הערכת השפעות הלחץ על גמישות קוגניטיבית באמצעות פרדיגמה של הסטת אסטרטגיה אופרנטית

אירועי חיים מלחיצים פוגעים בתפקוד הקוגניטיבי ומגבירה את הסיכון להפרעות פסיכיאטריות. פרוטוקול זה ממחיש כיצד מתח משפיע על גמישות קוגניטיבית באמצעות אסטרטגיה אופרנטית אוטומטית הסטת פרדיגמה בחולדות ספראג דולי זכר ונקבה. אזורים מסוימים במוח שבבראש התנהגויות מסוימות נדונים, ורלוונטיות תרגומית של תוצאות נבחנת.

מתח משפיע על התפקוד הקוגניטיבי. אם מתח משפר או פוגע בתפקוד הקוגניטיבי תלוי במספר גורמים, כולל סוג 1) סוג, אינטנסיביות, ומשך הלחץ; 2) סוג של תפקוד קוגניטיבי תחת מחקר; ו -3) תזמון של הלחץ ביחס ללמידה או לביצוע המשימה הקוגניטיבית. יתר על כן, הבדלי מין בין ההשפעות של מתח על התפקוד הקוגניטיבי תועדו באופן נרחב. המתואר כאן הוא הסתגלות של אסטרטגיה אופרנטית אוטומטית הסטת פרדיגמה כדי להעריך כיצד וריאציות בלחץ משפיעות על גמישות קוגניטיבית בחולדות ספראג דולי זכר ונקבה. באופן ספציפי, מתח איפוק משמש לפני או אחרי אימון במשימה זו המבוססת על אופרנט כדי לבחון כיצד מתח משפיע על הביצועים הקוגניטיביים בשני המינים. אזורים מסוימים במוח הקשורים לכל משימה בפרדיגמה אוטומטית זו הוקמו היטב (כלומר, קליפת המוח הקדם-מצחית המנטלית וקליפת המוח האורביטו-פרונטלית). זה מאפשר מניפולציות ממוקדות במהלך הניסוי או הערכה של גנים וחלבונים מסוימים באזורים אלה עם השלמת הפרדיגמה. פרדיגמה זו מאפשרת גם זיהוי של סוגים שונים של שגיאות ביצוע המתרחשות לאחר הלחץ, שכל אחת מהן הגדירה מצעים עצביים. כמו כן מזוהים הבדלי מין ברורים בטעויות מתמדות לאחר פרדיגמת לחץ איפוק חוזרת ונשנית. השימוש בטכניקות אלה במודל פרה-אקליני עשוי לחשוף כיצד מתח משפיע על המוח ופוגע בקוגניציה בהפרעות פסיכיאטריות, כגון הפרעת דחק פוסט טראומטית (PTSD) והפרעת דיכאון גדולה (MDD), המציגות הבדלי מין ניכרים בשכיחות.

אצל בני אדם, אירועי חיים מלחיצים עלולים לפגוע בתפקוד הקוגניטיבי (כלומר, גמישות קוגניטיבית¹), המציינת את היכולת להתאים אסטרטגיות עיבוד קוגניטיביות להתמודד עם תנאים חדשים בסביבה². פגיעה בקוגניציה מזרזת ומחמירה הפרעות פסיכיאטריות רבות, כגון הפרעת דחק פוסט טראומטית (PTSD) והפרעת דיכאון גדולה (MDD)^3,4. הפרעות אלה שכיחות פי שניים אצל^{נקבות 5,6,7,8}, אך הבסיס הביולוגי לפער זה עדיין אינו ידוע. היבטים של תפקוד מבצעי בבני אדם ניתן להעריך באמצעות משימת מיון כרטיס ויסקונסין, הדגמה של גמישות קוגניטיבית². הביצועים במשימה זו נפגעים בחולים עם PTSD⁹ ו- MDD¹⁰, אבל הבסיס העצבי של שינוי זה יכול להיבדק רק על ידי הדמיה מוחית¹¹.

התקדמות בהבנת האופן שבו הלחץ משפיע על המוח נעשתה באמצעות שימוש במודלים של בעלי חיים, במיוחד מכרסמים. כמו גמישות קוגניטיבית מושפעת במחלות הקשורות ללחץ, זה פנוטיפ רלוונטי במיוחד לבחון מכרסמים. עד כה, רוב ספרות נוירוביולוגיה מתח השתמש פרדיגמת גמישות קוגניטיבית חלופית (המכונה לפעמים משימת החפירה)^12,13,14,15. בעוד משימה זו נבדקה בהרחבה, זה דורש יותר זמן ומאמץ על ידי הנסיין לאמן מכרסמים. מותאם ומתואר כאן הוא פרוטוקול סט הסטה אוטומטי מבוסס היטב^{16 כדי להעריך גמישות} קוגניטיבית בחולדות ספראג דולי זכר ונקבה באמצעות מודלים מתח שונים^17,18. ההליך דורש פיקוח מינימלי על ידי הנסיין ומאפשר לחולדות מרובות להיבדק בו זמנית. בנוסף, בניגוד לגרסאות אחרות של משימה אוטומטית זו¹⁹, ההתאמה של פרדיגמה זו דורשת רק 3 ימי אימון וכוללת ניתוח נתונים מתוכנת יעיל.

אם מתח משפר או פוגע בתפקוד הקוגניטיבי תלוי בסוג, בעוצמה ובמשך הלחץ, כמו גם בתזמון של הלחץ ביחס ללמידה או לביצוע משימה קוגניטיבית^20,21. לפיכך, הפרוטוקול משלב נהלי לחץ הן לפני ואחרי ההכשרה האופרטיבית. הוא גם בוחן תוצאות מייצגות של מחקרי לחץ. בנוסף, אזורי המוח שבבסיס היבטים מסוימים של הסטה נקבעו היטב^2,16,22; לכן, הדו"ח מתאר גם כיצד למקד ולהעריך אזורים מסוימים במוח במהלך או אחרי נהלי שינוי מתח ואסטרטגיה.

יש כבר מחקר מוגבל על בחינה ישירה של הבדלי מין בגמישות קוגניטיבית^18,23.  הפרוטוקול מתאר כיצד לשלב 1) הן חולדות זכר ונקבה לתוך הפרדיגמה הניסיונית, אז 2) לעקוב אחר מחזורים אסטרוס לפני ובמהלכו ההליכים בנקבות רכיבה חופשית. מחקרים קודמים הצביעו על כך שמתח לפני אימון אופרנטי יכול להוביל לגירעונות ספציפיים למין בגמישות קוגניטיבית בחולדות¹⁷. במיוחד, חולדות נקבות להפגין שיבושים בגמישות קוגניטיבית לאחר מתח, ואילו גמישות קוגניטיבית משתפרת בחולדות זכר לאחר מתח¹⁷. מעניין, סימן היכר עיקרי של הפרעות פסיכיאטריות הקשורות ללחץ, אשר יש שכיחות מוטה מינית בבני אדם, הוא חוסר גמישות קוגניטיבית. תוצאות אלה מצביעות על כך שהנקבות עלולות להיות פגיעות יותר לסוג זה של פגיעה קוגניטיבית מאשר גברים. השימוש בטכניקות אלה במודלים של בעלי חיים ישפוך אור על השפעות הלחץ על המוח וכיצד הוא פוגע בקוגניציה בהפרעות פסיכיאטריות בבני אדם.

כל ההליכים במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) במכללת ברין מור. קבל IACUC או אישור רגולטורי ישים אחר לפני הזמנת חיות מעבדה ותחל בניסויים.

1. הכנת בעלי חיים

1. לרכוש חולדות זכר ונקבה בוגר ספראג דולי.
   הערה: החולדות יכולות להימסר לפני 65 ימים של גיל, אבל לא להתחיל נהלים עד לאחר נקודה זו כדי להבטיח כי הן זכרים ונקבות בוגרים לחלוטין.
2. זוג חולדות חד מיניות במשך זמן רב ככל האפשר, בידוד לטווח ארוך הוא לחץ²⁴. להגבלת מזון, חולדות בית ערמומיות ממש לפני פרוטוקול הסטת האסטרטגיה האופרנטית.
3. לאחר שבוע אחד של התאקלמות, בעדינות להתחיל לטפל בחולדות במשך 3-5 דקות ביום. לאסוף את משקל הגוף של כל חולדה. בנוסף, אם מעוניינים להעריך כיצד הורמוני גונדל עשויים להשפיע על התוצאות, לאסוף שטיפת נרתיק לחולדות נקבה (המתואר בסעיף 2).
4. הגבל (ממזון) בעלי חיים שינוהלו באסטרטגיה האופרנטית הסטת פרדיגמה לפחות 3 ימים לפני תחילת האימונים, כך שהם למדו בהצלחה את המשימה. ודא כי מים זמינים תמיד בחופשיות. רשומות בכתב צריכות להישמר כדי שכל בעל חיים יתעד את צריכת המזון והנוזלים היומית, מצב ההידרציה וכל שינוי התנהגותי וקליני המשמש כקריטריונים להסרה זמנית או קבועה של בעל חיים מפרוטוקול (Morton 2000; NRC 2003b).
   1. אם משתמשים בהליך לחץ במשך יותר מ -3 ימים לפני האימון, התאימו את מגבלת המזון כך שתתאים למספר ימי הלחץ (למשל, 5 ימים של איפוק בתוספת הגבלת^{מזון 25}).
   2. בכל יום, לספק 80% של צריכת המזון היומית הרגילה (כלומר, 4 גרם של מזון לכל 100 גרם של משקל הגוף)²⁶. השתמש באוסף המשקל היומי עבור החולדה כדי לחשב כמה מזון לתת בכל יום.
   3. המשך הגבלת המזון בימי האימונים והבדיקות. עם זאת, לא למקם מזון בכלוב הבית עד לאחר החולדה השלימה אימון או בדיקה ליום, אחרת הם לא יהיו מוטיבציה לבצע את המשימות עבור תגמול גלולה מזון. ודא כי העיתוי של משלוח מזון לחולדות עם השלמת המשימה הוא בלתי צפוי למדי שכן זה עוזר למנוע מוטיבציה מופחתת לבצע בחדר האופרנט (לטובת פשוט לחכות למזון בכלוב הבית לאחר מכן).
      הערה: בעלי חיים העוברים את פרדיגמת הלחץ ריסון אינם מפגינים ירידה במשקל גדולה משמעותית מאשר שליטה, נושאים שאינם מטופלים. עם זאת, הליכי לחץ שונים עלולים בעצמם לגרום לירידה במשקל, וכתוצאה מכך חולדות מקבלות פחות מזון מאשר עמיתים לא מטופלים במהלך הגבלת מזון על בסיס משקל הגוף. זה עשוי להציג מתח נוסף, מבלבל. אם זה נראה המקרה, לחלופין להשתמש בכמות קבועה של מזון שניתן לכל נושא, ללא קשר למשקל²⁷.

2. שטיפה בנרתיק

הערה: הורמוני גונדל (כלומר, אסטרוגן ופרוגסטרון) ידועים כמשפיעים על תגובת הלחץ וההובנה^28,29,30. הורמונים אלה משתנים מעל המחזור אסטרוס של חולדות^{נקבה 31}. אם מעוניינים לעקוב אחר מחזור אסטרוס של מכרסמים נשיים רכיבה חופשית כדי לתאם עם מתח או נתוני גמישות קוגניטיבית, לאסוף שטיפת נרתיק כמתואר להלן. נתונים מייצגים בהתחשב בשלב מחזור estrous אינם מסופקים.

1. כדי להשיג דגימות שטיפה בנרתיק מהנקבות, אסוף מים חמים בכוס נקייה, טפטפת זכוכית, שקופית "שטיפה" (מגלשת מיקרוסקופ עם עיגולי צבע אקרילי כדי להחזיק את דגימת השטיפה), וכוס ריקה אחת.
2. מלא את הטפטפת עם כמות קטנה של מים חמים (~ 0.5 מ"ל), ולאחר מכן להכניס את הקצה לתוך הנרתיק של החולדה הנשית (על ידי הרמה על ידי הזנב שלה). לגרש את המים סטריליים 2x-3x ולגרש את הנוזל שנאסף על שקופית מיקרוסקופית. אין להציף את עיגול שקופיות השטיפה.
3. לגרש כל נוזל עודף לתוך הכיס הריק. תייג את שקופית השטיפה במספרי חולדות ושים את הדגימות מכל חולדה בסדר הזה כך שיהיה ברור איזו דגימה שייכת לכל חולדה.
4. יש לשטוף היטב את הטפטפת על ידי צנרת מים חמים ונקיים וחלוקתה לתוך הכיס "עודף" מספר פעמים לפני מילוי הטפטפת כדי לדגום את החולדה הבאה.
5. בזהירות לשאת את שקופית שטיפה למיקרוסקופ Brightfield כדי לדמיין את מדגם שטיפה לסווג את היום בתוך מחזור אסטרוס כמתואר בקר ואח^'31.
   הערה: באופן אידיאלי, lavaging צריך להיעשות במשך כמה שבועות כדי לעקוב כראוי אחר מחזור של נקבה צריך להתבצע בזמן דומה מאוד בכל יום כדי לשלוט על מקצבים היממה. רצוי, הליך זה צריך להתבצע לפני מתח ואסטרטגיה אופרנטית שינוי נהלים. השימוש בצמר גפן מלוחים סטריליים יכול לשמש גם כחלופה לטכניקת טפטפת עיניים זו. נתונים עבור חולדות נקבה ניתן לנתח לאחר הוק על פי יום מחזור אסטרוס (לשקול ימים של מחזור כאשר הלחץ מבוצע ו/או יום מחזור כאשר הבדיקות מתרחשות).

3. ציוד ותוכנה

1. השתמש בתאים אופרנטיים להכשרה ובדיקה התנהגותית.
   1. ודא כי התאים מכילים לפחות שני מנופים נשלפים עם שני אורות גירוי מעל, אור בית, ומתקן לחיזוק עבור משימות אלה.
   2. בדוק כי המנופים נמצאים משני צדי אזור אספקת החיזוק המרכזי עם אור גירוי אחד מעל כל ידית.
   3. השתמש באור הבית כדי להאיר את התא מבלי להפריע לזיהוי גירוי האור (עדיף שאור הבית יהיה על הקיר האחורי של התא, מול המנופים ואורות הגירוי).
2. השתמש כדורי מזון ללא אבק (כאן, 45 כדורי מ"ג משמשים: 18.7% חלבון, 5.6% שומן, ו 4.7% סיבים) לחיזוק בחולדות מוגבלות מזון. אין להשתמש בכדורים עשירים ב סוכרוז או בשומן (אלא אם כן יש עניין באופן שבו מתח משפיע על צריכת מזון טעים).
3. שלוט בהצגת גירויים, פעולת מנוף ואיסוף נתונים ממחשב עם תוכנה המסוגלת להפעיל את התא (טבלת החומרים).
   הערה: לקבלת מידע הקשור לקוד של תוכניות המשתמשות בתוכנה זו, פנה אל המחברים. קבצי Script של MED-PC כלולים כקבצים משלימים. תוכנה זו אוספת מידע על תגובות החיה עבור כל ניסוי (איזה מנוף לחוץ, אם זה נכון / לא נכון / לא תגובה, והשהיה כדי לבצע את הבחירה). ממידע זה, משתמשים יכולים לחשב אמצעים שונים בפרדיגמה ההתנהגותית, כמתואר בסעיף הניתוח ההתנהגותי.
4. בצע אימון / בדיקות בו זמנית בכל יום כדי לשלוט על מקצבים היממה בהורמוני לחץ³² (ואמצעים רלוונטיים אחרים).
5. מלאו את המגש התחתון של כל קופסה אופרנטית במצעים טריים לאיסוף צואה / פסולת. לאחר כל מפגש, השלכו כל מגש, מגשים נקיים ופנים תא עם מגבוני אלכוהול או חומר חיטוי שאושר על ידי IACUC, והחליפו במצעים טריים לפני הנחת חיה חדשה בחדר.

4. נהלי מתח

1. להחליט אם יש לבצע את הליך הלחץ לפני, במהלך ו/או לאחר אימון על האסטרטגיה האופרנטית הסטת פרדיגמה (למשל, 5 ימים של לחץ איפוק לפני 3 ימים של אימון אופרנטי לעומת 3 ימים של אימון אופרנטי ואחריו איפוק ובדיקה בודדים).
2. בצע את הליך הלחץ בו זמנית מדי יום ביחס להכשרה אופרנטית. (למשל, 30 דקות של לחץ איפוק החל מ 9 A.M., ואחריו מיקום בחדר האופרנט).
3. בצע את נהלי הלחץ בחדר נפרד הן מחדר המושבה והן מחדרי פרדיגמת הסטת האסטרטגיה (כדי להבטיח שאין גורמים מבלבלים הקשורים ללחץ עדים)³³. בקצרה, מניחים את החולדה בצינור ריסון שקוף בסגנון ברום ולאטום את הפתח, תוך כדי קמצוץ את הגפיים או הזנב. בין כל נושא, השתמש בחומר חיטוי שאושר על ידי IACUC כדי לנקות את הצינור בסגנון ברום. חיטוי לא תקין יכול להשאיר פרומונים מאחור שיכולים להשפיע לרעה על פרוטוקול הבדיקה.
   הערה: הערכה כמה זמן תבלה קבוצת החולדות הראשונה בתאי האופרנט. זה ישתנה בהתאם לאימונים לעומת יום המבחן; עם זאת, לאחר הפעלת מספר קבוצות, ניתן לחשב זמן ממוצע להשלמת כל פעילות להערכת פעילויות עתידיות.
4. תלוי כמה תאים אופרנטיים זמינים, להדהים את הליך הלחץ עבור נושאים. לדוגמה, ארבע חולדות עוברות לחץ איפוק ומוצבות בארבעה תאים אופרנטיים. שעה לאחר מכן, ארבעה בעלי חיים נוספים עוברים הליכי לחץ כדי לעקוב אחר התא האופרנטי.

5. אימון

הערה: פרדיגמה זו משתנה מהליך הסטת הסטה אופרנטי שפותח על ידי פלורסקו ואח ', כך שניתן להשלים אותו תוך 3 ימים¹⁹.  נהלי אימון לחולדות דורשים 3 ימים (יום אחד כדי ללמוד כל משימה כמתואר להלן). נדיר שחולדה אינה לומדת את המשימות הללו. אם חולדה לא מצליחה ללמוד כל משימה, יש להחריג אותה מהמחקר הסופי. ראה איור 1A לתיאור חזותי של פרדיגמת האימון המתוארת להלן.

1. לפני הצבת החולדה בחדר, ודא שיש מספיק כדורי מזון במתקן וכי תיבות האופרנט מתפקדות כראוי. כדי להשיג זאת, לטעון וליזום תוכנית יום הדרכה או מבחן בתא ריק, בדיקה ידנית כי המנוף הנכון מספק כראוי פרס אחד לכל מכבש.
2. אימון החולדה ללחוץ על כל ידית
   1. לפני הנחת החולדה בקופסה ליום הראשון של האימון, יש להגדיר באופן ידני תגמול כדורי מזון אחד על הידית הנכונה, כפי שנקבע בעת טעינת הליך האימון בתוך כל תא.
   2. לאמן את החולדה באמצעות לוח זמנים יחס קבוע (FR-1), כך שכל לחיצת ידית נכונה מתוגמלת בחיזוק אחד. איזון המנוף הנכון ליום בין נושאים ו/או תנאים ניסיוניים (עיצוב ידית אחת בלבד בכל פעם) על-ידי ייעוד המנוף הנכון בעת טעינת הליך האימון במחשב המפעיל את התאים.
   3. אפשר לחולדה ללחוץ על הידית עד שהיא מגיעה לקריטריון על ידי לחיצה על הידית הנכונה 50x, בדרך כלל השלמת המשימה בין 30-45 דקות.
   4. למחרת לאלץ את החולדה לבצע משימה זו על המנוף הנגדי באמצעות אותה תוכנית כמו היום הראשון של האימון, אבל להגדיר את הידית ההפוכה כמו הנכון. אין צורך "לעצב" את הידית עם גלולה מזון ביום זה של אימונים. בדרך כלל, קריטריון זה נרכש במהירות לאחר חולדות למדו ללחוץ על הידית הראשונה.
3. אימון החולדה להגיב לסימן האור
   1. ביום השלישי של האימון, להאיר את האור מעל שני המנופים עבור 15 s ניסויים, שבמהלכם החולדה עשויה ללחוץ על אחד הידיות כדי לקבל תגמול כדורי מזון. במהלך משימת האפליה הקלה, תוכנית זו תבחר באופן אקראי איזה מנוף נכון על בסיס ניסיון אחר ניסיון.
   2. אם החולדה לוחצת על הידית הנכונה, ודא שהאורות נשארים מוארים במשך 3 s והפרס מועבר, ואחריו תקופת 5 s, שבמהלכה האורות כבויים לפני המשפט הבא. אם החולדה לוחצת על הידית השגויה, ודא שלא מועבר פרס ושהאורות כבויים למשך 10 לפני המשפט הבא.
   3. לאחר יום אחרון זה של אימון, לחשב "הטיה צדדית" כדי לקבוע אם החולדה יש העדפה עבור ידית שמאל או ימין על ידי חלוקת מספר לחיצות של ידית אחת חלקי המספר הכולל של לחיצות ידית. ביום המבחן, החולדה תתחיל בצד הפחות מועדף עליה כדי להבטיח שהיא לומדת את המגירה הספציפית של תגמול התגובה, במקום להגיב למנוף מועדף.

6. בדיקה

הערה: ראה איור 1B לתיאור חזותי של פרדיגמת הבדיקה המתוארת להלן.

1. ביום 4 (יום המבחן), הניחו את החולדה בחדר האופרנטים לאחר נהלי לחץ ובחנו אותם במשימות אפליה צדדיות, היפוך צדדי ואפליה קלה באופן סדרתי. ודא שמשימת האפליה הקלה רק מאירה את האור מעל המנוף "הנכון". בכל משימה, חולדות חייבות להשיג ברציפות שמונה משפטים נכונים כדי להשלים כל אפליה מבלי ללחוץ על המנוף הלא נכון והלא מתרשם. לחיצת מנוף שגויה תאפס שרשרת זו של ניסויים.
   1. בדוק חולדות באמצעות משימת האפליה הצדדית. באמצעות תוכנית האפליה הצדדית, לתגמל את העכברוש על לחיצה על המנוף בצד הפחות מועדף שלה כפי שנקבע מהיום השלישי של האימונים, ללא קשר לסימן האור. המשימה מסתיימת בעת לחיצה על הידית הנכונה 8x ברציפות (לא כולל השמטות).
   2. בצע את מבחן היפוך הצד על ידי הפעלת חולדות באמצעות תוכנית האפליה הצדדית שוב, אך הפעם ייעד את המנוף ממול לנכון ממשימת האפליה הצדדית כנכונה. ודא כי החולדה מתוגמלת על לחיצה על ידית זו, ללא קשר לסימן האור. המשימה מסתיימת בעת לחיצה על הידית הנכונה 8x ברציפות (לא כולל השמטות).
   3. בצע את משימת האפליה הקלה, המתגמלת את החולדה על לחיצה על המנוף עם האור המואר למעלה. כל בדיקה אופרנטית הושלמה בעת לחיצה על הידית הנכונה 8x ברציפות (למעט השמטות).
      הערה: בהתבסס על מחקרים קודמים, משימות אלה מקודדות מינימום של 30 ניסויים, ללא קשר למכבשים רצופים, כדי להבטיח שלעכברושים יהיה מספיק זמן ללמוד את הכללים של כל משימה¹⁸. לכן, אם החולדה משיגה ברציפות שמונה ניסויים נכונים לפני 30 ניסויים התרחשו, המשימה תישאר עוסקת עד 30 ניסויים הושלמו.

7. ניתוח התנהגותי

הערה: הנתונים שנרכשו עבור כל בעל חיים ביום המבחן נרשמים ונשמרים באופן אוטומטי על ידי המחשב, כל עוד סקריפט MED-PC עבור כל משימה הופעל והותר להשלים (ראה חומרים משלימים עבור סקריפטים MED-PC).

1. פתח את הנתונים עבור כל משימה של יום מבחן (אפליה צדדית, היפוך צדדי ואפליה קלה) באמצעות תוכנת המחשב. האמצעים העיקריים שנרשמו על ידי התוכנית הם ניסויים בקריטריון, שגיאות בקריטריון וזמן לקריטריון. אמצעים אלה מתוארים בפירוט להלן.
   הערה: המחברים יצרו סקריפט MATLAB המאפשר אוטומציה של תהליך הניתוח, כמו גם ניתוח של שגיאות מתפשרות לעומת רגרסיבית (צור קשר עם מחברי מידע קוד כדי לייעל את ניתוח הנתונים).
   1. השתמש בניסויים כדי קריטריון (המתייחס למספר הכולל של ניסויים [לא כולל השמטות] הדרושים לחולדה כדי להשלים ברציפות שמונה ניסויים נכונים, כולל שמונה ניסויים אלה) כאינדיקטור העיקרי לדיוק. נתונים אלה ממוקמים בעמודה הראשונה במערך B בקובץ נתונים שנוצר על-ידי קובץ ה- Script של MED-PC עבור כל אחת מהמשימות ביום הבדיקה.
   2. בדוק את סך השגיאות שבוצעו במהלך כל פעילות. נתונים אלה ממוקמים בעמודה השלישית של מערך B בקובץ נתונים שנוצר על-ידי קובץ ה- Script של MED-PC עבור כל אחת מהמשימות ביום הבדיקה. שגיאות אלה מסווגות גם לשגיאות התמדה או רגרסיבית. שגיאות התמדה מבוצעות כאשר החולדה ממשיכה לעקוב אחר הכלל הקודם מהמשימה הקודמת. שגיאות רגרסיביות מבוצעות לאחר שהתנתק מהכלל הקודם אך ממשיך לנסות להשיג את הכלל החדש (לקבלת פרטים נוספים על אופן החישוב של סוגי שגיאות אלה, עיין בשיטה שפורסמה¹⁸).
   3. אם החולדה לא הגיבה לסימן קל בתוך 15 s, המשפט מסווג כהשמטה, והוא לא ייחשב לקראת המספר הכולל של ניסויים לקריטריון. חשב זאת על-ידי הוספה ראשונה של מספר התגובות הנכונות (הממוקמות בעמודה השנייה של מערך B בקובץ נתונים) ומספר השגיאות (הממוקם בעמודה השלישית של מערך B בקובץ נתונים). לאחר מכן, הפחת מספר זה מהמספר הכולל של ניסויים לקריטריון (זהו המספר האחרון בעמודה הראשונה של מערך B בקובץ נתונים, שונה מהניסויים לקריטריון).
   4. השתמש בזמני התחלה וסיום שנרשמו על-ידי התוכנית (הממוקם בחלק העליון של קובץ נתונים שנוצר על-ידי קובץ ה- Script של MED-PC עבור כל אחת מהפעילויות ביום הבדיקה) כדי לחשב את הזמן לקריטריון. ניתן לחשב השהיה למכבש המנוף הראשון גם מקובץ הנתונים על-ידי חיסור ה- K המשתנה (זמן שחלף בשניות מהדפוס הראשון של המנוף) מהזמן לקריטריון.
   5. ממוצע הנתונים עבור כל מדד התנהגותי עבור חולדות באותה קבוצת טיפול. בצע ניתוחים סטטיסטיים מתאימים (בהתאם לכמה משתנים נבדקים).

8. מצעים מוחיים

1. קבע אזור מוח מעוניין ו/או היבט של גמישות קוגניטיבית. לדוגמה, אם מתח מגביר שגיאות התמדה במשימת היפוך הצד, קליפת המוח האורביטופרונטלית (OFC) עשויה לעניין במיוחד, שכן מחקרי נגעים קודמים הצביעו על כך שאזור המוח הזה ממלא תפקיד בצורות רבות של למידה הפוכה (כלומר, היפוך מרחבי שנבדק במשימת היפוך הצד)^34,35,36. בדוגמה זו, חולדות הקרבה לאחר פרדיגמת הסטת האסטרטגיה הושלמה ולבחון c-fos (מידה של הפעלה עצבית³⁷) ב- OFC באמצעות שיטות אימונוהיסטוכימיות^{המתוארות 25} ומתוארות כאן בקצרה.
   1. ראשית, לחלץ מוחות מבעלי חיים לחתוך לפרוסות 40 מיקרומטר.
   2. לשטוף את הרקמה מלוחים חוצצי פוספט (PBS) 4x במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן לדגור ב 0.3% מי חמצן במשך 10 דקות כדי להרוות פרוקסידסים אנדוגניים.
   3. לשטוף רקמה PBS 2x במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן דגירה בנוגדן העיקרי נגד C-fos עכבר (1:500), 3% סרום חמור רגיל (NDS), ו 0.3% Triton X לילה.
   4. למחרת, לשטוף רקמה PBS 3x במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן דגירה ביוטין-SP-מצומד חמור נוגדן נגד עכבר (1:500) עבור 2 שעות.
   5. לשטוף רקמה PBS 3x במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן לדגור במתחם AB avidin-סטרפטאבידין במשך 1 שעה.
   6. לשטוף רקמה PBS 3x במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן דגירה בתמיסת DAB עד 10 דקות כמו רקמה עוברת תגובה כרומוגנית חמצון.
   7. לשטוף רקמה PBS 3x במשך 5 דקות כל אחד, ולאחר מכן לעלות את פרוסות המוח על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית.
   8. מכסה את הרקמה באמצעות מדיום הרכבה מבוסס טולואן ותמונה באמצעות מיקרוסקופ Brightfield.
      הערה: כאן, כפי שמשתקף בתוצאות הייצוגיות, חולדות מוקרבות 30 דקות לאחר סיום פרדיגמת הסטת האסטרטגיה, בערך 60-90 דקות לאחר השלמת משימת ההיפוך (בהתאם לביצועים של כל חולדה במשימת האור). זה אמור לייצג תזמון אופטימלי עבור ביטוי c-fos³⁸, המשקף ביצועים בפעילות ההיפוך.
2. לחלופין, ניתן לתנווט אזור מוח מסוים להזרקת סמים או הזרקה ויראלית לפני ביצוע מתח או פרדיגמת הסטת האסטרטגיה האופרנטית.
   הערה: החוקרים עשויים לרצות לבחון כיצד מניפולציה של מצעים עצביים משנה את ההשפעות של מתח על גמישות קוגניטיבית. לדוגמה, חוקרים יכולים לחסום קולטן נוירוטרנסמיטר מסוים בקליפת המוח הקדם מצחית לפני הבדיקה.

האסטרטגיה האוטומטית המותאמת לשינוי פרדיגמה שתוארה לעיל שימשה כדי לקבוע אם לחץ איפוק חוזר על עצמו משפיע על קוגניציה בחולדות ספראג דולי זכר ונקבה. נתונים התנהגותיים מייצגים מתוארים באיור 2 להלן. בקיצור, חולדות שליטה ומאופקות שוב ושוב ביצעו את מבחן הסטת האסטרטגיה האופרנטי הזה, שכלל שורה של משימות: אפליה צדדית, היפוך צדדי ואפליה קלה.

ניסיונות לקריטריון עבור כל פעילות מתוארים באיור 2A. בדרך כלל, ביצועים טובים יותר בכל פעילות היו מיוצגים על-ידי מספר מופחת של ניסיונות לקריטריון. נתונים אלה מצביעים על כך, לאחר איפוק חריף, הזכרים השלימו את משימת היפוך הצד בניסויים פחות משמעותית מאשר גברים לא מטופלים, לשלוט. לעומת זאת, נקבות לחוצות נדרשו למספר גדול משמעותית של ניסויים כדי להשלים את משימת ההיפוך הצדדי. תוצאות אלה מצביעות על כך שהזכרים הציגו ביצועים משופרים בעקבות לחץ, ואילו הנקבות הציגו ביצועים לקויים. במשימת האפליה הקלה, הלחץ הגדיל את מספר הניסויים לקריטריון בהשוואה לנשים שליטה, ובכך פגע בביצועים של נשים אך לא אצל גברים במשימה זו.

המספר הכולל של שגיאות שבוצעו עבור כל משימת תשומת לב מתואר באיור 2B. בהתאם למספר הניסויים בקריטריון, גברים לחוצים עשו פחות טעויות באופן משמעותי מאשר זכרי בקרה, בעוד נקבות לחוצות עשו יותר טעויות במשימת היפוך הצד. יתר על כן, במשימת האפליה הקלה, נשים גם עשו טעויות משמעותיות יותר. לסיכום, נתונים אלה מראים כי מתח חוזר משפר את הביצועים הקוגניטיביים אצל גברים, אך פוגע בביצועים הקוגניטיביים אצל נשים.

סך השגיאות סווג עוד יותר לשגיאות התמדה או רגרסיביות באיור 2C (להבחנה בין שני סוגי שגיאות אלה, עיין בסעיף 7 של הפרוטוקול). מעניין, זכרים לחוצים עשו פחות טעויות התמדה במשימת היפוך הצד מאשר זכרים שליטה. מאידך גיסא, הן במשימות ההיפוך הצדדי והן במשימות האפליה הקלות, נשים לחוצות ביצעו מספר גדול יותר של טעויות מתמשכות מאשר שליטה בנשים. לא היו הבדלים בין קבוצות הטיפול במספר השגיאות הרגרסיביות שבוצעו במהלך כל משימה.

השמטות בכל ניסיון וזמן להגיע לקריטריון מוצגות באיור 2D (לקבלת מידע נוסף על אופן החישוב, עיין בסעיף 7 שלהפרוטוקול). אמצעים אלה הוערכו במשימת ההיפוך הצדדי בלבד, שכן משימה זו הציגה את הבדלי המין הגדולים ביותר. נקבות לחוצות עשו אחוז גבוה יותר של השמטות בהשוואה לכל קבוצות הטיפול האחרות. בנוסף, בעוד מתח נראה להקטין את הזמן כדי להשלים את משימת היפוך הצד אצל גברים, להדגיש השלמה ממושכת של המשימה אצל נקבות. לסיכום, מתח חוזר ונשנית פגע בגמישות הקוגניטיבית אצל הנקבות אך לא אצל גברים.

מצעי המוח הבסיסיים של הגמישות הקוגניטיבית מתוארים באיור 3. כפי שנצפו הבדלי מין חמורים במשימת ההיפוך הצדדית, נבדקו אזורי המוח שבביד משימה זו כדי לקבוע אם הם הציגו הבדלים מיניים דומים בפעילות העצבית. כפי שנדון בעבר, מחקרי נגעים הראו כי קליפת המוח האורביטו פרונטלית (OFC) מתווכת את משימת היפוך הצד³⁴. לכן, c-fos, מדד של הפעלה עצבית³⁷, תויג ב- OFC ב - 30 דקות לאחר השלמת הסטת האסטרטגיה, אשר היה צריך לשקף את הביצועים במשימת היפוך הצד³⁸. עם זאת, ייתכן כי OFC עשוי גם לשחק תפקיד באסטרטגיה החוץ-ממדית הסטה רכיב של משימה זו³⁹. לכן, חשוב לבצע את ההקרבה בזמן המתאים כדי לשקף את פעילות המוח במהלך משימה מסוימת בתוך האסטרטגיה האופרנטית הסטת פרדיגמה. כאן, מתח גרם לעלייה משמעותית בהפעלה העצבית ב- OFC של גברים בהשוואה לבקרות. עם זאת, מתח גרם לירידה משמעותית בהפעלה העצבית ב- OFC של נקבות בהשוואה לבקרות. יתר על כן, אצל גברים, הפעלת OFC וניסויים לקריטריון היו בקורלציה שלילית; באופן ספציפי, הפעלת OFC גבוהה יותר קושרה עם פחות ניסויים לקריטריון. לעומת זאת, לא היה קשר בין הפעלת OFC לביצועים אצל נשים, דבר המצביע על כך שה- OFC נותק במהלך הופעות אלה.

איור 1: סכמטי של האסטרטגיה האופרנטית הסטת פרדיגמה במהלך ימי אימונים ומבחן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: נתונים התנהגותיים מייצגים מאסטרטגיה אופרנטית המעבירה פרדיגמה. (א) ניסיונות לקריטריון עבור כל פעילות ביום הבדיקה. במשימת ההיפוך הצדדית, מתח שיפר את הביצועים אצל גברים אך לקוי בביצועים אצל הנקבות. במשימת האפליה הקלה, הלחץ החליש את הביצועים אצל הנקבות, בעוד שזה לא השפיע על גברים. (ב) מספר השגיאות עבור כל משימה ביום הבדיקה. הלחץ הפחית את מספר השגיאות שנעשו אצל גברים, אך הגביר את השגיאות אצל הנקבות במשימות היפוך ואפליה קלה. (ג) סיווג שגיאות התמדה ורגרסיבי. הלחץ הפחית טעויות התמדה שנעשו אצל גברים, אך הגביר את השגיאות ההתמדה שנעשו אצל נקבות במשימות היפוך צד ואפליה קלה. (D) אחוזי ניסיונות שהושמטו וזמן לקריטריון בפעילות ההיפוך הצדדית. הלחץ הגביר את אחוזי ההשמטה בחולדות. הלחץ הפחית את הזמן הנדרש על ידי גברים אבל הגדיל את הזמן הנדרש על ידי הנקבות כדי להשלים את המשימה. הסטטיסטיקה חושבה באמצעות ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן t של Tukey (n = 12 חולדות לכל קבוצה; סרגלי שגיאה מייצגים SEM; #p ≤ 0.10, *p < 0.05). נתון זה שונה מפרסום קודם¹⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הפעלה עצבית מייצגת לאחר אסטרטגיה אופרנטית הסטת פרדיגמה. (א) הפעלת OFC לאחר משימת הסטת אסטרטגיה. תמונות מייצגות של immunohistochemical 3,3'-diaminobenzidine (DAB) מכתים באמצעות נוגדן נגד c-fos ב- OFC דמיינו באמצעות מיקרוסקופיה Brightfield, ואז כימתו. מתח הגביר באופן משמעותי את ההפעלה (מדגים על ידי מספר תאים c-fos-מבטא) ב- OFC של זכרים, בעוד זה הפחית את ההפעלה אצל נקבות. סרגל קנה מידה בחלונית התמונה הימנית התחתונה מייצג 200 מיקרומטר. הסטטיסטיקה חושבה באמצעות ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן t של טוקי (n = 12 חולדות לכל קבוצה, 6-8 חלקים של OFC שנותחו לכל חולדה; סרגלי שגיאה מייצגים SEM; * p < 0.05). (ב) ניסיונות לקריטריון בפעילות ההיפוך הצדדית מתואמת עם הפעלת OFC. הזכרים הציגו מתאם שלילי משמעותי, ואילו הנקבות לא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

הפרוטוקול מדגים כיצד למדוד את ההשפעות של מתח על תפקוד קוגניטיבי. באופן ספציפי, אסטרטגיה אופרנטית שונה הסטת פרדיגמה משמש מכרסמים, אשר מודד גמישות קוגניטיבית (מקבילה למשימה מיון כרטיס ויסקונסין בבני אדם)¹. גמישות קוגניטיבית מציינת את היכולת להתאים אסטרטגיות עיבוד קוגניטיביות להתמודד עם תנאים חדשים בסביבה, והיא חיונית לתפקוד יומיומי תקין². כמו מחקרים בבני אדם על גמישות קוגניטיבית מוגבלים בעיקר הדמיה מוחית¹¹, השימוש פרדיגמה זו בבעלי חיים יקדם מאוד את ההבנה של ההשפעות של מתח על המוח וקוגניציה.

מתח יכול לפגוע בתפקוד הקוגניטיבי⁴⁰. למעשה, זהו אחד הפנוטיפים הנפוצים ביותר במחלות הקשורות ללחץ כגון PTSD ו- MDD^3,41. יתר על כן, ישנם הבדלים מיניים חמורים בהתרחשות של מחלות פסיכיאטריות הקשורות ללחץ^5,6,7, ובכל זאת יש הבנה מועטה של הנוירוביולוגיה מאחורי מקרים מוטים אלה. לפיכך, שימוש באסטרטגיה אופרנטית זו הסטת פרדיגמה בבעלי חיים משני המינים עשוי לעזור לקדם את ההבנה הנוכחית של הבדלי מין בפסיכיאטריה.

משימת הסטת אסטרטגיה אופרנטית זו מאפשרת לחוקרים לבחון היבטים מרכזיים של קוגניציה הרלוונטיים להפרעות פסיכיאטריות. לדוגמה, שגיאות מתמיד לאחר מניפולציה ניסיונית מחושבות בפרדיגמה זו. התמדה נצפתה בהפרעות פסיכיאטריות הקשורות ללחץ כגון PTSD, והיא פוגעת ביכולתו של אדם ללמוד מערכת כללים חדשה, ובסופו של דבר פוגעת בזיכרון העבודה³. לפיכך, מידת הטעויות התמידיות רלוונטית מבחינה תרגומית. יתר על כן, השמטות במשימות קשב צוינו בחולים עם PTSD, המציין עיבוד קליפת המוח איטי יותר³. בהתאם לכך, נתוני השמטה מפרדיגמה זו עשויים להיות מקבילים קליניים. לסיכום, גמישות קוגניטיבית הנמדדת על ידי פרדיגמה ניסיונית זו מודלים פנוטיפים מרכזיים הנצפים בהפרעות פסיכיאטריות.

פרדיגמה ניסיונית זו מאפשרת גם דיוק בתמקדות במצעים עצביים שבבסיס הגמישות הקוגניטיבית. לדוגמה, הספרות הצביעה על כך שקליפת המוח הקדם-מצחית (PFC) היא אזור מוח חיוני לגמישות קוגניטיבית³, כולל קליפת המוח הקדם-מצחית המהותית (mPFC) וקליפת המוח האורביטו-פרונטלית (OFC). מתוך תת-תחזיות אלה ב- PFC, ה- OFC חשוב לביצועים במשימת היפוך הצד^34,35. אזורים מוחיים אלה הם גם יעדים מרכזיים לשינויים תפקודיים הנגרמים על ידי מתח^42,43. מעניין, מודל הלחץ המשמש כאן נראה לשחק תפקיד בביצועים הבאים של מכרסמים במבחנים של גמישות קוגניטיבית; לכן, זה צריך להיחשב בעיצוב של ניסויים עתידיים. תגובות שונות אלה ללחץ מצביעות על מנגנונים חדשניים פוטנציאליים שבאמצעותם קוגניציה מושפעת מלחץ. לכן, מיקוד נוירוטרנסמיטורים ספציפיים, חלבונים, או הפעלה של אזורי מוח אלה עשוי לשפוך אור על איך מתח משפיע על קוגניציה מכרסמים זכר ונקבה. חוקרים יכולים לבחור לתפעל מצעים עצביים אלה בנקודות זמן שונות בשילוב עם מתח או הסטת אסטרטגיה, או לחילופין למדוד מצעים עצביים לאחר חשיפה לפרדיגמות התנהגותיות אלה.

למשימה זו של הסטת אסטרטגיה אופרנטית שונה יש יתרונות ברורים על פני פרדיגמות גמישות קוגניטיבית אחרות המשמשות בספרות הלחץ (כלומר, משימת החפירה^12,13,14,15), הדורשות יותר זמן ומאמץ על ידי הנסיין לאמן מכרסמים. הליך זה דורש פיקוח מינימלי על ידי הנסיין ומאפשר לחולדות מרובות להיבדק בו זמנית. בנוסף, בניגוד לגרסאות אחרות של משימה אוטומטית זו¹⁹, הפרדיגמה דורשת רק 3 ימי אימון וכוללת ניתוח נתונים מתוכנת יעיל.

לאסטרטגיה האופרנטית המשתנה פרדיגמה יש מגבלות מסוימות. מגבלה אחת היא שהוא יכול לבדוק רק שני ממדי גירוי (למשל, ידית שמאל או ימינה לעומת סימן אור), ואילו משימת החפירה^12,13,14,15 יכולה לבדוק ממד גירוי שלישי (למשל, לחפור מדיה לעומת ריח לעומת מרקם). עם זאת, המשימה המתוארת בפרוטוקול זה עדיין מאפשרת לבחון את יכולתו של החולדה לעבור לכללים שונים, המאפשרים בדיקה של מבנים גמישות קוגניטיבית. בנוסף, ניתן להוסיף פרמטרים אחרים לתאי האופרנט כדי לאפשר גירוי שלישי (למשל, ריח), אך זה עשוי להאריך את ההכשרה הנדרשת למשימה.

היתרון העיקרי של משימה זו הוא הפשטות שלה ואת היכולת לזווג אותו עם מניפולציות מלחיץ או פרמקולוגי כדי להבין עוד יותר כיצד מתח משפיע על המוח. יש לציין כי פשטות זו מגיעה עם קושי מוגבר כי הנבדקים להתמודד תוך כדי למידה למנף את העיתונות, לעומת משימת החפירה הרלוונטית מבחינה אקולוגית. בעוד משימה אופרנטית זו היא הרבה פחות עבודה אינטנסיבית, מכרסמים בדרך כלל ידרשו יותר ניסויים כדי לרכוש משימה זו. עם זאת, הן משימת החפירה והן פרדיגמה זו עוסקים במנגנונים נוירוביולוגיים דומים ובכך מייצגים אפשרויות תקפות לבחינת גמישות קוגניטיבית^16,44. אמנם היו תוצאות מגוונות בספרות לגבי ההשפעות של מתח על גמישות קוגניטיבית באמצעות משימת החפירה ואת ההליך האופרנטי הזה^{23,25,27,45,46}, השיטה המוצגת משקפת את ההשפעות המורכבות כי הסוג, העוצמה, ומשך של גורם לחץ יכול להיות על תפקוד קוגניטיבי^20,21.

מגבלה נוספת של המשימה היא כי מכרסמים שוכנים בקופסאות אטומות סגורות; לכן, התנהגויות אחרות מאלה שנאספו באמצעות ממשק המחשב לא ניתן לקודד. לדוגמה, מספר גבוה של השמטות על ידי חולדה עשוי להיות עקב עיכוב התנהגותי שנגרם על ידי מתח, או בגלל החולדה ישנה. יתר על כן, התנהגויות סטריאוטיפיות אחרות, כגון טיפוח (אשר רלוונטי במיוחד בחקר מתח), עשוי להיות מעניין לנתח במהלך המשימה. הרכבת מצלמות בתאים אופרנטיים עשויה לאפשר סוג זה של דיוק התנהגותי.

בסך הכל, דו"ח זה מפרט את השימוש בהליכי לחץ בשילוב עם אסטרטגיה אופרנטית הסטת פרדיגמה כדי להבין עוד יותר כיצד מתח משפיע על המוח. יש לציין כי בנוסף להליכי לחץ והערכה קוגניטיבית אצל מבוגרים, מחקר על שלבים התפתחותיים שונים עשוי לספק מידע מכריע על האטיולוגיה של חוסר גמישות קוגניטיבית. בנוסף לחקר ההשפעות של הלחץ על גמישות קוגניטיבית, אסטרטגיה אופרנטית פשוטה ויעילה זו שינוי פרדיגמה ניתן לזווג עם מניפולציות ניסיוניות רבות כדי לחקור כיצד המוח מסתגל לסביבות משתנות. יתר על כן, ניתן להשתמש בגישות ניסיוניות חלופיות כדי לחקור את הבסיס העצבי של גמישות קוגניטיבית, כולל נגעים, פרמקולוגיה, עריכת גנים ואלקטרופיזיולוגיה. כמו חוסר גמישות קוגניטיבית היא אחד הפנוטיפים העיקריים במחלות פסיכיאטריות, מחקר נוסף חייב להתבצע כדי להבין עוד יותר את המצעים הנוירוביולוגיים שלה.

למחברים אין מה לחשוף.

המחברים רוצים להודות להאנה זאמור, אמילי סאקס וג'וש סירל על עזרתם בביסוס האסטרטגיה האופרנטית הזו בהסטת פרדיגמה של שינוי פרדיגמה במעבדת גראף. הם גם רוצים להודות לקווין סניידר על עזרתו בקוד MATLAB לניתוח.