Оценка влияния стресса на когнитивную гибкость с использованием парадигмы изменения оперантной стратегии

Стрессовые жизненные события ухудшают когнитивные функции, увеличивая риск психических расстройств. Этот протокол иллюстрирует, как стресс влияет на когнитивную гибкость, используя автоматизированную оперантную стратегию смены парадигмы у самцов и самок крыс Sprague Dawley. Обсуждаются конкретные области мозга, лежащие в основе определенного поведения, и исследуется трансляционная релевантность результатов.

Стресс влияет на когнитивные функции. Усиливает ли стресс или ухудшает когнитивные функции, зависит от нескольких факторов, включая 1) тип, интенсивность и продолжительность стрессора; 2) тип изучаемой когнитивной функции; и 3) сроки стрессора в отношении обучения или выполнения познавательной задачи. Кроме того, половые различия между эффектами стресса на когнитивные функции были широко задокументированы. Здесь описана адаптация автоматизированной парадигмы смены оперантной стратегии для оценки того, как изменения в стрессе влияют на когнитивную гибкость у самцов и самок крыс Sprague Dawley. В частности, сдерживающее напряжение используется до или после тренировки в этой оперантной задаче, чтобы изучить, как стресс влияет на когнитивные функции у обоих полов. Конкретные области мозга, связанные с каждой задачей в этой автоматизированной парадигме, были хорошо установлены (то есть медиаальная префронтальная кора и орбитофронтальная кора). Это позволяет проводить целенаправленные манипуляции во время эксперимента или оценку конкретных генов и белков в этих областях после завершения парадигмы. Эта парадигма также позволяет обнаруживать различные типы ошибок производительности, которые возникают после стресса, каждый из которых имеет определенные нейронные субстраты. Также выявлены явные половые различия в персеверативных ошибках после повторяющейся парадигмы сдерживающего стресса. Использование этих методов в доклинической модели может показать, как стресс влияет на мозг и ухудшает познание при психических расстройствах, таких как посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) и большое депрессивное расстройство (MDD), которые демонстрируют заметные половые различия в распространенности.

У людей стрессовые жизненные события могут ухудшить когнитивную функцию (т.е. когнитивную гибкость^1),что означает способность адаптировать когнитивные стратегии обработки к новым условиям в окружающей среде^2. Нарушение когнитивных функций ускоряет и усугубляет многие психические расстройства, такие как посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) и большое депрессивное расстройство (МДД)^3,4. Эти расстройства в два раза распространенным явлением у женщин^5,6,7,8,однако биологическая основа этого несоответствия остается неизвестной. Аспекты исполнительного функционирования у людей могут быть оценены с помощью Wisconsin Card Sorting Task, демонстрации когнитивной гибкости^2. Производительность в этой задаче нарушена у пациентов с^{ПТСР 9} и MDD^10,но нейронная основа этого изменения может быть исследована только с помощью визуализации мозга^11.

Успехи в понимании того, как стресс влияет на мозг, были достигнуты благодаря использованию животных моделей, особенно грызунов. Поскольку когнитивная гибкость затрагивается при заболеваниях, связанных со стрессом, это исключительно релевантный фенотип для изучения у грызунов. На сегодняшний день в большинстве литератур по нейробиологии стресса используется альтернативная парадигма когнитивной гибкости (иногда называемая задачей копания)^12,13,14,15. Хотя эта задача была тщательно проверена, экспериментатор требует больше времени и усилий для обучения грызунов. Здесь адаптирован и описан хорошо задан автоматизированный протокол сдвига наборов¹⁶ для оценки когнитивной гибкости у самцов и самок крыс Sprague Dawley с использованием различных стрессовых моделей^17,18. Процедура требует минимального надзора со стороны экспериментатора и позволяет одновременно тестировать несколько крыс. Кроме того, в отличие от других версий этой автоматизированной задачи^19,адаптация этой парадигмы требует всего 3 дней обучения и включает в себя эффективный запрограммированный анализ данных.

Усиливает ли стресс или ухудшает когнитивную функцию, зависит от типа, интенсивности и продолжительности стрессора, а также от времени действия стрессора в отношении обучения или выполнения когнитивной задачи^20,21. Таким образом, протокол включает в себя стрессовые процедуры как до, так и после оперантной тренировки. В нем также рассматриваются репрезентативные результаты стрессовых исследований. Кроме того, области мозга, лежащие в основе конкретных аспектов смещения^{множеств,}были хорошо установлены^2,16,22; таким образом, в докладе также описывается, как нацеливаться и оценивать конкретные области мозга во время или после процедур изменения стресса и стратегии.

Были проведены ограниченные исследования по непосредственному изучению половых различий в когнитивной гибкости^18,23.  Протокол описывает, как 1) включить как самцов, так и самок крыс в экспериментальную парадигму, а затем 2) отслеживать эструсные циклы до и во время процедур у свободно циклических самок. Предыдущие исследования показали, что стресс перед оперантной тренировкой может привести к специфическому для пола дефициту когнитивной гибкости у крыс^17. В частности, самки крыс демонстрируют нарушения когнитивной гибкости после стресса, тогда как когнитивная гибкость улучшается у самцов крыс после стресса^17. Интересно, что основным признаком психических расстройств, связанных со стрессом, которые имеют склонность к сексу у людей, является когнитивная негибкость. Эти результаты свидетельствуют о том, что женщины могут быть более уязвимы к этому типу когнитивных нарушений, чем мужчины. Использование этих методов на животных моделях проложит свет на влияние стресса на мозг и на то, как он ухудшает познание при психических расстройствах у людей.

Все процедуры в этом исследовании были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в колледже Брин Мор. Получите одобрение IACUC или других применимых регулирующих органов, прежде чем заказывать лабораторных животных и начинать эксперименты.

1. Подготовка животных

1. Приобретите самцов и самок взрослых крыс Sprague Dawley.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крысы могут быть доставлены до 65-дневного возраста, но не начинайте процедуры до этого момента, чтобы убедиться, что как самцы, так и самки полностью зрелы.
2. Парные однополые крысы как можно дольше, так как длительная изоляция является стрессором^24. Для ограничения пищи, поощродно домовых крыс непосредственно перед протоколом оперантного изменения стратегии.
3. После 1 недели акклиматизации осторожно начинают обрабатывать крыс по 3–5 мин в день. Соберите массу тела каждой крысы. Кроме того, если вы заинтересованы в оценке того, как гонадные гормоны могут повлиять на результаты, соберите вагинальный лаваж для самок крыс (описано в разделе 2).
4. Ограничьте (от еды) животных, которые будут бегать в парадигме смены оперантной стратегии, по крайней мере, за 3 дня до начала дрессировки, чтобы они успешно освоили задачу. Убедитесь, что вода всегда находится в свободном доступе. Письменные записи должны вестись для каждого животного, чтобы документировать ежедневное потребление пищи и жидкости, состояние гидратации и любые поведенческие и клинические изменения, используемые в качестве критериев для временного или постоянного исключения животного из протокола (Morton 2000; NRC 2003b).
   1. Если вы используете стрессовую процедуру более чем за 3 дня до тренировки, скорректируйте ограничение в еде в соответствии с количеством дней стресса (например, 5 дней ограничения плюс ограничение в еде^25).
   2. Ежедневно доставляют 80% от нормальной суточной нормы потребления пищи (т.е. 4 г пищи на 100 г массы тела)^26. Используйте ежедневный сбор веса для крысы, чтобы рассчитать, сколько пищи давать каждый день.
   3. Продолжайте ограничение в еде в течение дней обучения и тестирования. Тем не менее, не размещайте пищу в домашней клетке до тех пор, пока крыса не завершит обучение или тестирование в течение дня, иначе они не будут мотивированы на выполнение задач за вознаграждение за пищевые гранулы. Убедитесь, что сроки доставки пищи крысам по завершении задания довольно непредсказуемы, так как это помогает избежать снижения мотивации к выступлению в оперантной камере (в пользу простого ожидания еды в домашней клетке впоследствии).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, подвергающиеся парадигме сдерживающего стресса, не демонстрируют значительно большей потери веса, чем контрольные, ненапряженные субъекты. Тем не менее, различные стрессовые процедуры могут сами по себе вызывать потерю веса, в результате чего крысы получают меньше пищи, чем ненапряженные коллеги во время ограничения пищи на основе массы тела. Это может представлять собой дополнительный, мешающий стрессор. Если это так, альтернативно используйте фиксированное количество пищи, даваемой каждому субъекту, независимо от веса^27.

2. Промывание влагалища

ПРИМЕЧАНИЕ: Известно, что гормоны гонад (т.е. эстроген и прогестерон) влияют на реакцию на стресс и познание^28,29,30. Эти гормоны колеблются в течение эстрального цикла самок крыс^31. Если вы заинтересованы в отслеживании эстрального цикла свободно езда на велосипеде самок грызунов, чтобы коррелировать со стрессом или данными о когнитивной гибкости, соберите влагалищное лаваж, как описано ниже. Репрезентативные данные, учитывающие стадию эструацикла, не представлены.

1. Чтобы получить образцы влагалищного лаважа от самок, соберите теплую воду в чистый стакан, стеклянную пипетку, слайд «лаваж» (слайд микроскопа с кружками акриловой краски для удержания образца лаважа) и один пустой стакан.
2. Наполните пипетку небольшим количеством теплой воды (~0,5 мл), затем вставьте кончик во влагалище самки крысы (подняв ее хвостом). Вытолкните стерильную воду в 2–3 раза и выталкивая собранную жидкость на микроскопический слайд. Не переполняйте круг скольжения лаважа.
3. Выталкивайте лишнюю жидкость в пустой замок. Пометьте слайд лаважа номерами крыс и поместите образцы от каждой крысы в этом порядке, чтобы было ясно, какой образец принадлежит каждой крысе.
4. Тщательно промойте пипетку, пипеткой чистой теплой воды и раздав ее в «лишний» клюш несколько раз, прежде чем заполнить пипетку, чтобы попробовать следующую крысу.
5. Осторожно перенесут слайд лаважа в микроскоп с ярким полем, чтобы получить изображение образца лаважа и классифицировать день в рамках эстрозного цикла, как описано в Becker et al^31.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, промывание должно проводиться в течение нескольких недель, чтобы правильно отслеживать женский цикл, и должно выполняться в очень похожее время каждый день, чтобы контролировать циркадные ритмы. Предпочтительно, чтобы эта процедура была выполнена до процедур изменения стрессовой и оперантной стратегии. Использование ватных тампонов и стерильного физиологического раствора также может быть использовано в качестве альтернативы этой технике пипетки для глаз. Данные для самок крыс могут быть проанализированы пост-hoc в соответствии с эструсным днем цикла (учитывайте дни цикла, когда выполняется стресс, и / или день цикла, когда происходит тестирование).

3. Оборудование и программное обеспечение

1. Используйте оперантные камеры для поведенческой тренировки и тестирования.
   1. Убедитесь, что камеры содержат по крайней мере два выдвижных рычага с двумя стимулирующими огнями выше, домашний свет и диспенсер для усиления для этих задач.
   2. Убедитесь, что рычаги находятся по обе стороны от центральной области доставки арматуры с одним стимулирующим светом над каждым рычагом.
   3. Используйте свет дома, чтобы осветить камеру, не мешая обнаружению светового стимула (лучше всего, если свет дома находится на задней стенке камеры, напротив рычагов и стимулирующих огней).
2. Используйте беспылевые пищевые гранулы (здесь используются гранулы 45 мг: 18,7% белка, 5,6% жира и 4,7% клетчатки) для подкрепления у крыс с ограниченным содержанием пищи. Не используйте гранулы с высоким содержанием сахарозы или жира (если нет интереса к тому, как стресс влияет на потребление вкусной пищи).
3. Управление представлением стимулов, работой рычага и сбором данных с компьютера с помощью программного обеспечения, способного управлять камерой(Таблица материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения информации, связанной с кодированием программ с использованием этого программного обеспечения, свяжитесь с авторами. Скрипты MED-PC включены в качестве дополнительных файлов. Это программное обеспечение собирает информацию об ответах животного для каждого испытания (какой рычаг нажат, является ли он правильным / неправильным / нет ответа, и задержка для выбора). Исходя из этой информации, пользователи могут рассчитать различные меры в поведенческой парадигме, как описано в разделе поведенческого анализа.
4. Выполняйте тренировки / тестирование в одно и то же время каждый день, чтобы контролировать циркадные ритмы в гормонах стресса³² (и другие соответствующие меры).
5. Заполните нижний лоток каждой оперантной коробки свежей подстилкой для сбора фекалий/отходов. После каждого сеанса сбрасывайте каждый лоток, чистые лотки и внутреннюю часть камеры спиртовыми салфетками или дезинфицирующим средством, одобренным IACUC, и заменяйте их свежим постельным бельем перед помещением нового животного в камеру.

4. Стрессовые процедуры

1. Решите, следует ли выполнять процедуру стресса до, во время и/или после тренировки парадигмы смены оперантной стратегии (например, 5 дней удерживающего стресса до 3 дней оперантной тренировки против 3 дней оперантной тренировки с последующим одним ограничением и тестированием).
2. Выполняйте стрессовую процедуру в одно и то же время ежедневно в отношении оперантного обучения. (например, 30 мин удерживающего напряжения, начиная с 9 А.M., с последующим помещением в оперантную камеру).
3. Выполняйте стрессовые процедуры в отдельной комнате как от колониальной комнаты, так и от комнаты смены парадигмы стратегии (чтобы убедиться, что нет смешанных факторов, связанных со стрессом свидетеля)^33. Вкратце, поместите крысу в прозрачную удерживающую трубку в стиле Брума и запечатайте отверстие, заботясь о том, чтобы не защемить конечности или хвост. Между каждым субъектом используйте дезинфицирующее средство, одобренное IACUC, для очистки трубки в стиле Брума. Неправильная санитарная проверка может оставить феромоны, которые могут негативно повлиять на протокол тестирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените, сколько времени первая группа крыс проведет в оперантных камерах. Это будет варьироваться в зависимости от тренировочного и тестового дня; однако после выполнения нескольких когорт можно рассчитать среднее время выполнения каждой задачи для оценки будущих задач.
4. В зависимости от того, сколько оперантных камер доступно, пошатнули процедуру стресса для испытуемых. Например, четыре крысы подвергаются сдерживающим нагрузкам и помещаются в четыре оперантные камеры. Через час еще четыре животных проходят стрессовые процедуры, за которыми следует оперантная камера.

5. Обучение

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта парадигма модифицирована из процедуры оперантного сдвига множеств, разработанной Floresco et al., так что она может быть завершена за 3 дня^19.  Процедуры дрессировки для крыс требуют 3 дня (1 день, чтобы изучить каждую задачу, как описано ниже). Редко, когда крыса не учится этим задачам. Если крыса не может выучить каждое задание, ее следует исключить из итогового исследования. На рисунке 1A показано визуальное описание парадигмы обучения, описанной ниже.

1. Прежде чем поместить крысу в камеру, убедитесь, что в дозаторе достаточно пищевых гранул и что оперантные коробки функционируют должным образом. Чтобы достичь этого, нагрузите и начните программу обучения или тестового дня в пустой камере, вручную проверяя, что правильный рычаг надлежащим образом обеспечивает одно вознаграждение за нажатие рычага.
2. Обучение крысы нажатию на каждый рычаг
   1. Перед тем, как поместить крысу в коробку на первый день обучения, вручную установите одну награду за пищевые гранулы на правильный рычаг, как указано при загрузке процедуры обучения в каждой камере.
   2. Тренируйте крысу, используя график с фиксированным соотношением (FR-1), так что каждое правильное нажатие рычага вознаграждается одним усилением. Уравновешивайте правильный рычаг в день по испытуемым и/или экспериментальным условиям (формируя только один рычаг за раз), назначая правильный рычаг при загрузке процедуры обучения на компьютер, работающий с камерами.
   3. Позвольте крысе нажимать на рычаг до тех пор, пока она не достигнет критерия, нажав правильный рычаг 50x, обычно выполняя задачу между 30-45 минутами.
   4. На следующий день заставьте крысу выполнить это задание на противоположном рычаге, используя ту же программу, что и в первый день обучения, но обозначьте противоположный рычаг как правильный. В этот день тренировки нет необходимости «формировать» рычаг пищевой гранулой. Как правило, этот критерий быстро приобретается после того, как крысы научились нажимать на первый рычаг.
3. Обучение крысы реагировать на световой сигнал
   1. На третий день обучения зажгите свет над обоими рычагами в течение 15 с испытаний, во время которых крыса может нажать на один из рычагов, чтобы потенциально получить награду за пищевые гранулы. Во время задачи легкой дискриминации эта программа будет случайным образом выбирать, какой рычаг является правильным на экспериментальной основе.
   2. Если крыса нажимает на правильный рычаг, убедитесь, что огни остаются включенными в течение 3 с и награда доставлена, а затем период 5 с, в течение которого свет выключается перед следующим испытанием. Если крыса нажимает на неправильный рычаг, убедитесь, что награда не доставлена и что свет выключен на 10 с до следующего испытания.
   3. После этого последнего дня тренировки рассчитайте «боковое смещение», чтобы определить, отдает ли крыса предпочтение левому или правому рычагу, разделив количество нажатий одного рычага, деленное на общее количество нажатий рычага. В день теста крыса начнет с наименее предпочтительной стороны, чтобы убедиться, что она изучает конкретную непредвиденную реакцию и вознаграждение, а не реагирует на предпочтительный рычаг.

6. Тестирование

ПРИМЕЧАНИЕ: См. рисунок 1B для визуального изображения парадигмы тестирования, описанной ниже.

1. На 4-й день (тестовый день) поместите крысу в оперантную камеру после стрессовых процедур и протестируйте их в задачах боковой дискриминации, бокового разворота и легкой дискриминации последовательно. Убедитесь, что задача различания света освещает только свет над «правильным» рычагом. В каждой задаче крысы должны последовательно достичь восьми правильных испытаний, чтобы завершить каждую дискриминацию, не нажимая на невознаградивый, неправильный рычаг. Неправильное нажатие рычага сбросит эту цепочку испытаний.
   1. Тестируйте крыс, используя задачу боковой дискриминации. Используя программу боковой дискриминации, вознаграждайте крысу за нажатие рычага на наименее предпочтительную сторону, как определено с третьего дня обучения, независимо от светового сигнала. Задача заканчивается при нажатии на правильный рычаг 8x последовательно (исключая пропуски).
   2. Выполните тест бокового разворота, снова запустив крыс с помощью программы боковой дискриминации, но на этот раз обозначив рычаг, противоположный правильному с боковой задачи дискриминации, как правильный. Убедитесь, что крыса вознаграждена за нажатие на этот рычаг, независимо от светового сигнала. Задача заканчивается при нажатии на правильный рычаг 8x последовательно (исключая пропуски).
   3. Выполните задание на различательность света, которое вознаграждает крысу за нажатие на рычаг с помощью света, освещенного выше. Каждое тестирование оперантов завершается при последовательном нажатии правильного рычага 8x (исключая пропуски).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основываясь на предыдущих исследованиях, эти задания кодируют как минимум 30 испытаний, независимо от последовательных нажатий, чтобы гарантировать, что крысы имеют достаточно времени для изучения правил каждого задания^18. Таким образом, если крыса последовательно достигает восьми правильных испытаний до того, как произойдет 30 испытаний, задача будет оставаться занятой до тех пор, пока не будет завершено 30 испытаний.

7. Поведенческий анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, полученные для каждого животного в день тестирования, автоматически записываются и сохраняются компьютером, при том, что сценарий MED-PC для каждой задачи был инициирован и разрешен к завершению (см. дополнительные материалы для сценариев MED-PC).

1. Откройте данные для каждого задания тестового дня (боковая дискриминация, боковое изменение и легкая дискриминация) с помощью компьютерной программы. Основными показателями, регистрируемыми программой, являются пробы к критерию, ошибки в критерии и время до критерия. Эти меры подробно описываются ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Авторы создали скрипт MATLAB, который позволяет автоматизировать процесс анализа, а также анализ персеверативных и регрессивных ошибок (свяжитесь с авторами для получения информации о коде для оптимизации анализа данных).
   1. Используйте критерий испытаний (который относится к общему количеству испытаний [не включая упущения], необходимых для того, чтобы крыса последовательно завершила восемь правильных испытаний, включая эти восемь испытаний) в качестве основного показателя точности. Эти данные находятся в первом столбце массива B в файле данных, сгенерированном скриптом MED-PC для любой из задач в день тестирования.
   2. Изучите общее количество ошибок, допущенных во время выполнения каждой задачи. Эти данные находятся в третьем столбце массива B в файле данных, сгенерированном скриптом MED-PC для любой из задач в день тестирования. Эти ошибки также подразделяются на персевертивные или регрессивные ошибки. Персеверативные ошибки совершаются, когда крыса продолжает следовать более раннему правилу из предыдущей задачи. Регрессивные ошибки совершаются после того, как он отключился от предыдущего правила, но продолжает пытаться получить новое правило (подробнее о том, как вычисляются эти типы ошибок, см. опубликованный метод^18).
   3. Если крыса не ответила на световой сигнал в течение 15 с, испытание классифицируется как упущение, и оно не будет учитываться в общем количестве испытаний по критерию. Рассчитайте это, сначала сложив количество правильных ответов (расположенных во втором столбце массива B в файле данных) и количество ошибок (расположенных в третьем столбце массива B в файле данных). Далее вычтите это число из общего числа испытаний по критерию (это последнее число в первом столбце массива B в файле данных, отличное от испытаний к критерию).
   4. Используйте время начала и окончания, записанные программой (расположенные в верхней части файла данных, сгенерированного скриптом MED-PC для любой из задач в день тестирования), чтобы рассчитать время до критерия. Задержка до первого нажатия рычага также может быть рассчитана из файла данных путем вычитания переменной K (время, прошедшее в секундах с первого нажатия рычага) из времени до критерия.
   5. Усредненные данные для каждой поведенческой меры для крыс в пределах одной группы лечения. Провести соответствующий статистический анализ (в зависимости от того, сколько переменных исследуется).

8. Субстраты мозга

1. Определите интересующий его область мозга и/или аспект когнитивной гибкости. Например, если стресс увеличивает персевертивные ошибки в задаче бокового разворота, орбитофронтальная кора (OFC) может представлять особый интерес, поскольку предыдущие исследования поражений показали, что эта область мозга играет роль во многих формах реверсивного обучения (т. Е. Пространственный разворот, протестированный в задаче бокового разворота)^34,35,36. В этом примере жертвоприношения крыс после завершения парадигмы смены стратегии и изучения c-fos (мера нейронной активации³⁷⁾в ОФК с использованием описанных иммуногистохимических методов²⁵ и кратко описанных здесь.
   1. Во-первых, извлеките мозг из животных и нарежьте на 40 мкм ломтики.
   2. Промыть ткань фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) 4x в течение 5 мин каждый, затем инкубировать в 0,3% перекиси водорода в течение 10 мин для гашения эндогенных пероксидаз.
   3. Промыть ткань в PBS 2x в течение 5 мин каждая, затем инкубировать в мышином анти-c-fos первичном антителе (1:500), 3% нормальной ослиной сыворотке (NDS) и 0,3% Triton X на ночь.
   4. На следующий день промыть ткань в PBS 3x в течение 5 мин каждая, затем инкубировать в биотин-SP-конъюгированных антимышьих антителах против мыши (1:500) в течение 2 ч.
   5. Промыть ткань в PBS 3x в течение 5 мин каждая, затем инкубировать в комплексе авидин-стрептавидин AB в течение 1 ч.
   6. Промывайте ткань в PBS 3x в течение 5 мин каждая, затем инкубируют в растворе DAB до 10 мин, так как ткань подвергается окислительной хромогенной реакции.
   7. Промыть ткань в PBS 3x в течение 5 минут каждая, затем установить срезы мозга на стеклянные слайды микроскопа.
   8. Обложивайте ткань с помощью монтажной среды на основе толуола и изображения с помощью микроскопа brightfield.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, как отражено в репрезентативных результатах, крыс приносят в жертву через 30 минут после окончания парадигмы смены стратегии, примерно через 60–90 минут после завершения задачи разворота (в зависимости от производительности каждой крысы в световой задаче). Это должно представлять собой оптимальное время для выражения c-fos^38,отражающее производительность в задаче разворота.
2. В качестве альтернативы, можно свести определенную область мозга для инъекции наркотиков или вирусной инъекции до выполнения стресса или смены парадигмы оперантной стратегии.
   Исследователи могут захотеть изучить, как манипулирование нейронными субстратами изменяет влияние стресса на когнитивную гибкость. Например, исследователи могут блокировать определенный рецептор нейротрансмиттера в префронтальной коре до тестирования.

Адаптированная автоматизированная парадигма смены оперантной стратегии, изложенная выше, была использована для определения того, влияет ли повторяющийся стресс сдерживания на познание у самцов и самок крыс Sprague Dawley. Репрезентативные поведенческие данные описаны на рисунке 2 ниже. Короче говоря, контрольные и многократно сдерживаемые крысы выполняли этот тест на изменение оперантной стратегии, который состоял из ряда задач: боковой дискриминации, бокового разворота и легкой дискриминации.

Испытания критерия для каждой задачи показаны на рисунке 2A. Как правило, более высокая производительность по каждой задаче была представлена сокращением числа испытаний по критерию. Эти данные указывают на то, что после острого сдерживания мужчины выполнили задачу бокового разворота в значительно меньшем количестве испытаний, чем безударные контрольные самцы. И наоборот, женщины, испытываемые стрессом, требовали значительно большего числа испытаний для выполнения задачи бокового разворота. Эти результаты свидетельствуют о том, что мужчины демонстрировали улучшенную производительность после стресса, в то время как женщины демонстрировали ухудшение производительности. В задаче легкой дискриминации стресс увеличил число испытаний по критерию по сравнению с контрольными женщинами, тем самым ухудшая производительность у женщин, но не у мужчин в этой задаче.

Общее количество ошибок, допущенных для каждой задачи внимания, показано на рисунке 2B. В соответствии с количеством испытаний по критерию, подчеркнутые мужчины сделали значительно меньше ошибок, чем контрольные мужчины, в то время как подчеркнутые женщины допустили больше ошибок в задаче бокового разворота. Кроме того, в задаче легкой дискриминации женщины также совершали значительно больше ошибок. В целом, эти данные свидетельствуют о том, что повторный стресс улучшает когнитивные функции у мужчин, но ухудшает когнитивные функции у женщин.

Общие ошибки были далее классифицированы на персеверативные или регрессивные ошибки на рисунке 2C (для различия между этими двумя типами ошибок см. раздел 7 протокола). Интересно, что стрессовые самцы делали меньше настойчивых ошибок в задаче бокового разворота, чем контрольные самцы. С другой стороны, как в задачах бокового разворота, так и в задачах легкой дискриминации женщины, испытывающие стресс, совершали большее число ошибок, чем контрольные женщины. Не было различий между группами лечения в количестве регрессивных ошибок, допущенных во время выполнения любой задачи.

Упущения в каждом испытании и время достижения критерия показаны на рисунке 2D (для получения дополнительной информации о том, как они были рассчитаны, см. раздел 7протокола). Эти меры были оценены только в задаче бокового разворота, поскольку эта задача продемонстрировала наибольшие половые различия. Женщины, испытываемые стрессом, показали более высокий процент упущений по сравнению со всеми другими группами лечения. Кроме того, в то время как стресс, по-видимому, уменьшал время для выполнения задачи бокового разворота у мужчин, стресс продлевал выполнение задачи у женщин. В целом, повторный стресс нарушил когнитивную гибкость у женщин, но не у мужчин.

Субстраты мозга, лежащие в основе когнитивной гибкости, изображены на рисунке 3. Поскольку резкие половые различия наблюдались в задаче бокового разворота, области мозга, лежащие в основе этой задачи, были исследованы, чтобы определить, демонстрируют ли они аналогичные половые различия в нейронной активности. Как обсуждалось ранее, исследования поражений показали, что орбитофронтальная кора (OFC) опосредует задачу бокового разворота^34. Таким образом, c-fos, мера нейронной активации^37,была помечена в OFC через 30 мин после завершения смены стратегии, что должно было отражать производительность в задаче бокового разворота^38. Однако не исключено, что ОФК может также играть определенную роль во внепространственном компоненте изменения стратегии этой задачи^39. Таким образом, важно выполнить жертвоприношение в соответствующее время, чтобы отразить активность мозга во время конкретной задачи в рамках парадигмы изменения оперантной стратегии. Здесь стресс вызвал значительное увеличение нейронной активации в OFC мужчин по сравнению с контрольнойчастью. Тем не менее, стресс вызвал значительное снижение нейронной активации в OFC женщин по сравнению с контрольной частью. Кроме того, у мужчин активация ОФК и испытания критерия были отрицательно коррелированы; в частности, более высокая активация OFC была связана с меньшим количеством испытаний по критерию. Напротив, не было никакой корреляции между активацией OFC и производительностью у женщин, что говорит о том, что OFC был отключен во время этих выступлений.

Рисунок 1: Схема парадигмы смены оперантной стратегии во время обучения и тестовых дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Репрезентативные поведенческие данные из парадигмы смены оперантной стратегии. (A) Испытания по критерию для каждого задания в день теста. В задаче бокового разворота стресс улучшил производительность у мужчин, но ухудшил производительность у женщин. В задаче легкой дискриминации стресс ослаблял производительность у женщин, в то время как он не влиял на мужчин. (B) Количество ошибок для каждого задания в день теста. Стресс уменьшил количество ошибок, допущенных у мужчин, но увеличил ошибки у женщин как в задачах бокового разворота, так и в задачах легкой дискриминации. (C) Категоризация персеверативных и регрессивных ошибок. Стресс уменьшал персеверативные ошибки, допущенные у мужчин, но увеличивался персеверативные ошибки, допущенные у женщин как в задачах бокового разворота, так и в задачах легкой дискриминации. (D) Процент пропущенных испытаний и время до критерия в задаче бокового разворота. Стресс увеличил процент упущений у самок крыс. Стресс уменьшал время, необходимое мужчинам, но увеличивал время, необходимое самкам для выполнения задачи. Статистика была рассчитана с использованием двустороннего ANOVA, за которым последовал t-тест Туки (n = 12 крыс в группе; полосы ошибок представляют SEM; #p ≤ 0,10, *p < 0,05). Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией¹⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Репрезентативная нейронная активация после оперантной стратегии смены парадигмы. (A) Активация OFC после изменения задачи по изменению стратегии. Репрезентативные изображения иммуногистохимического окрашивания 3,3'-диаминобензидином (DAB) с использованием антитела против c-fos в ОФК визуализируются с помощью микроскопии яркого поля, а затем количественно оцениваются. Стресс значительно увеличивался в активации (о чем свидетельствует количество с-фос-экспрессивных клеток) в ОФК самцов, в то время как он уменьшал активацию у самок. Шкала масштаба в правом нижнем углу панели изображения представляет 200 мкм. Статистика была рассчитана с использованием двустороннего ANOVA, за которым последовал t-тест Туки (n = 12 крыс в группе, 6-8 секций OFC, проанализированных на крысу; полосы ошибок представляют SEM; *p < 0,05). (B) Испытания критерия в задаче бокового разворота коррелировали с активацией OFC. Самцы показали значительную отрицательную корреляцию, в то время как женщины этого не сделали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Протокол демонстрирует, как измерить влияние стресса на когнитивные функции. В частности, модифицированная парадигма изменения оперантной стратегии используется у грызунов, которая измеряет когнитивную гибкость (аналогичную задаче сортировки карт Висконсина у людей)¹. Когнитивная гибкость означает способность адаптировать когнитивные стратегии обработки к новым условиям в окружающей среде, и она имеет решающее значение для нормального ежедневного функционирования². Поскольку исследования когнитивной гибкости на людях в основном ограничены визуализацией мозга^11,использование этой парадигмы на животных значительно повысит понимание влияния стресса на мозг и познание.

Стресс может ухудшить когнитивные функции⁴⁰. Фактически, это один из наиболее распространенных фенотипов при связанных со стрессом заболеваниях, таких как ПТСР и MDD^3,41. Более того, существуют резкие половые различия в возникновении психических^{заболеваний,}связанных со стрессом^5,6,7,но за этими предвзятыми случаями мало понимания нейробиологии. Таким образом, использование этой оперантной стратегии изменения парадигмы у животных обоих полов может помочь продвинуть современное понимание половых различий в психиатрии.

Эта задача изменения оперантной стратегии позволяет исследователям исследовать ключевые аспекты познания, относящиеся к психическим расстройствам. Например, в этой парадигме вычисляются персевертивные ошибки после экспериментальных манипуляций. Персеверация наблюдается при психических расстройствах, связанных со стрессом, таких как ПТСР, и она ухудшает способность человека изучать новый набор правил, в конечном итоге ухудшая рабочую память^3. Таким образом, мера персеверативных ошибок является переводчески релевантной. Кроме того, упущения в задачах внимания были отмечены у пациентов с ПТСР, что указывает на более медленную кортикальная обработка^3. Соответственно, данные об упущении из этой парадигмы могут иметь клинические аналоги. В целом, когнитивная гибкость, измеренная с помощью этой экспериментальной парадигмы, моделирует ключевые фенотипы, которые наблюдаются при психических расстройствах.

Эта экспериментальная парадигма также позволяет точно ориентироваться на нейронные субстраты, лежащие в основе когнитивной гибкости. Например, в литературе указано, что префронтальная кора (ПФК) является важнейшей областью мозга для когнитивной гибкости^3,включая медиальную префронтальную (mPFC) и орбитофронтальную кору (OFC). Из этих субрегионов в ПФК ОФК имеет важное значение для выполнения задачи бокового разворота^34,35. Эти области мозга также являются ключевыми мишенями для функциональных изменений, вызванных стрессом^42,43. Интересно, что используемая здесь модель стресса, по-видимому, играет роль в последующем выполнении грызунами тестов когнитивной гибкости; таким образом, его следует учитывать при проектировании будущих экспериментов. Эти различные реакции на стресс указывают на потенциально новые механизмы, с помощью которых стресс влияет на познание. Таким образом, нацеливание на конкретные нейротрансмиттеры, белки или активацию этих областей мозга может пролить свет на то, как стресс влияет на познание у самцов и самок грызунов. Исследователи могут манипулировать этими нейронными субстратами в разные моменты времени в сочетании со стрессом или изменением стратегии или, в качестве альтернативы, измерять нейронные субстраты после воздействия этих поведенческих парадигм.

Эта модифицированная задача переключения оперантных стратегий имеет явные преимущества перед другими парадигмами когнитивной гибкости, используемыми в литературе по стрессу (т. Е. Задача копания^{12,13,14,15),}которые требуют больше времени и усилий от экспериментатора для обучения грызунов. Эта процедура требует минимального надзора со стороны экспериментатора и позволяет одновременно тестировать несколько крыс. Кроме того, в отличие от других версий этой автоматизированной задачи^19,парадигма требует всего 3 дней обучения и включает в себя эффективный запрограммированный анализ данных.

Парадигма смены оперантной стратегии имеет определенные ограничения. Одним из ограничений является то, что он может проверить только два измерения стимула (например, левый или правый рычаг против светового сигнала), тогда как задача копания^12,13,14,15 может проверить третье измерение стимула (например, копание среды против запаха против текстуры). Тем не менее, задача, описанная в этом протоколе, по-прежнему позволяет проверить способность крысы переходить к другим правилам, что позволяет тестировать конструкции когнитивной гибкости. Кроме того, можно добавить другие параметры в оперантные камеры, чтобы обеспечить третий стимул (например, запах), но это может продлить обучение, необходимое для выполнения задачи.

Основным преимуществом этой задачи является ее простота и способность сочетать ее со стрессовыми или фармакологическими манипуляциями для дальнейшего понимания того, как стресс влияет на мозг. Следует отметить, что эта простота сопряжена с повышенной сложностью, с которой сталкиваются испытуемые при обучении рычажному прессованию, по сравнению с экологически значимой задачей копания. Хотя эта оперантная задача гораздо менее трудоемка, грызунам, как правило, требуется больше испытаний, чтобы выполнить эту задачу. Однако и задача копания, и эта парадигма задействуют сходные нейробиологические механизмы и, таким образом, представляют собой действительные варианты для изучения когнитивной гибкости^16,44. Хотя в литературе были различные результаты относительно влияния стресса на когнитивную гибкость с использованием задачи копания и этой оперантной процедуры^{23,25,27,45,46,}представленный метод отражает комплексные эффекты, которые тип, интенсивность и продолжительность стрессора могут оказывать на когнитивную функцию^20,21.

Еще одним ограничением задачи является то, что грызуны размещаются в закрытых непрозрачных ящиках; таким образом, поведение, отличное от того, которое собирается через интерфейс компьютера, не может быть закодировано. Например, большое количество упущений крысы может быть связано с поведенческим торможением, вызванным стрессом, или с тем, что крыса спит. Более того, другие стереотипные модели поведения, такие как груминг (который особенно актуален при изучении стресса), могут быть интересны для анализа во время выполнения задания. Установка камер в оперантных камерах может обеспечить этот тип поведенческой точности.

В целом, в этом отчете подробно описывается использование стрессовых процедур в сочетании с парадигмой изменения оперантной стратегии для дальнейшего понимания того, как стресс влияет на мозг. Следует отметить, что, в дополнение к стрессовым процедурам и когнитивной оценке у взрослых, исследования на разных стадиях развития могут дать важную информацию об этиологии когнитивной негибкости. В дополнение к изучению влияния стресса на когнитивную гибкость, эта простая и эффективная парадигма смены оперантной стратегии может сочетаться со многими экспериментальными манипуляциями для изучения того, как мозг адаптируется к изменяющейся среде. Кроме того, альтернативные экспериментальные подходы могут быть использованы для изучения нейронной основы когнитивной гибкости, включая поражения, фармакологию, редактирование генов и электрофизиологию. Поскольку когнитивная негибкость является одним из ключевых фенотипов при психиатрических заболеваниях, необходимо провести дополнительные исследования для дальнейшего понимания его нейробиологических субстратов.

Авторам нечего раскрывать.

Авторы хотели бы поблагодарить Ханну Замор, Эмили Сакс и Джоша Сирла за их помощь в установлении этой парадигмы изменения оперантной стратегии в лаборатории Графа. Они также хотели бы поблагодарить Кевина Снайдера за его помощь с кодом MATLAB для анализа.