نؤكد أن المناقشة التالية تتعلق بالفقاعات الصغيرة التي استقرت بواسطة الفوسفوليبيدات والتي تحتوي على سداسي فلوريد الكبريت (SF₆₎كغاز غير ضار^46،47، في حين أن تركيبات الفقاعات الدقيقة الأخرى ستعرض خصائص مختلفة بشكل عام.

التوقيت قبل حقن الفقاعات الدقيقة: يتراوح العمر المعلن عنه للفقاعات الصغيرة المتاحة تجاريا بعد إعادة الترطيب بين 3 و4 ساعات. في حين أن هذا مناسب لتطبيقات الموجات فوق الصوتية التشخيصية ، تجدر الإشارة إلى أنه خلال هذه الفترة بأكملها تفقد الفقاعات الدقيقة الغاز باستمرار وبالتالي فإن متوسط قطر الفقاعة يخضع للانجراف الهبوطي المستمر من متوسط الحجم الأولي البالغ 2.5 ميكرومتر. للتطبيقات العلاجية مثل BBBD بوساطة الموجات فوق الصوتية وهذا يعني توقيت أكثر صرامة الضرورات، لأن اتساع التذبذب من التجويف مستقرة (في تردد معين والضغط) والعتبة بداية التجويف القصور الذاتي هي نتيجة مباشرة تخضع أيضا لانجراف مستمر. من خلال تجربتنا ، لاحظنا أن الفقاعات الدقيقة تستخدم على أفضل وجه في غضون 30 دقيقة بعد الإماهة من أجل الحصول على نتائج قابلة للاستنساخ ، على غرار التقارير السابقة^48.

التوقيت بعد حقن الفقاعات الدقيقة: في الرئيسيات الكبيرة ، تظهر الفقاعات الدقيقة المتاحة تجاريا SF₆-phospholipid نصف عمر القضاء على بلازما الدم لمدة 6 دقائق تقريبا ويتم زفير أكثر من 80٪ من الغاز المدار عبر الرئتين بعد 11 دقيقة فقط⁴⁸. في الثدييات الصغيرة مثل الفئران والجرذان ، يكون نصف عمر القضاء على بلازما الدم لهذا النوع من الفقاعات الدقيقة في الجسم الحي أقصر بكثير من 90-120 ثانية بسبب ارتفاع معدل ضربات القلب^20. ونتيجة لذلك ، فإن الديناميكية السريعة لتركيز الفقاعات الدقيقة مباشرة بعد حقن البولوس والقضاء السريع على البلازما اللاحقة جنبا إلى جنب مع فقدان حجم الغاز المستمر للفقاعات تفرض متطلبات توقيت صارمة على بروتوكول سونيكيشن / الحقن من أجل الحصول على نتائج قابلة للتكرار في غضون فترة قصيرة من 3-4 دقائق بعد الحقن. تتطلب الإجراءات الأطول أو كميات أكبر من BBBD إدارة مستمرة للفقاعات الدقيقة. ومع ذلك ، فإن مثل هذا النهج معقد بسبب طفو الفقاعات في كل من الحقنة ونظام التغذية ، كما يقدم زيادة كبيرة في حجم الأموات عن طريق أنابيب التسريب المطلوبة. في تجربتنا الحل أبسط من تقسيم حجم الحقن الإجمالي إلى 2 إلى 3 جرعات فرعية أصغر قدمت نتائج قوية وقابلة للاستنساخ.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفقاعات الدقيقة حساسة للضغط للغاية ، وبالتالي لا يوصى بالضغط المائي العالي أثناء الحقن. الإبر الكبيرة (>19 G) ينصح لنقل الفقاعات الصغيرة في أنبوب بلاستيكي أو لوضع الفقاعات الدقيقة مع حقنة⁴⁹. ل i.v. الحقن في الفئران 26-30 ويوصى الإبر G; منذ الإبر أكبر هي أكثر صعوبة لإدراج في الوريد الذيل. ويوصى إبرة 26 G منذ الضغط الهيدروستاتيكي أقل مع هذه الإبرة. ومع ذلك، في حالة صعوبة الوصول الوريدي ينصح إبرة 30 G.

الجمجمة من الفأر هو مخفف مهم من سعة الضغط الذي يقلل بشكل كبير من اتساع الضغط في التركيز. يتم تحديد التوهين من خلال تردد محول وكثافة المتوسطة التي تنتشر بها الموجات فوق الصوتية. ارتفاع ترددات الموجات فوق الصوتية وكثافات الأنسجة العالية، مثل العظام يؤدي إلى تخفيف عالية. يتم امتصاص سعة الضغط جزئيا عن طريق العظام ويتم فقدان بعض سعة الضغط عن طريق الانعكاس وتشتت^50. في تجاربنا قررنا في الجثث الماوس أن التوهين في 1 ميغاهرتز هو 14.5 ± 1.3 ديسيبل / سم مع متوسط سمك الجمجمة من 0.9 ملم كما هو مبين قبل^21،50. يوصى بشدة بمراقبة التجويف نظرا لأن الفقاعات الدقيقة تعكس انبعاثات صوتية متميزة أثناء التجويف المستقر والتجويف القصور الذاتي. انبعاث النطاق العريض هو انبعاث صوتي متميز لتجويف القصور الذاتي^12. الرصد في الوقت الحقيقي يجعل من الممكن للكشف عن التجويف القصور الذاتي وخفض اتساع الضغط وفقا لذلك لتجنب تلف الأنسجة.

وصفت التقارير السابقة تأثير نوع التخدير على نفاذية BBB المحققة^11،31. بالنسبة للتخدير القائم على الأيزوفلوران ، يحدث توسع الأوعية بعد وقت قصير من بدء التخدير ، والذي يرتبط بانخفاض طفيف في تدفق الدم الدماغي. وعلاوة على ذلك، التخدير على مدى فترات طويلة، ولا سيما في غياب استقرار درجة الحرارة، يؤدي إلى انخفاض معدل ضربات القلب. وبما أن كلا العاملين يمكن أن يؤديا إلى تباين أكبر في التركيز الدماغي لكل من الفقاعات الدقيقة أو الأدوية التي تدار بشكل مشترك ، فمن المستحسن وجود بروتوكول تخدير صارم لتحقيق نتائج قابلة للاستنساخ^51. التخدير مع 1.5٪ v/v isoflurane في 2 L/min الأكسجين لمدة 35 إلى 45 دقيقةلم يكن إشكالية، كما نصح قسطنطينيدس وآخرون. على النقيض من McDannold وآخرون الذين أظهروا أن هذا الخليط الغاز بالاشتراك مع نوع معين من الفقاعات الصغيرة كانت إشكالية⁵²، لم نلاحظ مشاكل جديرة بالملاحظة مع هذا النوع من الفقاعات الصغيرة. بدلا من ذلك ، يمكن تخدير الحيوانات بمزيج من الكيتامين / الإكسيلازين ، والذي ليس له آثار فاسواكتيفي معروفة⁵³.

وباختصار، فإن تقنية فتح BBB الموجهة بالتصوير الموصوفة هنا قد استخدمت في دراسات تقييم الأدوية قبل السريرية عالية الحجم التي أظهرت كفاءة سير العمل المقترح. ويمكن بالتالي تشغيل النظام بواسطة موظفين غير تقنيين بعد تدريب قصير بسبب ارتفاع درجة التشغيل الآلي. وأدى ذلك، إلى جانب بساطة الإعداد، إلى درجة عالية من التوحيد القياسي، مما يضمن بدوره إمكانية إعادة الإنتاج التجريبية، وتقليل التباين داخل المجموعة، وبالتالي يسمح بتقليل حجم العينة المطلوبة.

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

تم تمويل هذا المشروع من قبل KWF-STW (تسليم المخدرات عن طريق سونوبواسيون في مرحلة الطفولة المنتشر بونتين جليوما وجليوما عالية الجودة). ونشكر اليا سكاتشكوف وتشارلز موجينوت على إسهامهما في تطوير النظام.