Evaluación de los efectos del estrés en la flexibilidad cognitiva utilizando un paradigma de cambio de estrategia operante

Los eventos estresantes de la vida perjudican la función cognitiva, lo que aumenta el riesgo de trastornos psiquiátricos. Este protocolo ilustra cómo el estrés afecta la flexibilidad cognitiva utilizando una estrategia operante automatizada que cambia el paradigma en ratas Sprague Dawley macho y hembra. Se discuten áreas específicas del cerebro que subyacen a comportamientos particulares y se explora la relevancia traslacional de los resultados.

El estrés afecta la función cognitiva. Si el estrés mejora o deteriora la función cognitiva depende de varios factores, incluyendo el 1) tipo, intensidad y duración del factor estresante; 2) tipo de función cognitiva en estudio; y 3) el momento del factor estresante en relación con el aprendizaje o la ejecución de la tarea cognitiva. Además, las diferencias de sexo entre los efectos del estrés en la función cognitiva han sido ampliamente documentadas. Aquí se describe una adaptación de una estrategia operante automatizada que cambia el paradigma para evaluar cómo las variaciones en el estrés afectan la flexibilidad cognitiva en ratas Sprague Dawley macho y hembra. Específicamente, el estrés de restricción se utiliza antes o después del entrenamiento en esta tarea basada en el operante para examinar cómo el estrés afecta el rendimiento cognitivo en ambos sexos. Las áreas cerebrales particulares asociadas con cada tarea en este paradigma automatizado han sido bien establecidas (es decir, la corteza prefrontal medial y la corteza orbitofrontal). Esto permite manipulaciones dirigidas durante el experimento o la evaluación de genes y proteínas particulares en estas regiones al completar el paradigma. Este paradigma también permite la detección de diferentes tipos de errores de rendimiento que ocurren después del estrés, cada uno de los cuales tiene sustratos neuronales definidos. También se identifican diferencias de sexo distintas en los errores perseverantes después de un paradigma de estrés de restricción repetido. El uso de estas técnicas en un modelo preclínico puede revelar cómo el estrés afecta al cerebro y afecta la cognición en trastornos psiquiátricos, como el trastorno de estrés postraumático (TEPT) y el trastorno depresivo mayor (TDM), que muestran marcadas diferencias de sexo en la prevalencia.

En los seres humanos, los eventos estresantes de la vida pueden afectar la función cognitiva (es decir, la flexibilidad cognitiva^1),lo que denota la capacidad de adaptar las estrategias de procesamiento cognitivo para enfrentar nuevas condiciones en el entorno². El deterioro de la cognición precipita y exacerba muchos trastornos psiquiátricos, como el trastorno de estrés postraumático (TEPT) y el trastorno depresivo mayor (TDM)^3,4. Estos trastornos son dos veces más prevalentes en las mujeres^5,6,7,8,sin embargo, la base biológica de esta disparidad sigue siendo desconocida. Los aspectos del funcionamiento ejecutivo en humanos se pueden evaluar utilizando la Wisconsin Card Sorting Task, una demostración de flexibilidad cognitiva². El rendimiento en esta tarea se ve afectado en pacientes con TEPT⁹ y MDD^10,pero la base neuronal de este cambio solo puede ser examinada por imágenes cerebrales¹¹.

Los avances en la comprensión de cómo el estrés afecta al cerebro se han logrado a través del uso de modelos animales, particularmente roedores. Como la flexibilidad cognitiva se ve afectada en las enfermedades relacionadas con el estrés, es un fenotipo excepcionalmente relevante para examinar en roedores. Hasta la fecha, la mayoría de la literatura de neurobiología del estrés ha utilizado un paradigma alternativo de flexibilidad cognitiva (a veces denominado la tarea de excavación)^12,13,14,15. Si bien esta tarea ha sido ampliamente examinada, requiere más tiempo y esfuerzo por parte del experimentador para entrenar roedores. Adaptado y descrito aquí es un protocolo automatizado de cambio de conjunto bien establecido¹⁶ para evaluar la flexibilidad cognitiva en ratas Sprague Dawley macho y hembra utilizando varios modelos de estrés^17,18. El procedimiento requiere una supervisión mínima por parte del experimentador y permite que múltiples ratas sean probadas simultáneamente. Además, a diferencia de otras versiones de esta tarea automatizada^19,la adaptación de este paradigma solo requiere 3 días de entrenamiento e incluye un eficiente análisis de datos programados.

Si el estrés mejora o deteriora la función cognitiva depende del tipo, la intensidad y la duración del factor estresante, así como del momento del factor estresante en relación con el aprendizaje o la ejecución de una tarea cognitiva^20,21. Así, el protocolo incorpora procedimientos de estrés tanto antes como después del entrenamiento operante. También examina los resultados representativos de los estudios de estrés. Además, las regiones cerebrales subyacentes a aspectos particulares del cambio de conjuntos han sido bien establecidas^2,16,22; por lo tanto, el informe también describe cómo apuntar y evaluar regiones cerebrales particulares durante o después de los procedimientos de cambio de estrés y estrategia.

Ha habido investigaciones limitadas sobre el examen directo de las diferencias sexuales en la flexibilidad cognitiva^18,23.  El protocolo describe cómo 1) incorporar ratas macho y hembra en el paradigma experimental, luego 2) rastrear ciclos estrales antes y durante los procedimientos en hembras que pedalean libremente. Estudios previos han indicado que el estrés antes del entrenamiento operante puede conducir a déficits específicos del sexo en la flexibilidad cognitiva en^{ratas 17}. En particular, las ratas hembra exhiben interrupciones en la flexibilidad cognitiva después del estrés, mientras que la flexibilidad cognitiva mejora en las ratas macho después del estrés¹⁷. Curiosamente, un sello distintivo importante de los trastornos psiquiátricos relacionados con el estrés, que tienen una incidencia sesgada por el sexo en los seres humanos, es la inflexibilidad cognitiva. Estos resultados sugieren que las mujeres pueden ser más vulnerables a este tipo de deterioro cognitivo que los hombres. El uso de estas técnicas en modelos animales arrojará luz sobre los efectos del estrés en el cerebro y cómo afecta la cognición en los trastornos psiquiátricos en humanos.

Todos los procedimientos de este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en Bryn Mawr College. Obtener la aprobación regulatoria de la IACUC o de otra manera aplicable antes de ordenar animales de laboratorio y comenzar la experimentación.

1. Preparación animal

1. Adquirir macho y hembra de ratas Sprague Dawley adultas.
   NOTA: Las ratas pueden ser entregadas antes de los 65 días de edad, pero no comiencen los procedimientos hasta después de este punto para asegurarse de que tanto los machos como las hembras estén completamente maduros.
2. Emparejar ratas del mismo sexo durante el mayor tiempo posible, ya que el aislamiento a largo plazo es un factor estresante²⁴. Para la restricción de alimentos, amese solo a las ratas justo antes del protocolo de cambio de estrategia operante.
3. Después de 1 semana de aclimatación, comience suavemente a manejar ratas durante 3-5 minutos por día. Recoge el peso corporal de cada rata. Además, si está interesado en evaluar cómo las hormonas gonadales pueden afectar los resultados, recoja el lavado vaginal para ratas hembra (descrito en la sección 2).
4. Restrinja (de la comida) a los animales que se ejecutarán en el paradigma de cambio de estrategia operante al menos 3 días antes de que comience el entrenamiento para que aprendan con éxito la tarea. Asegúrese de que el agua esté siempre disponible gratuitamente. Se deben mantener registros escritos para cada animal para documentar el consumo diario de alimentos y líquidos, el estado de hidratación y cualquier cambio de comportamiento y clínico utilizado como criterio para la eliminación temporal o permanente de un animal de un protocolo (Morton 2000; NRC 2003b).
   1. Si emplea un procedimiento de estrés durante más de 3 días antes del entrenamiento, ajuste la restricción de alimentos para que coincida con el número de días de estrés (por ejemplo, 5 días de restricción más restricción de alimentos²⁵).
   2. Cada día, entregar el 80% de la ingesta diaria normal de alimentos (es decir, 4 g de alimentos por cada 100 g de peso corporal)²⁶. Use la recolección diaria de peso para la rata para calcular la cantidad de comida que debe dar cada día.
   3. Continúe con la restricción de alimentos durante los días de entrenamiento y prueba. Sin embargo, no coloque la comida en la jaula del hogar hasta después de que la rata haya completado el entrenamiento o las pruebas del día, o de lo contrario no estará motivada para realizar las tareas para obtener una recompensa de pellets de alimento. Asegúrese de que el momento de la entrega de alimentos a las ratas al finalizar la tarea sea bastante impredecible, ya que esto ayuda a evitar una motivación reducida para realizar en la cámara operante (a favor de simplemente esperar la comida en la jaula doméstica después).
      NOTA: Los animales sometidos al paradigma de estrés de restricción no exhiben una pérdida de peso significativamente mayor que los sujetos de control no estresados. Sin embargo, varios procedimientos de estrés pueden inducir la pérdida de peso, lo que resulta en que las ratas reciban menos alimentos que sus contrapartes no estresadas durante la restricción de alimentos basada en el peso corporal. Esto puede presentar un factor estresante adicional y confuso. Si este parece ser el caso, alternativamente use una cantidad fija de alimentos dados a cada sujeto, independientemente del peso²⁷.

2. Lavado vaginal

NOTA: Se sabe que las hormonas gonadales (es decir, estrógeno y progesterona) afectan la respuesta al estrés y la cognición^28,29,30. Estas hormonas fluctúan a lo largo del ciclo estral de las ratas hembra³¹. Si está interesado en rastrear el ciclo estral de roedores hembras que circulan libremente para correlacionarlos con datos de estrés o flexibilidad cognitiva, recopile el lavado vaginal como se describe a continuación. No se proporcionan datos representativos que consideren la etapa del ciclo estral.

1. Para obtener muestras de lavado vaginal de las hembras, reúna agua tibia en un vaso de precipitados limpio, un cuentagotas de vidrio, un portaobjetos de "lavado" (portaobjetos de microscopio con círculos de pintura acrílica para contener la muestra de lavado) y un vaso de precipitados vacío.
2. Llene el cuentagotas con una pequeña cantidad de agua tibia (~ 0.5 ml), luego inserte la punta en la vagina de la rata hembra (levantándola por la cola). Expulse el agua estéril 2x–3x y expulse el líquido recolectado en un portaobjetos microscópico. No desborde el círculo de deslizamiento de lavado.
3. Expulse cualquier exceso de líquido en el beaker vacío. Etiquete la diapositiva de lavado con números de rata y coloque las muestras de cada rata en ese orden para que quede claro qué muestra pertenece a cada rata.
4. Enjuague bien el cuentagotas pipeteando agua tibia limpia y dispensándola en el beaker "excedente" varias veces antes de llenar el cuentagotas para muestrear la siguiente rata.
5. Lleve cuidadosamente el portaobjetos de lavado a un microscopio de campo brillante para obtener imágenes de la muestra de lavado y clasificar el día dentro del ciclo estral como se describe en Becker et al³¹.
   NOTA: Idealmente, el lavado debe hacerse durante unas semanas para rastrear adecuadamente el ciclo de una mujer y debe realizarse a una hora muy similar cada día para controlar los ritmos circadianos. Preferiblemente, este procedimiento debe realizarse antes de los procedimientos de cambio de estrategia operante y de estrés. El uso de hisopos de algodón y solución salina estéril también se puede utilizar como una alternativa a esta técnica de cuentagotas. Los datos de las ratas hembra se pueden analizar post-hoc de acuerdo con el día del ciclo estral (considere los días del ciclo cuando se realiza el estrés y / o el día del ciclo cuando se realizan las pruebas).

3. Equipos y software

1. Use cámaras operantes para el entrenamiento y las pruebas de comportamiento.
   1. Asegúrese de que las cámaras contengan al menos dos palancas retráctiles con dos luces de estímulo arriba, una luz doméstica y un dispensador de refuerzo para estas tareas.
   2. Compruebe que las palancas estén a ambos lados del área central de entrega de refuerzo con una luz de estímulo sobre cada palanca.
   3. Use la luz de la casa para iluminar la cámara sin interferir con la detección del estímulo de luz (es mejor si la luz de la casa está en la pared posterior de la cámara, opuesta a las palancas y las luces de estímulo).
2. Use gránulos de alimentos sin polvo (aquí, se utilizan gránulos de 45 mg: 18.7% de proteína, 5.6% de grasa y 4.7% de fibra) para el refuerzo en ratas restringidas en alimentos. No use gránulos ricos en sacarosa o grasa (a menos que haya interés en cómo el estrés afecta la ingesta de alimentos sabrosos).
3. Controlar la presentación de estímulos, el funcionamiento de la palanca y la recolección de datos desde una computadora con software capaz de operar la cámara (Tabla de Materiales).
   NOTA: Para obtener información relacionada con la codificación de programas que utilizan este software, póngase en contacto con los autores. Los scripts de MED-PC se incluyen como archivos complementarios. Este software recopila información sobre las respuestas del animal para cada ensayo (qué palanca se presiona, si es correcta / incorrecta / no responde y latencia para tomar la decisión). A partir de esta información, los usuarios pueden calcular varias medidas en el paradigma conductual, como se describe en la sección de análisis de comportamiento.
4. Realizar entrenamientos/pruebas a la misma hora todos los días para controlar los ritmos circadianos en las hormonas del estrés³² (y otras medidas relevantes).
5. Llene la bandeja inferior de cada caja operante con ropa de cama fresca para recoger heces/residuos. Después de cada sesión, vierta cada bandeja, limpie las bandejas y el interior de la cámara con toallitas con alcohol o un desinfectante aprobado por la IACUC, y reemplácela con ropa de cama fresca antes de colocar un nuevo animal en la cámara.

4. Procedimientos de estrés

1. Decida si el procedimiento de estrés debe realizarse antes, durante y / o después de la capacitación sobre el paradigma de cambio de estrategia operante (por ejemplo, 5 días de estrés de restricción antes de 3 días de entrenamiento operante frente a 3 días de entrenamiento operante seguido de una sola restricción y prueba).
2. Ejecutar el procedimiento de estrés al mismo tiempo diariamente con respecto al entrenamiento operante. (por ejemplo, 30 min de tensión de sujeción a partir de 9 A.M., seguido de la colocación en la cámara operante).
3. Realizar los procedimientos de estrés en una habitación separada de la sala de colonias y de las salas de cambio de paradigma de estrategia (para garantizar que no haya factores de confusión asociados con el estrés de los testigos)³³. Brevemente, coloque a la rata en un tubo de sujeción transparente estilo Broome y selle la abertura, teniendo cuidado de no pellizcar las extremidades o la cola. Entre cada sujeto, use un desinfectante aprobado por IACUC para limpiar el tubo estilo Broome. La desinfección inadecuada puede dejar feromonas que pueden afectar negativamente el protocolo de prueba.
   NOTA: Calcule cuánto tiempo pasará el primer grupo de ratas en las cámaras operantes. Esto variará dependiendo del entrenamiento frente al día de la prueba; sin embargo, después de ejecutar varias cohortes, se puede calcular un tiempo promedio para completar cada tarea para estimar tareas futuras.
4. Dependiendo de cuántas cámaras operantes estén disponibles, escalone el procedimiento de estrés para los sujetos. Por ejemplo, cuatro ratas sufren tensión de restricción y se colocan en cuatro cámaras operantes. Una hora más tarde, cuatro animales más se someten a procedimientos de estrés que deben ser seguidos por la cámara operante.

5. Formación

NOTA: Este paradigma se modifica a partir del procedimiento operante de cambio de conjunto desarrollado por Floresco et al. de tal manera que se puede completar en 3 días^19.  Los procedimientos de entrenamiento para ratas requieren 3 días (1 día para aprender cada tarea como se describe a continuación). Es raro que una rata no aprenda estas tareas. Si una rata no aprende cada tarea, debe excluirse del estudio final. Consulte la Figura 1A para obtener una representación visual del paradigma de entrenamiento que se describe a continuación.

1. Antes de colocar la rata en la cámara, asegúrese de que haya suficientes gránulos de comida en el dispensador y que las cajas operantes funcionen correctamente. Para lograr esto, cargue e inicie un programa de entrenamiento o día de prueba en una cámara vacía, probando manualmente que la palanca correcta entrega adecuadamente una recompensa por prensa de palanca.
2. Entrenar a la rata para presionar cada palanca
   1. Antes de colocar la rata en la caja para el primer día de entrenamiento, coloque manualmente una recompensa de pellet de alimento en la palanca correcta, según lo designado al cargar el procedimiento de entrenamiento dentro de cada cámara.
   2. Entrene a la rata utilizando un horario de relación fija (FR-1), de modo que cada palanca correcta sea recompensada con un refuerzo. Contraequilibre la palanca correcta por día entre sujetos y / o condiciones experimentales (dando forma a una sola palanca a la vez) designando la palanca correcta al cargar el procedimiento de entrenamiento en la computadora que opera las cámaras.
   3. Permita que la rata presione la palanca hasta que alcance el criterio presionando la palanca correcta 50x, generalmente completando la tarea entre 30-45 min.
   4. Al día siguiente forzar a la rata a realizar esta tarea en la palanca opuesta utilizando el mismo programa que el primer día de entrenamiento, pero designar la palanca opuesta como la correcta. No hay necesidad de "dar forma" a la palanca con un pellet de comida en este día de entrenamiento. Por lo general, este criterio se adquiere rápidamente después de que las ratas han aprendido a presionar la primera palanca.
3. Entrenar a la rata para que responda a la señal de luz
   1. En el tercer día de entrenamiento, ilumine la luz sobre ambas palancas durante 15 pruebas, durante las cuales la rata puede presionar una de las palancas para recibir potencialmente una recompensa de pellets de alimento. Durante la tarea de discriminación ligera, este programa seleccionará aleatoriamente qué palanca es correcta prueba por prueba.
   2. Si la rata presiona la palanca correcta, asegúrese de que las luces permanezcan iluminadas durante 3 s y se entregue la recompensa, seguida de un período de 5 s, durante el cual las luces se apagan antes de la próxima prueba. Si la rata presiona la palanca incorrecta, asegúrese de que no se entregue ninguna recompensa y que las luces se apaguen durante los 10 años anteriores a la siguiente prueba.
   3. Después de este último día de entrenamiento, calcule el "sesgo lateral" para determinar si la rata tiene preferencia por la palanca izquierda o derecha dividiendo el número de prensas de una palanca dividido por el número total de prensas de palanca. El día de la prueba, la rata comenzará en su lado menos preferido para asegurarse de que está aprendiendo la contingencia específica de respuesta-recompensa, en lugar de responder a una palanca preferida.

6. Pruebas

NOTA: Consulte la Figura 1B para obtener una descripción visual del paradigma de prueba que se describe a continuación.

1. El día 4 (día de prueba), coloque la rata en la cámara operante siguiendo los procedimientos de estrés y pruébelos en tareas de discriminación lateral, inversión lateral y discriminación ligera en serie. Asegúrese de que la tarea de discriminación de luz solo ilumine la luz por encima de la palanca "correcta". En cada tarea, las ratas deben lograr consecutivamente ocho ensayos correctos para completar cada discriminación sin presionar la palanca incorrecta y no recompensada. Una prensa de palanca incorrecta restablecerá esta cadena de pruebas.
   1. Pruebe a las ratas utilizando la tarea de discriminación lateral. Usando el programa de discriminación lateral, recompense a la rata por presionar la palanca en su lado menos preferido según lo determinado a partir del tercer día de entrenamiento, independientemente de la señal de luz. La tarea termina al presionar la palanca correcta 8x consecutivamente (excluyendo omisiones).
   2. Realice la prueba de inversión lateral ejecutando ratas utilizando el programa de discriminación lateral nuevamente, pero esta vez designando la palanca opuesta a la correcta de la tarea de discriminación lateral como correcta. Asegúrese de que la rata sea recompensada por presionar esta palanca, independientemente de la señal de luz. La tarea termina al presionar la palanca correcta 8x consecutivamente (excluyendo omisiones).
   3. Realice la tarea de discriminación de luz, que recompensa a la rata por presionar la palanca con la luz iluminada arriba. Cada prueba operante se completa al presionar la palanca correcta 8 veces consecutivamente (excluyendo omisiones).
      NOTA: Con base en estudios previos, estas tareas codifican un mínimo de 30 ensayos, independientemente de las prensas consecutivas, para garantizar que las ratas tengan tiempo suficiente para aprender las reglas de cada tarea¹⁸. Por lo tanto, si la rata logra consecutivamente ocho ensayos correctos antes de que se hayan producido 30 ensayos, la tarea permanecerá comprometida hasta que se completen 30 ensayos.

7. Análisis conductual

NOTA: Los datos adquiridos para cada animal el día de la prueba son registrados y guardados automáticamente por la computadora, siempre y cuando se haya iniciado y permitido completar un script MED-PC para cada tarea (consulte los materiales complementarios para los scripts MED-PC).

1. Abra los datos de cada tarea del día de la prueba (discriminación lateral, inversión lateral y discriminación ligera) utilizando el programa informático. Las principales medidas registradas por el programa son los ensayos según el criterio, los errores en el criterio y el tiempo para el criterio. Estas medidas se describen en detalle a continuación.
   NOTA: Los autores han generado un script de MATLAB que permite la automatización del proceso de análisis, así como el análisis de errores perseverantes frente a los regresivos (póngase en contacto con los autores para obtener información de código para agilizar el análisis de datos).
   1. Utilizar los ensayos como criterio (que se refiere al número total de ensayos [sin incluir las omisiones] necesarios para que la rata complete consecutivamente ocho ensayos correctos, incluidos esos ocho ensayos) como el principal indicador de exactitud. Estos datos se encuentran en la primera columna de la matriz B en un archivo de datos generado por el script MED-PC para cualquiera de las tareas del día de la prueba.
   2. Examine el total de errores cometidos durante cada tarea. Estos datos se encuentran en la tercera columna de la matriz B en un archivo de datos generado por el script MED-PC para cualquiera de las tareas del día de la prueba. Estos errores también se clasifican en errores perseverantes o regresivos. Los errores perseverantes se cometen cuando la rata continúa siguiendo la regla anterior de la tarea anterior. Los errores regresivos se cometen después de que se ha desconectado de la regla anterior, pero continúa tratando de adquirir la nueva regla (para obtener más detalles sobre cómo se calculan estos tipos de errores, consulte el método publicado¹⁸).
   3. Si la rata no respondió a una señal de luz dentro de los 15 s, el ensayo se clasifica como una omisión y no contará para el número total de ensayos según el criterio. Calcule esto sumando primero el número de respuestas correctas (ubicadas en la segunda columna de la matriz B en el archivo de datos) y el número de errores (ubicado en la tercera columna de la matriz B en el archivo de datos). A continuación, reste este número del número total de ensayos al criterio (este es el último número de la primera columna de la matriz B en un archivo de datos, diferente de los ensayos al criterio).
   4. Utilice las horas de inicio y finalización registradas por el programa (ubicadas en la parte superior de un archivo de datos generado por el script MED-PC para cualquiera de las tareas del día de la prueba) para calcular el tiempo según el criterio. La latencia a la primera pulsación de palanca también se puede calcular a partir del archivo de datos restando la variable K (tiempo transcurrido en segundos desde la primera pulsación de palanca) del tiempo al criterio.
   5. Promedie los datos para cada medida de comportamiento para ratas dentro del mismo grupo de tratamiento. Realizar análisis estadísticos apropiados (dependiendo de cuántas variables se estén examinando).

8. Sustratos cerebrales

1. Determinar un área cerebral interesada y/o un aspecto de la flexibilidad cognitiva. Por ejemplo, si el estrés aumenta los errores perseverantes en la tarea de inversión lateral, la corteza orbitofrontal (OFC) puede ser de particular interés, ya que estudios de lesiones anteriores han indicado que esta región del cerebro desempeña un papel en muchas formas de aprendizaje de reversión (es decir, inversión espacial probada en la tarea de inversión lateral)^34,35,36. En este ejemplo, sacrifica ratas después de que se completa el paradigma de cambio de estrategia y examina c-fos (medida de activación neuronal³⁷⁾en el OFC utilizando los métodos inmunohistoquímicos descritos²⁵ y descritos brevemente aquí.
   1. Primero, extraiga los cerebros de los animales y córtese en rodajas de 40 μm.
   2. Lave el tejido en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 4 veces durante 5 minutos cada una, luego incube en peróxido de hidrógeno al 0,3% durante 10 minutos para apagar las peroxidasas endógenas.
   3. Lave el tejido en PBS 2x durante 5 minutos cada uno, luego incube en anticuerpo primario anti-c-fos de ratón (1:500), suero de burro normal al 3% (NDS) y Tritón X al 0,3% durante la noche.
   4. Al día siguiente, lave el tejido en PBS 3x durante 5 minutos cada uno, luego incube en anticuerpo anti-ratón anti-ratón conjugado con biotina-SP (1:500) durante 2 h.
   5. Lave el tejido en PBS 3x durante 5 minutos cada uno, luego incube en el complejo AVIDIN-Streptavidin AB durante 1 h.
   6. Lave el tejido en PBS 3x durante 5 minutos cada uno, luego incube en solución DAB durante un período de hasta 10 minutos a medida que el tejido sufre una reacción cromogénica de oxidación.
   7. Lave el tejido en PBS 3x durante 5 minutos cada uno, luego monte las rebanadas cerebrales en portaobjetos de microscopio de vidrio.
   8. Cubre el tejido utilizando un medio de montaje a base de tolueno e imagen con un microscopio de campo brillante.
      NOTA: Aquí, como se refleja en los resultados representativos, las ratas se sacrifican 30 minutos después de que finaliza el cambio de paradigma de estrategia, aproximadamente 60-90 minutos después de que se haya completado la tarea de reversión (dependiendo del rendimiento de cada rata en la tarea ligera). Esto debe representar el momento óptimo para la expresión c-fos^38,lo que refleja el rendimiento en la tarea de reversión.
2. Alternativamente, cannulate un área específica del cerebro para la inyección de drogas o la inyección viral antes de la ejecución del estrés o el cambio de paradigma de la estrategia operante.
   NOTA: Los investigadores pueden querer examinar cómo la manipulación de sustratos neuronales altera los efectos del estrés en la flexibilidad cognitiva. Por ejemplo, los investigadores pueden bloquear un receptor de neurotransmisor particular en la corteza prefrontal antes de la prueba.

El paradigma de cambio de estrategia operante automatizada adaptada descrito anteriormente se utilizó para determinar si el estrés de restricción repetido afecta la cognición en ratas Sprague Dawley macho y hembra. Los datos de comportamiento representativos se describen en la Figura 2 a continuación. En resumen, las ratas de control y repetidamente restringidas realizaron esta prueba de cambio de estrategia operante, que consistió en una serie de tareas: discriminación lateral, inversión lateral y discriminación ligera.

Los ensayos según el criterio para cada tarea se representan en la Figura 2A. Por lo general, un mejor rendimiento en cada tarea se representó por un número reducido de ensayos según el criterio. Estos datos indican que, después de la restricción aguda, los varones completaron la tarea de reversión lateral en significativamente menos ensayos que los hombres control no arrestrados. Por el contrario, las mujeres estresadas requirieron un número significativamente mayor de ensayos para completar la tarea de reversión lateral. Estos resultados sugieren que los hombres exhibieron un mejor rendimiento después del estrés, mientras que las mujeres exhibieron un rendimiento deteriorado. En la tarea de discriminación ligera, el estrés aumentó el número de ensayos a criterio en comparación con las mujeres de control, lo que perjudicó el rendimiento en las mujeres pero no en los hombres en esta tarea.

El número total de errores cometidos para cada tarea de atención se muestra en la Figura 2B. De acuerdo con el número de ensayos según el criterio, los hombres estresados cometieron significativamente menos errores que los hombres de control, mientras que las mujeres estresadas cometieron más errores en la tarea de reversión lateral. Además, en la tarea de discriminación ligera, las mujeres también cometieron significativamente más errores. En resumen, estos datos sugieren que el estrés repetido mejora el rendimiento cognitivo en los hombres, pero afecta el rendimiento cognitivo en las mujeres.

Los errores totales se clasificaron además en errores perseverantes o regresivos en la Figura 2C (para una distinción entre estos dos tipos de errores, consulte la sección 7 del protocolo). Curiosamente, los hombres estresados cometieron menos errores perseverantes en la tarea de reversión lateral que los hombres de control. Por otro lado, tanto en las tareas de reversión lateral como en las de discriminación ligera, las mujeres estresadas cometieron un mayor número de errores perseverantes que las mujeres de control. No hubo diferencias entre los grupos de tratamiento en el número de errores regresivos cometidos durante cualquiera de las tareas.

Las omisiones en cada ensayo y el tiempo hasta alcanzar el criterio se muestran en la Figura 2D (para obtener más información sobre cómo se calcularon, consulte la sección 7 delprotocolo). Estas medidas se evaluaron solo en la tarea de reversión lateral, ya que esta tarea exhibió las mayores diferencias de sexo. Las mujeres estresadas hicieron un mayor porcentaje de omisiones en comparación con todos los demás grupos de tratamiento. Además, mientras que el estrés pareció disminuir el tiempo para completar la tarea de reversión lateral en los hombres, el estrés prolongó la finalización de la tarea en las mujeres. En resumen, el estrés repetido deterioró la flexibilidad cognitiva en las mujeres, pero no en los hombres.

Los sustratos cerebrales subyacentes a la flexibilidad cognitiva se representan en la Figura 3. A medida que se observaron marcadas diferencias de sexo en la tarea de inversión lateral, se examinaron las áreas cerebrales subyacentes a esta tarea para determinar si mostraban diferencias sexuales similares en la actividad neuronal. Como se discutió anteriormente, los estudios de lesiones han indicado que la corteza orbitofrontal (OFC) media la tarea de inversión lateral³⁴. Por lo tanto, c-fos, una medida de activación neuronal^37,se etiquetó en el OFC a los 30 minutos después de la finalización del cambio de estrategia, lo que debería haber reflejado el rendimiento en la tarea de inversión lateral³⁸. Sin embargo, es posible que ofC también pueda desempeñar un papel en el componente de desplazamiento de la estrategia extradimensional de esta tarea³⁹. Por lo tanto, es importante realizar el sacrificio en el momento adecuado para reflejar la actividad cerebral durante una tarea particular dentro del paradigma de cambio de estrategia operante. Aquí, el estrés indujo un aumento significativo de la activación neuronal en el OFC de los varones en comparación con loscontroles. Sin embargo, el estrés indujo una disminución significativa en la activación neuronal en el OFC de las mujeres en comparación con los controles. Además, en los varones, la activación de OFC y los ensayos se correlacionaron negativamente; específicamente, una mayor activación de OFC se asoció con menos ensayos según el criterio. Por el contrario, no hubo correlación entre la activación de OFC y el rendimiento en las mujeres, lo que sugiere que el OFC se desconectó durante estas actuaciones.

Figura 1: Esquema del paradigma de cambio de estrategia operante durante los días de entrenamiento y prueba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Datos de comportamiento representativos del paradigma de cambio de estrategia operante. (A) Ensayos a criterio para cada tarea el día de la prueba. En la tarea de reversión lateral, el estrés mejoró el rendimiento en los hombres, pero deterioró el rendimiento en las mujeres. En la tarea de discriminación ligera, el estrés debilitó el rendimiento en las mujeres, mientras que no afectó a los hombres. (B) Número de errores para cada tarea el día de la prueba. El estrés redujo el número de errores cometidos en los hombres, pero aumentó los errores en las mujeres tanto en las tareas de inversión lateral como en las tareas de discriminación ligera. (C) Categorización de errores perseverantes y regresivos. El estrés disminuyó los errores perseverantes cometidos en los hombres, pero aumentó los errores perseverantes cometidos en las mujeres tanto en las tareas de reversión lateral como en las tareas de discriminación ligera. (D) Porcentaje de ensayos omitidos y tiempo para criterio en la tarea de reversión lateral. El estrés aumentó el porcentaje de omisiones en ratas hembra. El estrés disminuyó el tiempo requerido por los hombres, pero aumentó el tiempo requerido por las mujeres para completar la tarea. Las estadísticas se calcularon utilizando ANOVA bidireccional seguido de la prueba t de Tukey (n = 12 ratas por grupo; las barras de error representan SEM; #p ≤ 0,10, *p < 0,05). Esta cifra ha sido modificada a partir de una publicación anterior¹⁷. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Activación neuronal representativa después del cambio de paradigma de la estrategia operante. (A) Activación de OFC después de la tarea de cambio de estrategia. Imágenes representativas de la tinción inmunohistoquímica de 3,3'-diaminobencidina (DAB) utilizando un anticuerpo contra c-fos en el OFC visualizadas mediante microscopía de campo brillante, luego cuantificadas. El estrés aumentó significativamente la activación (demostrada por el número de células que expresan c-fos) en el OFC de los machos, mientras que disminuyó la activación en las hembras. La barra de escala en el panel de imagen inferior derecho representa 200 μm. Las estadísticas se calcularon utilizando ANOVA bidireccional seguido de la prueba t de Tukey (n = 12 ratas por grupo, 6-8 secciones de OFC analizadas por rata; las barras de error representan SEM; *p < 0,05). (B) Ensayos a criterio en la tarea de reversión lateral correlacionada con la activación de OFC. Los hombres mostraron una correlación negativa significativa, mientras que las mujeres no. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El protocolo demuestra cómo medir los efectos del estrés en la función cognitiva. Específicamente, se utiliza un paradigma de cambio de estrategia operante modificada en roedores, que mide la flexibilidad cognitiva (análoga a la Wisconsin Card Sorting Task en humanos)¹. La flexibilidad cognitiva denota la capacidad de adaptar las estrategias de procesamiento cognitivo para enfrentar nuevas condiciones en el entorno, y es crucial para el funcionamiento diario normal². Como los estudios en humanos sobre la flexibilidad cognitiva se limitan principalmente a las imágenes cerebrales^11,el uso de este paradigma en animales avanzará en gran medida en la comprensión de los efectos del estrés en el cerebro y la cognición.

El estrés puede afectar la función cognitiva⁴⁰. De hecho, este es uno de los fenotipos más comunes en enfermedades relacionadas con el estrés como el TEPT y el MDD^3,41. Además, hay marcadas diferencias de sexo en la aparición de enfermedades psiquiátricas relacionadas con el estrés^5,6,7,sin^embargo,hay poca comprensión de la neurobiología detrás de estas incidencias sesgadas. Por lo tanto, el uso de esta estrategia operante que cambia el paradigma en animales de ambos sexos puede ayudar a avanzar en la comprensión actual de las diferencias sexuales en psiquiatría.

Esta tarea de cambio de estrategia operante permite a los investigadores examinar aspectos clave de la cognición relevantes para los trastornos psiquiátricos. Por ejemplo, los errores perseverantes después de la manipulación experimental se calculan en este paradigma. La perseverancia se observa en los trastornos psiquiátricos relacionados con el estrés, como el TEPT, y afecta la capacidad de uno para aprender un nuevo conjunto de reglas, lo que en última instancia afecta la memoria de trabajo³. Por lo tanto, la medida de los errores perseverantes es relevante traslacionalmente. Además, se han observado omisiones en las tareas de atención en pacientes con TEPT, lo que indica un procesamiento cortical más lento³. En consecuencia, los datos de omisión de este paradigma pueden tener contrapartes clínicas. En suma, la flexibilidad cognitiva medida por este paradigma experimental modela fenotipos clave que se observan en los trastornos psiquiátricos.

Este paradigma experimental también permite la precisión en la orientación de los sustratos neuronales subyacentes a la flexibilidad cognitiva. Por ejemplo, la literatura ha indicado que la corteza prefrontal (PFC) es una región cerebral crucial para la flexibilidad cognitiva^3,incluyendo la corteza prefrontal medial (mPFC) y orbitofrontal (OFC). De estas subregiones en el PFC, el OFC es importante para el desempeño en la tarea de reversión lateral^34,35. Estas áreas cerebrales también son un objetivo clave para las alteraciones funcionales inducidas por el estrés^42,43. Curiosamente, el modelo de estrés utilizado aquí parece desempeñar un papel en el rendimiento posterior de los roedores en las pruebas de flexibilidad cognitiva; por lo tanto, debe considerarse en el diseño de futuros experimentos. Estas respuestas variables al estrés apuntan a mecanismos potencialmente novedosos por los cuales la cognición se ve afectada por el estrés. Por lo tanto, apuntar a neurotransmisores específicos, proteínas o activación de estas regiones del cerebro puede arrojar luz sobre cómo el estrés afecta la cognición en roedores machos y hembras. Los investigadores pueden optar por manipular estos sustratos neuronales en diferentes puntos de tiempo junto con el estrés o el cambio de estrategia, o alternativamente medir los sustratos neuronales después de la exposición a estos paradigmas de comportamiento.

Esta tarea de cambio de estrategia operante modificada tiene claras ventajas sobre otros paradigmas de flexibilidad cognitiva utilizados en la literatura de estrés (es decir, la tarea de excavación^{12,13,14,15),}que requieren más tiempo y esfuerzo por parte del experimentador para entrenar roedores. Este procedimiento requiere una supervisión mínima por parte del experimentador y permite que múltiples ratas sean probadas simultáneamente. Además, a diferencia de otras versiones de esta tarea automatizada^19,el paradigma solo requiere 3 días de entrenamiento e incluye un eficiente análisis de datos programados.

El paradigma de cambio de estrategia operante tiene ciertas limitaciones. Una limitación es que solo puede probar dos dimensiones de estímulo (por ejemplo, palanca izquierda o derecha vs. señal de luz), mientras que la tarea de excavación^12,13,14,15 puede probar una tercera dimensión de estímulo (por ejemplo, medios de excavación vs. olor vs. textura). Sin embargo, la tarea descrita en este protocolo todavía permite probar la capacidad de la rata para cambiar a diferentes reglas, lo que permite probar las construcciones de flexibilidad cognitiva. Además, es posible agregar otros parámetros a las cámaras operantes para permitir un tercer estímulo (por ejemplo, un olor), pero esto puede prolongar el entrenamiento requerido para la tarea.

La principal ventaja de esta tarea es su simplicidad y capacidad para combinarla con manipulaciones estresantes o farmacológicas para comprender mejor cómo el estrés afecta al cerebro. Cabe señalar que esta simplicidad viene con una mayor dificultad que enfrentan los sujetos mientras aprenden a presionar palanca, en comparación con la tarea de excavación ecológicamente relevante. Si bien esta tarea operante es mucho menos intensiva en mano de obra, los roedores generalmente requerirán más ensayos para adquirir esta tarea. Sin embargo, tanto la tarea de excavación como este paradigma involucran mecanismos neurobiológicos similares y, por lo tanto, representan opciones válidas para el examen de la flexibilidad cognitiva^16,44. Si bien ha habido resultados variados en la literatura con respecto a los efectos del estrés sobre la flexibilidad cognitiva utilizando la tarea de excavación y este procedimiento operante^{23,25 , 27,45,46}, el método presentado refleja los efectos complejos que el tipo, la intensidad y la duración de un factor estresante pueden tener sobre la función cognitiva^20,21.

Otra limitación de la tarea es que los roedores se alojan en cajas opacas cerradas; por lo tanto, los comportamientos distintos de los que se recopilan a través de la interfaz de la computadora no se pueden codificar. Por ejemplo, un alto número de omisiones por parte de una rata puede deberse a la inhibición del comportamiento infligida por el estrés, o porque la rata está dormida. Además, otros comportamientos estereotipados, como el aseo (que es particularmente relevante en el estudio del estrés), pueden ser interesantes de analizar durante la tarea. El montaje de cámaras en cámaras operantes puede permitir este tipo de precisión de comportamiento.

En general, este informe detalla el uso de procedimientos de estrés junto con una estrategia operante que cambia el paradigma para comprender mejor cómo el estrés afecta al cerebro. Cabe señalar que, además de los procedimientos de estrés y la evaluación cognitiva en adultos, la investigación sobre diferentes etapas del desarrollo puede proporcionar información crucial sobre la etiología de la inflexibilidad cognitiva. Además de estudiar los efectos del estrés en la flexibilidad cognitiva, esta estrategia operante simple y eficiente que cambia el paradigma se puede combinar con muchas manipulaciones experimentales para investigar cómo el cerebro se adapta a los entornos cambiantes. Además, se pueden utilizar enfoques experimentales alternativos para estudiar la base neuronal de la flexibilidad cognitiva, incluidas las lesiones, la farmacología, la edición de genes y la electrofisiología. Como la inflexibilidad cognitiva es uno de los fenotipos clave en la enfermedad psiquiátrica, se debe realizar más investigación para comprender mejor sus sustratos neurobiológicos.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores desean agradecer a Hannah Zamore, Emily Saks y Josh Searle por su ayuda en el establecimiento de esta estrategia operante que cambia el paradigma en el laboratorio grafe. También les gustaría agradecer a Kevin Snyder por su ayuda con el código de MATLAB para el análisis.