נוירון סטראוטקטי מונחה תפוקה גבוהה ומערכת אולטרסאונד ממוקדת לפתיחת מחסום דם-מוח במכרסמים

מחסום הדם - מוח (BBB) יכול להיות משובש באופן זמני עם אולטרסאונד ממוקד microbubble בתיווך (FUS). כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לפתיחת BBB בתפוקה גבוהה ב vivo באמצעות מערכת FUS מודולרית נגישה למומחים שאינם אולטרסאונד.

מחסום הדם - מוח (BBB) היה משוכה גדולה לטיפול במחלות מוח שונות. תאי אנדותל, המחוברים באמצעות צמתים הדוקים, יוצרים מחסום פיזיולוגי המונע ממולקולות גדולות (>500 Da) להיכנס לרקמת המוח. אולטרסאונד ממוקד בתיווך Microbubble (FUS) יכול לשמש כדי לגרום לפתיחת BBB מקומית חולפת, המאפשרת לתרופות גדולות יותר להיכנס לפרנצ'ימה במוח.

בנוסף למכשירים קליניים בקנה מידה גדול לתרגום קליני, מחקר פרה-קליני להערכת תגובה טיפולית של מועמדים לתרופות דורש הגדרות ייעודיות של אולטרסאונד לבעלי חיים קטנים לפתיחת BBB ממוקדת. רצוי, מערכות אלה מאפשרות זרימות עבודה בעלות תפוקה גבוהה הן עם דיוק מרחבי גבוה והן עם ניטור משולב של cavitation, ועדיין להיות חסכוני הן בהשקעה הראשונית והן בעלויות התפעול.

כאן, אנו מציגים ביולומינציה ורנטגן מונחה מערכת FUS בעלי חיים קטנים סטראוטקטיים המבוססת על רכיבים זמינים מסחרית וממלאת את הדרישות הנ"ל. דגש מיוחד הושם על רמה גבוהה של אוטומציה המאפשרת את האתגרים בדרך כלל נתקל במחקרים בנפח גבוה להערכת תרופות פרה-קוליניות. דוגמאות לאתגרים אלה הן הצורך בתקינה על מנת להבטיח שחזור נתונים, להפחית את השונות הפנים-קבוצתית, להקטין את גודל המדגם ובכך לעמוד בדרישות אתיות ולהפחית עומס עבודה מיותר. מערכת BBB המוצעת אומתה בהיקף של BBB פתיחת ניסויים אספקת תרופות הקלה על מודלים קסנוגרפט שמקורם בחולה של גליובלסטומה multiforme ו glioma קו בינוני מפוזר.

מחסום הדם - מוח (BBB) הוא מכשול מרכזי להעברת סמים לתוך parenchyma המוח. רוב התרופות הטיפוליות שפותחו אינן חוצות את ה- BBB בשל הפרמטרים הפיזיוכימיים שלהן (למשל, ליפופיליות, משקל מולקולרי, מקבלי קשר מימן ותורמים) או אינן נשמרות בשל זיקתן למובילי קולוקס במוח^1,2. הקבוצה הקטנה של תרופות שיכולות לחצות את BBB הם בדרך כלל מולקולות ליפופיליות קטנות, אשר יעילים רק במספר מוגבל של מחלות מוח^1,2. כתוצאה מכך, עבור רוב מחלות המוח, אפשרויות הטיפול הפרמקולוגי מוגבלות ואסטרטגיות אספקת תרופות חדשות נדרשות^3,4.

אולטרסאונד טיפולית היא טכניקה מתפתחת שניתן להשתמש בה עבור יישומים נוירולוגיים שונים כגון הפרעה BBB (BBBD), נוירומודולציה, אבלציה^4,5,6,7. על מנת להשיג פתיחת BBB עם פולט אולטרסאונד חוץ גשמי דרך הגולגולת, אולטרסאונד ממוקד (FUS) משולב עם microbubbles. תוצאות FUS בתיווך Microbubble הזמינות הביולוגית מוגברת של תרופות parenchyma המוח^5,8,9. בנוכחות גלי קול, microbubbles מתחילים להתנדנד ייזום transcytosis ושיבוש של הצמתים ההדוקים בין תאי האנדותל של BBB, המאפשר הובלה paracellular של מולקולות גדולות^{יותר 10}. מחקרים קודמים אישרו את המתאם בין עוצמת הפליטה האקוסטית לבין ההשפעה הביולוגית על פתיחת BBB^11,12,13,14. FUS בשילוב עם microbubbles כבר נעשה שימוש בניסויים קליניים לטיפול גליובלסטומה באמצעות temozolomide או דוסורוביצ'ין ליפוזומלי כסוכן כימותרפי, או לטיפול במחלת אלצהיימר וטרשת לרוחב amyotrophic^5,9,15,16.

מאז אולטרסאונד בתיווך BBB תוצאות אפשרויות חדשות לחלוטין עבור פרמקותרפיה, דרוש מחקר פרה-קליני לתרגום קליני כדי להעריך את התגובה הטיפולית של מועמדים נבחרים לתרופות. פעולה זו דורשת בדרך כלל זרימת עבודה בעלת תפוקה גבוהה עם דיוק מרחבי גבוה ועדיף זיהוי cavitation משולב לניטור פתיחת BBB ייעודית עם יכולת רבייה גבוהה. במידת האפשר, מערכות אלה צריכות להיות חסכוניות הן בהשקעה הראשונית והן בעלויות התפעול על מנת להיות מדרגיות בהתאם לגודל המחקר. רוב מערכות FUS פרה-קוליניות משולבות עם MRI להנחיית תמונה ותכנון טיפול^15,17,18,19. למרות MRI נותן מידע מפורט על האנטומיה הגידול ונפח, זוהי טכניקה יקרה, אשר מבוצעת בדרך כלל על ידי מפעילים מאומנים / מיומנים. בנוסף, MRI ברזולוציה גבוהה לא תמיד יכול להיות זמין לחוקרים במתקנים פרה-קוליניים ודורש זמני סריקה ארוכים לכל בעל חיים, מה שהופך אותו פחות מתאים למחקרים תרופתיים בתפוקה גבוהה. ראוי לציין כי, עבור מחקר פרה-קליני בתחום הנוירו-אונקולוגיה, במיוחד מודלים של גידולים מסתננים, האפשרות לדמיין ולמקד את הגידול חיונית להצלחת הטיפול²⁰. נכון לעכשיו, דרישה זו מתקיימת רק על ידי MRI או על ידי גידולים transduced עם photoprotein, המאפשר הדמיה עם הדמיה bioluminescence (BLI) בשילוב עם ניהול של מצע photoprotein.

מערכות FUS מונחות MRI משתמשות לעתים קרובות באמבט מים כדי להבטיח התפשטות גלי אולטרסאונד ליישומים טרנס-קרניים, לפיה ראש החיה שקוע בחלקו במים, מה שמכונה מערכות 'מלמטה למעלה'^15,17,18. בעוד עיצובים אלה עובדים בדרך כלל היטב במחקרים בבעלי חיים קטנים יותר, הם פשרה בין זמני הכנת בעלי חיים, ניידות ותקנים היגייניים הניתנים לתחזוקה מציאותית במהלך השימוש. כחלופה MRI, שיטות הדרכה אחרות לניווט סטראוטקטי להקיף את השימוש אטלס אנטומי מכרסמים^21,22,23, מצביע לייזר סייע ראייה^{חזותית 24}, סיכה בסיוע מכשיר סריקה מכני²⁵, או BLI²⁶. רוב העיצובים הללו הם מערכות "מלמעלה למטה" שבהן המתמר ממוקם על ראשו של בעל החיים, כאשר החיה נמצאת במצב טבעי. זרימת העבודה 'מלמעלה למטה' מורכבת מאמבט מים^22,25,26 או חרוט מלא מים^21,24. היתרון של שימוש במתמר בתוך חרוט סגור הוא טביעת הרגל הקומפקטית יותר, זמן התקנה קצר יותר ואפשרויות טיהור ישר קדימה המפשטות את זרימת העבודה כולה.

האינטראקציה של השדה האקוסטי עם microbubbles הוא תלוי בלחץ נע בין תנודות משרעת נמוכה (המכונה cavitation יציב) כדי התמוטטות בועה חולפת (המכונה cavitation אינרציאלי)^27,28. יש קונצנזוס מבוסס כי אולטרסאונד-BBBD דורש לחץ אקוסטי הרבה מעל סף cavitation יציב כדי להשיג BBBD מוצלח, אבל מתחת לסף cavitation אינרציאלי, אשר קשורה בדרך כלל עם נזק כלי דם / עצביים²⁹. הצורה הנפוצה ביותר של ניטור ובקרה היא ניתוח של האות האקוסטי המפוזר (האחורי) באמצעות זיהוי cavitation פסיבי (PCD), כפי שהוצע על ידי McDannold ואח^'12. PCD מסתמך על ניתוח ספקטרום פורייה של אותות פליטת microbubble, שבו הכוח והמראה של סימני ההיכר cavitation יציב (הרמוניקה, subharmonics, ו ultraharmonics) וסמני cavitation אינרציאלי (תגובת פס רחב) ניתן למדוד בזמן אמת.

"מידה אחת מתאימה לכולם" PCD-ניתוח לבקרת לחץ מדויקת מסובך בשל polydispersity של ניסוח microbubble (משרעת תנודה תלויה מאוד בקוטר הבועה), ההבדלים בתכונות מעטפת בועה בין מותגים, ואת התנודה האקוסטית, אשר תלוי מאוד בתדירות ולחץ^30,31,32. כתוצאה מכך, הוצעו פרוטוקולי זיהוי PCD רבים ושונים, אשר הותאמו לשילובים מסוימים של כל הפרמטרים הללו ושימשו בתרחישי יישומים שונים (החל מניסויים במבחנה על פרוטוקולים קטנים של בעלי חיים ועד PCD לשימוש קליני) לגילוי cavitation חזק ואפילו לבקרת משוב רטרואקטיבית של הלחץ^{11,14,30,31,32,33,34,35}. פרוטוקול PCD המועסקים בהיקף של מחקר זה נגזר ישירות מ McDannold ואח^'12 ומנטר את הפליטה ההרמונית לנוכחות של cavitation יציב ורעש פס רחב לגילוי cavitation אינרציאלי.

פיתחנו מערכת FUS נוירון מונחה תמונה לפתיחה חולפת של BBB כדי להגדיל את אספקת הסמים לתוך parenchyma המוח. המערכת מבוססת על רכיבים מסחריים זמינים וניתן להתאים אותה בקלות למספר שיטות הדמיה שונות, בהתאם לטכניקות ההדמיה הזמינות במתקן בעלי החיים. מכיוון שאנו זקוקים לזרימת עבודה בעלת תפוקה גבוהה, בחרנו להשתמש בצילום רנטגן ו- BLI להנחיית תמונה ותכנון טיפול. תאים סרטניים שעברו עירוי עם פוטופרוטאין (למשל, לוציפראז) מתאימים להדמיית BLI²⁰. לאחר מתן מצע photoprotein, תאים סרטניים ניתן לפקח vivo וצמיחה הגידול ואת המיקום ניתן לקבוע^20,36. BLI הוא מודאליות הדמיה בעלות נמוכה, הוא מאפשר לעקוב אחר הגידול לאורך זמן, יש לו זמני סריקה מהירים והוא מתואם היטב עם צמיחת הגידול נמדד עם MRI^36,37. בחרנו להחליף את אמבט המים בקונוס מלא מים המחובר לתמר כדי לאפשר גמישות להזיז בחופשיות את הפלטפורמה שעליה רכוב המכרסם^8,24. העיצוב מבוסס על פלטפורמה נתיקת המצוידת בשילוב של (I) סמנים סטריאוטקטיים לבעלי חיים קטנים (II) עם מערכת חימום בעלי חיים מווסתת רנטגן ותמונות אופטיות (III) הניתנת להסרה מהירה, ומערכת חימום בעלי חיים משולבת (IV). לאחר האינדוקציה הראשונית של הרדמה, החיה מותקנת במיקום מדויק על הרציף שבו היא נשארת במהלך ההליך כולו. כתוצאה מכך, האסדה כולה עוברת את כל התחנות של זרימת העבודה של ההתערבות כולה, תוך שמירה על מיקום מדויק וניתן לשחזור והרדמה מתמשכת. תוכנת הבקרה מאפשרת זיהוי אוטומטי של סמני fiducial ורושמת באופן אוטומטי את כל סוגי התמונות ודרכי התמונה (כלומר, מיקרו-CT, רנטגן, BLI והדמיה פלואורסצנטית) למסגרת הייחוס של הפלטפורמה הסטראוטקטית. בעזרת הליך כיול אוטומטי, אורך המוקד של מתמר אולטרסאונד ידוע בדיוק בפנים, המאפשר היתוך אוטומטי של תכנון התערבותי, משלוח אקוסטי וניתוח הדמיה מעקב. כפי שמוצג באיור 1 ובאיור 2, הגדרה זו מספקת רמה גבוהה של גמישות בתכנון זרימות עבודה ניסיוניות ייעודיות ומאפשרת טיפול משולב בבעלי החיים בתחנות שונות, מה שמאפשר ניסויים בתפוקה גבוהה. השתמשנו בטכניקה זו להעברת סמים מוצלחת בקסנוגרפטים של עכברים של גליומה ברמה גבוהה כגון גליומה דו-קוית מפוזרת.

כל הניסויים ב vivo אושרו על ידי ועדת האתיקה ההולנדית (מספר רישיון היתר AVD114002017841) ואת הגוף לרווחת בעלי חיים של אוניברסיטת Vrije אמסטרדם, הולנד. החוקרים הוכשרו ביסודות מערכת FUS על מנת למזער את אי הנוחות של בעלי החיים.

1. מערכת אולטרסאונד ממוקדת

הערה: ההתקנה המתוארת היא מערכת שיבוש BBB מובנית המבוססת על רכיבים זמינים מסחרית וכוללת חרוט בהתאמה אישית בהדפסה תלת-ממדית ופלטפורמה סטראוטקטית הניתנת להסרה. המערכת מתוכננת מודולרית, המאפשרת שינויים בהתאם לציוד הזמין ושימוש ספציפי. הפרוטוקול מתאר את ההליך עבור sonoporation של שטח גדול יותר באזור פונטין של מוח העכבר. על ידי התאמת מיקום היעד, חלקים שונים של המוח יכולים להיות ממוקדים. במחקר זה נעשה שימוש במתמר מונו-אלמנט של 1 מגה-הרץ באורך מוקד של 75 מ"מ, צמצם של 60 מ"מ ואזור מוקד של 1.5 x 1.5 x 5 מ"מ (FWHM של לחץ שיא). מישור המוקד של המתמר ממוקם דרך הגולגולת של החיה במישור האופקי המצטלב עם מוטות האוזן.

1. בחר מתמר מתאים לפתיחת BBB במכרסמים.
   הערה: בהתבסס על המאפיינים של microbubbles ואת התדירות המועסקים, ההגדרות האקוסטיות, במיוחד את האינדקס המכני (MI), כפופים^{לשינויים 13,38}.
2. הנח את המתמר בקונוס המודפס בתלת-ממד.
3. השתמש קרום מיילר שקוף אקוסטית בקצה התחתון של החרוט כדי להשיג צימוד אקוסטי של נתיב התפשטות הקרן, ולמלא את הקונוס עם מים degassed.
4. הר את המתמר מעל החיה על במה ליניארית ממונעת כפי שמוצג באיור 1 ומאפשר מיקום אנכי אוטומטי של המתמר.
5. תכננו פלטפורמה סטראוטקטית נתיקת המבוססת על דרישות המחקר, הכוללת מוטות חימום, ביס ואוזן מווסתים בטמפרטורה, הרדמה וסמנים פידוקאליים רב-מודאליים, כפי שמוצג באיור 1 ובאיור 2. ההרכבה של הפלטפורמה הסטריאוטקטית מורכבת ממערכת שלבים ליניארית דו-מימדית, המאפשרת מיקום אוטומטי מדויק (< 0.1 מ"מ) של החיה מתחת לקורה.
6. חבר את המתמר לשרשרת הפליטה האקוסטית המוצגת באיור 1 המורכבת ממתמר, מחולל פונקציות ומגבר חשמל.
7. לתכנן צינור עיבוד תמונה כדי לזהות את סמנים fiducial רב מודאלי המאפשר מיקוד sonoporation מדויק של אזור המוח של עניין ואיסוף של נתוני cavitation זוהה על ידי הידרופון המחט.
8. כייל את המערכת וקבע את נקודת המיקוד של המתמר בהתכתבות עם מיקום אנכי של החיה בפלטפורמה הסטריאוטקטית.

2. הכנת בעלי חיים

הערה: הפרוטוקול הבא מצוין עבור עכברים אך ניתן להתאים אותו לחולדות. עבור ניסויים אלה נעשה שימוש בעכברים בעירום אתימי נקבה Foxn1-/- (בן 6-8 שבועות).

1. אפשרו לבעל החיים להתאקלם לפחות שבוע במתקן החיות ולשקול את החיה באופן קבוע.
2. ניהול buprenorphine (0.05 מ"ג /ק"ג) באמצעות הזרקה תת עורית (s.c.) 30 דקות לפני הטיפול FUS כדי להתחיל טיפול משכך כאבים.
3. יש להרדים את החיה עם 3% isoflurane, 2 L/min O₂ ולוודא כי החיה מורדמת עמוקות. שמור על בעלי החיים מורדמים במהלך כל ההליך ולפקח על תדירות הנשימה ואת קצב הלב כדי להתאים את הריכוז של isoflurane כנדרש.
4. יש למרוח משחת עיניים כדי למנוע עיניים יבשות ולמנוע פגיעה אפשרית.
5. הסר שיער על החלק העליון של הראש עם סכין גילוח קרם depilatory לשטוף לאחר מכן עם מים כדי להסיר את כל השאריות, כדי למנוע גירוי על העור.
6. לניסויים עם מודלים גידול BLI, להזריק 150 μL של D-לוציפרין (30 מ"ג / מ"ל) תוך-פיטוני (i.p.) עם מזרק אינסולין 29 G עבור BLI תמונה הדרכה.
7. הכנס קטטר וריד זנב 26-30 G ורוקן את הקטטר והווריד עם נפח קטן של פתרון הפרין (5 ממשק משתמש / מ"ל). ממלאים את הקטטר בתמיסת הפרין כדי למנוע קרישת דם.
   הערה: צנתור טוב נראה כאשר יש ריפלוקס של דם לתוך הקטטר. הימנע בועות אוויר בקטטר כדי למנוע emboli. כדי למנוע לחץ הזרקה מוגזם, ודא את אורך הקטטר הוא קצר ככל האפשר.
8. מניחים את החיה על הפלטפורמה הסטריאוטקטית המווסתת בטמפרטורה כדי למנוע היפותרמיה.
   הערה: היפותרמיה מפחיתה את זרימת הדם, אשר יכול להשפיע על הזרקה / זרימת הדם של microbubbles ואת הפרמקוקינטיקה של התרופות³⁹.
9. לשתק ולתקן את הראש של החיה על הפלטפורמה הסטריאוטיפית באמצעות מוטות אוזניים ובר ביס. מקובעים את הגופה ברצועה ומדביקים את זנב החיה לרציף.

3. באולטרסאונד ממוקד מונחה תמונה vivo

הערה: עבור פרוטוקול זה מתמר מונו-אלמנט 1 MHz עם דופק פרץ טון עם משך 10 ms, MI של 0.4 ותדר חזרה על הדופק של 1.6 הרץ עם 40 מחזורים עבור 240 s שימש. הפרוטוקול מותאם למיקרו-בועות המיוצבות על ידי פוספוליפידים המכילים הקספלואוריד גופרית (SF₆₎כגז בלתי מזיק, לפיו קוטר הבועה הממוצע הוא 2.5 מיקרומטר ויותר מ -90% מהבועות קטנות מ -8 מיקרומטר.

1. הנח את הפלטפורמה הסטריאוטקטית עם החיה הרכובה במדולי ההדמיה(למשל, BLI או רנטגן) וצלם תמונות של החיה.
2. השתמש בסמנים פידוקאליים רב-מודאליים בשילוב עם צינור עיבוד התמונה כדי לסמן את מיקום החיה בהתאם לנקודת המוקד של המתמר.
3. קבעו את אזור היעד על ידי הצבת קו מתאר של המוח מעל תמונת הרנטגן הנרכשת או שימוש בתמונות BLI כדי לקבוע את מרכז הגידול (איור 2). המיקום של חלקים מסוימים של המוח מצוינים אטלס המוח Paxinos⁴⁰ באמצעות סימוני הגולגולת bregma ו lambda כנקודות התייחסות. לדוגמה, ה-pons ממוקם x=-1.0, y=-0.8 ו- z=-4.5 ממבדה.
4. להגן על הנחיריים והפה של החיה עם סרט דבק כדי למנוע ג'ל אולטרסאונד להפריע לנשימה.
5. החל ג'ל אולטרסאונד על ראשה של החיה.
6. לחזור בו מעור צווארם של בעלי החיים, לשמן את המחט הידרופון עם ג'ל אולטרסאונד ומניחים את ההידרופון המחט בסביבה הישירה של עצם העורף.
7. הנחה את המתמר למיקום הנכון באמצעות צינור עיבוד התמונה ונקודת המוקד.
8. החל את ההגדרות שנקבעו מראש על כל המכשירים המחוברים ולמקד את אזור המוח של עניין.
   הערה: בהתאם לשאלת המחקר, ניתן לציין אזורי גידול או מוח כמוקד יחיד או כצורה נפחית, כפי שמוצג באיור 2.
9. הפעל microbubbles כמתואר על ידי היצרן. להזריק בולוס אחד של 120 μL (5.4 מיקרוגרם) של microbubbles.
10. לשטוף את קטטר וריד הזנב עם מלוחים כדי לבדוק את פתיחת הקטטר.
11. להזריק את microbubbles ולהתחיל את ההסתבכות.
12. הקלט קיבוץ מיקרו-בובל עם ההידרופון של המחט.
13. לנהל סוכן ניגודיות תוך וסקולרי או תרופה לאחר sonoporation. המינון, העיתוי והתכנון תלויים במטרת המחקר והתרופה.
    הערה: כחול אוונס הוא סוכן צבע נפוץ להעריך BBB פתיחת⁴¹.
14. לפקח על החיה עד לנקודת הזמן שנקבעה מראש או לפני נקודת הקצה ההומנית.

4. ניתוח של cavitation microbubble

הערה: כאן מתואר ההליך החל, אשר מתאים ניסויים vivo עבור SF₆-phospholipid microbubbles עם קוטר ממוצע של 2.5 מיקרומטר (80% של בועות מתחת 8 מיקרומטר) נרגש עם דופק פרץ טון של 10 ms משך בתדירות של 1 MHz, כפי שהוצע במקור על ידי McDannold ואח^'.

1. Fourier-להפוך את אות PCD מוקלט מקבוצת הזמן לתוך תחום התדירות.
2. שלב את העוצמה הספקטרלית המתקבלת לגילוי יציבות של cavitation סביב^{ההרמוניה} השנייה^{והשלישית} (± 50 קילו-הרץ), כפי שמוצג באיור 3 (תיבה ירוקה ב- 2 ו- 3 מגה-הרץ).
3. שלבו את העוצמה הספקטרלית לגילוי קוויציה אינרציאלי, בין התדר הראשי, ההרמוניה^{2 nd},^{3rd, ה-} 1 st ו- 2^nd ultraharmonic והתת-הרמוני הראשון (± 150 קילו-הרץ), כפי שמוצג באיור 3 (תיבות אדומות).
4. שלב את העוצמה הספקטרלית סביב התדר העקרוני (1 מגה-הרץ ± 50 קילו-הרץ) לנורמליזציה של אותות PCD שהושגו בעבר.
   הערה: אות ה-PCD, עבור מיקרו-בועות SF₆-פוספוליפידים בניסויי vivo במהירות של 1 מגה-הרץ, אינו מציג אולטרה-הרמוניה או תת-הרמוניה לפני שההתלכדות האינרטיבית מופיעה, כפי שמוצג באיור 3.

מערכת FUS המתוארת (איור 1 ואיור 2) וזרימת העבודה המשויכת שימשו ביותר מ-100 בעלי חיים והפיקו נתונים הניתנים לשחזור הן על עכברים בריאים והן על עכברים הנושאים גידולים. בהתבסס על cavitation נרשם ואת הצפיפות הספקטרלית בהרמוניה ברגע השיא של הזרקת בולוס microbubble, הכוח הספקטרלי של כל תדר ניתן לחשב באמצעות ניתוח פורייה כפי שהוסבר בשלב 4 של הפרוטוקול. בהתבסס על הפרוטוקול האקוסטי (1 מגה-הרץ, משך פעימה של 10 אלפיות השנייה) עם MI של 0.4 בשילוב עם microbubbles, ספקטרום הכוח המשולב המנורמל בהרמוניות² ו-3^rd נרמל את ספקטרום הכוח המשולב של תדר העירור שנצפה באיור 3. זה סיפק אמצעי רגיש מאוד ואמין של גילוי cavitation יציב, בהשוואה ללא זיהוי של subharmonics כאשר לא הוזרקו microbubbles או תצפית של cavitation אינרציאלי כאשר MI של 0.6 הוחל. במקרה של cavitation אינרציאלי, רצפת רעש רחבה מוגברת של עד 25 dB זוהה, כמו גם את המראה של אולטרה הרמוניה subharmonics. למרות שלחץ אקוסטי של MI של 0.4 ו-0.6 לא גרם לנזק מקרוסקופי, נזק מיקרוסקופי הוכח באופן היסטולוגי ב MI של 0.6, כפי שמוצג באיור 4. עלייה נוספת של משרעת הלחץ עד MI של 0.8 הביא דימום מוחי מקרוסקופי של כלי גדול יותר תמוגה רקמה התפשטות רחבה עם פזרנות של אריתרוציטים. הממצאים ההיסטולוגיים תאמו את הנתונים האקוסטיים של חיישן cavitation הפסיבי, כפי שמוצג באיור 3, המאשרים את המאפיינים המזיקים של cavitation אינרציאלי של רקמת המוח. כתוצאה מכך, MI של 0.4 נבחר משרעת הלחץ הבטוח שסיפקה פתיחת BBB רבייה מאוד, תוך מתן מרווח בטוח למשטר cavitation אינרציאלי, כפי שנצפה לפני¹¹.

כחול אוונס תוך ורידי הוזרק כדי לאמת את הפתיחה של BBB באזור פונטין. האלבום החזק של כחול אוונס מוביל למולקולה גדולה של יותר מ 66 kDa⁴². ברמה של pons ובחלקו המוח הקטן, פזרנות של אלבומין כחול מצומד אוונס נצפתה בעכבר שטופלו FUS ו microbubbles בניגוד לעכבר ללא microbubbles (איור 5). זה מדגיש את המיקוד המדויק של אזור העניין המבוסס על ניווט סטראוטקטי מונחה תמונה עם מערכת FUS לבנות בתוך הבית ואת הפרוטוקול המתואר.

איור 1: הגדרת אולטרסאונד ממוקדת.
(A)ייצוג סכמטי של אולטרסאונד ממוקד להגדיר. (B) תמונה של הגדרת אולטרסאונד ממוקדת. המערכת מורכבת מתמר רכוב מלמעלה למטה על שלב ליניארי 1D על שלב 2D השני עבור מיקום 3D אוטומטי. המתמר בנוי בקונוס קרן מלא מים, סגור בתחתית עם קרום מיילר שקוף אקוסטית, אשר מוליך את הצליל לגולגולת של החיה. המתמר מחובר למגבר הספק, המחובר בתורו למחולל צורת גל שרירותי (AWG) ליצירת אותות. לזיהוי cavitation נעשה שימוש בהידרופון נתיק בשילוב עם מגבר מתח רעש נמוך. ההידרופון ממוקם בסביבה הישירה של עצם העורף. הידרופון חיצוני יש משטח פעיל 2 מ"מ והוא בשילוב אקוסטי עם ג'ל אולטרסאונד. הן אות המתח הגבוה של פעימת העירור והן אות cavitation המוקלט עוברים דיגיטציה על ידי אוסילוסקופ סטנדרטי של 200 מגה-הרץ ומועברים למחשב בקרה (לא מוצג) לעיבוד תוך כדי תנועה ובקרה בזמן אמת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: זרימת עבודה ממוקדת של אולטרסאונד.
זרימת העבודה המוצעת של מערכת אולטרסאונד ממוקדת מתחילה עם (A) המיקום הראשוני של בעלי חיים על פלטפורמה סטראוטקטית נתיקה, שים לב ליישום של ג'ל צימוד אקוסטי (מיושם פוסט BLI / רנטגן). בו זמנית הדמיה רב-מודאלית יכולה להתבצע עבור פילוח. (B) בהתחלה הדמיית רנטגן היא אפשרות, ואילו אזור של עניין יכול להיות ממוקד בעזרת קו מתאר של המוח (אשר בתורו מוזכר אטלס המוח העכבר⁴⁰, מותאם לגודל ויציבה של הגולגולת). (C) לחלופין, ניתן להחיל תמונת BLI של גידול גליומה מפוזרת של קו האמצע של לוציפראז על הקרנת רנטגן בעוצמה מקסימלית עבור מיקוד. (D)לאחר מכן, הפלטפורמה הסטריאוטיפית מותקנת עם החיה במצב טיפולי עם הידרופון ומתמר מחוברים. המתמר נוהג באופן אוטומטי בתנוחת טיפול ו sonicates המסלול שנבחר לאחר הזרקת בולוס. המערכת ממוטבת לניסויים בעלי תפוקה גבוהה, לפיה פלטפורמות מרובות מאפשרות עבודה משולבת, כפי שמוצג למעלה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ניטור Cavitation.
(A)ספקטרום התדרים של ניסוי in vivo בהיעדר ניהול microbubble ב MI של 0.4 ב 1 MHz. (B) מוצג הוא הספקטרום המתאים בשיא בולוס לאחר הזרקת microbubbles. שים לב לעלייה של הרמוניות גבוהות יותר, אשר מעיד על cavitation יציב של microbubbles. (C) ספקטרום מתאים נצפה ב MI גבוה יותר של 0.6 בשילוב עם הזרקת microbubble, בתוך רצועת המעבר להתפרצות של cavitation אינרציאלי, המוביל לעלייה ברצפת רעש עד 25 dB ואת המראה של ultraharmonics ו subharmonics. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: פתיחת BBB והיסטולוגיה משויכת.
(A) cavitation יציב באמצעות MI של 0.4 עדות parenchyma המוח שלם הן מקרוסקופיה אור לבן ו HE מוכתם מיקרוסקופיה. (B) לאחר MI של 0.6 סימנים ראשונים של נזק רקמות בלתי הפיך מקומי של parenchyma המוח מתגלה בנתונים היסטולוגיים מוכתמים HE. (C) עבור לחץ מכני גבוה עוד יותר של MI 0.8, דימום מקרוסקופי ניכר, כמו גם תמוגה רקמות התפשטות רחבה של parenchyma המוח ואת פזרנות של אריתרוציטים עקב דימום מיקרו. הגוון הכחול במקרוסקופיית האור הלבן מעיד על פזרנות של סוכן הניגודיות התוך-וסקולרית המוזרק במשותף אוונס כחול המציין פתיחת BBB (ראה איור 5 לתצוגה קשתית). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: אימות פתיחת BBB.
הדגמה של פתיחת BBB מוצלחת במשטר ההסתעפות היציב (B) בהשוואה לשליטה (A), לא הוזרקו מיקרו-ביבים. במקרה זה כחול אוונס שימש כסוכן ניגודיות תוך-וסקולרי. כריכת האלבומין החזקה של כחול אוונס מובילה למולקולה גדולה של יותר מ-66 kDa. כתוצאה מכך, עדות לפזרנות הכחולה של אוונס מעידה על הובלה paracellular על פני BBB עקב פתיחה (חלקית) של הצמתים ההדוקים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

במחקר זה, פיתחנו מערכת FUS מבוססת תמונה חסכונית עבור שיבוש BBB חולף לאספקת תרופות מוגברת לתוך parenchyma המוח. המערכת נבנתה ברובה עם רכיבים מסחריים זמינים בשילוב עם רנטגן ו- BLI. המודולריות של העיצוב המוצע מאפשרת שימוש במספר שיטות הדמיה לתכנון והערכה בתזומות עבודה בעלות תפוקה גבוהה. המערכת יכולה להיות משולבת עם אופנים מקיפים יותר ברזולוציה גבוהה הדמיה תלת-ממדית, למשל MRI ברזולוציה גבוהה או מיקרו-CT, ואילו עבור החלק הארי של המחקר 2D הדמיה אופנים כגון רנטגן 2D ו / או BLI משמשים. רנטגן דו מימדי ו/או BLI הם שניהם הרבה יותר חסכוניים, כמו גם אידיאלי עבור מחקרים בנפח גבוה בשל זמני הרכישה הקצרים שלהם בהתאמה. המתמר המתואר כאן מתאים היטב לייצר BBBD באזורים גדולים יותר (בקנה מידה של מוח עכבר) בחלקים עמוקים יותר של המוח (מספר f של 1.25). השתמשנו במערכת לגידולים הגדלים באופן מפוזר באזור פונטין^43,44. עבור אזורים אלה נפח גדול יותר צריך להיות sonoporated המקיף את כל אזור הגידול ב pons. המערכת המודולרית יכולה בקלות להיות מותאמת עבור סוגים אחרים של גידולים במוח בחלקים על-מנת יותר של המוח. על מנת להחליט על סוג מתמר אחד צריך להחזיק בחשבון את מספר f, אורך מוקד ותדירות.

העיצוב הכולל מציע ובכך שני עידונים לעומת עיצובים שהוצעו בעבר. (I) לעתים קרובות אמבט מים משמש להעברת גל אולטרסאונד של מערכות טיפוליות. עבור יישומים transcranial בבעלי חיים קטנים סוג זה של עיצוב תוצאות הגדרות גדולות והפותות, לפיה החיה שקועה חלקית^11,22,25. בעוד עיצובים אלה עובדים בדרך כלל טוב מאוד בהיקף של מחקרים בבעלי חיים קטנים יותר, הם פשרה לגבי זמני ההתקנה, ניידות ותקנים היגייניים הניתנים לתחזוקה מציאותית במהלך השימוש. בפרט האחרון הוא בעל חשיבות רבה במחקרי ההיקף המקיפים בעלי חיים immunocompromised ובכך סטנדרטים היגייניים מחמירים. כתוצאה מכך, על מנת לעצב מערכת עם טביעת רגל קומפקטית יותר, זמן התקנה קצר יותר, אפשרויות טיהור קלות ומיקום טבעי של החיה במהלך כל זרימת העבודה, נבחר עיצוב "מלמעלה למטה". (II) הבחירה העיצובית השנייה השונה מכמה עיצובים שתוארו קודם לכן הייתה להשמיט את האינטגרציה הישירה של מערכת האספקה האקוסטית למערכת הדמיה רפואית כגון MRI או מיקרו CT^{15,17,18,19,45}. בעוד שמערכות משולבות במלואן הן אידיאליות למחקרים פרמקוקינטיים אורך או מחקר אקספלורטיבי על מספר מצומצם של בעלי חיים, הגדרות כאלה בדרך כלל פחות מתאימות למחקרים תרופתיים בנפח גבוה בשל מורכבות מוגברת במידה ניכרת, עלויות ריצה גבוהות וצורך במפעילים מיומנים/מיומנים. יתר על כן, מערכות כאלה מוגבלות בדרך כלל רק לאופן הדמיה אחד. כתוצאה מכך, העיצוב המוצע כאן מסתמך על פלטפורמה סטראוטקטית מודולרית הניתנת להסרה, התואמת למספר שיטות הדמיה (מיקרו-CT, MRI של בעלי חיים קטנים, מגוון מצלמות BLI/פלואורסצנטיות, אלה עם או בלי הדמיית רנטגן משולבת) ומספקת גם סמנים פידוקאליים רב-מודאליים לשילוב אוטומטי של כל נתוני התמונה במסגרת התייחסות משותפת הן לתכנון התערבותי והן למעקב אחר פוסט BBB.

לגבי שיקולים מעשיים, הנקודה הקריטית ביותר של כישלון בהליך היא היציבות של microbubbles בשל חייהם מוגבל ואופי שביר שלהם. ברצוננו להדגיש כי הדיון הבא נוגע microbubbles התייצב על ידי פוספוליפידים ומכיל הקספלואוריד גופרית (SF₆) כמו גז מזיק^46,47, בעוד ניסוחים microbubble אחרים יציגו בדרך כלל תכונות שונות.

תזמון לפני הזרקת מיקרו-בובל: תוחלת החיים המפורסמת של microbubbles זמין מסחרית לאחר לחות מחדש הוא בין 3 ל 4 שעות. אמנם זה מתאים ליישומי אולטרסאונד אבחון, יש לציין כי במהלך כל תקופה זו microbubbles ברציפות לאבד גז וכתוצאה מכך קוטר הבועה הממוצע כפוף להיסחף כלפי מטה מתמשך מהגודל הממוצע הראשוני של 2.5 מיקרומטר. עבור יישומים טיפוליים כגון BBBD בתיווך אולטרסאונד זה מרמז על הרבה יותר מחמיר תזמון ציוויים, שכן משרעת התנודות של cavitation יציב (בתדירות נתונה ולחץ) ואת תחילת הסף של cavitation אינרציאלי הם כתוצאה ישירה גם כפוף להיסחף מתמשך. מניסיוננו, ראינו כי microbubbles משמשים בצורה הטובה ביותר בתוך 30 דקות לאחר התייבשות על מנת להשיג תוצאות לשחזור, בדומה לדיווחים^{קודמים 48}.

תזמון לאחר הזרקת microbubble: אצל פרימטים גדולים יותר, SF₆-phospholipid microbubbles זמין מסחרית להציג זמן מחצית חיים חיסול פלזמה בדם של כ 6 דקות ויותר מ 80% של הגז מנוהל נושף דרך הריאות לאחר רק 11 דקות⁴⁸. ביונקים קטנים כגון עכברים וחולדות חיסול פלזמת הדם מחצית החיים של סוג זה של microbubbles ב vivo הוא עם 90-120 שניות קצר משמעותית בשל קצב הלב הגבוה^{יותר 20}. כתוצאה מכך, הדינמיקה המהירה של ריכוז microbubble מיד לאחר הזרקת בולוס וחיסול פלזמה מהיר לאחר מכן בשילוב עם אובדן נפח הגז המתמשך של הבועות כופה דרישות תזמון קפדניות על פרוטוקול sonication / הזרקה על מנת להשיג תוצאות לשחזור בתוך משך קצר של 3-4 דקות לאחר ההזרקה. הליכים ארוכים יותר או כמויות נרחבות יותר של BBBD דורשים עדיף ניהול מתמשך של microbubbles. עם זאת, גישה כזו מסובכת על ידי הציפה של הבועות הן במזרק והן במערכת ההזנה וגם מציגה נפח מת מוגבר במידה ניכרת על ידי צינורות העירוי הנדרשים. מניסיוננו, הפתרון הפשוט יותר של פיצול נפח ההזרקה הכולל ל-2 עד 3 תת-מנות קטנות יותר סיפק תוצאות חזקות וניתן לשחזור.

בנוסף, microbubbles הם מאוד לחץ רגיש ולחצים הידרוסטטיים גבוהים במהלך ההזרקה ולכן אינם מומלצים. מחטים גדולות (>19 G) מומלץ להעברת microbubbles לתוך צינור פלסטיק או לצייר את microbubbles עם מזרק⁴⁹. עבור i.v. הזרקה בעכברים 26-30 G מחטים מומלץ; מאז מחטים גדולות יותר קשה יותר להכניס לתוך וריד הזנב. המחט 26 G מומלץ מאז הלחץ ההידרוסטטי הוא נמוך יותר עם מחט זו. עם זאת, במקרה של גישה ורידית קשה מומלץ מחט 30 G.

הגולגולת של העכבר היא מנחת חשוב של משרעת הלחץ כי באופן משמעותי מוריד את משרעת הלחץ במוקד. הנחתה נקבעת על ידי התדירות של מתמר ואת הצפיפות של המדיום גל אולטרסאונד מתפשט. תדרי אולטרסאונד גבוהים יותר וצפיפויות רקמות גבוהות, כמו תוצאות העצם בהטלה גבוהה. משרעת הלחץ נספגת חלקית על ידי העצם וכמה משרעת לחץ אובדת על ידי השתקפות ופיזור⁵⁰. בניסויים שלנו קבענו בגופיות עכבר כי הנחתה ב 1 MHz הוא 14.5 ± 1.3 dB / cm עם עובי גולגולת ממוצע של 0.9 מ"מ כפי שמוצג לפני^21,50. ניטור Cavitation מומלץ מאוד מאז microbubbles לשקף פליטות אקוסטיות ברורות במהלך cavitation יציב cavitation אינרציאלי. פליטת פס רחב היא פליטה אקוסטית מובהקת עבור cavitation אינרציאלי¹². ניטור בזמן אמת מאפשר לזהות cavitation אינרציאלי ולהוריד את משרעת הלחץ בהתאם, כדי למנוע נזק לרקמות.

דיווחים קודמים תיארו את ההשפעה של סוג ההרדמה על חדירות BBB^{שהושגה 11,31}. עבור הרדמה מבוססת איזופלורן, vasodilation מתרחשת זמן קצר לאחר חניכה הרדמה, אשר קשורה עם הפחתה קלה של זרימת הדם במוח. יתר על כן, הרדמה על פני משכי זמן ארוכים, במיוחד בהיעדר ייצוב טמפרטורה, מובילה לקצב לב מופחת. מאז שני הגורמים יכולים להוביל שונות גדולה יותר של הריכוז המוחי של שני microbubbles או תרופות משותפות, פרוטוקול הרדמה קפדני מומלץ להשיג תוצאות לשחזור⁵¹. הרדמה עם 1.5% v / v isoflurane ב 2 L / min חמצן במשך 35 עד 45 דקות לא היה בעייתי, כפי שמומלץ על ידי קונסטנטינידס ואח^'51. בניגוד McDannold ואח 'שהראה כי תערובת גז זה בשילוב עם סוג מסוים של microbubbles שלהם היה בעייתי⁵², לא ראינו בעיות ראויות לציון עם סוג זה של microbubbles. לחלופין, בעלי החיים יכולים להיות מורדמים עם תערובת של קטמין / xylazine, אשר אין השפעות vasoactive ידוע⁵³.

לסיכום, טכניקת פתיחת BBB מונחית ההדמיה המתוארת כאן שימשה למחקרים להערכת תרופות פרה-קליניות בנפח גבוה שהוכיחו את היעילות של זרימת העבודה המוצעת. המערכת יכולה להיות מופעלת על ידי כוח אדם לא טכני לאחר הכשרה קצרה בשל רמה גבוהה של אוטומציה. זה בשילוב עם הפשטות של ההתקנה הביא רמה גבוהה של סטנדרטיזציה, אשר בתורו מבטיח רבייה ניסיונית, שונות פנים-קבוצתית מופחתת ובכך מאפשר להקטין את גודל המדגם הנדרש.

למחברים אין מה לחשוף.

פרויקט זה מומן על ידי KWF-STW (אספקת סמים על ידי Sonoporation בילדות מפוזרת פנימית פונטין Glioma ו Glioma בדרגה גבוהה). אנו מודים לאליה סקצ'קוב וצ'ארלס מוגנות על תשומת ליבם בפיתוח המערכת.