Operant Strateji Değiştirme Paradigması Kullanılarak Bilişsel Esneklik Üzerindeki Stres Etkilerinin Değerlendirilmesi

Stresli yaşam olayları bilişsel işlevi bozarak psikiyatrik bozukluk riskini artırır. Bu protokol, erkek ve dişi Sprague Dawley sıçanlarında paradigmayı değiştiren otomatik bir strateji kullanarak stresin bilişsel esnekliği nasıl etkilediğini göstermektedir. Belirli davranışların altında kalan belirli beyin bölgeleri tartışılır ve sonuçların çevirisel ilgisi araştırılır.

Stres bilişsel işlevi etkiler. Stresin bilişsel işlevi geliştirip geliştirmediği veya bozup bozmadığı, 1) tipi, yoğunluğu ve stresörün süresi de dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır; 2) çalışma altındaki bilişsel işlev türü; ve 3) bilişsel görevin öğrenilir veya yürütülmesi ile ilgili olarak stresörün zamanlaması. Ayrıca, stresin bilişsel işlev üzerindeki etkileri arasındaki cinsiyet farklılıkları yaygın olarak belgelenmiştir. Burada, stresteki değişimlerin erkek ve dişi Sprague Dawley sıçanlarında bilişsel esnekliği nasıl etkilediğini değerlendirmek için otomatik bir operant strateji değiştirme paradigmasının bir uyarlaması açıklanmıştır. Özellikle, kısıtlama stresi, stresin her iki cinsiyette de bilişsel performansı nasıl etkilediğini incelemek için bu operant tabanlı görevde eğitimden önce veya sonra kullanılır. Bu otomatik paradigmadaki her görevle ilişkili belirli beyin alanları iyi belirlenmiştir (yani, medial prefrontal korteks ve orbitofrontal korteks). Bu, deney sırasında hedeflenen manipülasyonlara veya paradigmanın tamamlanmasından sonra bu bölgelerdeki belirli genlerin ve proteinlerin değerlendirilmesine izin verir. Bu paradigma ayrıca stres sonrası meydana gelen ve her biri sinirsel substratları tanımlayan farklı performans hatalarının tespit edilmesine izin verir. Ayrıca tekrarlanan bir kısıtlama stres paradigması sonrası perseveratif hatalarda belirgin cinsiyet farklılıkları tespit edilmiştir. Bu tekniklerin preklinik bir modelde kullanılması, stresin beyni nasıl etkilediğini ve travma sonrası stres bozukluğu (TSSB) ve yaygınlıkta belirgin cinsiyet farklılıkları gösteren majör depresif bozukluk (MDD) gibi psikiyatrik bozukluklarda bilişi nasıl bozar ortaya çıkarabilir.

İnsanlarda, stresli yaşam olayları bilişsel işlevi bozabilir (yani bilişsel esneklik¹), bilişsel işleme stratejilerini ortamdaki yeni koşullarla yüzleşmeye uyarlama yeteneğini gösterir². Bilişteki bozukluk, Travma Sonrası Stres Bozukluğu (TSSB) ve Majör Depresif Bozukluk (MDD)^3,4gibi birçok psikiyatrik bozukluğu çökeltir ve şiddetlendirir. Bu bozukluklar kadınlarda iki kat daha yaygındır^5,6,7,8, ancak bu eşitsizliğin biyolojik temeli bilinmemektedir. İnsanlarda yönetici işleyişinin yönleri, bilişsel esnekliğin bir göstergesi olan Wisconsin Kart Sıralama Görevi kullanılarak değerlendirilebilir². Bu görevdeki performans TSSB⁹ ve MDD¹⁰olan hastalarda bozulur, ancak bu değişikliğin sinirsel temeli sadece beyin görüntüleme ile incelenebilir¹¹.

Stresin beyni nasıl etkilediğini anlamadaki gelişmeler, hayvan modellerinin, özellikle kemirgenlerin kullanımıyla yapılmıştır. Strese bağlı hastalıklarda bilişsel esneklik etkilendiği için kemirgenlerde incelemek son derece alakalı bir fenotiptir. Bugüne kadar, çoğu stres nörobiyoloji literatürü alternatif bir bilişsel esneklik paradigması kullanmıştır (bazen kazma görevi olarak adlandırılır)^12,13,14,15. Bu görev kapsamlı bir şekilde incelenmiş olsa da, kemirgenleri eğitmek için deneyci tarafından daha fazla zaman ve çaba gerektirir. Burada uyarlanmış ve tanımlanmış, çeşitli stres modelleri kullanan erkek ve dişi Sprague Dawley sıçanlarında bilişsel esnekliği değerlendirmek için iyi kurulmuş bir otomatik set değiştirme protokolü^{16 , 17,18}. Prosedür, deneyci tarafından minimum gözetim gerektirir ve birden fazla sıçanın aynı anda test edilmesine izin verir. Ek olarak, bu otomatik görevin diğer sürümlerinden farklı^{olarak 19}Bu paradigmanın adaptasyonu sadece 3 günlük eğitim gerektirir ve verimli bir programlanmış veri analizi içerir.

Stresin bilişsel işlevi geliştirip geliştirmediği veya bozup bozmadığı, stresörün türüne, yoğunluğuna ve süresine ve bilişsel bir görevin öğrenilip yürütülmesiyle ilgili olarak stresörün zamanlamasına bağlıdır^20,21. Bu nedenle, protokol hem operant eğitimden önce hem de sonra stres prosedürlerini içerir. Ayrıca stres çalışmalarından elde edilen temsili sonuçları da inceler. Ek olarak, set kaydırmanın belirli yönlerinin altında kalan beyin bölgeleri iyi belirlenmiştir^2,16,22; bu nedenle, rapor ayrıca stres ve strateji değiştirme prosedürleri sırasında veya sonrasında belirli beyin bölgelerinin nasıl hedefleneceğini ve değerlendirileceğini de açıklar.

Bilişsel esneklikteki cinsiyet farklılıklarını doğrudan inceleme konusunda sınırlı araştırma yapıldı^18,23.  Protokol, 1) hem erkek hem de dişi sıçanların deneysel paradigmaya nasıl dahil edildirılacağını, daha sonra 2) özgürce bisiklete binen kadınlarda prosedürlerden önce ve sırasında östrous döngülerini izlemeyi açıklar. Önceki çalışmalar, operant eğitimden önceki stresin sıçanlarda bilişsel esneklikte cinsiyete özgü eksikliklere yol açabileceğini belirtmiştir¹⁷. Özellikle, dişi sıçanlar stres sonrası bilişsel esneklikte bozulmalar sergilerken, stres sonrası erkek sıçanlarda bilişsel esneklik artar¹⁷. İlginçtir ki, insanlarda cinsiyete bağlı bir insidansa sahip olan strese bağlı psikiyatrik bozuklukların önemli bir özelliği bilişsel esneksizliktir. Bu sonuçlar, kadınların bu tür bilişsel bozukluklara karşı erkeklerden daha savunmasız olabileceğini göstermektedir. Bu tekniklerin hayvan modellerinde kullanılması, stresin beyin üzerindeki etkilerine ve insanlarda psikiyatrik bozukluklarda bilişi nasıl bozduğuna ışık tutacaktır.

Bu çalışmadaki tüm prosedürler Bryn Mawr Koleji Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Laboratuvar hayvanlarını sipariş etmeden ve deneylere başlamadan önce IACUC veya başka bir şekilde geçerli düzenleyici onay alın.

1. Hayvan hazırlığı

1. Erkek ve dişi yetişkin Sprague Dawley sıçanları alın.
   NOT: Sıçanlar 65 günden önce teslim edilebilir, ancak hem erkeklerin hem de kadınların tamamen olgun olmasını sağlamak için bu noktadan sonrasına kadar işlemlere başlamayın.
2. Çift ev aynı cinsiyetli sıçanlar mümkün olduğunca uzun süre, uzun süreli izolasyon bir stresör olduğu için²⁴. Gıda kısıtlaması için, tekli ev sıçanları operant strateji değiştirme protokolünün hemen öncesinde.
3. 1 haftalık alışmadan sonra, sıçanları günde 3-5 dakika hafifçe idare etmeye başlayın. Her sıçanın vücut ağırlığını toplayın. Ek olarak, gonadal hormonların sonuçları nasıl etkileyebileceğini değerlendirmekle ilgileniyorsanız, dişi sıçanlar için vajinal lavaj toplayın (bölüm 2'de açıklanmıştır).
4. Görevi başarıyla öğrenmeleri için eğitim başlamadan en az 3 gün önce paradigmayı değiştiren operant stratejide çalıştırılacak hayvanları kısıtlayın . Suyun her zaman serbestçe kullanılabilir olduğundan emin olun. Her hayvanın günlük yiyecek ve sıvı tüketimini, hidrasyon durumunu ve bir hayvanın geçici veya kalıcı olarak bir protokolden çıkarılması için kriter olarak kullanılan davranışsal ve klinik değişiklikleri belgelemesi için yazılı kayıtlar tutulmalıdır (Morton 2000; NRC 2003b).
   1. Eğitimden önce 3 günden fazla bir stres prosedürü uyguladıysanız, gıda kısıtlamasını stres günlerinin sayısına uyacak şekilde ayarlayın (örneğin, 5 günlük kısıtlama artı gıda kısıtlaması^25).
   2. Her gün, normal günlük gıda alımının% 80'ini (yani, 100 g vücut ağırlığı başına 4 g yiyecek)²⁶. Her gün ne kadar yiyecek vereceğini hesaplamak için sıçan için günlük ağırlık koleksiyonunu kullanın.
   3. Eğitim ve test günleri boyunca gıda kısıtlamasına devam edin. Bununla birlikte, sıçan gün için eğitim veya testi tamamlayana kadar yiyecekleri ev kafesine yerleştirmeyin, aksi takdirde bir gıda pelet ödülü için görevleri yerine getirmek için motive olmazlar. Görevin tamamlanmasından sonra sıçanlara yiyecek teslimatının zamanlamasının oldukça öngörülemez olduğundan emin olun, çünkü bu, operant odada (daha sonra ev kafesinde yiyecek beklemek lehine) daha az motivasyondan kaçınmaya yardımcı olur.
      NOT: Kısıtlama stresi paradigmasına giren hayvanlar, kontrolden, paysız deneklerden önemli ölçüde daha fazla kilo kaybı göstermez. Bununla birlikte, çeşitli stres prosedürleri kendilerini kilo kaybına neden olabilir, bu da sıçanların vücut ağırlığına dayalı gıda kısıtlaması sırasında payandalanmamış meslektaşlarından daha az yiyecek almasına neden olabilir. Bu ek, şaşırtıcı bir stresör sunabilir. Bu durumda, alternatif olarak, ağırlık^27'denbağımsız olarak her konuya verilen sabit miktarda yiyecek kullanın.

2. Vajinal lavaj

NOT: Gonadal hormonlarının (östrojen ve progesteron) stres tepkisini ve bilişi etkilediği bilinmektedir^28,29,30. Bu hormonlar dişi sıçanların östrous döngüsü üzerinde dalgalanır³¹. Stres veya bilişsel esneklik verileriyle ilişkili olmak için serbestçe bisiklete binen dişi kemirgenlerin östrous döngüsünü izlemekle ilgileniyorsanız, aşağıda açıklandığı gibi vajinal lavaj toplayın. Östrous döngü aşaması göz önünde bulundurularak temsili veriler sağlanmaz.

1. Dişilerden vajinal lavaj örnekleri elde etmek için, temiz bir beherde, cam bir damlalıkta, bir "lavaj" kaydıracında (lavaj örneğini tutmak için akrilik boya daireleriyle mikroskop kaydırağı) ve bir boş beherde ılık su toplayın.
2. Damlalığı az miktarda ılık suyla (~0,5 mL) doldurun, ardından ucu dişi sıçanın vajinasına yerleştirin (kuyruğundan kaldırarak). Steril suyu 2x-3x dışarı atın ve toplanan sıvıyı mikroskobik bir kaydırağa atın. Lavaj slayt çemberinden taşma.
3. Fazla sıvıyı boş kabın içine at. Lavaj kaydırağı fare numaralarıyla etiketleyin ve her sıçandan alınan örnekleri bu sıraya koyun, böylece hangi numunenin her sıçana ait olduğu açıktır.
4. Bir sonraki sıçanı örneklemek için damlalığı doldurmadan önce temiz ılık suyu pipetleyerek ve birkaç kez "fazla" kabın içine dağıtarak damlalığı iyice durulayın.
5. Lavaj örneğini görüntülemek ve becker ve ark^31'deaçıklandığı gibi östrous döngüsü içinde günü sınıflandırmak için lavaj kaydıramasını dikkatlice parlak bir alan mikroskobuna taşıyın.
   NOT: İdeal olarak, lavaging bir dişinin döngüsünü düzgün bir şekilde izlemek için birkaç hafta yapılmalı ve sirkadiyen ritimleri kontrol etmek için her gün çok benzer bir zamanda yapılmalıdır. Tercihen, bu prosedür stres ve operant strateji değiştirme prosedürlerinden önce yapılmalıdır. Pamuklu çubuklar ve steril salin kullanımı da bu göz damlalığı tekniğine alternatif olarak kullanılabilir. Dişi sıçanlar için veriler, östrous döngü gününe göre geçici olarak analiz edilebilir (stresin gerçekleştirildiği döngü günlerini ve / veya test gerçekleştiğinde döngü gününü düşünün).

3. Ekipman ve yazılım

1. Davranış eğitimi ve sınama için operant odaları kullanın.
   1. Odaların, yukarıda iki uyarıcı ışığı, bir ev ışığı ve bu görevler için takviye için bir dağıtıcı ile en az iki geri çekilebilir kol içerdiğinden emin olun.
   2. Kolların merkezi takviye dağıtım alanının her iki tarafında olup olmadığını kontrol edin ve her kolun üzerinde bir uyarıcı ışık vardır.
   3. Işık uyaranının algılanmasını engellemeden odayı aydınlatmak için ev ışığını kullanın (ev ışığının odanın arka duvarında, kolların ve uyaran ışıklarının karşısında olması en iyisidir).
2. Gıda kısıtlamalı sıçanlarda takviye için tozsuz gıda peletleri kullanın (burada 45 mg pelet kullanılır: % 18.7 protein,% 5.6 yağ ve% 4.7 lif). Sakkaroz veya yağ bakımından yüksek peletler kullanmayın (stresin lezzetli gıda alımını nasıl etkilediğine dair bir ilgi olmadıkça).
3. Odayı çalıştırabilen bir yazılıma sahip bir bilgisayardan uyaranların sunumunun, kol çalışmasının ve veritoplamanınsunumunun kontrolü ( Malzeme Tablosu ).
   NOT: Bu yazılımı kullanan programların kodlası ile ilgili bilgi için yazarlara başvurun. MED-PC komut dosyaları ek dosyalar olarak dahil edilir. Bu yazılım, hayvanın her deneme için verdiği yanıtlar hakkında bilgi toplar (hangi kolun basıldığı, doğru/yanlış/yanıtsız olup olmadığı ve seçimi yapmak için gecikme süresi). Bu bilgilerden, kullanıcılar davranış analizi bölümünde açıklandığı gibi davranış paradigmasındaki çeşitli önlemleri hesaplayabilirler.
4. Stres hormonlarında sirkadiyen ritimleri kontrol etmek için her gün aynı saatte eğitim /test gerçekleştirin³² (ve diğer ilgili önlemler).
5. Dışkı / atık toplamak için her bir operant kutunun alt tepsisini taze yataklarla doldurun. Her seansı takiben, her tepsiyi boşaltın, tepsileri ve oda içini alkol mendilleri veya IACUC onaylı bir dezenfektanla temizleyin ve odaya yeni bir hayvan yerleştirmeden önce taze yataklarla değiştirin.

4. Stres prosedürleri

1. Stres prosedürünün operant strateji değiştirme paradigması üzerinde eğitimden önce, sırasında ve/veya eğitimden sonra mı yapılması gerektiğine karar verin (örneğin, 3 günlük operant eğitimden önce 5 günlük kısıtlama stresi ve ardından 3 günlük operant eğitim ve ardından tek bir kısıtlama ve test).
2. Stres prosedürünü, operant eğitimle ilgili olarak günlük olarak aynı anda uygulayın. (örneğin, 9 A.M.'dan başlayan 30 dakikalık kısıtlama stresi, ardından operant odaya yerleştirme).
3. Stres prosedürlerini hem koloni odasından hem de strateji değiştiren paradigma odalarından ayrı bir odada gerçekleştirin (tanık stresi ile ilişkili kafa karıştırıcı faktörlerin olmadığından emin olmak için)³³. Kısaca, sıçanı Broome tarzı şeffaf bir kısıtlama tüpüne yerleştirin ve uzuvları veya kuyruğu sıkıştırmamaya dikkat ederek açıklığı kapatın. Her konu arasında, Broome tarzı tüpü temizlemek için IACUC onaylı bir dezenfektan kullanın. Yanlış sanitasyon, test protokolünü olumsuz yönde etkileyebilecek feromonları geride bırakabilir.
   NOT: İlk sıçan grubunun ameliyathanelerde ne kadar zaman geçireceğini tahmin edin. Bu, eğitime ve sınav gününe bağlı olarak değişecektir; ancak, birkaç kohort çalıştırdıktan sonra, gelecekteki görevleri tahmin etmek için her görevi tamamlamak için ortalama bir süre hesaplanabilir.
4. Kaç tane işlem odasının mevcut olduğuna bağlı olarak, denekler için stres prosedürünü kademeler. Örneğin, dört sıçan kısıtlama stresine maruz gelir ve dört operant hazneye yerleştirilir. Bir saat sonra, dört hayvan daha operant odası tarafından takip edilecek stres prosedürlerinden geçer.

5. Eğitim

NOT: Bu paradigma Floresco ve arkadaşları tarafından geliştirilen operant set değiştirme prosedüründen 3 günde tamamlanabilecek şekilde değiştirilmiştir¹⁹.  Sıçanlar için eğitim prosedürleri 3 gün gerektirir (aşağıda açıklandığı gibi her görevi öğrenmek için 1 gün). Bir sıçanın bu görevleri öğrenmemesi nadirdir. Bir sıçan her görevi öğrenemezse, son çalışmadan hariç tutulmalıdır. Aşağıda açıklanan eğitim paradigmasının görsel bir tasviri için Şekil 1A'ya bakın.

1. Sıçanı odaya yerleştirmeden önce, dağıtıcıda yeterli yiyecek peletleri olduğundan ve operant kutuların düzgün çalıştığından emin olun. Bunu başarmak için, boş bir bölmeye bir eğitim veya test günü programı yükleyin ve başlatın, doğru kolun kol presi başına uygun şekilde bir ödül sağladığını manuel olarak test edin.
2. Sıçanı her kola basmak için eğitme
   1. Sıçanı eğitimin ilk günü için kutuya yerleştirmeden önce, her odanın içindeki eğitim prosedürünü yükledikten sonra belirtildiği gibi, doğru kola manuel olarak bir gıda pelet ödülü ayarlayın.
   2. Sıçanı sabit bir oran (FR-1) programı kullanarak eğitin, böylece her doğru kol presi bir takviye ile ödüllendirilir. Eğitim prosedürünü odaları işleten bilgisayara yükledikten sonra doğru kolu belirleyerek denekler ve/veya deneysel koşullar (aynı anda yalnızca bir kolu şekillendirerek) genelinde günde doğru kolu dengeleyin.
   3. Sıçanın doğru kola 50x basarak kritere ulaşana kadar kolu bastırmasına izin verin, genellikle görevi 30-45 dakika arasında tamamlayın.
   4. Ertesi gün sıçanı, eğitimin ilk günüyle aynı programı kullanarak karşı kolda bu görevi yerine getirmek için zorlar, ancak karşı kolu doğru kol olarak belirleyin. Bu eğitim gününde kolu bir gıda peletiyle "şekillendirmeye" gerek yoktur. Tipik olarak, bu kriter sıçanlar ilk kola basmayı öğrendikten sonra hızla elde edilir.
3. Sıçanı ışık işaretine yanıt vermesi için eğitmek
   1. Eğitimin üçüncü gününde, sıçanın potansiyel olarak bir gıda pelet ödülü almak için kollardan birine basabileceği 15 s denemeler için her iki kolun üzerindeki ışığı aydınlatın. Işık ayrımcılığı görevi sırasında, bu program deneme bazında hangi kolun doğru olduğunu rastgele seçecektir.
   2. Sıçan doğru kola basıyorsa, ışıkların 3 s boyunca aydınlatıldığından ve ödülün teslim edildiğinden ve ardından bir sonraki denemeden önce ışıkların kapatıldığı 5 s'lik bir süre olduğundan emin olun. Sıçan yanlış kola basıyorsa, ödül olmadığından ve ışıkların bir sonraki denemeden önce 10 sn kapalı olduğundan emin olun.
   3. Bu son antrenman gününü takiben, bir kolun pres sayısını toplam kol presi sayısına bölerek sıçanın sol veya sağ kolu tercih edip etmediğini belirlemek için "yan önyargıyı" hesaplayın. Test gününde, sıçan, tercih edilen bir kola yanıt vermek yerine, belirli bir yanıt-ödül acilliğini öğrendiğinden emin olmak için en az tercih edilen tarafında başlayacaktır.

6. Test

NOT: Aşağıda açıklanan test paradigmasının görsel bir tasviri için Şekil 1B'ye bakın.

1. 4. günde (test günü), sıçanı stres prosedürlerini takiben operant odaya yerleştirin ve bunları seri olarak yan ayrımcılık, yan tersine çevirme ve hafif ayrımcılık görevlerinde test edin. Işık ayrımcılığı görevinin yalnızca "doğru" kolun üzerindeki ışığı aydınlattığından emin olun. Her görevde, sıçanlar, her ayrımcılığı karşılıksız, yanlış kola basmadan tamamlamak için ardışık olarak sekiz doğru deneme elde etmelidir. Yanlış bir kol presi bu deneme zincirini sıfırlar.
   1. Yan ayrımcılık görevini kullanarak sıçanları test edin. Yan ayrımcılık programını kullanarak, sıçanı, ışık işaretinden bağımsız olarak, eğitimin üçüncü gününden itibaren belirlendiği gibi en az tercih edilen tarafındaki kola bastığı için ödüllendirin. Görev, doğru kola 8x ardışık olarak basıldığında sona erer (eksiklikler hariç).
   2. Yan ayrımcılık programını tekrar kullanarak sıçanları çalıştırarak yan ters testi gerçekleştirin, ancak bu sefer yan ayrımcılık görevinden doğru olanın karşısındaki kolu doğru olarak belirleyin. Işık işaretinden bağımsız olarak, farenin bu kola bastığı için ödüllendirilmesini sağlayın. Görev, doğru kola 8x ardışık olarak basıldığında sona erer (eksiklikler hariç).
   3. Yukarıda ışık yanmış olarak kolu bastığı için sıçanı ödüllendiren ışık ayrımcılığı görevini yerine getir. Her işlenen test, doğru kola 8x ardışık olarak basıldığında tamamlanır (eksiklikler hariç).
      NOT: Önceki çalışmalara dayanarak, bu görevler, sıçanların her görevin kurallarını öğrenmek için yeterli zamana sahip olmasını sağlamak için ardışık preslere bakılmaksızın en az 30 denemeyi kodlar¹⁸. Böylece, sıçan 30 deneme gerçekleşmeden önce ardışık olarak sekiz doğru deneme elde ederse, görev 30 deneme tamamlanana kadar meşgul kalacaktır.

7. Davranış analizi

NOT: Test gününde her hayvan için elde edilen veriler, her görev için bir MED-PC komut dosyası başlatıldığı ve tamamlanmasına izin verildiği sürece bilgisayar tarafından otomatik olarak kaydedilir ve kaydedilir (MED-PC komut dosyaları için ek malzemelere bakın).

1. Bilgisayar programını kullanarak her test günü görevi (yan ayrımcılık, yan ters çevirme ve ışık ayrımcılığı) için verileri açın. Program tarafından kaydedilen başlıca önlemler, kriter denemeleri, kriterdeki hatalar ve kriter süresidir. Bu önlemler aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
   NOT: Yazarlar, analiz sürecinin otomasyonunun yanı sıra azimli ve gerileyen hataların analizine izin veren bir MATLAB komut dosyası oluşturmuşlardır (veri analizini kolaylaştırmak için kod bilgileri için yazarlarla iletişime geçin).
   1. Denemeleri, doğruluğun ana göstergesi olarak (sıçanın sekiz deneme de dahil olmak üzere sekiz doğru denemeyi ardışık olarak tamamlaması için gerekli olan toplam deneme sayısını [ihmaller dahil değil] ifade eder) değerlendirmek için kullanın. Bu veriler, test günündeki görevlerden herhangi biri için MED-PC komut dosyası tarafından oluşturulan bir veri dosyasında B dizisinin ilk sütununda bulunur.
   2. Her görev sırasında yapılan toplam hataları inceleyin. Bu veriler, test günündeki görevlerden herhangi biri için MED-PC komut dosyası tarafından oluşturulan bir veri dosyasında B dizisinin üçüncü sütununda bulunur. Bu hatalar da azimli veya gerileyen hatalar olarak kategorize edilir. Sıçan önceki görevden önceki kurala uymaya devam ettiğinde kalıcı hatalar işlenir. Regresif hatalar, önceki kuraldan ayrıldıktan sonra tamamlanır, ancak yeni kuralı almaya çalışmaya devam eder (bu tür hataların nasıl hesaplandıklarına ilişkin daha fazla ayrıntı için, yayınlanan yöntem^18'ebakın).
   3. Sıçan 15 s içinde bir ışık işaretine yanıt vermediyse, deneme bir ihmal olarak kategorize edilir ve kritere yönelik toplam deneme sayısına dahil değildir. Bunu, önce doğru yanıtların sayısını (veri dosyasında B dizisinin ikinci sütununda bulunur) ve hata sayısını (veri dosyasındaki B dizisinin üçüncü sütununda bulunur) bir araya getirerek hesaplayın. Ardından, bu sayıyı toplam deneme sayısından ölçüte çıkarın (bu, bir veri dosyasındaki B dizisinin ilk sütunundaki denemelerden ölçüte kadar olan son sayıdır).
   4. Ölçüt süresini hesaplamak için program tarafından kaydedilen başlangıç ve bitiş saatlerini (test günündeki görevlerden herhangi biri için MED-PC komut dosyası tarafından oluşturulan bir veri dosyasının üst kısmında bulunur) kullanın. İlk kol presine gecikme süresi, K değişkenini (ilk kol presinden saniyeler içinde geçen süre) zaman dilimine çıkararak veri dosyasından da hesaplanabilir.
   5. Aynı tedavi grubundaki sıçanlar için her davranışsal ölçü için verileri ortalama. Uygun istatistiksel analizler yapmak (kaç değişkenin incelendiklerine bağlı olarak).

8. Beyin substratları

1. bilişsel esnekliğin ilgili bir beyin alanını ve/veya yönünü belirleyin. Örneğin, stres yan tersine çevirme görevinde azimli hataları artırırsa, orbitofrontal korteks (OFC) özellikle ilgi çekici olabilir, çünkü önceki lezyon çalışmaları bu beyin bölgesinin birçok ters öğrenme biçiminde rol oynadığını belirtmiştir (yani, yan tersine çevirme görevinde test edilen mekansal geri dönüş)^34,35,36. Bu örnekte, strateji değiştirme paradigması tamamlandıktan sonra sıçanları kurban etmek ve açıklanan immünohistokimyasal yöntemler²⁵ kullanarak OFC'deki c-fos 'u (nöral aktivasyon ölçüsü³⁷⁾inceleyin ve burada kısaca açıklanmıştır.
   1. İlk olarak, hayvanlardan beyin çıkarın ve 40 μm dilimler halinde kesin.
   2. Dokuyu fosfat tamponlu salin (PBS) ile her biri 5 dakika boyunca 4 kat yıkayın, ardından endojen peroksidazları söndürmek için 10 dakika boyunca% 0.3 hidrojen peroksit içinde kuluçkaya yatırın.
   3. Pbs 2x'te her biri 5 dakika boyunca dokuyu yıkayın, ardından fare anti-c-fos primer antikorunda (1:500), % 3 normal eşek serumunda (NDS) ve bir gecede% 0.3 Triton X'te kuluçkaya yatırın.
   4. Ertesi gün, pbs 3x her biri 5 dakika boyunca doku yıkayın, sonra 2 saat boyunca biotin-SP-konjuge eşek anti-fare sary antikor (1:500) kuluçka.
   5. Pbs 3x'te her biri 5 dakika boyunca dokuyu yıkayın, ardından 1 saat boyunca avidin-streptavidin AB kompleksinde kuluçkaya yatırın.
   6. Her biri 5 dakika PBS 3x'te dokuyu yıkayın, ardından doku oksidasyon kromojenik reaksiyona girerken DAB çözeltisinde 10 dakikaya kadar kuluçkaya yatırın.
   7. Pbs 3x'te her biri 5 dakika boyunca dokuyu yıkayın, ardından beyin dilimlerini cam mikroskop slaytlarına monte edin.
   8. Toluen bazlı montaj ortamı ve parlak alan mikroskobu kullanarak görüntü kullanarak dokuyu kaplar.
      NOT: Burada, temsili sonuçlara yansıdığı gibi, sıçanlar strateji değiştirme paradigması sona erdikten 30 dakika sonra, tersine çevirme görevi tamamlandıktan yaklaşık 60-90 dakika sonra (her sıçanın hafif görevdeki performansına bağlı olarak) feda edilir. Bu c-fos ifadesi için en uygun zamanlamayı temsil etmelidir³⁸, ters görevdeki performansı yansıtır.
2. Alternatif olarak, stresin yürütülmesinden veya paradigmayı değiştiren operant stratejiden önce ilaç enjeksiyonu veya viral enjeksiyon için belirli bir beyin bölgesini kanüle edin.
   NOT: Araştırmacılar, sinirsel substratların manipüle etmenin stresin bilişsel esneklik üzerindeki etkilerini nasıl değiştirdiğini incelemek isteyebilirler. Örneğin, araştırmacılar test etmeden önce prefrontal kortekste belirli bir nörotransmitter reseptörü engelleyebilirler.

Yukarıda özetlenen uyarlanmış otomatik operant strateji değiştirme paradigması, tekrarlanan kısıtlama stresinin erkek ve dişi Sprague Dawley sıçanlarında bilişi etkileyip etkilemediğine karar vermek için kullanılmıştır. Temsili davranışsal veriler aşağıdaki Şekil 2'de açıklanmıştır. Kısacası, kontrol ve sürekli kısıtlanan sıçanlar, bir dizi görevden oluşan bu operant strateji değiştirme testini gerçekleştirdi: yan ayrımcılık, yan tersine çevirme ve hafif ayrımcılık.

Her görev için ölçüt denemeleri Şekil 2A'da tasvir edilir. Genellikle, her görevde daha iyi performans, ölçüte indirgenmiş sayıda deneme ile temsil edilir. Bu veriler, akut kısıtlamanın ardından, erkeklerin, korunmasız, kontrol edilen erkeklere göre önemli ölçüde daha az denemede yan geri dönüş görevini tamamladığını göstermektedir. Tersine, stresli kadınlar yan tersine çevirme görevini tamamlamak için önemli ölçüde daha fazla sayıda denemeye ihtiyaç duyuyorlar. Bu sonuçlar, erkeklerin stres sonrasında daha iyi performans gösterdiğini, kadınların ise düşük performans gösterdiğini göstermektedir. Hafif ayrımcılık görevinde stres, kontrol eden kadınlara kıyasla deneme sayısını kritere yükseltti, böylece kadınlarda performansı bozdu, ancak bu görevdeki erkeklerde değil.

Her dikkat görevi için yapılan toplam hata sayısı Şekil 2B'de gösterilir. Kritere yapılan denemelerin sayısıyla tutarlı olarak, stresli erkekler kontrol eden erkeklerden önemli ölçüde daha az hata yaptı, stresli kadınlar ise yan geri dönüş görevinde daha fazla hata yaptı. Ayrıca, hafif ayrımcılık görevinde, kadınlar da önemli ölçüde daha fazla hata yaptı. Özetle, bu veriler tekrarlanan stresin erkeklerde bilişsel performansı artırdığını, ancak kadınlarda bilişsel performansı bozdığını göstermektedir.

Toplam hatalar Şekil 2C'de azimli veya gerileyen hatalar olarak kategorize edilmiştir (bu iki hata türü arasındaki ayrım için protokolün 7. bölümüne bakın). İlginçtir ki, stresli erkekler yan geri dönüş görevinde erkekleri kontrol etmekten daha az azimli hata yaptı. Öte yandan, hem yan tersine çevirme hem de hafif ayrımcılık görevlerinde, stresli kadınlar kontrol kadınlarından daha fazla sayıda azimli hata yaptı. Her iki görev sırasında yapılan regresif hata sayısında tedavi grupları arasında fark yoktu.

Her denemedeki eksiklikler ve kritere ulaşma süresi Şekil 2D'de gösterilmiştir (bunların nasıl hesaplandıkları hakkında daha fazla bilgi için protokolün 7. bölümüne bakın). Bu önlemler, en büyük cinsiyet farklılıklarını sergilediği için sadece yan tersine çevirme görevinde değerlendirildi. Stresli kadınlar diğer tüm tedavi gruplarına kıyasla daha yüksek oranda ihmalde bulundular. Ek olarak, stres erkeklerde yan geri dönüş görevini tamamlama süresini azaltırken, kadınlarda görevin uzun süre tamamlanmasını strese sokmuştır. Özetle, tekrarlanan stres kadınlarda bilişsel esnekliği bozmuş, ancak erkeklerde değil.

Bilişsel esnekliğin altında kalan beyin substratları Şekil 3'te tasvir edilir. Yan geri dönüş görevinde stark cinsiyet farklılıkları gözlendiğinden, bu görevin altında bulunan beyin bölgeleri, sinirsel aktivitede benzer cinsiyet farklılıkları gösterip göstermediklerini belirlemek için incelendi. Daha önce tartışıldığı gibi, lezyon çalışmaları orbitofrontal korteksin (OFC) yan tersine çevirme görevine aracılık ettiğini belirtmiştir³⁴. Böylece, nöral aktivasyonun bir ölçüsü olan c-fos³⁷, strateji değiştirmenin tamamlanmasından sonra OFC'de 30 dk olarak etiketlenmiştir, bu da performansı yan tersine çevirme görevinde yansıtmalıydı³⁸. Ancak, OFC'nin bu görevin ekstra boyutlu strateji kaydırma bileşeninde de rol oynaması^{mümkündür 39}. Bu nedenle, operant strateji değiştirme paradigması içindeki belirli bir görev sırasında beyin aktivitesini yansıtmak için fedakarlığı uygun zamanda gerçekleştirmek önemlidir. Burada, stres, erkeklerin OFC'sinde kontrollere kıyasla nöronal aktivasyonda önemli bir artışa nedenoldu. Bununla birlikte, stres, kontrollere kıyasla kadınların OFC'sinde nöronal aktivasyonda önemli bir azalmaya neden oldu. Ayrıca, erkeklerde OFC aktivasyonu ve kriter denemeleri negatif korelasyon gösterdi; özellikle, daha yüksek OFC aktivasyonu, kritere daha az deneme ile ilişkiliydi. Buna karşılık, KADıNLARDA OFC aktivasyonu ile performans arasında bir korelasyon yoktu, bu da OFC'nin bu performanslar sırasında devre dışı bırakıldığını düşündürdü.

Şekil 1: Eğitim ve test günlerinde paradigmayı değiştiren operant stratejinin şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Operant strateji değiştirme paradigmasından temsili davranışsal veriler. (A) Sınav günü her görev için kriter için denemeler. Yan tersine çevirme görevinde, stres erkeklerde performansı artırdı, ancak kadınlarda performansı artırdı. Işık ayrımcılığı görevinde, stres kadınlarda performansı zayıflatırken, erkekleri etkilemedi. (B) Sınav günündeki her görev için hata sayısı. Stres erkeklerde yapılan hataların sayısını azalttı, ancak hem yan geri dönüş hem de hafif ayrımcılık görevlerinde kadınlarda hataları artırdı. (C) Azimli ve gerileyen hata kategorizasyonu. Stres erkeklerde yapılan azimli hataları azalttı, ancak hem yan geri dönüş hem de hafif ayrımcılık görevlerinde kadınlarda yapılan azimli hataları artırdı. (D) Yüzde denemeleri atlandı ve yan ters görevde kritere zaman. Stres, dişi sıçanlardaki ihmallerin yüzdesini artırdı. Stres erkeklerin gerektirdiği süreyi azalttı, ancak kadınların görevi tamamlaması için gereken süreyi artırdı. İstatistikler iki yönlü ANOVA ve ardından Tukey'in t testi (n = grup başına 12 sıçan; hata çubukları SEM'yi temsil eder; #p ≤ 0.10, *p < 0.05) kullanılarak hesaplanmıştır. Bu şekil önceki bir yayından değiştirilmiştir¹⁷. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Paradigmayı değiştiren operant stratejiden sonra temsili sinirsel aktivasyon. (A) Strateji değiştirme görevinden sonra OFC etkinleştirmesi. IMMÜNOhistokimyasal 3,3'-diaminobenzidin (DAB) boyamanın, OFC'deki c-fos'a karşı bir antikor kullanılarak temsili görüntüleri brightfield mikroskopisi kullanılarak görselleştirildi, daha sonra ölçülebilir. Stres, erkeklerin OFC'sinde aktivasyonu önemli ölçüde artırdı (c-fos eksprese eden hücrelerin sayısı ile gösterilmiştir), kadınlarda ise aktivasyonu azalttı. Sağ alt görüntü panelinde ölçek çubuğu 200 μm'dir. İstatistikler iki yönlü ANOVA ve ardından Tukey'in t testi kullanılarak hesaplanmıştır (n = grup başına 12 sıçan, sıçan başına analiz edilen 6-8 OFC bölümü; hata çubukları SEM'yi temsil eder; *p < 0.05). (B) Yan ters görevdeki kriter denemeleri OFC aktivasyonu ile ilişkilidir. Erkekler önemli bir negatif korelasyon gösterirken, dişiler görüntülemedi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol, stresin bilişsel işlev üzerindeki etkilerinin nasıl ölçüldük olduğunu gösterir. Özellikle, bilişsel esnekliği ölçen kemirgenlerde değiştirilmiş bir strateji değiştirme paradigması kullanılır (insanlarda Wisconsin Kart Sıralama Görevine benzer)¹. Bilişsel esneklik, bilişsel işleme stratejilerini ortamdaki yeni koşullarla yüzleşmeye uyarlama yeteneğini gösterir ve normal günlük işleyiş için çok önemlidir². Bilişsel esneklik üzerine yapılan insan çalışmaları çoğunlukla beyin görüntüleme ile sınırlı olduğundan¹¹Bu paradigmanın hayvanlarda kullanılması, stresin beyin ve biliş üzerindeki etkilerinin anlaşılmasını büyük ölçüde ilerletecektir.

Stres bilişsel işlevi bozabilir⁴⁰. Aslında, bu TSSB ve MDD^3,41gibi strese bağlı hastalıklarda en yaygın fenotiplerden biridir. Dahası, strese bağlı psikiyatrik hastalıkların oluşumunda keskin cinsiyet farklılıkları vardır^5,6,7, ancak bu önyargılı insidansların arkasındaki nörobiyoloji hakkında çok az anlayış vardır. Bu nedenle, her iki cinsiyetteki hayvanlarda bu operant strateji değiştirme paradigmasının kullanılması, psikiyatrideki cinsiyet farklılıklarının mevcut anlayışını ilerletmeye yardımcı olabilir.

Bu operant strateji değiştirme görevi, araştırmacıların bilişin psikiyatrik bozukluklarla ilgili temel yönlerini incelemelerini sağlar. Örneğin, deneysel manipülasyondan sonraki azimli hatalar bu paradigmada hesaplanır. TSSB gibi strese bağlı psikiyatrik bozukluklarda azim gözlenir ve kişinin yeni bir dizi kural öğrenme yeteneğini bozar, sonuçta çalışma belleğini bozar³. Bu nedenle, azimli hataların ölçüsü çevirisel olarak ilgilidir. Ayrıca, TSSB'li hastalarda dikkat görevlerinde eksiklikler belirtilmiştir, bu da daha yavaş kortikal işleme³. Buna göre, bu paradigmadan elde edilen ihmal verilerinin klinik karşılıkları olabilir. Özetle, bu deneysel paradigma ile ölçülen bilişsel esneklik, psikiyatrik bozukluklarda gözlenen temel fenotipleri modeller.

Bu deneysel paradigma, bilişsel esnekliğin altında kalan sinirsel substratların hedefinde hassasiyet sağlar. Örneğin, literatür prefrontal korteksin (PFC) bilişsel esneklik için çok önemli bir beyin bölgesi olduğunu belirtmiştir³Medial prefrontal (mPFC) ve orbitofrontal korteks (OFC) dahil. PFC'deki bu alt bölgeler arasında, OFC yan ters görev^34,35'teki performans için önemlidir. Bu beyin bölgeleri aynı zamanda stres kaynaklı fonksiyonel değişiklikler için önemli bir hedeftir^42,43. İlginçtir ki, burada kullanılan stres modeli, bilişsel esneklik testlerinde kemirgenlerin sonraki performansında rol oynuyor gibi görünmektedir; bu nedenle, gelecekteki deneylerin tasarımında dikkate alınmalıdır. Strese verilen bu değişen yanıtlar, bilişin stresten etkilendiği potansiyel olarak yeni mekanizmalara işaret eder. Bu nedenle, belirli nörotransmitterleri, proteinleri hedeflemek veya bu beyin bölgelerinin aktivasyonu, stresin erkek ve dişi kemirgenlerde bilişi nasıl etkilediğine ışık tutabilir. Araştırmacılar, bu sinirsel substratları stres veya strateji değiştirme ile birlikte farklı zaman noktalarında manipüle etmeyi seçebilir veya alternatif olarak bu davranış paradigmalarına maruz kalmadan sonra sinirsel substratları ölçebilirler.

Bu değiştirilmiş strateji değiştirme görevi, kemirgenleri eğitmek için deneyci tarafından daha fazla zaman ve çaba gerektiren stres literatüründe kullanılan diğer bilişsel esneklik paradigmalarına (yani, kazma görevi^12,13,14,15)göre açık avantajlara sahiptir. Bu prosedür deneyci tarafından minimum gözetim gerektirir ve birden fazla sıçanın aynı anda test edilmesine izin verir. Ek olarak, bu otomatik görevin diğer sürümlerinden farklı^{olarak 19}Paradigma sadece 3 günlük eğitim gerektirir ve verimli bir programlanmış veri analizi içerir.

İşleyen strateji değiştirme paradigmasının belirli sınırlamaları vardır. Bir sınırlama, yalnızca iki uyaran boyutunu (örneğin, sol veya sağ kol ve ışık işareti) test edebilmesidir, kazma görevi^{ise 12,13,14,15} üçüncü bir uyaran boyutunu test edebilir (örneğin, kazma ortamı ve koku ve doku). Bununla birlikte, bu protokolde açıklanan görev hala sıçanın bilişsel esneklik yapılarının testine izin veren farklı kurallara geçme yeteneğinin testine izin verir. Ek olarak, üçüncü bir uyarana (örneğin, bir koku) izin vermek için operant odalara başka parametreler eklemek mümkündür, ancak bu görev için gereken eğitimi uzatabilir.

Bu görevin birincil avantajı, stresin beyni nasıl etkilediğini daha iyi anlamak için basitliği ve stresli veya farmakolojik manipülasyonlarla eşleştirme yeteneğidir. Bu basitliğin, ekolojik olarak ilgili kazma görevine kıyasla, deneklerin pres yapmayı öğrenirken karşılaştıkları artan bir zorlukla birlikte geldiği belirtilmelidir. Bu operant görev çok daha az emek yoğun olsa da, kemirgenler genellikle bu görevi almak için daha fazla deneme gerektirecektir. Bununla birlikte, hem kazma görevi hem de bu paradigma benzer nörobiyolojik mekanizmaları devreye sokur ve böylece bilişsel esnekliğin incelenmesi için geçerli seçenekleri temsil eder^16,44. Kazı görevini ve bu operant prosedür 23 ,25 ,^27,45,46kullanarak stresin bilişsel esneklik üzerindeki etkileri ile ilgili literatürde çeşitli sonuçlar olsa da, sunulan yöntem, bir stresörün tipinin, yoğunluğunun ve süresinin bilişsel işlev üzerinde sahip olabileceği karmaşık etkileri yansıtır^20,21.

Görevin bir başka sınırlaması, kemirgenlerin kapalı opak kutularda barındırıldır; bu nedenle, bilgisayar arabirimi aracılığıyla toplananlar dışındaki davranışlar kodlanamaz. Örneğin, bir sıçan tarafından yüksek sayıda ihmal, stresin neden olduğu davranışsal inhibisyondan veya sıçanın uykuda olmasından kaynaklanabilir. Ayrıca, tımar (özellikle stresi çalışmada ilgili olan) gibi diğer basmakalıp davranışların görev sırasında analiz edilmesi ilginç olabilir. Kameraların operant odalarına montesi, bu tür davranışsal hassasiyete izin verebilir.

Genel olarak, bu rapor, stresin beyni nasıl etkilediğini daha iyi anlamak için paradigmayı değiştiren bir strateji ile birlikte stres prosedürlerinin kullanımını detaylandırmaktedir. Yetişkinlerde stres prosedürlerine ve bilişsel değerlendirmeye ek olarak, farklı gelişimsel aşamalar üzerinde yapılan araştırmaların bilişsel esnekliğin etiyolojisi hakkında çok önemli bilgiler sağlayabileceği belirtilmelidir. Stresin bilişsel esneklik üzerindeki etkilerini incelemenin yanı sıra, bu basit ve verimli işlenen strateji değiştirme paradigması, beynin değişen ortamlara nasıl uyum sağladığını araştırmak için birçok deneysel manipülasyonla eşlenebilir. Ayrıca, lezyonlar, farmakoloji, gen düzenleme ve elektrofizyoloji de dahil olmak üzere bilişsel esnekliğin sinirsel temelini incelemek için alternatif deneysel yaklaşımlar kullanılabilir. Bilişsel esneksizlik psikiyatrik hastalıktaki temel fenotiplerden biri olduğundan, nörobiyolojik alt tabakalarını daha iyi anlamak için daha fazla araştırma yapılmalıdır.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Yazarlar Hannah Zamore, Emily Saks ve Josh Searle'e Grafe laboratuvarında bu operat strateji değiştirme paradigmasını kurmadaki yardımları için teşekkür etmek istiyor. Ayrıca Analiz için MATLAB koduna yaptığı yardım için Kevin Snyder'a teşekkür etmek istiyorlar.